CN1061623A - 睫状神经营养性因子受体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及睫状神经营养性因子(CNTF)受体， 并提供了CNTF受体核酸和氨基酸序列。还涉及 (I)测定CNTF活性的检测***；(II)研究CNTF 生理学作用的实验模型***；(III)鉴定CNTF相关 的神经病理状态的诊断技术；(IV)治疗CNTF相关 的神经和肌肉病理状态的治疗技术；以及(V)鉴定同 源于CNTF和CNTFR的分子的方法。

Description

1、引言

本发明涉及睫状神经营养性因子受体（CNTER），并提供了CNTF受体编码核酸以及氨基酸序列。本发明也涉及（ⅰ）为检测CNTF活性的检测***;（ⅱ）为研究CNTF的生理学作用的试验模型***;（ⅲ）为鉴定CNTF相关的神经状态的诊断技术;（ⅳ）为处理CNTF相关的神经状态的治疗技术;以及（ⅴ）为鉴别与CNTFR同源分子的方法。

2、发明背景

2.1.睫状神经营养性因子

睫状神经营养性因子（CNTF）是一种特定地为胚胎鸡睫状节神经元体外存活所需的蛋白质（Manthorpe  et  al.，1980，J.Neurochem.34∶69-75）。该睫状神经节解剖学上位于视觉神经的侧直肌和鞘之间的眶腔范围内;它容纳来自支配睫状肌和瞳孔***的动眼神经的副交感神经纤维。

已经发现，睫状节神经元属于呈现确定细胞死亡周期的神经元群体。在鸡睫状神经节中，已观察到胚胎期8天（E8）时存在的半数神经元在E14之前死亡（Landmesser  and  Pilar，1974，J.Phy-siol.241∶737-749）。在这一相同的时间周期内，睫状节神经元正与其靶组织，即眼的睫状体和脉络膜形成接连。Landmesser和Pilar（1974，J.Physiol.241∶751-736）观察到，在细胞死亡周期之前去除一眼，导致在同侧神经节中睫状节神经元的完全损失。相反地，Narayanan和Narayanan（1978，J.Embryol.Ex.Morphol.44∶53-70）观察到，通过植入一补充的眼原基从而增加可得到的靶组织的量，可以减少睫状节神经元细胞的死亡。这些结果与作用于睫状节神经元的靶衍生的神经营养性因子的存在是一致的。

在培养时，已发现，睫状神经节（CG）神经元为了存活需要一个因子或多个因子。已在下述情况下鉴定了睫状神经营养因子的活性：在鸡肌肉细胞条件培养基中（Helfand  et  al.，1976，Dev.Biol.50∶541-547;Helfand  et  al.，1978，Exp.Cell  Res.113∶39-45;Bennett  and  Nurcome，1979，Brain  Res.173∶543-548;Nishi  and  Berg，1979，Nature  277∶232-234;Varon  et  al.，1979，Brain  Res.173∶29-45），在肌肉提取物中（McLennan  and  Hendry，1978，Neu-rosci.Lett.10∶269-273），在鸡胚胎提取物中（Varon  et  al.，1979，Brain  Res.173∶29-45;Tuttle  et  al.，1980，Brain  Res.183∶161-180），以及在由心脏细胞调整的培养基中（为了讨论，也可参阅Adler  et  al.，1979，Science  204∶1434-1436以及Barbin  et  al.，1984，J.Neurochem.43∶1468-1478）。

Adler等人（1979，Science  204∶1434-1436）使用了一种基于CG神经元的微井培养物的测试***以证明在CG神经元神经支配的眼内靶组织中发现了非常丰富的CNTF源。在十二天胚胎中存在的8000营养单位（TU）范围中，发现了2500TU存在于眼组织中;活性看来局限在含有睫状体和脉络膜的部分。

其后，Barbin等人（1984，J.Neurochem.43∶1468-1478）报导了由鸡胚胎眼组织中富集CNTF的方法。也发现了CNTF活性是与非CG组织，包括大鼠坐骨神经相关的（Williams  et  al.，1984，Int.J.Develop.Neurosci.218∶460-470）。Manthrope等人（1986，Brain  Res.367∶282-286）报导了使用一种类似于由鸡眼中分离CNTF活性所用的分离工序由成年的大鼠坐骨神经提取物中部分提纯哺乳动物CNTF活性。另外，Watters和Hendry（1987，J.Neurochem.49∶705-713）公开了一种使用肝素-亲和性色谱法在非变性条件下由牛心组织中将CNTF活性富集约20000倍的方法。也鉴定了损伤的脑组织中的CNTF活性（Manthorpe  et  al.，1983，Brain  Res.267∶47-56;Nieto-Sampedro  et  al.，1983，J.Neurosci.3∶2219-2229）。

Carnow等人（1985，J.Neurosci.5∶1965-1971）和Rudge等人（1987，Develop.Brain  Res.32∶103-110）公开了由组织提取物的Western印迹鉴定类CNTF活性并随后通过用CG神经元在培养皿中培养硝化纤维条鉴定含有CNTF活性的蛋白质带以及使用活性染料鉴定细胞存活区的方法。使用这一方法，Carnow等人（1985，J.Neurosci.5∶1965-1971）观察到，成年大鼠坐骨神经和脑衍生的CNTF活性与鸡CNTF（20.4kD）相比看上去呈现出不同的尺寸（24kD）。

近来，CNTF已在细菌表达***中被克隆和合成，正如Sendtner等人在申请号为07/570  651，名称为“Ciliary  Neurotrophic  Factor”，申请日为1990年8月20日的美国专利申请中所描述的，在此将之全部加入作为参考。使用重组体探针，成年大鼠组织中的CNTF-mRNA的尺寸似乎是约1.2kb。大鼠脑CNTF被克隆并被发现由具有77bp的短5′未转译区和600bp开放读码的mRNA所编码，预示了一种约200个氨基酸的蛋白质（Stockli  et  al.，1989，Nature  342∶920-923）。人体CNTF也被克隆并定序（Sendtner等人的美国专利申请：申请号为07/570651，名称为“Ci-liary  Neurotrophic  Factor”，申请日为1990年8月20日）;其编码序列基本上相应于其大鼠的序列被保存，而未编码序列保存较少。

2.2.睫状神经营养性因子的机能性质

一系列生理效应已被认为是由于CNTF引起的。如上所述，CNTF最初被说成是作为支持E8鸡睫状神经节的神经元-一种副交感神经***的组分-存活的活性。对已知含有CNTF活性制剂的其它生物性质描述如下：

Saadat等人（1989，J.Cell.Biol.108∶1807-1816）观察到大鼠坐骨神经CNTF的最高程度提纯的制剂诱导了培养物中大鼠交感神经的胆碱能分化。还有，Hoffman（1988，J.Neurochem.51∶109-113）发现了由鸡眼衍生物的CNTF活性提高了视网膜单分子层培养物中胆碱-O-乙酰转移酶活性的水平。

Hughes等人（1988，Nature  335∶70-73）研究了由产期鼠视觉神经和脑衍生的培养物中两性潜势胶质先祖细胞的群体;已经显示出这些先祖细胞首先使产生少突神经胶质细胞并且随后产生2型星形细胞。在所采用的培养条件下，少突神经胶质细胞的分化看来是由一个少突神经胶质细胞2型星形细胞（0-2A）的先祖细胞直接形成的，而2型星形细胞的分化看来需要存在一种类似于或等同于CNTF的诱导蛋白质（也可参见Anderson，1989，Trends  Neurosci.12∶83-85）。

Heymanns和Unsicker（1979，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.4∶7758-7762）观察到，成神经细胞瘤的细胞提取物的高速上清液产生类似于与来自鸡眼或大鼠坐骨神经的CNTF活性相关的那些效应;表明了与CNTF类似但不等同（就分子量而言）的蛋白质的存在。

Ebendal（1987，J.Neurosci.Res.17∶19-24）研究了多种大鼠和鸡组织中的类CNTF活性。他观察到在相当广范围的大鼠中的类CNTF活性，但在鸡组织中未观察到;发现了鼠肝、脾T细胞和下颌腺细胞与低水平的CG存活启动活性有关，而心脏、脑、和骨骼肌肉组织与较高存活启动活性有关。在所试验的组织中，观察到最高的类CNTF活性与鼠肾有关。

尽管上述研究已表明，许多组织和细胞提取物含有支持也响应CNTF的神经元种群存活的活性（即它们支持在组织培养生物检定中E8鸡睫状节神经元的存活），但不能认为单个或等同的蛋白质是可响应这些活性的。如成纤维细胞生长因子（FGFG）这一家系所示（Dionne  et  al.，1990，EMBO  J.9∶2685-2692），例如，一系列不同的多肽或蛋白质在单独生理学检定中具有相同的生理学活性。

最初发现了鸡眼和大鼠坐骨神经CNTF的神经元特异性与响应NGF的神经元群体有某些重叠。尽管观察到了CNTF与NGF具有某些重叠的神经元特性，但在研究发育的神经元群体中CNTF和NGF的作用时，它们之间的区别特征变得最为明显（Skaper  and  Varon，1986，Brain  Res.389∶39-46）。除了在发育时它们的不同作用外，也可以根据分子量、等电点、不能被NGF抗体失活以及根据CNTF支持CGF神经元体外存活的能力将CNTF与NGF区分开（Barbin  et  al.，1984，J.Neurochem.43∶1468-1478）。Lin等人（1989，Science  246∶1023-1026）已经报导了CNTF没有与任何现有技术报导过的蛋白质同源的序列。Sendtner等人（申请号为07/570  651，名称为“Ciliary  Neuro-trophic  Factor”，申请日为1990年8月20日的美国专利申请）观察到重组体CNTF启动中背部和腹部脊髓神经元的存活，还有提纯的大鼠坐骨神经CNTF看来防止了新生大鼠损伤的面神经（第七脑神经）中运动神经元的细胞死亡（Sendtner  et  al.，1990，Nature  345∶440-441）。

使用重组体DNA技术，CNTF的克隆与表达导致了一系列CNTF活性的发现。

2.3.生长因子受体

一系列作为引起结合和响应蛋白质因子媒介的受体在近几年内已被表征和分子克隆，包括胰岛素、血小板衍生的生长因子、表皮生长因子及其相关物、成纤维细胞生长因子、和各种白细胞间素以及造血生长因子的受体。最近的资料显示了，某些受体可与多种（相关的）生长因子结合，而在其它场合，相同的因子可作用在多种（相关的）受体上（例如Lupu  et  al.，1990，Science  249∶1552-1555;Dionne  et  al.，1990，EMBO  J.9∶2685-2692;Miki  et  al.，1991，Science  251∶72-75）。大多数结合蛋白质因子的受体可广泛地被表征为具有对特定地结合因子可响应的胞外部分，跨越细胞膜的横跨膜区域，和胞内区域，该区域在蛋白质因子结合到受体的胞外部分上时经常包含在起始信号转导中。有意义的是，尽管许多受体是由单一多肽链组成，但其他受体显然需要（至少）二个独立亚单位以便结合到其具有高亲合性的因子上并在结合后可以机能响应（例如Hempstead  et  al.，1989，Science  243∶373-375;Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157）。给定受体的胞外和胞内部分经常与其它受体相应区域都具有共同的结构主题（motif），表示了不同受体之间的进化和机能关系。这些关系经常是相当远的并可能完全地反映某种普通区域结构的重复使用。例如，多种结合独立的因子的不同受体利用其胞外部分中的“免疫球蛋白”区域，而其他受体利用其因子结合区域中的“细胞活素受体”区域（例如Akira  et  al.，1990，The  FASEB  J.4∶2860-2867）。大量具有不同胞外结合区域（该区域从而结合了不同因子）的受体含有为在响应因子结合中所活化的酪氨酸特性蛋白质激酶编码的相关胞质内区域（例如，Ullrich  and  Schlessinger，1990，Cell  61∶203-212）。因子结合使信号转导过程“活化”的机理是难于理解的，甚至在受体酪氨酸激酶的场合下也是如此。在其他受体中胞内区域编码未知机能的区域或者结合组分与未知机能的第二种蛋白质相联（例如Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157），这样信号转导的活化甚至更难理解。

3、发明概述

本发明涉及CNTF受体（CNTFR）基因和蛋白质。它部分地基于在转染的COS细胞中人体CNTFR基因及其表达的克隆和特征化。

本发明提供了编码CNTFR的核酸序列以及由此衍生的片段。本发明还提供了基本上提纯的CNTFR蛋白质，以及其肽片段。

本发明的另一方面是，可以利用CNTFR探针，包括核酸以及抗体探针，鉴别CNTFR相关的分子。例如，本发明提供了这样的分子，它们与CNTFR形成复合体并从而参与CNTFR机能。另一个例子是，本发明提供了受体分子，它们与CNTFR在抗原上是同源的或交叉反应性的，但不相同。这些特定的实施方案是基于这样的发现，CNTFR与其他生理学上相关分子具有同源现象，包括：特别应提到的是IL-6受体，但还有PDGF受体、CSF-1受体、促乳素受体、IL-2和IL-4受体、GM-CSF粒细胞巨噬细胞群体刺激因子受体、妊娠特异α1-β糖蛋白、以及癌胚抗原-种肿瘤标志。

本发明还提供了检测CNTF活性的分析***，包括表达高水平CNTFR，并从而对甚至极低浓度的CNTF或类CNTF分子都非常敏感的细胞。

此外，本发明提供了为研究CNTF生理学作用的试验模型***。这些***包括动物模型，比如（ⅰ）暴露在循环CNTFR肽中的动物，这些肽和细胞受体争夺CNTF结合并从而造成CNTF缺失的状态，（ⅱ）用CNTFR免疫的动物，（ⅲ）表达高水平CNTFR并从而对CNTF过敏的转基因动物;以及（ⅳ）使用干细胞技术衍生的动物，其中内生CNTFR基因是由基因组缺失的胚胎。

在本发明的再一个实施方案中，可以使用CNTFR探针鉴别响应正常或患病状态CNTF的细胞和组织。例如，患有CNTF相关紊乱的病人可以呈现出CNTFR表达的异常性。

此外，本发明的CNTFR基团和蛋白质可以在治疗上使用。例如，但不作为限定，可以使用循环CNTFR减少中心神经***损伤区域中CNTF的水平。另一方面，重组体CNTFR基因可以被***到得益于提高对CNTF灵敏度的组织中，如遭受肌萎缩侧胞壁增厚病人中的运动神经元。

4.附图说明

图1.A.使用标记配位体结合方法表达克隆的示意图。B.二次碘化抗体试验表明了，与用原生cDNA库转染的COS细胞的比较，许多COS细胞被用一轮淘盘分析（panning）后得到的DNA转染（在转染COS细胞的60mm平皿上进行放射自显影照相;每个黑斑表示表达CNTF结合位点的单个转染COS细胞）。C.如（B）所述的相同检验，但COS细胞是用非CNTFR编码质粒（负克隆）或CNTFR编码质粒（正克隆）转染的。示出的仅是每个平皿的小部分。D.用（C）的负克隆或正克隆转染的COS细胞的用荧光激活细胞分类术（FACS）分析的结果。

图2.CNTFR编码cDNA的核酸序列（SEQ  ID  NO：1）和导出的氨基酸序列（SEQ  ID  NO：2）。

图3.显示类免疫球蛋白区域和类细胞活素受体区域的同源性的人体CNTFR的排列。左边的数字表示由第一甲硫氨酸开始的氨基酸数目。等同的残基和保留的替代物用方框标记。***间隙以达到最大同源。IL-6＝白细胞间素6;CEA＝癌胚抗原，PDGF＝血小板衍生的生长因子，CSF-1＝集落刺激因子1;α1-β  GD＝α1β糖蛋白，PRL＝促乳素，EPO＝***;IL-2＝白细胞间素2;IL-4＝白细胞间素4，GM-CSF＝粒细胞巨噬细胞集落刺激因子。

图4.CNTFR和其他相关受体之间的结构关系。人体IL-6受体和CNTFR具有一个融合在所提出的因子结合区域末端上的免疫球蛋白区域。一个短酸链（之字形线）连接球状免疫球蛋白和所提出的因子结合区域。如本文中所讨论的，所提出的类似于gp130的蛋白质显示出与CNTFR联接。HuGRHR-人体激素受体;RbPRLR-免促乳素受体;MoEPOR-小鼠***受体;HuIL2Rβ-人体白细胞间素-2受体β-链;HuIL6R-人体白细胞间素6受体;HuCNTFR-人体睫状衍生的神经营养性因子受体;C-半胱氨酸;X-未知氨基酸;W-色氨酸;S-丝氨酸;F-苯丙氨酸。

图5.CNTFR讯息的组织定位。如8.1.节所述由大鼠的指定组织中制得RNA。如8.1.节所述由在pCMX中含有这些基团的表达构成物中衍生的CNTFR的DNA片段。组织：小脑（CD）;后脑（HB）;中脑（MB）;丘脑（TH/HYP）;纹状体（STRI）;海马B（HIP  B）;海马A（HIP  A）;皮层（CORT）;嗅球（OLF）;成年脑（ADBR）;皮肤（SK）;心脏（HRT）;肌肉（MUS）;肺（LUNG）;肠（INT）;肾（KID）;肝（LIV）;脾（SPL）;胸腺（THY）;E17肝（E17LIV）。

图6.含有hCNTF-R基团***物的pCMX。在共同待批申请中pCMX的构成。

图7.骨骼肌肉中CNTF受体表达的Northern印迹分析。在每一行中试验10μg总RNA。行1，小鼠成肌细胞系C2C12mb;行2，小鼠管状肌细胞系C2C12mt;行3，大鼠管状肌细胞系C2C12mt;行4，大鼠管状肌细胞系L6mt;行5，大鼠比目鱼肌;行6，大鼠趾长伸（EDL）肌;行7，除神经支配的骨骼肌;行8，提纯的人体管状肌;行9，骨骼肌（这一RNA试样被降解）;行10，成年大鼠小脑;行11，假手术比目鱼肌;行12，72小时除神经支配的大鼠比目鱼肌;行13，假手术的EDL肌;行14，72小时除神经支配的EDL肌。

图8.经受外科神经切除术的右后肢的解剖图。

图9.UNOP＝来自动物组1（表Ⅳ）未手术的比目鱼肌;实心条表示右侧以及点画条表示左侧;NONE＝来自动物组2的损伤的（除神经支配的，右侧）和对照（假手术的）比目鱼肌而没有经过任何注射液;ALB＝来自动物组6用PBS/BSA（SC）处理的损伤的（右侧）和对照（左侧）比目鱼肌;CNTF＝来自动物组5用CNTF/BSA（SC）处理的损伤的（右侧）和对照（左侧）比目鱼肌。实心条：损伤的;点画条：对照。

5.发明的详细描述

为了清楚地描述本发明，但不是作为限定，本发明的详细说明将分为如下几部分：

（ⅰ）克隆CNTF受体;

（ⅱ）核酸编码CNTF受体;

（ⅲ）CNTFR肽;

（ⅳ）CNTF受体的表达;

（ⅴ）鉴别与CNTF受体相关的分子;以及

（ⅵ）本发明的应用。

5.1.克隆睫状神经营养性因子受体

本发明能够通过提供一种选择表达CNTFR的靶细胞的方法克隆CNTF受体（CNTFR）。通过提供一种富集CNTFR编码序列的手段，本发明能够提纯CNTFR蛋白质和直接克隆CNTFR编码DNA。

例如，可以选择含有CNTFR的靶细胞，以及CNTFR蛋白质可以使用本专业领域普通技术人员公知的提纯受体分子的方法提纯。例如，但不是作为限定，如下述5、6.3节所述CNTF或附着在可检测的分子上的CNTF（CNTF/标记），可以可逆地交联在靶细胞上，其中标记可以是放射性标记、抗原定子、或抗体，这里仅举几例;并且可以将连接来自所述靶细胞蛋白质的细胞膜进行提纯。这些提纯方法可以包括SDS-PAGE，紧接着检测凝胶中CNTF或CNTF/标记的位置;例如，可以使用放射性标记的CNTF，并且交联到其受体上，可以在凝胶中通过放射自显影照相被观察到。另一方面，可以在Western印迹技术中使用抗CNTF或抗标记抗体以鉴定在这些凝胶中的CNTF/受体复合体的位置。可以利用初步凝胶电泳法分离足够量的蛋白质以实现受体的肽片段的氨基酸定序或使能够制备可用以提纯靶细胞提取物中CNTFR分子的抗CNTFR抗体。由提纯的CNTFR得到的氨基酸序列可用于设计简并低核苷酸探针，这些探针可被用于鉴定CNTFR编码克隆基因组DNA库或较佳的是克隆入一个由CNTFR产生的靶细胞构成的cDNA库的核酸。

另一方面，CNTFR可以通过扣除杂交方法被克隆，其中mRNA可以由表达CNTFR的靶细胞制备，并且然后可以通过使mRNA（或由其制得的cDNA）与由不能表达CNTFR的细胞，如神经元细胞衍生的mRNA或cDNA杂交扣除非CNTFR编码序列。扣除后剩余的核酸可容易地富集在CNTFR编码序列中。

较佳的是，由CNTFR的内源表达和/或由如上所述讨论的扣除技术，从富集在CNTFR编码序列中的靶细胞制得的核酸也可以被用于表达克隆技术中以直接克隆CNTFR。例如，但不是作为限定，可以制备来自表达CNTFR的靶细胞的总基因组DNA并随后将其转染入不能表达CNTFR并较佳的是由靶细胞物种中不同物种所衍生的细胞系中（例如，来自人体CNTFR编码细胞的DNA可以被转染入小鼠细胞，如一种L细胞中）。尽管较少数量的转染细胞可以表达CNTFR，但这些细胞可通过如下文5、6.3.节所述的丛生（rosetting）技术或免疫荧光技术被鉴定并可以通过例如本专业领域中普通技术人员公知的荧光激活细胞分类术或利用抗体偶联磁珠或淘盘分析（panning）技术分离。可以通过由转染子制备基因组库，然后分离并繁殖这些既含有与CNTFR氨基酸序列一致的序列，又含有与物种特定基因元素同源序列的克隆，从而由受体产生的转染子中克隆CNTFR编码DNA;例如，可以通过在整个人体基因组中以高频率分布的Alu重复序列鉴定人体DNA。例如，但不是作为限定，可以选择繁殖含有编码CNTFR并表达人体CNTFR的转染的人体DNA的培养的非人体细胞，然后可以利用由这些细胞制得的基因组DNA转染培养的非人体细胞，并可以选择CNTFR表达细胞。这一工艺可以重复;其目的是用每一转染步骤以减少在CNTFR编码细胞中存在的人体DNA的量。因此，当转染的表达细胞的人体CNTFR的基因组DNA被克隆以产生信息库时，在已进行重复转染时包括人体DNA（已被鉴定，例如通过对明显的人体序列元素筛选）的克隆更可能含有CNTFR编码序列。

来自CNTFR表达细胞素或组织源的RNA或由这一来源得到的cDNA表达库可以通过直接注射以集合物形式被引入爪蟾属（Xenopus）***中;用编码CNTFR的集合物注射的***可通过对机能响应的检测（例如离子流）被鉴定，机能响应可通过将这些***暴露在CNTF中，或者另一种方法是通过检测在这些注入的***表面上存在的CNTF结合位点而被诱导。重复地将确定的集合物分成越来越小的集合物可导致鉴定编码CNTFR的个体克隆。

另一方面，cDNA表达库可以由载有靶细胞的CNTFR衍生并随后被用于瞬时表达检测中。在本发明的一个较佳实施方案中，所述的表达库可以结合SV40复制源并使用COS细胞进行瞬时表达检测。可以如上所述检定CNTFR表达转染子，并可以使用标准方法恢复CNTFR编码DNA。然后可以使用如对核酸编码CNTF所述的方法繁殖编码CNTFR的核酸序列和/或将其用于表达***中，如Sendtner等人在申请号为07/570  651，名称为“Ciliary  Neurotrophic  Factor”，申请日为1990年8月20日的美国专利申请中所描述的。

在下文6.节（见图1）举例说明的本发明的一个特定实施方案中，可以如下述进行CNTFR的表达克隆。可以由表达CNTFR如SH-SY5Y的细胞系或组织制备cDNA库，以使cDNA被***表达载体中。然后可使用例如DEAE/氯喹转染操作技术将这一库转染入合适的细胞系中，比如COS  M5细胞中。转染后几天，可以将这些细胞从其培养皿中分离并使其进行Aruffo/Seed淘盘分析（panning）步骤（Seed  and  Aruffo，1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶365-3369），同时有如下的改变：

（ⅰ）可以首先用标记的CNTF（例如CNTF真菌（myc））在将这些细胞在冰上培养约30分钟，通过磷酸盐缓冲盐水（PBS）/2%Ficoll离心分离以除去过量配位体，然后用抗标记抗体（例如抗真菌抗体9E10）在冰上培养约30分钟，而不是用抗受体抗体培养转染的细胞。

（ⅱ）然后可以将这些细胞通过PBS/2%Ficoll离心分离并随后在涂有能识别抗标记抗体的抗体（例如，如果抗标记抗体是9E10，则为抗小鼠抗体）的平板上“淘盘分析（panned）”。

然后，在从平板上洗去未粘附细胞后，可以由粘附细胞制得Hirt上清液，并可以在有约10-20μg  tRNA存在下沉淀质粒DNA。然后可以通过标准技术，包括但不限于，电穿孔将得到的质粒DNA引入合适的细菌（例如DH10  B细菌）中。然后由转化的细菌生长的培养物可用于制备另一轮真核细胞转染和淘盘洗选的质粒DNA。在第二次转染、淘盘洗选和质粒DNA制备及转化后，可以在选择性培养基上平皿培养出细菌转化体，可收集个体菌落并用于制备质粒DNA，由一系列这些克隆制得的DNA可分别用于COS细胞转染。另一方面，在测试个体菌落之前可能需要更多轮次的富集。可通过一系列技术，包括但不限于，使用放射性活化标记或荧光标记指示剂抗体的直接粘合试验可以鉴定生成的表达CNTF结合位点的COS细胞。一个CNTFR编码核酸的例子被包括在图6的pCMX-hCNTFR（Ⅰ2）中，它被保藏在NRRL，保藏号为B-18789，并由Davis和Yan-copoulos公开在申请号为，名称为“Mammalin  Expres-sion  Vector”的美国专利申请中。然后可通过使用标准技术的限制性片段绘图和核酸定序分析用这一方法鉴别的克隆。然后可以利用标准杂交技术使用CNTFR编码cDNA片段以鉴定含有例如来自基因组DNA库的CNTFR基因的基因组DNA序列。

一旦得到后，可以利用现有技术中任何已知的方法克隆或亚克隆CNTFR基因。可以使用现有技术中已知的大量载体-宿主***。可能的载体包括，但不限于，粘粒、质粒或变异的病毒，但该载体***必须与使用的宿主细胞是可亲和的。这些载体包括，但不限于，噬菌体比如λ衍生物，或质粒如pBR322、pUC、或Blue script

（Stratagene）质粒衍生物，可以通过转化、转染、感染、电穿孔等将重组体分子引入宿主细胞。

可以将CNTFR基因***能用于转化、转染或感染合适的宿主细胞的克隆载体内，以使产生许多拷贝基因序列。这可以通过将DNA片段连接在具有补充粘性末端的克隆载体中而实现。然而，如果在克隆载体中不存在用于把DNA分为片段的补充的限制性位点，则DNA分子的末端可以在酶活性上被修饰。它证明了将限制性核酸内切酶***位点结合到用于聚合酶链式反应的低核苷酸引物上以促进***到载体中这一优点。另一方面，可通过将核苷酸序列（衔接物）连接到DNA末端上制得所需的任何位点;这些连接衔接物可以包含特定的化学合成的低核苷酸编码的限制性核酸内切酶识别序列。在一可选择的方法中，可以通过均聚谱尾而修饰***的载体和CNTFR基因。

在特定的实施方案中，含有结合一种分离的CNTFR基因、cDNA、或合成的DNA序列的重组体DNA分子的宿主细胞的转化可以产生多个拷贝基因。因而，通过生长转化体，从转化体中分离重组体DNA分子，以及必要时从分离的重组体DNA中收回***的基因，可以大量得到该基因。

5.2.核酸编码睫状神经营养性因子受体

利用上文详述的以及下文6.节的实施例中的方法，测定了以下核酸序列，并推导了相应的氨基酸序列。图2中描绘了人体CNTFR的序列（SEQ  ID  NO：1）。按照本发明可以使用这一序列，其机能等价物，或长度至少为6个核苷酸的这一序列的片段。此外，本发明涉及由猪、羊、猫科动物、鸟类、马、或犬以及灵长类来源和任何存在CNTF活性的物种中分离出的CNTFR基因。含有CNTFR序列的可杂交部分的亚序列可以用于例如在核酸杂交检测、Southern和Northern印迹分析等中。

例如，图2（SEQ  ID  NO：1）中描绘的核酸序列可以通过提供编码机能上等价分子序列的突变，如取代、附加或缺失而改变。按照本发明，一种分子如果具有结合CNTF的能力，则该分子与具有图2（SEQ  ID  NO：1）所描绘序列的分子比较是机能上等价或活性的，但它不必结合具有与天然CNTFR相似的亲合力的CNTF。由于核苷酸编码序列的退化，在本发明的实践中可以使用编码基本上如图2（SEQ  ID  NO：2）中所描绘的相同氨基酸序列的其他DNA序列。这些序列包括，但不限于含有全部或部分图2（SEQ  ID  NO：2）中所描绘的CNTFR基因的核苷酸序列，该基因是通过取代在序列范围内编码机能上等价的氨基酸残基的不同密码子而被改变的，因而产生不活动变化。

此外，可以巧妙地设计本发明的重组体CNTFR编码核酸序列，以使修饰CNTFR的加工和表达。例如，但不是作为限定，CNTFR基因可与启动子序列和/或核蛋白体结合位点结合，或者可以在CNTFR编码序列上游***信号序列以使分泌CNTFR并由此促进收获或生物利用率。

此外，给定的CNTFR可在体外或体内突变以建立和/或破坏转译、起动、和/或终止序列，或者在编码范围内建立变异体和/或形成新的限制性核酸内切酶位点或破坏预先存在的位点，以促进体外进一步修饰。可使用现有技术中已知的任何诱变技术，包括但不限于，体外定位点诱变（Hutchinson et al.，1978，J.Biol.Chem.253∶6551），使用TAB

衔接物（Pharmacia）等。

5.3.睫状神经营养性因子受体肽

本发明还提供具有上述图2（SEQ  ID  NO：2）中的氨基酸序列的CNTFR蛋白质、片段及其衍生物或其机能等价物以及提供与这种蛋白质同源的蛋白质（这种同源性至少为约30%）。本发明还提供包含至少6个氨基酸、包含一种抗原定子、或功能上是活性的CNTFR蛋白质的片段或衍生物。具有图2（SEQ  ID  NO：2）所描绘的氨基酸序列的CNTFR蛋白质分子量约为42kd。

本发明的CNTFR蛋白质、或片段或其衍生物包括，但不限于，作为原始氨基酸序列含有全部或部分基本上如图2所描绘的氨基酸序列的物质，包括其中用机能上等价的氨基酸残基取代序列内的残基导致不活动变化的变更序列。例如，序列范围内的一种或多种氨基酸残基被作为机能等价物的另一种类似极性的氨基酸所取代，导致不活动变更。可以由其他氨基酸所属类的成员中选择序列范围内的氨基酸的取代物。例如，非极性（疏水）的氨基酸包括丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、缬氨酸、脯氨酸、苯丙氨酸、色氨酸和甲硫氨酸。极性中性氨基酸包括甘氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、酪氨酸、天冬胺酸和谷氨酸胺。正电荷（碱性）氨基酸包括精氨酸、赖氨酸和组氨酸。负电荷（酸性）氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸。在本发明的范围内还包括例如通过磷酸化、糖基化、交联、酰化、蛋白水解***、键合在一种抗体分子、膜分子或其他配位体上，在转译期间或之后分别地修饰的CNTFR蛋白质或片段或其衍生物（Ferguson  et  al.，1988，Ann.Rev.Biochem.57∶285-320）。

本发明的CNTFR肽可以通过重组体核酸表达技术或通过利用标准肽的合成技术化学合成而制得。

5.4.睫状神经营养性因子受体的表达

为了表达重组体CNTFR，对CNTFR蛋白质编码的核苷酸序列，或其一部分可以被***合适的表达载体中，即一种含有转录和转译该***蛋白质编码序列的必要元素的载体。必要的转录和转译信号也可由天然CNTFR基因和/或其侧面区域提供。可以使用多种宿主-载体***以表达蛋白质编码序列。这些***包括，但不限于，感染病毒（例如，牛痘病毒、腺病毒）的哺乳动物细胞***;感染病毒（例如杆状病毒）的昆虫细胞***;微生物、如含有酵母载体的酵母、或用噬菌体DNA、质粒DNA、或粘粒DNA转化的细菌。这些载体的表达元素在其强度及特异性方面不同。根据所用的宿主-载体***，可以使用任-系列合适的转录和转译元件。

在本发明的一个较佳具体实施方案中，CNTFR基因可以包含在保藏在NRRL中、指定的保藏号为No.B-18790的pCMX表达载体中。

可以使用为将DNA片段***载体中的上述任何方法以构成含有由转录/转译控制信号和蛋白质编码序列组成的嵌合基因的表达载体。这些方法可包括体外重组体DNA和合成技术以及体内重组（基因重组）。编码CNTFR蛋白质或肽片段的核酸序列的表达可以由第二种核酸序列调节以使CNTFR蛋白质或肽在用重组体DNA分子转化的宿主中被表达。例如，可以由现有技术中已知的任何启动子/强化因子控制CNTFR的表达。可以用于控制CNTFR表达的启动子包括，但不限于，SV40早期启动子区域（Bernoist  and  Cham-bon，1981，Nature  290∶304-310）、CMV启动子、在劳氏肉瘤病毒的3′末端复制中所含的启动子（Yamamoto，et  al.，1980，Cell  22：787-797）、疱疹胸苷激酶启动子（Wagner  et  al.，1981，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.78∶144-1445），金属硫堇基因的调节序列（Brinster  et  al.，1982，Nature  296∶39-42）;原核表达载体，如β-内酰胺酶启动子（Villa-Kamaroff，et  al.，1978，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.75∶3727-3731），或tac启动子（DeBoer，et  al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80∶21-25），还可参见“Useful  proteins  from  recombinant  bacteria”in  Scientific  American，1980，242∶74-94;来自酵母或其他真菌的启动子，如Ga14启动子、ADC（醇脱氢酶）启动子、PGK（磷酸甘油酸激酶）启动子、碱性磷酸酶启动子、以及以下呈现组织特异并用于转基因动物的动物转录控制区：在胰腺泡细胞中活性的弹性蛋白酶Ⅰ基因控制区（Swift  et  al.，1984，Cell  38：639-646;Ornitz  et  al.，1986  Cold  Spring  Harbor  Symp.Quant.Biol.50∶399-409;MacDonald，1987，Hepa-tology  7∶425-515）;在胰β细胞中活性的胰岛素基因控制区（Hana-han，1985，Nature  315∶115-122），在淋巴样细胞中活性的免疫球蛋白基因控制区（Grosschedl  et  al.，1984，Cell  38∶647-658;Adames  et  al.，1985，Nature  318∶533-538;Alexander  et  al.，1987，Mol.Cell.Biol.7∶1436-1444），在睾丸、胸、淋巴样和肥大细胞中活性的小鼠乳汁病毒控制区（Leder  et  al.，1986，Cell  45∶485-495），在肝脏中活性的清蛋白基因控制区（Pinkert  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1∶268-276），在肝脏中活性的α-胎儿球蛋白基因控制区（Krumlanf  et  al.，1985，Mol.Cell.Biol.5∶1639-1648;Hammer  et  al.，1987，Science  235∶53-58）;在肝脏中活性的α1-抗胰蛋白酶基因控制区（Kelsey  et  al.，1987，Genes  and  Devel.1∶161-171），在髓样体细胞中活性的β-珠蛋白基因控制区（Mogram  et  al.，1985，Nature  315∶338-340;Kollias  et  al.，1986  Cell  46∶89-94），在脑的少突神经胶质细胞中活性的髓磷脂碱性蛋白基因控制区（Readhead  et  al.，1987，Cell  48∶703-712）;在骨骼肌中活性的肌球蛋白轻链-2基因控制区（Sani，1985，Nature  314∶283-286），以及在下丘脑中活性的促性腺释放激素基因控制区（Mason  et  al.，1986，Science  234∶1372-1378）。

含有CNTFR基因***体的表达载体可用三个普通方法鉴定：

（a）DNA-DNA杂交，（b）“标记”基因官能的存在或缺失，以及（c）***序列的表达。首先，***到表达载体中的异源基因的存在可通过使用含有与***的CNTFR基同源序列的探针进行DNA-DNA杂交来探测。第二步，重组载体/宿主体系可依据由于把异源基因***到载体中而引起的某些“标记”基因官能（例如胸苷激酶活性抗生素抗性、转型表型、在杆状病毒中闭合体（occlusion  body）的形成等）的存在或缺失进行鉴定和选择。例如，如果把CNTFR基因***到载体的标记基因序列内部，含有CNTFR***体的重组体可用标记基因官能的缺失来鉴定。第三步，重组体表达载体可通过分析由重组体表达的异源基因产物进行鉴定。这种分析可以例如通过使受体连接到CNTF上或者直接识别CNTFR的抗体上而依据于例如CNTFR基因产物的物理或官能性质。

在另一实施方案中，不能正常表达CNTFR的细胞可以用重组CNTFR编码的核酸转染然后通过把转染子暴露在CNTFR下并且随后测定cAMP水平的增加来测定官能CNTFR的表达。

一旦一个特定的重组DNA分子被鉴定和分离，就可使用本领域已知的几种方法使之繁殖。一旦建立起一个适当的宿主体系和生长条件，重组表达载体就可以大量地繁殖和制备。如前所述，可以使用的表达载体包括下列载体或其衍生物：人或动物病毒，比如牛痘病毒或腺病毒;昆虫病毒，比如杆状病毒;酵母载体;噬菌体载体（例如λ），以及质粒和粘粒DNA载体，这里仅举几例，并不限于这些。

此外，可以选择一种宿主细胞株以便调整***序列的表达或以希望的具体方式修饰并加工基因产物。从某些特定启动子的表达可以在某些诱导物的存在下得以提高;从而遗传基因化的CNTFR蛋白质的表达可以被控制。而且，不同宿主细胞有其特定和具体的机理进行蛋白质的转译和转译后的加工和修饰（例如糖基化、***）。τ以选择合适的细胞系或宿主体系以保证对被表达的异种蛋白质进行所希望的修饰和加工。例如，可以使用在细菌体系中的表达以生产未糖基化的核心蛋白质产物。在酵母中的表达可用于生产糖基化的产物。在哺乳动物细胞中的表达可用于保证异种CNTFR蛋白质的“天然”糖基化。而且，不同的载体/宿主表达体系可以使加工反应比如蛋白水解***进行到不同的程度。

一旦一种表达CNTFR基因的重组体被鉴定，就应进行基因产物的分析。这可通过基于产物的物理或官能性质的分析来实现。

一旦CNTFR蛋白质被鉴定，就可利用下述标准方法将之分离和纯化，这些标准方法包括色谱法（例如离子交换、亲和性、以及分级柱色谱法）、离心法、差示溶解度法或任何其他纯化蛋白质的标准方法。特别是，CNTFR蛋白质可以通过连接到一含有连接到一个固定支撑上的CNTF的亲和柱而进行分离。

还制备了与DNA或RNA序列编码的CNTFR或其官能活性部分互补的核酸序列。一种特定情况是，可以合成反意低核苷酸，它与至少一部分CNTFR  mRNA是互补的。

5.5.与睫状神经营养因子受体有关的分子的鉴定

已经定义了多个受体因子体系，其中同一因子能够连接到多个受体上（如上文所述）。对CNTF情况也是如此，本发明可以通过与用于获得这里描述的CNTFR相同的步骤来鉴定任何其它的CNTFR受体，但用于制备cDNA表达库的RNA源除外。可以选择能够容易地表达不同CNTF受体的源;可以在对CNTFR没有作用的CNTF连接存在下对源进行评估（从CNTFR序列产生的基因探针和抗体试剂可用于把在细胞系或组织源中造成CNTF连接的蛋白质与在此描述的CNTF进行比较）。此外，因为已知受体连接到多于一个的相关因子上（如上文所述），CNTFR的鉴定也应能够鉴定任何其它连接到该受体上的天然配位体。

本发明的另一方面是，CNTFR序列可用于鉴定与CNTFR相关的分子。CNTFR含有与多种其它受体所共有的主题。CNTFR的细胞外部分既在其N末端含有一个“免疫球蛋白”域又含有一个“细胞活素受体”区域，二者由一短的绞合区分开。尽管许多受体同源于“免疫球蛋白”或“细胞活素受体”，但是仅仅有一种受体-IL-6受体-与CNTFR具有相同的这些域的特定排列。因此IL-6受体是与CNTFR最相关的蛋白质。令人感兴趣的是，IL-6受体有一个非常短的胞质内域，这与CNTFR也是类似的，这种胞质内域明显地对起动IL-6连接响应是不必要的（Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157）。最近，IL-6受体的一种新型信号转导体，称为gp130，被分子克隆。这种转导体本身并不连接IL-6，但是它确实为IL-6受体赋予高亲和力连接，并且需要它来转导IL-6信号（Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157）。CNTFR的克隆表明它与IL-6受体具有共同的重要特征，这些特征在其它已知受体中没有发现，从而定义了受体的一个新家系。如本发明所定义的，该受体家系中前两个成员的同源性可经如下方法用于鉴定其它相关受体，即利用DNA或者相应于同源区的抗体探针，或者同时使用聚合酶链式反应方法和相应于氨基酸同源性的共有区的简并低核苷酸（例如  Maisonpierre  et  al.，1990，Science  247∶1146-1451）。本发明也可用于测试CNTFR是否使用与IL-6受体相同的信号转导体，或者它是否使用相关的分子。最后，CNTFR相关的受体的鉴定有助于与这些受体连接的新型配位体的鉴定。

按照本发明，通过用相应于如图2（SEQ  ID  No：1）所示的或者从蛋白质序列数据或者从核酸序列衍生出的CNTFR序列的低核苷酸筛选DNA库（包括基因组DNA或者更好地是cDNA），以便为上述家系的新成员编码的克隆可以被鉴定。通过降低杂交的严格性，可以使对该家系中略有差别的成员的鉴定机会增加。也希望使用基本上与已定序的该家系中成员所共有的序列;这些高度保存区在鉴定该家系中其它成员时是特别有用的。库的筛选可以通过使用例如Benton和Davis（1977，Science  196∶180）或者Grunstein和Hogness（1975，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.72∶3961-3965）的杂交技术来进行。然后对用杂交鉴定的克隆可进一步分析，并且新成员可以按照本领域熟知的方法通过限制性片段绘图（mapping）和定序技术进行鉴定。

希望使用聚合酶链式反应（PCR）技术（Saiki  et  al.，1985，Science  230∶1350-1354）来鉴定CNTFR总家系中的其它成员。例如，相应于已知CNTFR序列的有意和反意引物可用在PCR中，较佳地是使用cDNA作为模板。希望制备这些引物以便使之包括限制性酶***位点，这些***位点可促进把PCR的产物***到适当的载体中然后对新成员可以选择所得到的克隆。这种选择可使用标准技术来实现，包括用相应于已知序列的探针的杂交分析。例如，如上所述，可以使表示一种特征化的CNTFR蛋白质的不同区的一系列探针在低严格性下被杂交到载有来自由PCR产生的克隆的双层过滤器上。观察到，各种克隆可以杂交某些探针但不能杂交其他探针。家系中新成员也可以通过增加杂交条件的严格性而被鉴定，其中与从已知成员中衍生出的探针不同的新成员在高严格性下会杂交得不太强烈。另外，家系中新成员可以使用标准技术通过限制性绘图或者定序分析以揭示限制性图或者序列相对于已知成员的差别来鉴定。

在另一实施方案中，本发明提供了与CNTFR形成配合物从而参与CNTFR官能的分子。例如，业已发现，通过序列分析，CNTFR并不显示出具有胞质区域;事实上，它可以通过GPI键糖基磷脂酰肌醇结合到一薄膜上（在Ferguson  et  al.，1988，Ann.Rev.Biochem.57∶285-320中进行了描述）。这表明至少一种其它分子与CNTFR形成了群丛而通过细胞膜参与信号转导。这样一种分子可以是例如伴随IL-6R一起发现的一种蛋白质，比如GP130（Taga  et  al.，1989，Cell  58∶573-581）;从CNTFR和IL-6受体之间的同源性来看这种情况是特别可能的。与CNTFR在细胞膜上形成群丛的分子可用任何本领域已知的方法进行分离和鉴定，包括化学交联、与抗CNTFR抗体共沉淀、或者使用CNTF/标记、和/或使用蛋白质或类脂提纯技术，但并不限于这些方法。

此外，本发明提供了除CNTF之外的可与CNTFR连接的分子。这些分子定义为与CNTF竞争CNTFR连接的分子，包括其它常规配位体，这些分子包括肽、肽衍生物和非肽（例如类肽）化合物

5.6.本发明的用途

5.6.1.测定***

本发明提供了测定***，在其中可通过测量在响应于CNTF的表达本发明CNTF分子的细胞或细胞系中对CNTF的生理响应来检测由于暴露于肽或非肽化合物中而产生的CNTF活性或类似于CNTF活性的活性。生理响应包括CNTF的任何生理效应，包括上面2.2节所述的、及某些核酸序列的转录活化（例如启动子/增强子以及结构基因）、与CNTF相关的加工、转译、或者磷酰基化、响应于直接地或间接地由CNTF诱导的过程的次级过程的诱导、以及形态变异、比如轴突芽殖、或者维持细胞比如睫状神经节细胞、运动神经元、蒲肯野氏细胞、或者海马神经元生存的能力，这里仅举几例，不限于此。

本发明的一个较佳的具体实施方案中，CNTF和CNTFR之间的官能反应可以通过检测在响应许多生长因子刺激的横跨膜的信号（包括但不限于c-fos和c-jun）时活化的“即刻早期”初次响应基因的生产量的增加来观察到。例如，即刻早期基因的活化可通过即刻早期基因mRNA水平的Northern印迹分析进行检测。本发明的一个较佳实施方案中，c-fos或c-jun  mRNA水平可通过由用CNTF培育的靶细胞制备的mRNA的Northern印迹分析来确定，其中CNTF活性用c-fos或c-jun水平的增加来证实。值得注意的是，在本发明的某一特定实施方案中，一旦生产出含有重组CNTFR编码核酸的靶细胞或通过与CNTF连接而进行选择，就希望保证靶细胞特征性地响应于CNTF或者具有类CNTF活性的化合物。在本发明的描述中，术语类CNTF活性是指与CNTF的活性类似但是可以相同也可以不同的生物活性;这些活性包括但不限于上述2.2节中描述的，或者具体的即刻早期启动子比如fos或jun启动子的活化。

本发明提供了新型的用于筛选CNTF活性或类CNTF活性的化合物的测定***。连接到CNTF上的靶细胞可通过与CNTFR编码的核酸转染来生产并可通过例如荧光激活细胞分类术、莲座细胞的沉淀、或者限制性稀释进行鉴定和分离，如下文5.6.3节所述。

一旦靶细胞系被生产和鉴定，就希望选择对CNTF异常敏感的细胞。这些靶细胞可带有大量的CNTFR;带有大量CNTFR的靶细胞可通过选择连接到高水平CNTF上的靶细胞进行鉴定，例如当细胞与CNTF/标记一起培养并进行免疫荧光分析时就产生数量相当大的荧光。此外，对CNTF异常敏感的细胞在响应CNTF连接时会显示出相当强的生物响应，比如即刻早期基因产物如c-fos或c-jun的突然增加。通过改进使用对CNTF相当敏感的靶细胞的测定***，本发明提供了筛选CNTF活性或类CNTF活性的方法，该方法能够检测低水平的CNTF活性。

特别是，使用重组DNA技术，本发明提供了设计成对CNTF高度敏感的CNTF靶细胞。例如，按照5.1节描述的方法克隆的CNTF-受体基因可以***到具有天然CNTF响应的细胞内，结果重组CNTFR基因以高水平被表达并且所得到的设计的靶细胞在其细胞表面上表达了大量的CNTFR。

换句话说，或者作为另一种情况，靶细胞可被设计成含有在响应CNTF/受体连接时被高水平表达的重组基因。这种重组基因较佳地是伴随有容易检测的产物。例如，但并限于此，来自即刻早期基因的转录控制区（即启动子/增强子区）可用于在一个可引入到靶细胞内的构建中控制报道基因的表达。即刻早期基因/报道基因构建当通过强启动子/增强子或高拷贝数目在靶细胞中以高水平表达时，就可用于产生一种放大的响应于CNTFR连接。例如，但并不限于此，具有CNTF响应的启动子（比如c-fos或c-jun启动子）可用于控制可检测的报道基因的表达，报道基因包括β-半乳糖苷酶、生长激素、氯霉素乙酰基转移酶、新霉素磷酸转酶乙酰、荧光素酶、或者β-葡糖苷酸酶。这些报道基因产物的检测对本领域的普通技术人员而言是熟知的，这种检测可作为医药化合物的CNTF活性或类CNTF活性的敏感指示剂。

上述的CNTFR编码或报道基因构建可以用本领域已知的任何方法***到靶细胞中。这些方法包括但不限于：转染、电穿孔、磷酸钙/DEAE葡聚糖方法、和细胞喷枪、以及带有上述构建作为转基因的转基因动物的生产，并且从其中可以使用上述的方法选择CNTF靶细胞。

本发明的测定***使得可有效地筛选用于治疗与CNTF相关疾病的医药化合物。例如，但不是作为限定，希望筛选CNTF活性的以及对小脑退化有治疗效果的医药试剂。本发明的一个具体实施方案中，响应CNTF的蒲肯野氏细胞可被鉴定和分离，然后在多井培养平皿的微＃中培养。加入了试验试剂或加入了CNTF的培养基可以无限稀度与适当的对照物一起加入到井中。然后检测到细胞的生存、轴突芽殖等得到提高，并可确定试验试剂和CNTF的活性以及它们的相对活性。另一个例子是，已经发现运动神经元病灶对CNTF为良性响应（Sendtner  et  al.，1990，Nature  345∶440）。因此希望鉴定能够在轴向切除术（axotomy）之后如同CNTF一样防止运动神经元死亡的类CNTF化合物。具有CNTF响应的运动神经元可用在测定***中以鉴定可用于治疗运动神经元疾病的化合物。已经发现CNTF可有效地在轴向切除术之后防止运动神经元细胞死亡，当企图治疗脊髓损伤、肌萎缩侧生胞壁增厚以及糖尿病神经病时，在设计能有效地治疗这些失调的药品时，包括通过血液大脑障碍层所需要的药品，上述发现很明显地是特别重要的发现。鉴于上述发现，关键是找到一种如本发明提供的方法的可靠且敏感的筛选***，又一个例子是，如果发现一种具体疾病与一具体组织中的有毛病CNTF响应有关，那么对疾病的合理治疗是为患者提供外生的CNTF。然而，希望研究出半衰期比内生的CNTF长，或者作为CNTF***，或者以一具体组织作为目标的分子。因此，本发明的方法可用于生产能够用于鉴定具有所希望的性质的分子的有效并敏感的筛选***。相似的测定***可用于鉴定CNTF拮抗物

5.6.2.实验模型***

本发明还提供了用于研究CNTF的生理作用的实验模型***。在这些模型***中，CNTFR蛋白质、肽片段或其衍生物可以或者加入到该体系中或者在该体系中制备。这些模型***可用于研究CNTF过量或CNTF缺失的影响。这些实验模型***可用于研究在细胞或组织培养基内、在整个动物体内、特别是在整个动物的细胞或组织内或者是组织培养体系内、或者是在CNTFR表达被可诱发或改进的调节启动子控制的实施方案中的一个具体时间间隔（包括胚胎发生过程）下对CNTF增强的或降低的响应的影响。本发明的具体实施方案中，CMV启动子可用于控制在转基因动物内CNTFR的表达。本文中术语“转基因动物”是指非人转基因动物，包括转基因嵌合体，非人转基因动物在其某些或全部细胞中带有转基因，它包括任何非人物种，并可用本领域中已知的任何方法生产，所说方法包括但不限于：显微注射、细胞融合、转染、电穿孔、等。例如，动物可以用接合子显微注射方法生产，比如在“Brinster  et  al.，1989，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.82∶4438-4442”中描述的。

本发明也对自身免疫疾病提供了在其中自身免疫直接响应于CNTFR的模型***。这些模型包括用致免疫量的CNTFR免疫了的并且较佳地能生产抗CNTFR抗体和/或细胞传递免疫性的动物。为了生产这样一种模型***，就希望将CNTFR与免疫佐药比如卡介苗（BCG）一起给药。

5.6.2.1.增强的CNTF活性的模型

例如，但不限于，可以制备用于研究过量CNTF活性的作用的实验模型***。在这样的***中，通过在模型***的细胞上设计增加数量的CNTFR可使其对CNTF的响应比没有如此设计的细胞增加。较佳的是选择性地在可正常表达CNTFR的细胞上增加CNTFR的数量。

细胞可通过用带有本发明的CNTFR基因的病毒感染而设计以使其CNTF的数量增加。此外，CNTFR基因可经转染而提供给细胞。

如果模型***是动物，那么重组CNTFR基因可通过用带有CNTFR基因的病毒感染而引入到动物的细胞中。此外，可以得到有CNTFR基因作为转基因的转基因动物。

为了保证CNTFR的表达，CNTFR基因应当置于适当的启动子序列的控制之下。希望把CNTFR基因置于组成型和/或组织特异性启动子的控制之下，启动子包括但不限于CNS神经元特异性烯醇酶、神经丝、和酪氨酸羟化酶启动子、一种可诱导启动子比如金属巯基组氨酸三甲内盐启动子、人免疫缺乏病毒长末端重复的UV活化的启动子（Valeri  et  al.，1988，Nature  333∶78-81）、或者CMV启动子（如下文中pCMX中所含有的）或者改进调节启动子。

通过增加细胞的CNTFR的数目，对内生CNTF的响应可被增强。如果模型***含有很少或不含有CNTF，那么就可把CNTF加入到该***中。还希望把其它CNTF加入到该模型***中以便提高过量CNTF活性的作用。过分表达CNTF（或分泌的CNTF）是较佳的用于研究对已经表达CNTFR的细胞CNTF的提高水平的作用的方法。更佳地是在所有细胞中表达CNTFR（一般表达）并确定随后是那些细胞为CNTF赋予官能响应，从而可能鉴定次级受体组分，如果有一个存在的话。

5.6.2.2.降低的CNTF活性的模型

另一方面，作为一个例子不是作为限定，可建立一个用于研究降低的CNTF活性的作用的实验模型***。该***可鉴定所需要的CNTF和表示可能的治疗目标的方法或神经元。在这样的***中，对CNTF的响应可通过提供不与细胞表面相关或者设计成对响应于CNTF的转导无效的重组CNTFR而降低。

例如，可把CNTFR蛋白质、肽或衍生物提供给该***以便使提供的受体可与内生的CNTFR竞争CNTF连接，从而减弱了对CNTF的响应，CNTFR可以是一种无细胞受体，它或者被加入到该***中或者由该***生产。例如，缺少横跨膜区域的CNTFR蛋白质可以用***内的细胞生产，比如无锚CNTFR可以从产生的细胞中分泌出来。另外，CNTFR蛋白质、肽或衍生物可以加入到***内的细胞外空间中。

本发明的另一实施方案中，重组CNTFR基因可用于经同源重组失活或“打出”内生基因，从而生产一种CNTFR缺失细胞、组织或动物。例如，但不是限定，重组CNTFR基因可设计成含有一种***突变例如neo基因而失活CNTFR。这样一种构建在适当的启动子控制下使用比如转染、转导、注射等技术而被引入到细胞中，比如胚胎干细胞。然后含有该构建的细胞可用G418抗性选择。缺少完整CNTFR基因的细胞然后可通过例如表达的Southern印迹或Northern印迹或测定未鉴定。缺少完整CNTFR基因的细胞然后可融合到早期胚细胞中以产生CNTFR缺失的转基因动物。这样一种动物与未表达内生CNTF的动物相比表明，或者两种表型完全匹配或者不完全匹配，意谓着其它类CNTF因子或受体的存在。

这样一种动物可用于定义具体的神经元种群或者任何其它活体过程，一般取决于CNTF。因此，如果动物不表达CNTFR从而不能响应CNTF，那么这些种群或过程就有希望发生。

另外，与内生受体竞争CNTF的重组CNTFR蛋白质、肽或衍生物可表达在***内的细胞表面上，但是可以设计成不能转导对CNTF连接的响应。

上述的重组CNTFR蛋白质、肽或衍生物可以类似于或不同于内生CNTFR对CNTF的亲合力的亲合力连接到CNTF上。为更有效地降低对CNTF的响应，CNTFR蛋白质、肽或衍生物较好的是以大于天然受体所显示出的亲合力的亲合力连接到CNTF上。

如果CNTFR蛋白质、肽或衍生物在模型***内产生，那么核酸编码的CNTFR蛋白质、肽或衍生物就可通过感染、转导、转染等或者作为转基因提供给该***。如上文所述，CNTFR基因可以置于适当的启动子的控制下，启动子可以是例如组织特异性启动子或是可诱导启动子或是改进调节启动子。

在本发明的一具体实施方案中，细胞的内生CNTFR基因可以通过同源重组被突变CNTFR基因取代。

在本发明的另一实施方案中，CNTFR表达可通过提供CNTFR表达细胞而降低，该细胞含有其含量足以降低CNTFR蛋白质表达的CNTFR反意RNA或DNA。

5.6.3.诊断用途

按照本发明，CNTFR探针可用于鉴定能响应CNTF的处于正常或有病状态的细胞和组织。本发明提供了用于鉴定能响应CNTF的细胞的方法，包括检测在这些细胞中CNTFR的表达。CNTFR表达可通过CNTFR  mRNA的转录或者CNTFR蛋白质的生产来证实。CNTFR表达可使用鉴定CNTFR核酸或蛋白质的探针来检测。

一种可用于检测CNTFR表达的探针是核酸探针，它可用于利用本领域已知的任何方法检测CNTFR编码的RNA，这些方法包括但不限于：原位杂交、Northern印迹分析或PCR相关技术。

另一种可使用的探针是标记的CNTF，如在申请号为No.07/532  285的美国专利申请中描述的，在此将其全部内容加入本文中作为参考。

按照本发明，术语“标记的”CNTF是指连接到第2个可检测化合物（“标记”）上的CNTF分子。可检测化合物可包括放射性同位素、荧光基团、或者是能够连接到受体上的配位体、或者是可用比色法检测或具有催化活性的物质。在较佳实施方案中，标记可含有抗原定子以便抗体能够连接到标记上。在另一实施方案中，标记本身可以是一种抗体;本发明的一种具体实施方案中，标记为单克隆抗体RP3-17。希望标记不干扰CNTF的生物活性并且标记的检测方法基本上不干扰CNTF连接到其受体上。

标记可用任何本领域已知的方法连到CNTF上。本发明的较佳实施方案是，标记共价连接到CNTF上，但是在某些情况下希望标记用非共价键结合力相连（例如，如果标记含有免疫球蛋白分子）。

标记可以是任何适于保持其指示器官能而基本上不改变相连的CNTF生物活性的分子尺寸。如果标记是为了提供抗原定子，那么就希望它至少含有约5-15个氨基酸。

作为举例说明而不是限定，本发明的一种较佳的具体方法是，CNTF可使用“碎片”聚合酶链式反应作标记，其中重组神经营养性因子（CNTF）设计成在其C末端带有相应于已知抗原定子的十个氨基酸。例如，但不是作为限定，该抗原定子可相应于人c-真菌（c-myc）原致癌基因蛋白质的已定义的抗原决定基。

例如，但不是作为限定，“碎片”PCR方法如下所述可用于连结十个氨基酸真菌标记（本发明提供了用类似方法连结的氨基酸标记）。相应于在细菌表达构建中位于特定限制性酶***位点上游的CNTF序列的5′PCR引物可用于与“碎片”引物的PCR反应中，其中使用来自CNTF响应的细胞的cDNA作为模板，所说“碎片”引物含有相应于3′末端CNTF序列的核酸序列以及核酸序列编码的肽标记。

PCR反应也含有相应于碎片引物序列并包含含有特定限制性内切酶***位点的核酸序列的3′引物。较佳实施方案是，5′和3′引物的用量超过碎片引物，结果5′和碎片引物之间的PCR放大在几个PCR周期后就停止，而5′和3′引物之间的放大可起动并继续生产大量的全长CNTF/标记序列。“碎片”技术可解决对长引物的需要，长引子的合成是困难并耗时的。放大的CNTF/标记产物可经凝胶提纯、用限制性内切酶浸提，然后亚克隆到表达载体的相应限制位点内，其中限制性内切酶在设计到产物的末端的位点上***。例如，为了生产CNTF-真菌标记，可使用下述引物：5′引物＝5′  GAC  TCG  AGT  CGA  CAT  CGG  AGG  CTG  ATG  GGA  TGCC  3′（SEQ  ID  No：3）;碎片引物＝3′  CTA  AAG  ACT  CCT  CCT  AGA  CAT  CGC  CGG  CGT  ATCG  5′（SEQ  ID  NO：4）;引物可以使用的比例为100ng5′引子/100ng3′引子/1ng碎片引子;详细描述见下文6节。CNTF/标记的表达可以按照Sendtner等人在下述文件中对重组CNTF的表达的描述进行：申请日为1990年8月20日、申请号为07/570  651的美国专利申请，其名称为“Ciliary  Neurotrophic  Factor”或者1991年4月4日出版的PCT公开No  WO  91/04316。

本发明也提供了含有免疫球蛋白分子或其一部分，例如抗体分子的Fc、F（ab）₂或F（ab）′片段的标记。标记应连接到CNTF上并且可以是多克隆或单克隆抗体。

按照本发明，标记的CNTF可以用细胞在能促进CNTF向所说细胞的连接或附着的条件下培育。在大多数情况下，这可在标准培养条件下实现。例如，在本发明的较佳实施方案中，细胞可以在标记的CNTF存在下培养约30分钟。如果标记是抗体分子，那么较佳是使CNTF首先连接到细胞上并随后洗涤细胞以除去未连接的配位体，然后加入抗CNTF抗体标记。

在本发明的具体实施方案中，位于CNTF响应的细胞表面上的标记的CNTF，下文中称为靶细胞，可用丛生分析（rosetting  assay）检测，其中能够连接到标记上的指示器细胞带有CNTF/标记的细胞培养，结果它们粘到靶细胞的CNTF/标记上，并且连接的指示器细胞在含CNTF-标记的细胞周围形成了丛生状的丛。这些可以在用平皿培养的细胞（plated cell）上用标准显微镜技术观测到，或者，另一方面，可以用密度离心法分离丛生化和非丛生化细胞。在本发明的一个较佳具体实施方案中，靶细胞比如神经元细胞可在多井（例如60个井）培养平皿内在约200细胞/井的浓度下在比如带有10%胎儿牛血清和2mM谷氨酰胺的RPM1 1640的培养基内收获并用平皿培养，沉积的细胞在潮湿的5%CO₂气氛的培养箱中在37℃培养约16至24小时以使细胞附着。然后，过量的细胞培养基被除去并且细胞可以在室温用标记的CNTF培养约30分钟。细胞然后用加入了1%牛血清清蛋白（BSA）的PBS（带有钙和镁）洗涤数次以除去未连接的配位体然后在室温用约10μg/ml的识别标记分子的抗体培养约30分钟。细胞然后用PBS洗涤数次以去除未连接的抗体。然后，靶细胞（含有连接到抗标记抗体上的CNTF/标记）在室温用连接到抗标记抗体上的丛生指示器细胞（比如含有兔-抗-小鼠免疫球蛋白的指示器细胞）的约0.2%（V/V）悬浮液培养1小时。平皿然后用PBS洗涤并在相衬显微镜下检验丛生。例如，如果抗标记抗体由鼠产生，那么指示器细胞可通过用另一物种生产的抗（小鼠免疫球蛋白）抗体涂敷红细胞（比如人O+红细胞）来产生。指示器细胞可通过按照Albino等的程序（1981，J.Exp.Med.154∶1764-1778）在盐水中稀释的0.01%CrCl₃·6H₂O存在下用抗免疫球蛋白抗体（在浓度大于约1毫克/毫升下）培养红细胞来制备。另外，可以使用本领域已知的磁珠（magne-tic bead）或其它方法。

在本发明的另一实施方案中，在靶细胞表面上的标记的CNTF可使用免疫荧光技术检测，其中与标记较佳地是与抗体起反应的分子直接或间接地产生荧光。荧光可在显微镜下观察到，荧光可用于通过荧光激化细胞分类技术进行含CNTF/标记的细胞的离析。本发明的一个较佳的具体实施方案用例子描述为，靶细胞可在含有CNTF/标记（浓度过量）和迭氮化钠（0.05%）的分析缓冲剂中在4℃研制和再悬浮约30分钟。细胞然后可在分析缓冲剂中经在800转/分下离心5分钟进行洗涤三次。细胞然后在约10微克/毫升浓度下在4℃用抗标记抗体培养约30分钟，按如上方式洗涤，然后在4℃用生物素基化的（biotinylated）抗免疫球蛋白和抗生蛋白链菌素-德克萨斯红（Texas  Red）共轭物培养约30分钟。细胞然后被洗涤、在封固溶液（mounting  solution）中再悬浮、盖片培养（Coverslipped）、然后用荧光显微术检验。

本发明也提供了检验其它形式标记比如产色的标记、催化标记等的方法。任何具体标记的检测方法取决于从标记产生信号所必需的条件，但本领域的普通技术人员应能容易地识别。

可以使用的另一种探针是抗CNTFR抗体。

按照本发明，CNTFR蛋白质、或片段或者衍生物可用作免疫原以生产抗CNTFR抗体。通过使用蛋白质合成的重组技术（以本发明的CNTFR核酸序列为基础）可生产大量的CNTFR蛋白质，这样就避免了限量的CNTFR这一问题。

为进一步改进生产抗CNTFR免疫响应的可能性，应对CNTFR的氨基酸序列进行分析以鉴定与增加的免疫原性相关的分子的部分。例如，对氨基酸序列进行计算机分析以鉴定表面抗原决定基，抗原决定基表示了亲水性、表面几率、灵活度、抗原指数、两亲螺旋结构、两亲层以及CNTFR的二级结构的由计算机产生的小区。另外，导出的不同物种的CNTFR的氨基酸序列可进行比较，并且相对的非同源区被鉴定;这些非同源区对各种物种更有可能是呈免疫原性的。

为了制备指向CNTFR的单克隆抗体，通过在培养基中的连续细胞系制备抗体分子的任何技术均可使用。例如，最初由kohler和Milstein研究的杂交瘤技术（1975，Nature  256∶495-497）、以及trioma技术、人B细胞杂交瘤技术（Kozbor  et  al.，1983，Immu-nology  Today  4∶72）、以及生产人单克隆抗体的EBV杂交瘤技术（Cole  et  al.，1985，in“Monoclonal  Antibodies  and  Cancer  Therapy”，Alan  R.Liss，Inc.pp.77-96）等等均属于本发明的范围。

用于治疗的单克隆抗体可以是人单克隆抗体或嵌合体人-鼠（或其它物种）单克隆抗体。人单克隆抗体可用许多本领域已知的技术生产（例如Teng  et  al.，1983，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.80：7308-7312;Kozbor  et  al.，1983，Immunology  Today  4∶72-79;Olsson  et  al.，1982，Meth.Enzymol.92∶3-16）。制备的嵌合体抗体可以含有小鼠抗原连接区域与人恒定区（Morrison  et  al.，1984，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.81∶6851，Takeda  et  al.，1985，Nature  314∶452）。

本领域已知的各种技术可用于生产CNTFR抗原决定基的多克隆抗体。对于生产抗体，经注射CNTFR蛋白质、或片段或其衍生物可使各种宿主动物免疫，所说动物包括但不限于：兔、小鼠、大鼠等。各种佐剂可用于增强免疫响应，这取决于宿主物种，佐剂包括但不限于：弗洛因德佐剂（完全的和不完全的）、矿物凝胶比如氢氧化铝、表面活性物质比如溶血卵磷脂、环氧乙烷-环氧丙烷的嵌段共聚物多元醇（pluronic polyol）、聚阴离子、肽、油乳状液、钥孔

血蓝蛋白、二硝基苯酚、以及具有潜在用途的人的佐剂比如BCG（卡介苗）以及短小棒状杆菌（Corynebacterium  parvum）。

CNTFR抗原决定基的抗体的分子克隆可用已知技术制备。重组DNA方法（参见例如Maniatis  et  al.，1982，Molecular  Cloning，A  Laboratory  Manual，Cold  Spring  Harbor  Laboratory，Cold  Spring  Harbor，New  York）可用于构建编码单克隆抗体分子或其抗原连接区的核酸序列。

抗体分子可用已知技术，例如免疫吸附或免疫亲和性色谱法、比如HPLC（高性能液相色谱）的色谱法、或它们的组合等进行提纯。

本发明提供了抗体分子以及这些抗体分子的片段。含有分子的个体基因型的抗体片段可用已知技术生产。例如，这些片段包括但不限于：F（ab′）₂片段，可用抗体分子的胃蛋白酶消化生产;Fab′片段，可经减少F（ab′）₂片段的二硫键来生产;以及Fab片段，可经用木瓜蛋白酶和还原剂处理抗体分子来生产。

上述探针可实验性地用于鉴定到目前为止还未用于表达CNTFR的细胞或组织。此外，这些方法可通过畸变组织比如癌用于鉴定CNTFR的表达。在其它实施方案中，这些方法可论断性地用于把遭受紊乱的病人的细胞、液体或组织中CNTFR的表达与健康人的相似细胞、液体或组织进行比较。液体指任何体内液体，但特别是指血液或脑脊髓液。病人与健康人相比其CNTFR表达的水平的差异表明，病人的紊乱主要地或次要地与CNTF代谢有关。CNTFR水平的增加，例如，或者表明病人的紊乱与对CNTF的正常水平的提高的敏感度有关，或者另一方面，表明病人的CNTF水平低，结果受体的数目由于补偿而增加。这些病原可通过让病人服用CNTF来彼此分开。如果病人的状况恶化，他就患有CNTF过敏;如果病人转好，他就患有CNTF缺失。从而可以选择CNTF或基于CNTF拮抗物的治疗方案。表达的不同可在蛋白质和/或RNA水平下检测出;即通过测量病人的相对于健康人的CNTFR蛋白质或CNTFR  RNA的量。

上述探针也可用于选择用于测定***中的CNTF响应的细胞，如上所述，或者参见申请号为No.07/532  285的美国专利申请，或者按照细胞选择或细胞分类的标准方法。

5.6.4.治疗用途

本发明也提供了使用本发明的有效量的CNTFR蛋白质、肽片段、或衍生物治疗患有紊乱如神经紊乱的病人的方法。包括用CNTFR、CNTFR***、CNTFR拮抗物（它与内生CNTF竞争）或者抗CNTFR抗体给药的治疗方法都属于本发明的范围。

本发明也提供了在合适的药用载体中含有CNTFR蛋白质、肽片段、或衍生物的药物组合物。

CNTFR蛋白质、肽片段或衍生物可以全身地或局部地给药。本领域已知的任何适当的给药方式均可使用，包括但不限于：静脉内、椎管内、动脉内、鼻内、口服、皮下、腹膜内、或是局部注射或外科植入。还提供了持久性释放配方。

当我们对神经退化疾病/神经创伤认识得更清楚时，降低内源CNTF营养作用的益处就更明显。所以，在神经***创伤区域中，常望提供CNTF拮抗物，包括（但不限于此）无细胞CNTFR，该CNTFR可与内源细胞受体争夺CNTF结合。在这些情况下，在损伤部位而不是在全身局部提供CNTF可能是合乎要求的。使用提供CNTFR的植入物可能是所希望的。

另外，某些病理状态可能从CNTF响应性的提高得到益处。因此，在遭受这种病理状态的患者中增加CNTFR的数量或结合亲合性可能是有益的。这可通过基因疗法而达到。使用由组织特异性或诱导启动子控制的CNTFR基因，或通过用带有重组体CNTFR基因的复制缺损性病毒产生局部感染而获得在合适细胞中的重组体CNTFR的选择表达那些可受益于增加对CNTF敏感性的病理状态特别包括（但不限于）运动神经元紊乱，包括肌萎缩侧硬化、和后脊髓灰质炎（post-polio）综合症。这种疗法也可用于治疗与糖尿病、帕金森病、Al-zheimer病和Huntington舞蹈病有关的神经紊乱。

此外，本发明通过CNTF给药提供对特殊组织或细胞类型紊乱的治疗，这类组织或细胞类型已作为表达CNTF受体而鉴定出。在特定实施方案中，已经表明该CNTFR基因在肌肉细胞内被表达（见下文第8节），并且该CNTF可防止与体内去神经支配萎缩有关的肌肉重量和肌原纤维蛋白含量的损失（见下文第9节）。因此，本发明提供了治疗肌肉细胞紊乱，或包括神经肌肉单元紊乱的方法，该方法包括给需这种治疗的病人服用：（ⅰ）一处含有编码CNTFR的核苷酸序列的核酸分子或官能活性部分或其衍生物，以使其能够表达，或（ⅱ）CNTF，或其官能活性部分或其衍生物。这种紊乱包括但不限于基础病理学发现的肌肉萎缩或营养不良变化。例如，这种肌肉萎缩可能是由因神经创伤引起的去神经支配（肌肉与其神经失去接触）;退化的，代谢的或发炎的（例如格-巴二氏（Guillian-Barre）综合症）外周神经病、或由环境毒物或药物引起的对神经的损伤而造成的。在另一实施方案中，肌肉萎缩是由因运动神经引起的去神经支配而造成的。这种运动神经病包括但不限于成人运动神经元疾病，包括肌萎缩侧硬化（ALS或LouGehrig′s病）;婴幼儿脊椎肌肉萎缩，和具有多病灶传导区的自身免疫的运动神经病。在另一实施方案中，肌肉萎缩是由慢性废用性引起的。这类废用性萎缩可由以下这些病理状态产生，包括但不限于：由于中风引起的瘫痪，脊髓损伤，脑损伤或其他中枢神经***损伤，由于创伤（如骨折、扭伤或错位）造成的骨骼固定术或长期卧床休息。在一个实施方案中，肌肉萎缩是由代谢紧张状态或营养不良造成的，这包括但不限于癌症和其他慢性病的恶病质，断食或横纹肌溶解（rhabdomyolysis），内分泌失调如（但不限于）甲状腺失调和糖尿病。肌肉萎缩也可是由于肌肉营养不良综合症引起的，这包括但不限于杜兴氏（Duchenne）、贝克尔氏（Becker）、肌强直的、筋膜肩胛肱骨（Fascioscapulohumeral）、Emery-Dreifuss、眼咽的（ocu-lopharyngeal）、肩胛肱骨、肢带、和先天型的、以及已知为遗传远侧肌病（Hereditary  Distal  Myopathy）的营养不良。在另一实施方案中，肌肉萎缩是由先天肌肉病引起的，这包括，但不限于良性先天压力过低（Benign  Congenital  Hypotonia）、中心核（Central  Core）病。线虫肌病（Nemaline  Myopathy）、和管状肌（Myotu-bular）（中心核）病。另外，CNTFR编码核酸或CNTF及其活性片段或衍生物可用于治疗后天（中毒或发炎）肌病。那些由于肌肉发炎疾病引起的肌病包括但不限于多肌炎和皮肤炎。中毒性肌病可以由以下这些试剂引起，包括但不限于乙胺碘呋酮、氯喹、安妥明、阿霉素、乙醇、羟基氯喹、有机磷酸盐、双环己乙哌啶、和长春新碱。

在本发明的另外实施方案中，对于遭受过量CNTFR、对CNTF、过量CNTF等过敏的病人可通过服用有效量的相应于CNTFR基因编码区的反义RNA或反义少脱氧核糖核苷酸由此降低CNTFR的表达而得到治疗。

6.实施例：睫状神经营养性因子受体的表达克隆

6.1.材料和方法

6.1.1.CNTF受体表达库的构建

SH-SY5Y细胞（由Dr.June  Biedler最先获得）用作构建cDNA库的mRNA来源，并且pCMX表达载体（公开在同时待批的1991年3月28日申请流水号No.07/678408的美国专利申请中，见上文），这是一种pCDM8载体的衍生物（Seed，1987，Nature  329∶840-842）。在琼脂糖凝胶上选择用于cDNA库的***物，其尺过大于1kb。

6.1.2.“淘盘分析（panning）”方法

对由Seed和Aruffo开发的“淘盘分析”方法（1987，Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.84∶3365-3369）作如下改变：细胞首先用CNTF/真菌（1μg/ml）在冰上培养30分钟，旋转通过PBS/2%Ficoll以去除的配体，然后用9E10抗体（由Oncogene  Sciences，Manhasset，N.Y.获得）在冰上培养30分钟，而不是用识别受体的抗体来培养细胞。随后再将其旋转通过PBS/2%  Ficoll，并且在敷有从Sigma公司获得的抗真菌肽小鼠单克隆抗体的平皿上“淘盘分析”。该平皿的制备如下：将敷有抗真菌小鼠单克隆抗体细菌的60mm平皿（Falcon  100）或其等同物，或10cm皿，如Fisher  8-757-12，用50mM  Tris  HCl（pH9.5）稀释至每毫升10微克。3ml的抗体用于覆盖每个6cm皿或10ml用于每个10cm皿;将平皿暴露于抗体约1.5小时，然后将抗体转移到下一皿中，使保持1.5小时，然后再转移到第三个皿中。用0.15M  NaCl洗涤该平皿三次（为此用洗涤瓶是较方便的），然后在PBS中用3ml  1mg/ml  BSA培养过夜。尤其是按下述进行“淘盘分析”：将细胞在100mm皿中培养。从每个皿中吸出培养基，再加2ml  PBS/0.5mM  EDTA/0.02%叠氮化物，将该混合物在37℃下培养30分钟以将细胞从皿上脱离下来。用短的巴氏（pas-teur）吸管用力将这些细胞捣碎，从每个皿中收集入离心管中，并在2.5位置（200xg）旋转4分钟。将细胞悬浮在0.5-1.0ml  PBS/EDTA/叠氮化物/  5%FBS中，并用CNTF/真菌在冰上培养30分钟。加入等体积的PBS/EDTA/叠氮化物，在3ml  PBS/EDTA/叠氮化物/2%  Ficoll中仔细分层，在位置2.5处旋转4分钟，将上清液平稳地吸出。然后用9E10抗体在冰上将这些细胞培养30分钟，再重覆旋转通过PBS/EDTA/叠氮化物/2%Ficoll。将这些细胞溶解在0.5ml  PBS/EDTA/叠氮化物中，将等分试样加入到含有3ml  PBS/EDTA/叠氮化物/5%FBS的用抗真菌小鼠单克隆抗体覆盖的皿上。至多从2个60mm皿中将细胞加入到1个60mm抗体覆盖的平皿中，并使在室温放置1-3小时。通过用PBS/5%血清或用培养基缓慢地洗涤而将未粘附于皿上的过量细胞去除（通常用3ml洗涤2-3次就足够）。

6.1.3.含有睫状神经营养性因子受体基因克隆的鉴定

按照标准方法使用DEAE/氯喹将来自表达库的质粒DNA转染到COSM5细胞中（每100mm皿约250-500ng;转染二个皿）。转染后二天，将细胞从其皿上脱离，并经受如上文所述的改进的Aruffo/Seed的淘盘步骤。

从平皿上洗涤非粘附细胞后，制备Hirt上清液（Hirt，1967，J.Mol.Biol.26∶365-369），在存在10-20μg  tRNA时沉淀质粒DNA。按照厂商的说明通过电穿孔将得到的DNA引种到DH10B细菌中（Electromax，BRL）。由电穿孔的细菌生长的培养基用于制备质粒DNA以用于下一轮的转染和淘盘;通过间接的碘化-抗体结合测试，用这种质粒DNA转染的一平皿COS细胞明显表现为大量的表达CNTFR的COS细胞（见图1B的典型数据，测定方法见下文）。在这些转染子上进行第二轮淘盘/质粒DNA分离/电穿孔后，在氨苄青霉素平皿上平板培养出由电穿孔步骤得到的细菌转化体。收集个体的细菌克隆，由每个该克隆制备的质粒DNA单个地转染到COS细胞中以用于测定。15个试验质粒中的14个，通过一系列测定，包括如下文所述的间接抗体结合测定和荧光激活细胞分类术（FACS）分析，结果形成转染COS细胞中表达CNTF结合位点。

6.1.4.直接¹²⁵I-hCNTF结合测定

用来自库、增强库、或个体克隆的质粒DNA转染COS细胞。48小时后，移去培养基，并用仅含有¹²⁵I-hCNTF的0.25ml结合缓冲液（具有10%FBS和0.1%NaN₃的RPM1 1640）或用未标记的hCNTF来代替。在室温用¹²⁵I-hCNTF培养60分钟。培养完全后，除去该¹²⁵I-hCNTF溶液，并用1.0ml结合缓冲液洗涤这些细胞三次，然后用0.25ml的0.1N NaOH溶解。将溶胞产物转移到12×75mm聚苯乙烯管中并置于r计数器中。通过加入至少100倍过量的未标记hCNTF来测定非特异性结合。在最终洗涤后，将该平皿进行放射自显影照相。

6.1.5.荧光激活细胞分类术分析

将转染的COS细胞依次用CNTF/真菌、9E10抗体、以及FITC-标记的山羊抗小鼠抗体培养。然后从皿上脱离并经过FACS分析。用负和正质粒转染的结果绘于图1D中;用CNTF受体表达质粒转染的COS细胞含有大量的亚群，通过本测定显示出荧光大大增强。

6.1.6  hCNTF的碘化

在20℃使用乳过氧化物酶6ng/μl（Sigma）用1mci¹²⁵INa磺化10μg hCNTF（560μg/ml，在10mM NaPO₄中，pH7.4）15分钟。15分钟后，用含有0.1M NaI、0.1%BSA和0.1%细胞色素C.0.3%HOAC、0.05%酚红和0.02%NaN₃的等体积缓冲液抑制反应。移出等分试样以用于测定TCA的沉淀数量。将剩余部分装到载有0.05M NaPO₄、0.1M NaCl、0.5mg/ml硫酸鱼精蛋白和1mg/ml BSA的BioRad PD-10生物凝胶柱上。收集馏分并测定TCA沉淀数。

6.1.7  CNTFR的序列分析

依照厂商的说明，使用二脱氧双线DNA元件（U.S.Biochemi-cal公司出售）用Sequenase^TM进行序列分析

6.1.8.间接的¹²⁵I山羊抗小鼠抗体结合测定

用来自库、增强库、或个体克隆的质粒DNA转染COS细胞。48小时后，在冰上依次用PBS（含有Ca、Mg）/5%FBS培养这些细胞30分钟，5%FBS含有：

1）1μg/ml  CNTF-真菌;

2）10μg/ml9E10;

3）¹²⁵I山羊抗小鼠抗体（GaM）（0.5-1μCi/ml）。

每一步骤后，将细胞在PBS/5%FBS中洗涤3×5分钟。最后一次洗涤后，将该平皿进行放射自显影照相。

对于个体克隆，用手提式r计数器定量地测定其结合的总放射性。

6.2.结果的讨论

6.2.1.限制性分析

在限制性分析时，将14个正克隆分为4组：

a）I2＝I7（2kb）

b）I1＝I5＝I6（2kb）

c）I4＝I8＝I9＝I11＝I14＝I15（4kb）

d）I10＝I12＝I13（1.6kb）

（I3为负的）

用酶Pst  I消化时，各组的成员都产生相同的带花样。进一步的限制性分析表明克隆的四组是重叠的，初始序列的数据证明，它们在其5′端共有重叠的序列。奇怪的是，相对其核启动子元件，组b）表明在载体的错误取向上有其***物。如表1可见，相对于其他克隆，这些克隆的表达是低的。在这些克隆中的转录可由在载体多衔接物的下游区中存在弱隐藏启动子而产生。

6.2.2.体外转录和转译

为表征对四组克隆的蛋白质编码，将它们全部由在载体多衔接物的5′区中的T7启动子所转录。在体外转译后，将产物在聚丙烯酰胺凝胶上进行电穿孔。组a）不产生蛋白质，这是因为相对于T7启动子位于错误的取向。其他三组都产生相同尺寸的蛋白质（约42kd），这证明它们编码相同的蛋白质。

表Ⅰ

在CNTFR克隆中¹²⁵Ⅰ-GaM结合的数量

克隆  结合CPM

Ⅰ1  2000

Ⅰ2  8500

Ⅰ3  600

Ⅰ4  9000

Ⅰ5  2000

Ⅰ6  1600

Ⅰ7  6000

Ⅰ8  7500

Ⅰ9  7000

Ⅰ10  4500

Ⅰ11  7000

Ⅰ12  5000

Ⅰ13  8000

Ⅰ14  10000

Ⅰ15  8000

负对照  500

本底  250

6.2.3.与CNTF的结合分析

使用9E10抗真菌抗体和¹²⁵I山羊抗小鼠抗体的间接CNTF-真菌结合测定的结果示于图1B和1C以及表1中。在图1B中，在左边的平皿是由未增强库的转染而得到的，而右边的平皿是来自进行一轮淘盘后得到的增强库质粒DNA转染的（使用与未增强库大约相同数量的DNA）。仅在右边的平皿中观察到大量的黑点，每个黑点都代表放射自显影检测的单个COS细胞表达CNTF-真菌结合位点。

对于在第6.2.1.节中讨论的个体正克隆，用手提式r计数器进行总放射性的定量测定。对个体克隆I1-I15的测定结果示于表1中并表明15个克隆中的14个表达CNTF结合位点（通过间接抗体结合试验测得）。此外，如图1C所示对来自某些个体克隆的平皿中的片段进行放射自显影照相。

如图1D所示，第二次间接结合的实验使用了CNTF-真菌，随后用9E10抗体、FITC标记的山羊抗小鼠抗体，以及FACS分析。用正克隆转染的COS细胞与用负克隆转染的细胞相比，表明其提高CNTFR的表达为100倍。

用CNTF-真菌获得的间接结合数据通过用直接¹²⁵I-CNTF结合进行了验证，结果示于表Ⅱ。在转染的COS细胞上表达的该受体如同CNTFR被克隆的SH-SY5Y细胞一样特别易与碘化的CNTF以及CNTF-真菌配体结合。每个转染的COS细胞表达比SH-SY5Y细胞高约30倍每细胞受体。

表Ⅱ

用碘化了的CNTF结合分析

COS  Ⅰ2  SH-SY5Y

¹²⁵Ⅰ-CNTF 特殊的 cpm/细胞^＊特殊的 cpm/细胞

浓度  结合cpm  结合cpm

2.16nM 1412 2.17×10^-21284 4.28×10^-3

在24井培养皿中用3×10⁵个SH-SY5Y细胞/井或6.5×10⁴个COS细胞/井来进行单层结合测定。特殊的结合cpm的计算是从仅以所指明浓度的¹²⁵I-CNTF时的结合cmp中减去存在1000倍过量的未标记的CNTF时的结合cpm。在未转染的COS细胞中未检测到特殊的结合。

^＊通过用DEAE Dextran（二乙氨乙基葡聚糖）转染后48小时进行COS细胞测定，典型地是在其中只转染20-40%。假设转染20%的COS细胞，特殊的结合cpm表明每个转染的COS细胞比SH-SY5Y细胞表达约高30倍的每细胞受体。

6.2.4.CNTFR和同源于其他生长因子受体序列

该CNTFR含有与一系列其他受体共有的主题。CNTFR的胞外部分含有位于N-未端的“免疫球蛋白”区域，以及通过短的铰合区从“免疫球蛋白”中分离出的“细胞活素受体”区域。尽管很多受体既与“免疫球蛋白”又与“细胞活素受体”同源（图3），但只有一个受体即IL-6受体与CNTFR共有这些区域的相同的特定排列（图3和图4）。所以该IL-6受体是与CNTFR最相关的蛋白质（图4）。有意义的是，该IL-6受体也类似于CNTFR，在其中它具有非常短的胞质区域，显然对于IL-6结合不需要起始响应（Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157）。最近，一种新的对IL6受体的信号转导物，定名为gp130，进行了分子克隆。这种转导物本身不结合IL-6，但它提供结合到IL-6受体上的高亲合性，并为转导IL-6信号所需（Hibi  et  al.，1990，Cell  63∶1149-1157）。我们对CNTFR的克隆表明它与IL-6受体共有重要的特征，这在已知的其他受体中是没有发现的，所以，定义了一个新的受体家系。IL-6R和CNTFR之间的相似性表明CNTFR可以象IL-6受体一样使用相同的信号转导物，或相关的分子。最后，CNTFR相关的受体的鉴定可借助于与这些受体结合的新的配体的鉴定。

7.实施例：对CNTFR信息的组织探测

7.1.材料的方法

7.1.1.CNTFR探针的制备

将hCNTFR的编码区分子克隆入pCMX表达载体中，这公开在与此同时申请的题目为“哺乳动物的表达载体”的美国专利申请中，所得到的表达载体绘于图6中。合成了由CNTFR序列碱基对889伸展至碱基对1230的PCR探针，并将它用作Northern分析探针。

7.1.2.RNA的制备和Northern印迹

从Sprague-Dawley大鼠中解剖出所选择的组织并立即冰冻于液氮中。如Bothwell等人所述（1990，Methods  of  Cloning  and  Analysis  of  Eukaryotic  Genes，Boston，MS，Jones  and  Bartlett）通过在3M  LiCl、6M尿素中组织的均化而将RNA分离出。通过经四次1%琼脂糖-甲醛凝胶的电泳法将RNA（10μg）碎粒（Bothwell et al.，1990，Methods of Cloning and Analysis of Eukaryotic Genes，Boston，MS，Jones and Bartlett），然后用毛细管转移到具有10×SSC（pH7）的尼龙膜上（MagnaGrath，Micron Separation Inc.）。通过暴露在紫外光线下将RNA紫外线交联到该膜上（Stratalinker，Stratagen，Inc.），并在68℃下在存在有0.5M NaPO₄（pH7），1%牛血清蛋白（馏分V，Sigma，Inc.）、7%SDS、1mM EDTA（Mahmoudi et al.，1989，Biotechniques 7∶331-333）、100μg/ml声处理的变性鲑精DNA时与放射性标记的探针杂交。在68℃用3×SSC、0.1%SDS洗涤滤器并在70℃下用一个或二个增强膜（Cronex，Dupont）和X射线底片（SAR-5，Kodak）进行放射自显影照相一天至二周。对凝胶的溴化3，8-二氨基-5-乙基-6-苯基菲啶嗡染色表明对不同试样测定的总RNA的水平是相当的（如Maisonpierre et al.，1990，Science 247∶1446-1451）。

7.2.结果

如图5所示，CNTFR  mRNA在坐骨神经和肾上腺中为低水平时的中枢神经***组织中，以及在肌肉中是可检测出的。这表明CNTF不仅具有神经营养活性，而且也具有肌肉营养活性，并可以说明涉及到在特定紊乱中的中枢神经***和肌肉两者，这些紊乱例如杜兴氏肌肉营养不良和先天肌强直营养不良，在这些病中，病人遭受精神阻滞。CNTFR在肌肉中表达这说明CNTF可能在肌肉生理学中具有一定的作用。所以，除了作用于神经，CNTF在肌肉中可能具有重要的作用，如作为肌营养剂的作用，或换句话说影响肌肉发育和/或分化。

8.实施例：证明CNTF受体通过糖基磷脂酰肌醇（GPI）键连接到细胞表面上

8.1  材料和方法

在补充有10%未活化的胎儿牛血清的RPMI中于24井皿（Falcon）中培养SH-SY5Y细胞。在实验中，在CNTF结合之前进行磷脂酶（以及对照）处理，将培养基吸出，用PBS（+Ca/Mg）将细胞冲洗二次，然后用补充有或不补充磷脂酰肌醇-特性磷酯酶（PI-PLC）最终浓度为500mU/ml（购于Boehringer  Mannheim  的＃1143-069产品）的PBS（+Ca/mg）在37℃下培养45分钟。然后用结合缓冲液（PBS（+Ca/Mg）和5%胎儿牛血清）将细胞洗涤三次，然后再用250ml含有碘化的CNTF（约100微微摩尔），该CNTF含有或不含1000倍过量的未标记的CNTF结合缓冲液，在室温培养30分钟。在实验中，在PI-PLC处理之前将碘化的CNTF结合，在37℃下，在含有碘化的CNTF，该CNTF含有或不含过量未标记的CNTF的结合缓冲液中首先培养45分钟。然后用PBS（+Ca/Mg）将细胞洗涤二次，再用补充或不补充PI-PLC（最终浓度为500mu/ml）的PBS（+Ca/Mg）培养45分钟。而后用结合缓冲液冲洗细胞三次。在所有情况下，在0.1N  NaOH中计数之前溶解细胞，然后再计数。

8.2.结果和讨论

CNTF受体的序列表明编码蛋白质终止在其后跟有外胞质区域的疏水区中，没有出现任何明显的终止转移序列或内胞质区域。这一结构使人想起了在没有横跨膜区域的并通过GPI键连接在细胞表面上的膜蛋白质上发现的C-末端（Ferguson  and  Williams，1988）。所以，进行实验以试验该CNTF受体是否是通过GPI键连接到细胞表面上。如表Ⅲ所示，用PI-PLC处理SH-SY5Y细胞完全消除了SH-SY5Y其后结合CNTF的能力，这与该CNTF受体通过GPI键连接到细胞表面上的观点相一致。然而，可通过PI-PLC处理使已连接到SH-SY5Y细胞上的CNTF释放（表Ⅲ）。有意义的是，可溶形式的IL-6受体可与对IL-6信号转导所需的第二膜蛋白质（GP130）紧密地结合。所以，通过事先结合在CNTF上来防止CNTF受体释放可能是由于CNTF、其受体及其信号转导物（GP130或GP130类似物）间结合的结果。另一方面，CNTF结合可改变CNTF受体的结构，使其对PI-PLC更为不敏感（有些GPI连接的蛋白质具有PI-PLC抗性形式）。

CNTF受体通过GPI键连接在细胞表面上这一发现有重要的结果。这表示了第一次发现生长因子受体以这种方式连接到膜上，增加了附加的受体可以被GPI连接的可能性。因为一些蛋白质具有GPI连接形式和含有普通的横跨膜区域形式这两种形式，我们的发现增加了CNTF受体具有交替可编码横跨膜区域的C末端的可能性，并类似于IL-6受体具有GPI连接的形式。生长因子受体的GPI连接形式可使用新的受体调节和释放机制。例如，表面受体的向下调节可通过活化外胞质的磷脂酶活性使GPI连接的受体的释放而迅速发生。这些释放的受体也可作用于另外的细胞（或单独的或以大致相同的方式与CNTF结合），可溶的IL-6受体表明已结合IL-6并活化了表达GP130的细胞。

使用PI-PLC将CNTF受体释放可阻滞CNTF作用的这一可能性具有重要的意义。这可用于验证所观察的CNTF的作用是由于克隆的CNTF受体的结果。在治疗上，当认为CNTF活性是有害的时，PI-PLC可用于释放CNTF受体，并可能阻滞CNTF的作用。

如果CNTF受体的CNTF可阻滞的PI-PLC释放是由于在CNTF、其受体、和蛋白质的信号转导蛋白质之间形成了四元络合物，那么该受体的这一特征就可用于定义和分子克隆该转导分子。

表Ⅲ

对结合于SH-SY5Y细胞上的CNTF的

PI-PLC处理的分析

结合cpm

无冷的过量物  冷的过量物

用PI-PLC予处理

无PI-PLC  1440  370

有PI-PLC  420  310

PI-PLC之前结合CNTF

无PI-PLC  1250  310

有PI-PLC  1060  300

9.CNTF在体外对去神经大鼠骨骼肌的作用

在此所述的实验目的是为了检验纯化的重组体CNTF在体外对去神经骨骼肌的作用以及确定CNTF是否能防止与去神经支配的萎缩，例如肌肉重量和肌原纤维蛋白质损失有关的某些表型变化。我们发现该CNTF受体在骨骼肌包括管状肌和成肌细胞两者中表达，并且该CNTF可防止与去神经支配的萎缩有关的肌肉重量和肌原纤维蛋白质含量的损失。

9.1.CNTF受体在骨骼肌包括管状肌和成肌细胞两者中的表达

如图5所示，在由多种大鼠组织中得到的RNA试样上进行Nor-thern印迹分析以鉴定CNTF的主要的细胞靶。来自人体CNTF受体编码区的探针鉴定了2kb转录体，这些转录体的表达通常只限于中枢神经***，只有意外地在骨骼肌中发现了其高水平的表达，而在肾上腺和坐骨神经中发现为低水平表达。

特别是在骨骼肌中CNTF受体表达的更详细的分析，是通过用由特殊大鼠肌肉类型、纯化的人体肌肉管状肌细胞、和一些小鼠和大鼠来源的骨骼肌细胞系制备的mRNA的Northern印迹按上文进行（图7）。将人体探针用于CNTF受体时，在一些肌肉RNA试样中测定了两种mRNA种类（2.0和1.7kb）。图7表明CNTF受体在小鼠（行1和2）或大鼠（行3和4）来源的管状肌和成肌肌肉细胞系两者中都表达，以及在大鼠的红色慢颤搐比目鱼肌和白色快速颤趾长伸肌（EDL）中表达（分别为行5和6）。这表明CNTF受体mRNA的水平在比目鱼肌（行12）和EDL肌肉（行14）中都增加，这些肌肉相对于其假手术对侧的对照物（分别为行11和行13）为第一次去神经72小时。有意义的是，表达的最高水平是在来自由人胎儿骨骼肌得到的管状肌的RNA试样中观察到的。将这些管状肌培养，然后在RNA分离之前用荧光激活细胞分类术纯化以与成纤维细胞和其他非肌肉细胞分离（行8）。我们注意到在肌肉细胞Northern印迹上已鉴定出两种不同的CNTF受体mRNA物种，并注意到1.7kb  CNTF受体信息优先在成肌细胞系C2C12mb（行1）中表达，这可能表示一种受体的交替连接形式。

9.2.CNTF防止与去神经支配萎缩有关的肌肉重量和肌原纤维蛋白质含量的损失

9.2.1.神经切除外科手术

用于这些研究的不同的动物组示于下面表Ⅳ中。通常一组中包含三只动物。对于所有实验组，通过右后肢的中腿（midthigh）部位皮肤造成约20cm的最初切口。这一外科步骤后，在左后肢中腿部位也切20cm的切口以进行假手术。

在动物组2-6中，右后肢的比目鱼肌肉通过在中腿部位处的外科手术去除坐骨神经的2-5mm节片而进行去神经，以分离32至35mm的远侧神经残端（在图8中用A标记）。左侧的比目鱼肌肉作为对照，其中通过缓慢地将坐骨神经拉离比目鱼肌肉的神经支配点32至35mm而在该肌肉上进行假手术。当动物在轻度戊巴比妥麻醉（0.3g/Kg）下时，进行所有的外科手术。动物组1（对照）不作任何神经切除术也不作任何注射。所有的动物体重均在100和150克之间。

9.2.2.处理

组1和2中的动物不进行处理，组3中的动物用含有1mg/ml  BSA（PBS/BSA）的磷酸盐缓冲液盐水（PBS）肌肉（IM）注射，每天一次，共注射4天。在动物两侧的中腿部位的肌肉都进行多次注射。组4中的动物用含有1mg/ml  BSA（CNTF/BSA）的重组体大鼠CNTF（1mg/Kg）IM注射，每天一次，共4天。如上所述在动物的两侧都进行多次注射。组5中的动物也每天用rCNTF/BSA注射，但是通过皮下而不是IM注射。组6中的动物每天用PBS/BSA注射（SC）。

表Ⅳ

组  ＃动物  外科手术方案  神经切除术时间  处理

1  3  无  96小时  无

2  3  R-Den/L-Sham  96小时  无

3  3  R-Den/L-Sham  96小时  PBS/BSA（1mg/ml）

4  3  R-Den/L-Sham  96小时  CNTF/BSA（1mg/Kg）（IM）

5  3  R-Den/L-Sham  96小时  CNTF/BSA（1mg/kg）（SC）

6  3  R-Den/L-Sham  96小时  PBS/BSA（SC）

R-Den＝右后肢切除神经术;L-Sham＝左后肢假手术

9.2.3.肌肉重量和蛋白质分析

神经切除外科手术进行96小时后，通过断头术将动物杀死，并将比目鱼肌肉小心地由腱到腱切断。将比目鱼肌置于在冰上的称重舟中，用解剖刀去除腱，然后立即将肌肉称重以防止发生任何干燥。为制备肌原纤维蛋白匀浆，收集切断的比目鱼肌肉并在冷室中于冰上将其绞碎，然后在含有0.32M蔗糖和3mM MgCl₂（2.5%w/v）的PBS中搅匀。将该匀浆以约800xg离心分离，依照厂商所推荐的使用Bio-Rad Dye Binding（染料结合）方法，对上清液测定每肌肉总的肌原纤维蛋白质。

图9表明去神经支配的比目鱼肌肉在96小时其净重明显降低（P＜0.01）约25%。每天的PBS/BSA注射对取决于去神经支配的肌肉重量损失无作用。然而，取自每天用CNTF（1mg/Kg）/BSA注射的大鼠的去神经比目鱼肌的重量比其对侧假手术对照物的重量低约5%。CNTF处理的去神经的和假手术的比目鱼肌肉的净重量与未手术的对照物的重量没有明显的不同。当每天注射（SC）共4天（组5）时，CNTF也表现出对肌原纤维蛋白质的去神经诱导的损失有明显的防止作用，并且蛋白质的损失与肌肉净重的降低相当（表Ⅴ）。

表Ⅴ

CNTF对去神经的比目鱼肌蛋白质含量的作用

总的肌原纤维

肌肉试样  蛋白质（mg/肌肉）  %（假）

组1-未去神经  7.5

组2-去神经-未注射  5.8  80

-假-未注射  7.2

组3-去神经+PBS（IM）  5.2  75

-假-PBS（IM）  6.9

组4-去神经+CNTF（IM）  6.5  83

-假+CNTF（IM）  7.8

组5-去神经+CNTF（SC）  6.6  93

-假+CNTF（SC）  7.1

组6-去神经+PBS（SC）  5.3  67

-假+PBS（SC）  7.9

（IM）＝肌肉注射;（SC）＝皮下注射;表中数据代表收集3份比目鱼肌的总蛋白质含量

当每天IM注射时，观察到CNTF对总的肌原纤维蛋白质没有显著的作用。

我们发现CNTF受体在骨骼肌包括管状肌细胞和成肌细胞中表达，并且CNTF可防止与去神经支配萎缩有关的肌肉重量和肌原纤维蛋白质含量这两者的损失。

10.微生物的保藏

于1991年3月26日在The  Agricultural  Research  Culture  Collection（NRRL）（1815  North  University  Street，Peoria，Illi-nois，61604）进行了如下保藏。

载有质粒pCMX-hCNTFR（Ⅰ2）的大肠杆菌，含有hCNTFR编码序列的表达质粒，给定的保藏号为NRRL  B-18789。

本文所引证的各种参考文献、文献所公开的内容都全部与本申请结合并作为参考。

本发明并不限于所保藏的构建或实施例中公开的实施方案的范围，这些都是为了说明本发明的几个方面，任何功能相当的实施方案都在本发明的范围之内。另外，对本发明在此所示和描述的各种改变对于本领域内的普通技术人员来讲都是显而易见的，并落在所附的权利要求的范围之内。

Claims (36)

1、一种基本上纯的编码CNTF受体的核酸分子。

2、权利要求1的核酸分子，该分子具有基本上如图2中所绘出的核酸序列（SEQ  ID  No：1），或其至少为6个核苷酸长度的片段。

3、权利要求2的核酸分子是cDNA。

4、一种含有图2中所绘出的核酸序列（SEQ  ID  No：1）的至少6个核苷酸部分的基本纯的核酸分子。

5、一种含有图2中所绘出的核酸序列（SEQ  ID  No：1）的至少6个核苷酸部分但带有突变的基本上纯的核酸分子。

6、一种含有具有基本上如图2绘出的序列（SEQ  ID  No：1）的第一种核酸分子的可杂交部分的基本上纯的第二种核酸分子。

7、一种基本上纯的核酸分子，该分子编码具有基本上如图2绘出的氨基酸序列（SEQ  ID  No：2）的蛋白质，或由至少6个氨基酸组成的其一部分或其衍生物。

8、一种含有权利要求1、2或7的核酸分子的生物。

9、权利要求8的生物是一种微生物。

10、权利要求9的微生物是一种细菌。

11、权利要求9的微生物是酵母。

12、权利要求8的生物是一种转基因动物。

13、一种含有权利要求1、2或7的核酸分子的细胞。

14、一种含有权利要求1、2或7的核酸分子的永久的细胞系。

15、权利要求1、2或7的核酸分子还含有能控制基因表达的核酸序列。

16、一种基本上纯的CNTF受体分子，该分子含有基本上如图2中绘出的氨基酸序列（SEQ  ID  No：2），或由具至少6个氨基酸组成的一部分。

17、一种能识别权利要求16的CNTFR受体的单克隆抗体。

18、一种鉴定与CNTF结合的细胞的方法，包括通过该细胞测定CNTF受体的表达。

19、权利要求18的方法还包括通过将来自含有CNTF受体编码RNA的悬浮细胞的试样杂交到核酸探针上而测定CNTF受体-编码RNA的存在，该探针含有图2中绘出的序列（SEQ  ID  No：1）的至少6个核苷酸部分。

20、权利要求18的方法，还包括通过（ⅰ）在可发生免疫特性结合的条件下将该细胞暴露在抗CNTF受体抗体中，然后（ⅱ）测定抗体与该细胞的结合来测定CNTF受体蛋白质的存在。

21、一种筛选具有CNTF活性的药用化合物的检测***，其中的CNTF包含含有重组体核酸分子的细胞，该核酸分子含有基本上如图2中绘出的核酸序列（SEQ  ID  No：1）或至少6个核苷酸长度的其片段。

22、一种筛选具有CNTF活性的药用化合物的检测***，其中的CNTF含有表达重组体CNTF受体蛋白质或其官能活性部分的细胞。

23、权利要求22的检测***，其中的重组体CNTF受体蛋白质含有基本上如图2中绘出的核酸序列（SEQ  ID  No：2）或至少6个核苷酸长度的其片段。

24、一种研究CNTF生理学的实验模型***，其中的CNTF包含含有编码CNTF受体的重组体核酸的细胞，并且与相同类型的不含编码CNTF受体的重组体核酸的细胞相比，该细胞在其表面表达增加的CNTF受体数。

25、权利要求24的实验模型***是一种转基因动物。

26、一种载有编码与细胞表面无关的重组体CNTF受体的转基因的非人体转基因动物。

27、一种载有编码在转导对CNTF生物响应中无作用的重组体CNTF受体的转基因的非人体转基因动物。

28、一种药用组合物，含有CNTF受体蛋白质、肽片段、或其衍生物;及可药用的载体。

29、一种药用组合物，含有具有氨基酸序列的蛋白质及一种可药用的载体，其中的氨基酸序列含有基本上如图2所绘出的氨基酸序列（SEQ  ID  No：2）或其6个氨基酸部分。

30、一种鉴定关于包括IL-6受体分子家系成员的CNTF受体分子的方法，包括：

（ⅰ）筛选用于杂交到CNTF受体一编码核酸部分中的克隆的DNA库;

（ⅱ）分离和繁殖杂交到CNTF受体编码核酸中的克隆;

（ⅲ）测定在步骤（ⅱ）中分离和繁殖的克隆的核酸序列;以及

（ⅳ）将步骤（ⅲ）测定的核酸序列与家系中已知成员的核酸序列相比较。

31、一种除CNTF外的基本上纯的分子，该分子与CNTF争夺结合在CNTF受体上。

32、一种含有已用致免疫量的CNTF受体免疫的动物的自免疫疾病模型***。

33、一种基本上纯的补充权利要求1核酸分子的第二种核酸分子。

34、一种基本上纯的补充权利要求2核酸分子或片段的第二种核酸分子。

35、一种基本上纯化的表达重组体CNTF受体蛋白质或其官能活性部分的细胞组合物。

36、一种含有包含在质粒pCMX-hCNTFR中的CNTF受体核酸序列的核酸，它已保藏在NRRL，具有的保藏号为B-18789。

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