CN1232500A - 轴突素,一种神经基因(neurogene) - Google Patents

Abstract

公开了名为轴突素的新多肽的DNA序列和氨基酸序列,轴突素主要在大脑的选定区中表达。

Description

轴突素，一种神经基因(neurogene)

                     发明背景

发明领域

本发明涉及编码名为轴突素(Neuritin)的多肽的新DNA序列，该多肽主要在某些脑组织中在对某些刺激应答时表达。

相关技术

一些神经障碍和疾病至少部分由特定类别的神经元的退化或死亡引起。例如，帕金森病的特征为随意肌运动减慢、肌肉僵硬和震颤。这种症状至少部分归因于位于称为黑质的大脑特定区域的产多巴胺神经元的进行性退化。这些神经元(“多巴胺能神经元”)的退化导致在称为纹状体的大脑邻近区域内多巴胺水平降低。纹状体具有表达多巴胺受体的神经元；这些神经元参与控制运动原活性。未知多巴胺能神经元退化的原因，但已归因于自由基、铁含量过量、环境毒素、兴奋性氨基酸神经毒性和可能缺乏某些神经营养因子(Jenner,Neurology，增刊3:S6-S12[1995]；Adams和Victor编辑，Principles of Neurology，第42章：神经***的退化性疾病，McGraw Hill,NY[1993])。

诸如肌萎缩性侧索硬化(ALS)、进行性肌萎缩和遗传性运动和感觉神经病(Charcot-Marie-Tooth病)全部至少部分是由于位于脊索腹侧角中的运动神经元衰退。

海马这一属于大脑皮质一部分的已准确定义的结构在形成长期记忆中很重要。海马的破坏(例如由局部缺血造成)可以导致不能形成新的记忆。位于海马CA1区的锥形CA1神经元的退化是早老性痴呆的特征之一。这些神经元选择性地易受在诸如中风和头部创伤的情况下发生的局部缺血和缺氧损伤的伤害。另外，CA1锥形海马神经元以及位于海马CA3区的锥形神经元在癫痫中被选择性地损伤。

纹状体是黑质具有多巴胺能的神经元的神经末梢的神经分布区。纹状体神经元的大多数利用GABA(4-氨基丁酸)做为它们的神经递质。纹状体是亨廷顿舞蹈病中发生的进行性退化的主靶，其中主要的神经元损失即是纹状体的利用GABA的神经元的损失。

含有5-羟色胺的神经元位于成簇围绕后脑中线的群中。这些神经元参与控制体温、情绪和睡眠。含有5-羟色胺的神经元***的疾病包括例如压抑、其它情绪障碍和睡眠紊乱。

感光细胞是视网膜神经元的特化亚群，负责视觉。感光细胞的损伤和/或死亡可以导致失明。诸如由色素性视网膜炎、年龄相关性黄斑变性和固定夜盲引起的视网膜退化的特征均为感光细胞外节进行性萎缩和丧失功能，所述外节是含有将光刺激转化成为电活性的视色素的特化结构。

虽然有一些可用的治疗法治疗这种疾病的症状和减轻其严重性(例如，治疗帕金森病的L-多巴)，但目前没有有效的治疗以防止或减轻大多数上述类别的受影响神经元的退化或促进它们的修复。

近来，基于对各种神经元的营养活性，已鉴别了几种自然产生的蛋白质分子。这些分子被命名为“神经营养因子”。神经营养因子是可以调节神经元生存、生长和/或形态可塑性的内源可溶性蛋白质(参见Fallon和Laughlin,Neurotrophic Factors,Academic Press,San Diego,CA[1993])。

基于氨基酸序列同源性和/或三维结构，已知的神经营养因子属于多肽生长因子的几种不同的蛋白超家族(MacDonald和Hendrikson,Cell,73:421-424[1993])。神经营养因子的一个家族是神经营养蛋白家族。目前这个家族包括NGF(神经生长因子)、BDNF(脑源神经营养因子)、NT-3(神经营养蛋白-3)、NT-4(神经营养蛋白-4)和NT-6(神经营养蛋白-6)。

CNIF(睫状神经营养因子)和LIF(白血病抑制因子)是具有神经营养活性的细胞因子多肽。鉴于其结构特征和受体成分，这些多肽与造血细胞因子家族有关，该家族包括IL-6(白细胞介素-6)、IL-11(白细胞介素-11)、G-CSF(粒细胞集落刺激因子)和制癌蛋白-M。

GDNF(神经胶质源神经营养因子)是属于TGF-β(转化生长因子β)超家族的神经营养因子。GDNF对多巴胺能神经元和运动神经元显示出有效力的促进生存和分化的作用(Lin等，Science,260:1130-1132[1993]；Yan等，Nature,373:341-344[1995])。

虽然已知这些神经营养因子增强神经元的生长和/或生存，但对与这些因子联合作用的分子所知较少。可以鉴别其它神经营养蛋白和相关分子的一种方式，是给予一种动物一种或多种已知对神经***有影响的化合物，然后分析组织中参与对该化合物神经应答的基因的诱导。例如，可以筛选在诸如大脑海马区的神经***的某些组织中被诱导的基因。Nedivi等(Nature,363:718-722[1993]；Nedivi等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,93:2048-2053[1996])使用了这种技术，鉴别对给予称为红藻氨酸的谷氨酸神经递质类似物应答时在海马齿状回部分诱导的新基因。

诸如NGF、BDNF、NT3、GDNF、bFGF、IGF-1和TGF-β的许多神经营养因子的表达由传入神经元活性和/或由神经元损伤调节。可以在对谷氨酸类似物红藻氨酸应答时，在海马齿状回观察到一些这种基因的强诱导(Isaokson,Current Opinions in Neurobiology 5:50-357[1995])。看来红藻氨酸处理增加了从警觉大鼠海马释放新化合物，这种活性看来与已知神经营养因子的作用不同(Humpel，等，Science,269:552-554[1995])。

从许多神经***障碍和疾病没有已知治愈方法的事实来看，在本领域内需要鉴别新化合物治疗神经病症和疾病，例如帕金森病、肌萎缩性侧索硬化(ALS)、早老性痴呆、中风和各种影响视力的退化性疾病。

因此，本发明的一个目的是提供可以用于促进神经元再生和恢复神经功能的新化合物。

本发明的再一目的是提供治疗某些神经疾病的方法。

根据本发明书，本发明的这些和其它目的对本领域一般技术人员是显而易见的。

                     发明概述

在一个实施方案中，本发明提供选自以下的编码多肽的核酸分子：

(a)SEQ ID NO:1的核酸分子；

(b)SEQ ID NO:2的核酸分子；

(c)编码SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子；

(d)编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子；

(e)编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少70％相同的多肽的核酸分子；

(f)是上述(a)-(e)的任何一个的互补物的核酸分子。

在一个实施方案中，本发明提供包括上述陈述的核酸分子的载体。

在再一实施方案中，本发明提供包含这些载体的宿主细胞。

在又一实施方案中，本发明提供产生轴突素多肽的方法，包括步骤：

(a)在适当宿主中表达由权利要求1的核酸编码的多肽；和

(b)分离该多肽。可选地，该轴突素多肽是SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4。

在再一实施方案中，本发明提供选自以下的轴突素多肽：

(a)SEQ ID NO:3的多肽；

(b)SEQ ID NO:4的多肽；和

(c)与(a)或(b)的多肽至少70％同源的多肽。可选地，该轴突素多肽可以是轴突素的生物活性片段，诸如氨基酸25-115、25-143、氨基酸1-115等等。

                   附图简述

图1描绘大鼠轴突素cDNA序列(SEQ ID NO:1)。

图2描绘人轴突素cDNA序列(SEQ ID NO:2)。

图3描绘大鼠轴突素全长翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO:3)。

图4描绘人轴突素全长翻译的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。

图5描绘二个RNA印迹。图5A是用轴突素探针探测的各种大鼠组织的RNA印迹。缩写是h(心脏)；br(大脑)；sp(脾脏)；lu(肺)；li(肝脏)；m(肌肉)；k(肾脏)；t(睾丸)。图5B是或者对照(-)大鼠或者红藻氨酸处理(+)大鼠的大脑各种区域的RNA印迹。缩写是Cereb(小脑)；Hipp(海马)；DG(齿状回)。用轴突素探测该印迹。

图6描绘各种RNA印迹。图6A显示用BDNF、NT-3、FGF、AMPA、NMDA或KCl处理的大鼠海马神经元和皮质神经元的RNA印迹。对照“0”未接受处理。图6B显示从用盐水(“S”)或BDNF(“B”)注射的大鼠得到的海马RNA和皮质RNA的RNA印迹。“0”表明没有处理。

图7是对用或者BDNF或者KCl的处理应答时大鼠E-18海马神经元中轴突素mRNA水平的诱导时间进程图。

图8描绘用抗轴突素抗体探测的二个蛋白质印迹。图8A描绘用或者对照质粒(“亲代”)或者具有编码全长人轴突素的基因的质粒转染的CHO细胞(细胞系名称“CHO15.4”)的蛋白质印迹。“PI-PLC”指磷脂酰肌醇-磷脂酶C,“+”和“-”指存在或不存在PI-PLC。图8B描绘大鼠各种组织的蛋白质印迹。用轴突素抗体探测该印迹。在此印迹中评价的组织的缩写见于本文中。

图9描绘在存在(+)或缺乏(-)轴突素时培养的海马(“Hipp”)和皮质(“Cort”)大鼠胚胎神经元培养物。“DiI”指用亲脂性荧光染料DiI处理。

                发明详述

本文使用的术语“轴突素”当用于描述核酸分子时，指核酸分子或其片段，它(a)具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:2中陈述的核苷酸序列；(b)具有编码下述多肽的核苷酸序列，所述多肽与由SEQ IDNO:1或SEQ ID NO:2的任何一个编码的多肽至少70％相同，但可以至少80％或90％相同；(c)是(a)或(b)的自然产生的等位基因变异体；(d)按照本文提供所产生的(a)-(c)的核酸变异体；和/或(e)与(a)-(d)互补。

可以通过通常用于比较二条多肽氨基酸位置的相似性的标准方法确定序列相同性百分比。使用诸如BLAST或FASTA的计算机程序，将二条多肽对齐以使其相应的氨基酸最佳匹配(或者沿着一个或二个序列的全长度，或者沿着一个或二个序列的预定部分)。所述程序提供了一个“默认”openig补偿值(opening penalty)和一个“默认”空隙补偿值，可以将诸如PAM 250(标准计分矩阵；参见Dayhoff等，载于：Atlas of Protein Sequence and Structure,第5卷，增刊3[1978])的计分基质与该计算机程序联合使用。然后可以如下计算相同性百分比：

至少70％相同的多肽一般具有一个或多个氨基酸替代、缺失和/或***。通常替代是保守性的，使对该蛋白的总静电荷、极性或疏水性具有几乎没有或没有影响，但可选地可以增强轴突素的活性。在以下表Ⅰ中陈述了保守性替代。

                      表Ⅰ

               保守性氨基酸替代

碱性：               精氨酸

                     赖氨酸

                     组氨酸

酸性：               谷氨酸

                     天冬氨酸

极性：               谷氨酰胺

                     天冬酰胺

疏水性：             亮氨酸

                     异亮氨酸

                     缬氨酸

芳族：               苯丙氨酸

                     色氨酸

                     酪氨酸

小的：               甘氨酸

                     丙氨酸

                     丝氨酸

                     苏氨酸

                     甲硫氨酸

术语“严格条件”指在仅允许诸如寡聚核苷酸或cDNA分子探针的核酸分子与高度同源序列结合的条件下杂交和清洗。一种严格清洗溶液是在55℃-65℃的温度下使用的0.015M NaCl、0.005M柠檬酸钠和0.1％SDS。另一种严格清洗条件是在50℃-65℃之间的温度下使用的0.2XSSC和0.1％SDS。当使用寡聚核苷酸探针筛选cDNA或基因组文库时，可以使用以下严格清洗条件。一种方案使用35℃-62℃下的含有0.05％焦磷酸钠的6XSSC，温度取决于寡聚核苷酸探针的长度。例如，14个碱基对的探针在35℃-40℃清洗，17个碱基对的探针在45-50℃清洗，20个碱基对的探针在52-57℃清洗，而23个碱基对的探针在57-63℃清洗。当本底非特异性结合高时，可以将温度增加2-3℃。第二种方案使用氯化四甲铵(TMAC)清洗寡聚核苷酸探针。一种严格清洗溶液是3M TMAC、50mM Tris-HCl、pH8.0和0.2％SDS。使用该溶液的清洗温度是探针长度的函数。例如，在约45-50℃清洗17个碱基对的探针。

本文使用的术语“轴突素蛋白”或“轴突素多肽”指任何具有本文描述的轴突素性质的蛋白或多肽。轴突素多肽根据其制备方式可以具有或不具有氨基末端甲硫氨酸。作为说明，轴突素蛋白或轴突素多肽指(1)由上述(a)-(e)的任何一项陈述的核酸分子编码的氨基酸序列及由其衍生的肽或多肽片段，(2)SEQ ID NO:3或4中陈述的氨基酸序列，和/或(3)本文提供的化学修饰衍生物以及核酸序列和/或氨基酸序列的变异体。

本文使用的术语“轴突素片段”指小于自然产生轴突素蛋白全长氨基酸序列、但具有与上述轴突素多肽或轴突素蛋白基本上相同的生物学活性的肽或多肽。这种片段可以在氨基末端、羧基末端(例如大约是轴突素多肽的最后27个氨基酸的GPI锚定域)和/或内部截短，并可以是化学修饰的。优选地，该轴突素片段为保留至少6个半胱氨酸残基的轴突素片段。可以制备具有或不具有氨基末端甲硫氨酸的这种轴突素片段。

本文使用的术语“轴突素衍生物”或“轴突素变异体”指这样的轴突素多肽或轴突素蛋白，它1)已例如通过添加聚乙二醇或其它化合物进行化学修饰，和/或2)与图3或4中陈述的轴突素相比，具有一个或多个核酸或氨基酸序列替代、缺失、和/或***。

本文使用的术语“生物学活性多肽”和“生物学活性片段”指具有轴突素活性(即促进海马或皮质神经元培养物中轴突发生(neuritogenesis))的肽或多肽。

本文使用的术语“有效量”和“治疗有效量”指支持上述轴突素的一种或多种生物学活性必需的轴突素的量。

可以用于实践本发明的轴突素多肽可以是自然产生的全长多肽、截短多肽或肽(即“片段”)。所述多肽或片段可以如下述化学修饰即糖基化、磷酸化和/或连接至聚合物，根据其制备方法，它们可以具有氨基末端甲硫氨酸。另外，所述多肽或片段可以是自然产生的轴突素多肽的变异体(即，与自然产生轴突素相比，可以具有一个或多个氨基酸缺失、***和/或替代)。

可以使用熟知的重组DNA技术方法，例如在Sambrook等(分子克隆：实验室手册，Cold Spring Harbor Laboratory Press,ColdSpring Harbor,NY[1989])和/或Ausubel等编辑(分子生物学现行方法，Green Publishers Inc.和Wiley and Sons,NY[1994])中描述的那些方法，制备全长轴突素多肽或其片段。可以通过例如筛选基因组或cDNA文库或者通过PCR扩增，得到编码轴突素蛋白或其片段的基因或cDNA。或者，可以使用本领域技术人员熟知的诸如由Engels等(Angew.Chem.Intl.Ed.,28:716-734[1989])描述的那些方法，通过化学合成制备编码轴突素多肽或片段的基因。这些方法包括特别是用于核酸合成的磷酸三酯、亚磷酰胺和H-磷酸酯方法。这种化学合成的优选方法是使用标准亚磷酰胺化学的聚合物支持合成。一般地，编码轴突素多肽的DNA长度为几百个核苷酸。使用这些方法，可以分几个片段合成大于约100个核苷酸的核酸。然后可以将所述片段连接起来形成全长轴突素多肽。通常，编码该多肽氨基末端的DNA片段具有一个ATG，其编码甲硫氨酸残基。在轴突素多肽的成熟形式上可以存在或不存在该甲硫氨酸，取决于在宿主细胞中产生的所述多肽是否从该细胞分泌。

在一些情况下，可能希望制备自然产生的轴突素的核酸和/或氨基酸变异体。可以使用定点诱变或PCR扩增产生核酸变异体(其中设计一个或多个核苷酸与野生型或自然产生的轴突素不同)，使用PCR时的引物具有所需点突变(有关诱变技术的描述，参见Sambrook等，见上述，和Ausubel等，见上述)。亦可以使用由Engels等(见上述)描述的方法，使用化学合成制备这种变异体。也可以使用本领域技术人员已知的其它技术。优选的核酸变异体是那些考虑到用于产生轴突素的宿主细胞中的密码予选择而具有的核苷酸替代的变异体。其它优选的变异体是那些与野生型相比编码如上述的保守性氨基酸改变(例如，其中通过用不同的氨基酸替代，基本上不改变自然产生的氨基酸侧链的电荷或极性)的变异体，和/或那些设计用于在轴突素上或者产生新糖基化位点和/或磷酸化位点的变异体，或那些设计用于在轴突素上缺失现存糖基化位点和/或磷酸化位点的变异体。

可以将轴突素基因或cDNA***用于在宿主细胞中表达的适当载体。选择在使用的特定宿主细胞中有功能的载体(即，该载体与宿主细胞机制相容，使得轴突素基因的扩增和/或该基因的表达可以发生)。可以在原核生物、酵母、昆虫(杆状病毒***)和/或真核生物细胞中扩增/表达轴突素多肽或其片段。宿主细胞的选择至少部分取决于该轴突素多肽或其片段是否要糖基化。如果要糖基化，最好使用酵母、昆虫或哺乳动物宿主细胞；酵母细胞将糖基化该多肽，昆虫和哺乳动物细胞可以如在轴突素多肽上自然发生的那样糖基化和/或磷酸化该多肽(即“自然”糖基化和/或磷酸化)。

一般地，用于任何宿主细胞的载体都具有5’侧翼序列(亦称为‘启动子’)和其它调节元件，诸如增强子、复制起点元件、转录终止元件、具有供体和受体剪接位点的完整内含子序列、信号肽序列、核糖体结合位点元件、聚腺苷酸化序列、用于***编码欲表达的多肽的核酸的多接头区和选择标记元件。在以下讨论每种这些元件。可选地，该载体可以有一个“标记”序列，即位于轴突素编码序列5’或3’末端、编码多聚组氨酸(诸如六聚组氨酸)或另一小免疫原性序列的寡聚核苷酸序列。该标记可以与所述蛋白一起表达，并可以用作从宿主细胞纯化轴突素多肽的亲和标记。可选地，以后可以通过各种方法，诸如使用例如选择的肽酶，从纯化的轴突素多肽除去该标记。

5’侧翼序列可以是同源的(即，源自宿主细胞的同一物种和/或菌株)、异源的(即，源自与宿主细胞的物种或菌株不同的物种)、杂种(即，多种来源5’侧翼序列的组合)、合成的，或它可以是天然轴突素5’侧翼序列。如此，该5’侧翼序列的来源可以是任何单细胞原核生物或真核生物、任何脊椎动物或无脊椎动物生物体、或任何植物，只要该5’侧翼序列在宿主细胞机制中具有功能和可以被宿主细胞机制激活。

可以通过本领域已知的几种方法的任何一种，得到可用于本发明载体的5’侧翼序列。一般地，可以通过作图和/或限制性内切酶消化，预先鉴别不同于轴突素5’例翼序列的可用于本文的5’侧翼序列，并由此可以使用适当的限制性内切酶从适当的源组织将其分离。在某些情况下，该5’侧翼序列的全长核苷酸序列可能是已知的。在此，可以采用上述关于核酸合成或克隆的方法合成该5’侧翼序列。

当已知该5’侧翼序列的全部或部分时，可以使用PCR和/或通过用适当的寡聚核苷酸和/或同一物种或另一物种的5’侧翼序列片段筛选基因组文库将其得到。

当未知该5’侧翼序列时，可以从可能含有例如编码序列或甚至另外一种或多种基因的大片段DNA分离含有5’侧翼序列的DNA。使用一种或多种仔细挑选的用于分离正确DNA片段的酶，通过限制性内切酶消化完成所述分离。消化后，可以通过琼脂糖凝胶纯化、Qiagen柱或本领域技术人员已知的其它方法分离所需片段。完成这一目的的适当酶的选择，对本领域一般技术人员是显而易见的。

复制起点元件一般是市售购得的原核表达载体的一部分，可以帮助所述载体在细胞中扩增。将该载体扩增至某一拷贝数，可能在某些情况下对轴突素多肽的最佳表达很重要。如果选择的载体没有复制起点位点，可以根据已知序列化学合成一个起点位点，并将其连接至所述载体。

转录终止位点一般位于轴突素多肽编码序列的3’末端，起终止轴突素多肽转录的作用。通常，原核细胞中的转录终止元件是后接多聚T序列的富含G-C片段。虽然可以容易地从文库克隆该元件或可以做为载体的一部分市售购得，但亦可以容易地使用诸如上述核酸合成的方法合成该元件。

可选择标记基因元件编码在选择性培养基中生长的宿主细胞的生存和生长所必需的蛋白。典型的选择标记基因编码这种蛋白质，该蛋白(a)赋予对抗生素或其它毒素的抗性，例如，对于原核宿主细胞的氨苄青霉素、四环素或卡那霉素的抗性，(b)弥补细胞的营养缺陷；或(c)提供复合培养基没有的关键营养。优选的可选择标记是卡那霉素抗性基因、氨苄青霉素抗性基因和四环素抗性基因。

通常称为SD序列(原核生物)或Kozak序列(真核生物)的核糖体结合元件对mRNA翻译起始是必需的。该元件一般位于启动子的3’和欲合成的轴突素多肽编码序列的5’。SD序列有变化，但一般是多嘌呤(即，具有高A-G含量)。已鉴别了许多SD序列，每一个SD序列都可以使用上述方法容易地合成并用于原核载体。

在希望轴突素从宿主细胞分泌的那些情况下，可以使用信号序列将轴突素多肽导出合成它的宿主细胞，并且可以将该蛋白的羧基末端部分缺失以防止膜锚定。一般地，将信号序列置于轴突素核酸序列的编码区，或直接置于轴突素编码区的5’末端。已鉴别了许多信号序列，任何在选择的宿主细胞中有功能的信号序列都可以与轴突素基因联用。因此，信号序列可以与轴突素多肽同源或异源，并且可以与轴突素多肽同源或异源。另外，可以使用上述方法化学合成信号序列。在大多数情况下，借助信号肽的存在从宿主细胞分泌多肽，将导致除去多肽的氨基末端甲硫氨酸。为便于分泌，可以除去轴突素多肽的C末端区。该C末端区长度为约27个氨基酸，而且许多氨基酸是疏水性的；再则，在该区域有一个在许多糖基磷脂酰肌醇(GPI)锚定蛋白中发现的共有酶切信号序列。

在许多情况下，载体上存在一个或多个内含子增加轴突素多肽的转录；这对真核宿主细胞特别是哺乳动物宿主细胞尤其如此。所述内含子可以是该轴突素核酸序列内自然存在的，特别是当使用的轴突素序列是全长基因组序列或其片段时。如果所述内含子不是自然存在于轴突素DNA序列之内(绝大多数cDNA即是如此)，则可以从其它来源得到内含子。内含子相对于5’侧翼序列和轴突素编码序列的位置很重要，因为必须将内含子转录为有效的。如此，当轴突素核酸序列是cDNA序列时，内含子的优选位置是转录起始位点的3’和多聚A转录终止序列的5’。对于轴突素cDNA，最好内含子位于轴突素编码序列的一边或另一边(即，5’或3’)，使得它不干扰该编码序列。任何来源的、包括任何病毒、原核生物和真核生物(植物或动物)的任何内含子都可以用于实践本发明，只要它与其***的宿主细胞相容。本文亦包括合成内含子。可选地，在载体中可以使用一个以上的内含子。

在上述的一个或多个元件在欲使用的载体中不存在的情况下，可以分别得到它们并连接入所述载体。用于得到每一种所述元件的方法对本领域技术人员是众所周知的，可以与上述方法(即，合成DNA、文库筛选等等)相类似。

一般从诸如市售得到的载体的起始载体，构建用于实践本发明的最终载体。这种载体可以具有或不具有准备包含于完成的载体中的一些元件。如果在起始载体中没有任何所需元件，通过用适当限制性内切酶切割所述载体，使得欲连接入的元件末端和载体的末端适于连接，单独地将每个元件连接入所述载体。在一些情况下，可能需要使欲连接的末端“形成平端”，以得到满意的连接。使用Klenow DNA聚合酶或T4DNA聚合酶，在存在所有四种核苷酸时首先填满“粘性末端”，完成平端形成。该程序是本领域众所周知的，例如在Sambrook等，见上述中做了描述。

或者，可以首先将欲***所述载体的二个或多个元件连接在一起(如果要将它们邻接配置)，然后再连接入载体。

构建载体的另一方法是在一个反应混合物中同时进行各种元件的所有连接。这样由于元件的错误连接或***，会产生许多无用或非功能性载体，但是可以通过限制性内切酶消化，鉴别和选择功能载体。

用于实践本发明的优选载体是那些与细菌、昆虫和哺乳动物宿主细胞相容的载体。这种载体包括特别是pCRⅡ(InvitrogenCompany,San Diego,CA)、pBSⅡ(Stratagene Company,LaJolla,CA)和pETL(BlueBacⅡ；Invitrogen)。

已构建载体并已将轴突素核酸***载体的正确位点之后，可以将完成的载体***适当的宿主细胞，以扩增和/或表达轴突素多肽。

宿主细胞可以是原核宿主细胞(诸如大肠杆菌)或真核宿主细胞(诸如酵母细胞、昆虫细胞或脊椎动物细胞)。该宿主细胞在适当条件下培养时，可以合成轴突素蛋白，接着可以从该培养基收集该蛋白(如果宿主细胞将其分泌入培养基)，或直接从产生它的宿主细胞收集该蛋白(如果不分泌)。收集后，使用诸如分子筛层析、亲和层析等等方法可以纯化轴突素蛋白。

宿主细胞的选择部分取决于该轴突素蛋白是否要糖基化或磷酸化(此时优选使用真核宿主细胞)、以及宿主细胞能够将该蛋白“折叠”成为其天然三级结构(即二硫桥的正确定向)使得由该细胞产生生物学活性蛋白的方式。然而，在宿主细胞不合成生物学活性轴突素的情况下，可以使用下述适当化学条件在合成后“折叠”轴突素。

适当的细胞或细胞系可以是哺乳动物细胞，例如中国仓鼠卵巢细胞(CHO)或3T3细胞。适当哺乳动物宿主细胞的选择以及转化、培养、扩增、筛选和产物的产生和纯化方法是本领域已知的。其它适当的哺乳动物细胞系是猴COS-1和COS-7细胞系和CV-1细胞系。其它典型的哺乳动物宿主细胞包括灵长类细胞系和啮齿类动物细胞系，包括转化细胞系。源自初生组织体外培养的正常二倍体细胞、细胞株以及初生外植块亦是合适的。候选的细胞可以是选择基因的基因型缺陷，或可以含有一个显性作用选择基因。其它合适的哺乳动物细胞系包括但不限于HeLa、小鼠L-929细胞、源自Swiss、Balb-c或NIH小鼠的3T3系、BHK或HaK仓鼠细胞系。

类似的可以做为适用于本发明的宿主细胞使用的是细菌细胞。例如，大肠杆菌的各种菌株(例如，HBl01、DH5α、DH10和MC1061)是生物技术领域众所周知的宿主细胞。枯草杆菌(B.subtilis)、假单孢菌属未定名种(Pseudomonas spp.)、其它芽胞杆菌属未定名种(Bacillius spp.)、链霉菌属未定名种(Streptomyces spp.)等等的各种菌株亦可以用于该方法中。

本领域技术人员已知的酵母细胞的许多菌株亦可以做为表达本发明多肽的宿主细胞。另外，如果需要，可以使用昆虫细胞做为本发明的宿主细胞(Miller等，Genetic Engineering 8:277-298[1986])。

使用诸如氯化钙、电穿孔、微注射、脂转染或DEAE-葡聚糖方法的方法，可以完成将载体***(亦称为“转化”或“转染”)选择的宿主细胞。选择的方法在某种程度上随使用的宿主细胞类型而变。这些方法和其它合适的方法对本领域技术人员是众所周知的，在例如Sambrook等，见上述中有描述。

使用本领域技术人员众所周知的标准培养基，可以培养含有所述载体的(即，转化或转染的)宿主细胞。所述培养基通常具有对于细胞生长和生存所必需的所有营养。培养大肠杆菌细胞的合适培养基是例如Luria Broth(LB)和/或Terrific Broth(TB)。培养真核细胞的合适培养基是RPMI1640、MEM、DMEM，它们均可以根据培养的特定细胞系的需要补充血清和/或生长因子。昆虫培养的合适培养基是根据需要补充了yeastolate、水解乳清蛋白和/或胎牛血清的Grace培养基。

一般地，将可用于仅选择性生长转化细胞的抗生素或其它化合物做为补充物添加至所述培养基。由转化宿主细胞的质粒上的可选择标记元件确定拟使用的化合物。例如，在可选择标记元件是卡那霉素抗性的情况下，则添加至培养基中的化合物是卡那霉素。

使用本领域已知的方法，可以评价宿主细胞中产生的轴突素多肽的量。这种方法包括但不限于蛋白质印迹分析、SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳、非变性凝胶电泳、HPLC分离、免疫沉淀和/或诸如DNA结合凝胶变动测定(DNA binding gel shift assay)的活性分析。

如果已设计轴突素多肽使其从宿主细胞分泌，则可能在细胞培养基中发现大多数的多肽。以此方法制备的多肽一般不具有氨基末端甲硫氨酸，因为在从细胞分泌时将其除去。然而，如果轴突素多肽未从宿主细胞分泌，则其将存在于细胞质(真核细胞、***和昆虫宿主细胞)或周质(革兰氏阴性细菌宿主细胞)中，并具有氨基末端甲硫氨酸。

对于胞内轴突素蛋白，一般首先以机械或渗透压方式破碎宿主细胞，将细胞质内含物释放入缓冲溶液。然后可以从该溶液分离轴突素多肽。

使用各种技术可以完成从溶液纯化轴突素多肽。如果所述多肽已被合成，使得其具有诸如六聚组氨酸的标记(轴突素/六聚组氨酸)或者其羧基或者氨基末端具有其它小肽，则通过将溶液通过亲和柱一个步骤就可以基本将其纯化，其中该亲和柱基质对该标记或直接对该多肽具有高亲和性(即，特异性识别轴突素的单克隆抗体)。例如，多聚组氨酸以极高的亲和性和特异性与镍结合，因此可以使用镍亲和柱(例如Qiagen镍柱)纯化轴突素/多聚组氨酸。(参见例如，Ausubel等编辑，分子生物学现行方法，10.11.8节，John Wiley & Sons,NewYork[1993])。

当所述轴突素多肽没有标记并且没有可用的抗体的情况下，可以使用其它众所周知的纯化程序。这种程序包括但不限于离子交换层析、分子筛层析、HPLC、非变性凝胶电泳与凝胶洗脱联合、制备性等电聚焦(“Isoprime”仪器/技术，Hoefer Scientific)。在某些情况下，可以联合二种或多种这种技术以提高纯度。优选的纯化方法包括多聚组氨酸标记和离子交换层析与制备性等电聚焦联合。

如果预期主要在细菌的周质空间或真核细胞的细胞质中发现轴突素多肽，则使用任何本领域技术人员已知的标准方法，可以从宿主细胞提取周质或细胞质的内含物，包括包含体(例如，革兰氏阴性细菌)，如果被加工的多肽已形成这种复合物。例如，通过弗氏压碎器、匀浆和/或超声处理可以裂解宿主细胞，释放周质的内容物。然后可以将匀浆液离心。

如果轴突素多肽在周质中形成了包含体，包含体经常与内和/或外细胞膜结合，因此主要存在于离心后的沉淀物中。然后可以用诸如胍或尿素的离液剂处理沉淀材料，以释放、打碎和溶解包含体。然后使用凝胶电泳、免疫沉淀等等可以分析溶解形式的轴突素多肽。如果需要分离轴突素多肽，使用诸如以下描述的和Marston等(Meth.Enz.,182:264-275[1990])中描述的方法可以完成分离。

如果轴突素多肽包含体未在宿主细胞的周质中形成至显著程度，则轴突素多肽主要存在于细胞匀浆液离心后的上清液中，使用诸如以下描述的方法可以从上清液分离轴突素多肽。

在那些最好部分或完全分离轴突素多肽的情况下，使用本领域技术人员众所周知的方法可以完成纯化。这种方法包括但不限于，通过电泳分离并接着进行电洗脱、各种类型的层析(免疫亲和、分子筛和/或离子交换)、和/或高压液相层析。在一些情况下，可能最好使用超过一种的这种方法以进行完全纯化。

除使用重组DNA技术制备和纯化轴突素多肽之外，可以使用本领域已知的方法，通过化学合成方法(诸如固相肽合成)制备轴突素多肽及其片段和/或衍生物，所述方法例如由Merrifield等，(J.Am.Chem.Soc.,85:2149[1964])、Houghten等(Proc.Natl.AcadSci.USA,82:5132[1985])和Stewart和Young(固相肽合成，Pierce Chem Co,Rockford,IL[1984])描述的方法。可以合成在氨基末端具有或不具有甲硫氨酸的这种多肽。使用这些参考文献中描述的方法可以氧化化学合成的轴突素多肽或片段以形成二硫桥。所述轴突素多肽或片段在治疗和免疫过程中可以做为天然的、纯化轴突素多肽的生物学活性或免疫学替代物。

其中轴突素多肽连接至聚合物(“轴突素-聚合物”)的化学修饰轴突素组合物(即，“衍生物)属于本发明的范围。选择的聚合物一般是水溶性的，使得连接它的蛋白质在诸如生理环境的水性环境中不会沉淀。一般修饰选择的聚合物，使其具有单个反应基团，例如用于酰化作用的活性酯或用于烷基化的醛，使得可以按照本发明的方法控制聚合度。优选的反应性醛是聚乙二醇丙醛，它为水溶性，或其单C1-C10烷氧基或芳氧基衍生物(参见美国专利5,252,714)。该聚合物可以分枝或不分枝。包含于轴突素-聚合物范围内的是聚合物的混合物。优选的，对于最终产物制剂的治疗用途，所述聚合物是药学可接受的。水溶性聚合物或其混合物可以选自例如聚乙二醇(PEG)、单甲氧基聚乙二醇、葡聚糖、纤维素、或其它基于碳水化合物的聚合物、聚-(N-乙烯基吡咯烷酮)聚乙二醇、丙二醇均聚物、聚环氧丙烷/环氧乙烷共聚物、聚氧乙烯化多元醇(例如，甘油)和聚乙烯醇。对于酰化反应，选择的聚合物应具有单个反应性酯基。对于还原性烷基化，选择的聚合物应具有单个反应性醛基。聚合物可以是任何分子量，可以分枝或不分枝。

通过本领域已知的任何聚乙二醇化反应进行轴突素的聚乙二醇化，所述反应例如在以下文献中描述：Focus on Growth Factors 3:4-10(1992)；EP0154316；和EP0401384。优选的，如下述通过酰化反应或者烷基化反应，使用反应性聚乙二醇分子(或类似的反应性水溶性聚合物)进行聚乙二醇化。

通过酰化作用的聚乙二醇化一般涉及将聚乙二醇(PEG)的活性酯衍生物与轴突素蛋白反应。可以使用任何已知的或后来发现的反应性PEG分子进行轴突素的聚乙二醇化。优选的活化PEG酯是酯化为N-羟基琥珀酰亚胺(“NHS”)的PEG。本文使用的“酰化作用”设想包括但不限于以下类型的轴突素与诸如PEG的水溶性聚合物之间的连接：酰胺、氨基甲酸酯、尿烷等等，如Bioconjugate Chem.5:133-140(1994)中所述。可以从聚乙二醇化领域已知的那些或后续发展的那些条件选择反应条件，只要避免使欲修饰的轴突素种类失活的诸如温度、溶剂和pH的条件。

通过酰化作用的聚乙二醇化通常导致多聚乙二醇化的轴突素产物，其中赖氨酸的ε-氨基通过酰基连接基团聚乙二醇化。优选的，连接键为酰胺。此外，产生的产物最好至少约95％单、双或三聚乙二醇化。但是，根据使用的特定反应条件，通常将形成更高程度聚乙二醇化的某些种类(多至轴突素的最大数量的赖氨酸ε-氨基加上轴突素氨基末端的一个α-氨基)。如果需要，通过标准纯化技术，可以从所述混合物特别是未反应种类中分离更加纯化的聚乙二醇化的种类，所述技术其中包括透析、盐析、超滤、离子交换层析、凝胶过滤层析和电泳。

通过烷基化的聚乙二醇化通常涉及在存在还原剂时，将PEG的末端醛衍生物与诸如轴突素的蛋白质反应。不管聚乙二醇化的程度如何，PEG基团最好通过CH₂-NH-基团连接至所述蛋白。具体关于-CH₂-基团，这种类型的键本文称为“烷基”键。

通过还原性烷基化衍生产生单聚乙二醇化产物，利用了轴突素中可用于衍生的不同类型伯氨基(赖氨酸对N-末端)的差异反应性。一般的，在使得可以利用所述蛋白的赖氨酸残基的ε-氨基与N末端残基的α-氨基之间的pKa差异的pH下进行反应。通过这种选择性衍生，控制具有诸如醛的反应性基团的水溶性聚合物连接至蛋白质：与该聚合物的缀合主要发生在蛋白的N-末端，而不显著地修饰诸如赖氨酸侧链氨基的其它反应性基团。本发明提供基本上均质的轴突素-单聚合物蛋白缀合物分子制剂(意味着一个聚合物分子基本上仅(即，至少95％)在轴突素蛋白的单一位点连接至轴突素蛋白)。更具体地说，如果使用聚乙二醇，则本发明亦提供缺乏可能的抗原连接基团并具有直接偶联至轴突素蛋白的聚乙二醇分子的聚乙二醇化轴突素蛋白。

特别优选用于本文的水溶性聚合物是聚乙二醇，缩写为PEG。本文使用的聚乙二醇指包括已用于衍生其它蛋白的任何形式的PEG，诸如单-(C1-C10)烷氧基-或芳氧基-聚乙二醇。

总之，可以在用于将生物学活性物质与活化聚合物分子反应的任何适当条件下进行化学衍生。制备聚乙二醇化轴突素的方法一般包括以下步骤(a)在轴突素变为连接至一个或多个PEG基团的条件下，将轴突素多肽与聚乙二醇(诸如PEG的反应性酯或醛衍生物)反应，和(b)得到反应产物。总之，酰化反应的最佳反应条件将基于已知参数和所需结果确定。例如，PEG∶蛋白的比例越大，多聚乙二醇化产物的百分比越高。

产生基本上均质的单-聚合物/轴突素蛋白缀合分子群的还原性烷基化一般包括以下步骤：(a)将轴突素蛋白与反应性PEG分子在还原性烷基化条件下反应，反应pH适于允许选择性修饰所述轴突素蛋白氨基末端的α-氨基；和(b)得到反应产物。

对于基本上均质的单-聚合物/轴突素蛋白缀合分子群，还原性烷基化反应条件是那些允许选择性连接水溶性聚合物部分至轴突素N-末端的条件。这种反应条件通常提供了赖氨酸氨基和N末端的α-氨基的pK_a差异(pK_a是50％的氨基被质子化、50％的氨基未被质子化时的pH)。pH亦影响聚合物与欲使用的蛋白质的比值。一般而言，如果pH较低，则需要聚合物更大地超出蛋白质(即，N-末端α-氨基的反应性越低，需要越多的聚合物以达到最佳条件)。如果pH较高，则聚合物∶蛋白质的比值不需要这样大(即，可利用的反应基团越多，需要的聚合物分子越少)。对于本发明的目的，pH的范围一般为3-9，最好为3-6。

另一个重要的考虑是聚合物的分子量。一般地，聚合物的分子量越大，连接至蛋白的聚合物分子数量越少。类似地，当优化这些参数时，应考虑聚合物的分枝。一般地，分子量越高(或者分枝越多)，聚合物∶蛋白的比值越高。一般地，对于本文考虑的聚乙二醇化反应，优选的平均分子量是约2kDa至约100kDa(术语“约”表明±1kDa)。优选的平均分子量是约5kDa至约50kDa，特别优选的是约12kDa至约25kDa。水溶性聚合物与轴突素蛋白的比例范围一般为1∶1至100∶1，优选为(对于多聚乙二醇化)1∶1至20∶1和(对于单聚乙二醇化)1∶1至5∶1。

使用上述表明的条件，还原性烷基化将提供所述聚合物选择性连接至在氨基末端具有α-氨基的任何轴突素蛋白，并提供单聚合物/轴突素蛋白缀合物的基本均质制剂。术语“单聚合物/轴突素蛋白缀合物”在本文用于指连接至轴突素蛋白分子的单个聚合物分子的组合物。所述单聚合物/轴突素蛋白缀合物最好在N-末端而不是在赖氨酸氨基侧链基团上具有一个聚合物分子。所述制剂优选的是超过90％的单聚合物/轴突素蛋白缀合物，更优选的是超过95％的单聚合物轴突素蛋白缀合物，剩余的可观察到的分子都未反应(即，缺乏聚合物部分的蛋白)。以下的实施例提供了至少约90％单聚合物/蛋白缀合物和约10％未反应蛋白的制剂。所述单聚合物/蛋白缀合物具有生物学活性。

对于本发明的还原性烷基化，还原剂在水溶液中应稳定，且优选能够仅还原在还原性烷基化的初始过程中形成的席夫碱。优选的还原剂可以选自硼氢化钠、氰基硼氢钠、二甲胺甲硼烷、三甲胺甲硼烷和吡咯甲硼烷。特别优选的还原剂是氰基硼氢钠。

其它反应参数诸如溶剂、反应时间、温度等和产物纯化的手段，可以根据已发表的有关用水溶性聚合物衍生蛋白质的信息确定。

可以通过酰化和/或烷基化方法如上述制备聚合物-轴突素蛋白缀合物分子的混合物，可以选择包括在所述混合物中的单聚合物/蛋白缀合物的比例。因此，如果需要，可以制备连接了各种数量的聚合物分子(即，双、三、四等)的各种蛋白的混合物，并与使用本发明方法制备的单聚合物/轴突素蛋白缀合物材料混合。

一般地，通过给予本发明的聚合物/轴突素减轻或调节的疾病，包括那些本文一般对轴突素分子所描述的疾病。但是，与非衍生分子相比，本文公开的聚合物/轴突素分子可以具有额外的活性、增强或减弱的活性、或其它特征。

自身不编码在活性测定有活性的多肽的轴突素核酸分子、片段和/或衍生物，可以用做诊断测定中的杂交探针，以或者定性或者定量测试哺乳动物组织或体液样本中轴突素DNA或RNA的存在。

自身在活性测定无活性的轴突素多肽片段和/或衍生物可以用做体外或体内轴突素受体的调节剂(例如，抑制剂或刺激剂)，或用于制备轴突素多肽的抗体。

轴突素多肽和其片段无论是否化学修饰，均可以单独使用或与其它药用组合物联合使用，用于治疗神经***疾病，所述其它药用组合物例如为神经营养因子、细胞因子、干扰素、白介素、生长因子、抗生素、抗炎药、神经递质受体激动剂或拮抗剂和/或抗体。

可以使用轴突素多肽和/或其片段，制备通过标准方法产生的抗体。因此，与轴突素多肽反应的抗体以及这种抗体的反应性片段也属于本发明的考虑范围。所述抗体可以是多克隆、单克隆、重组的、嵌合的、单链的和/或双特异性的。一般地，抗体或其片段将是“人源化”的，即制备使得在给予患者时防止或最大程度地降低对该抗体的免疫反应。所述抗体片段可以是与本发明的轴突素有反应性的任何片段，例如Fab、Fab’等。本发明亦提供杂交瘤，其制备方法是将轴突素或其片段做为抗原提呈给选择的哺乳动物，接着通过已知技术将该动物的细胞(例如，脾细胞)与某种癌细胞融合产生无限增殖细胞系。本发明亦包含用于产生这种细胞系和针对本发明的人轴突素多肽的全部或部分的抗体的方法。

所述抗体可以用于治疗，例如抑制轴突素与其受体结合。所述抗体还可以用于体内和体外诊断目的，诸如以标记形式检测体液中轴突素的存在。治疗组合物和给予

治疗各种神经***疾病的治疗组合物属于本发明的范围。这种组合物可以包含与药学可接受的载体混合的治疗有效量的轴突素多肽或其片段(它们都可以化学修饰)。所述载体物质可以是注射用水，优选补充了给予哺乳动物的溶液中常见的其它物质。一般地，轴突素治疗化合物将以包含纯化的蛋白(可以化学修饰)与一种或多种生理可接受载体、赋形剂或稀释剂联用的组合物形式给予。中性缓冲盐水或与血清白蛋白混合的盐水是典型的适当载体。优选地，使用适当的赋形剂(例如，蔗糖)将该产物做为冻干剂配制。根据需要，可以包括其它的标准载体、稀释剂和赋形剂。其它典型的组合物包含约pH7.0-8.5的Tris缓冲液、或约pH4.0-5.5的乙酸盐缓冲液，它们可以再包括山梨醇或其适当的替代物。

所述轴突素组合物可以***地肠胃外给予。或者所述组合物可以静脉内或皮下给予。当***给予时，用于本发明的治疗组合物可以是无热原、肠胃外可接受的水溶液的形式。与pH、等渗性、稳定性等等有关的这种药学可接受蛋白溶液的制备属于本领域技术范围。

用于实践本发明的轴突素组合物治疗制剂可以制备成为冻干饼或水溶液的形式以储存，方法为将具有目标纯度的选择的组合物与可选的生理可接受载体、赋形剂或稳定剂(Remingtons’sPharmaceutical Sciences,第18版，A.R.Gennaro编辑，MackPublishing Company[1990])混合。可接受的载体、赋形剂或稳定剂对接受者无毒性，并优选的在使用的剂量和浓度下为惰性，包括诸如磷酸、柠檬酸或其它有机酸的缓冲液；诸如抗坏血酸的抗氧化剂；低分子量多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；包括葡萄糖、甘露糖或糊精的单糖、双糖或其它碳水化合物；诸如EDTA的螯合剂；诸如甘露醇或山梨醇的糖醇；诸如钠的形成盐的平衡离子；和/或诸如吐温、Pluronics或聚乙二醇(PEG)的非离子表面活性剂。

用于体内给予的轴突素组合物必须是无菌的。这可以通过除菌过滤膜过滤容易地完成。如果轴突素组合物是冻干的，使用这些方法的灭菌可以在冻干和重建之前或之后进行。用于肠胃外给予的组合物一般将以冻干形式或在溶液中储存。

通常将治疗组合物置于一个具有无菌入口的容器中，例如静脉内溶液袋或具有皮下注射针头可穿透的瓶塞的西林瓶。

给予所述组合物的途径与已知方法一致，即口服、通过静脉内、腹膜内、大脑内(实质内)、脑室内、肌肉内、眼内、动脉内或病灶内途径注射或输注，或通过可以可选地涉及使用导管的缓释***或植入装置给予。如果需要，所述组合物可以通过输注、大剂量注射或通过植入装置连续给予。二者择一地或者另外地，轴突素可以通过将其上已吸附了轴突素多肽的海绵或其它适当材料植入受影响区域局部给予。

当使用植入装置时，可以将该装置植入任何合适的组织或器官，例如植入脑室或植入大脑实质，轴突素可以直接通过该装置借助大剂量给予或连续给予或通过导管使用连续输注传递。

轴突素多肽可以以缓释制剂给予。缓释制剂的适当的实例包括成型粒子形式的半透聚合物基质(例如薄膜)或微胶囊。缓释基质包括聚酯、水凝胶、聚丙交酯(U.S.3,773,919,EP58,481)、L-谷氨酸和γ乙基-L-谷氨酸的共聚物(Sidman等，Biopolymers,22:547-556[1983])、聚(异丁烯酸2-羟乙酯)(poly(2-hydroxyethyl-methacrylate))(Langer等，J.Biomed.Mater.Res.,15:167-277[1981]和Langer,Chem.Tech.,12:98-105[1982])、乙烯乙酸乙酯(Langer等，见上述)或聚-D(-)-3-羟基丁酸(EP133,988)。缓释组合物亦可以包括脂质体，它可以通过本领域已知的几种方法制备(例如，DE3,218,121；Epstein等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,82:3688-3692[1985]；Hwang等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,77:4030-4034[1980]；EP52,322；EP36,676；EP88,046；EP143,949)。

在一些情况下，可能希望以活体外方式使用轴突素组合物，即，治疗从患者取出的细胞或组织，然后将其植回患者。

在其它情况下，可以通过将某些已遗传工程化(使用上述方法)以表达和分泌轴突素多肽的细胞植入患者而传递轴突素。这种细胞可以是人类细胞，可以源自患者自己的组织或源自患者人类或者非人类的另一来源。可选的，所述细胞可以永生化。所述细胞可以植入大脑、肾上腺或植入其它身体组织或器官。

在某些情况下，可能希望使用基因治疗方法以将轴突素给予患有某些神经疾病的患者。在这些情况下，编码轴突素或其片段或变异体的基因组DNA、cDNA和/或合成DNA可以可操作地与在将要注射所述组合物的组织中活跃的组成型或诱导型启动子连接。此轴突素DNA构建物或者已***载体或者没有载体，都可以直接注射入大脑或其它或者神经元或者非神经元的组织。

或者，可以将轴突素DNA构建物直接注射入肌肉组织，在所述肌肉组织中该构建物被摄入细胞并在所述细胞中表达，只要所述轴突素DNA可操作地连接至在肌肉组织中活跃的启动子，例如细胞肥大病毒(CMV)启动子、劳斯肉瘤病毒(RSV)启动子或肌肉肌酸激酶启动子。一般地，所述DNA构建物可以包括(除轴突素DNA和启动子之外)从载体得到的载体序列，所述载体诸如腺病毒载体、腺伴随病毒载体、逆转录病毒载体和/或疱疹病毒载体。所述载体/DNA构建物可以与药学可接受载体混合用于注射。

治疗所使用的轴突素组合物的有效量取决于例如治疗目标，例如使用轴突素针对的适应症、给药途径和病人的病症。因此，治疗者有必要根据需要调整剂量和给药途径，以得到最佳治疗效果。典型的日剂量范围为约0.1μg/kg至100mg/kg或更多，取决于上述因素。一般地，临床医师将给予轴突素组合物直至达到取得目标效果的剂量。所述轴突素组合物可以以单剂量给予，或在一段时间内以二个或多个剂量(其可以含有或不含有等量的轴突素)给予，或做为通过植入装置或导管的连续输注。

随着进一步的研究，有关在各种患者的各种疾病治疗的适当剂量水平的信息会出现，本领域一般技术人员在考虑治疗史、治疗的疾病类型、接受治疗者的年龄和总体健康情况的情况下，可以确定正确的剂量。一般地，剂量为0.01μg/kg体重(仅计算该蛋白质的质量，不考虑化学修饰)和300μg/kg(计算根据同前)之间。

可以利用轴突素蛋白、其片段和/或衍生物，治疗伴随有轴突素表达型式改变的、或可以得益于暴露给轴突素或抗轴突素抗体的中枢神经或外周神经***疾病或障碍。

可以使用轴突素蛋白和/或其片段或衍生物治疗病人，所述病人的中枢神经***、自主神经***或外周神经***的各种细胞已经退化和/或已被疾病损伤，所述疾病为先天性疾病、创伤、机械损伤、手术、中风、局部缺血、感染、代谢病、营养缺陷、恶性肿瘤和/或毒性药剂。更具体地说，可以对这种适应症调节(上调或下调)轴突素蛋白水平，所述适应症是早老性痴呆、帕金森病、肌萎缩性侧索硬化、Charcot-Marie-Tooth综合症、亨廷顿舞蹈病、由糖尿病或其它代谢紊乱诱导的外周神经病和/或视网膜神经营养不良或退化，诸如色素性视网膜炎、药物诱导的视网膜病、固定形式的夜盲、固定形式的夜盲、进行性锥体杆状退化等等。

在本发明的其它实施方案中，轴突素蛋白或肽或其片段或衍生物可以与组织的外科植入联用，用于需要组织植入的疾病治疗。DNA保藏

具有已***编码全长人轴突素(氨基酸1-142)的cDNA的质粒pCRScript SK+的大肠杆菌细胞，已于1996年8月9日保藏于ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,MD,USA)，保藏号是98134。

以下实施例仅用于说明本发明，在任何情况下都不限制本发明的范围。

                       实施例实施例Ⅰ：轴突素cDNA的克隆

用约8mg/kg体重的红藻氨酸盐(在磷酸盐水缓冲液[PBS]中制备5mg/ml红藻氨酸盐储存溶液)腹膜内注射约8-10周龄的雄性大鼠(Wistar)(体重为约230-300克)。约6小时后，杀死动物，取出大脑齿状回(DG)区并储存于液氮中。合并约100只动物的DG组织，通过硫氰酸鈲法(“GTC”；Chomczynski等，Anal.Biochem.,162:156[1987])的修改方法制备该组织的RNA。在GTC中裂解该组织后，接着进行2次酚抽提和一次氯仿抽提，沉淀RNA并在水中再悬浮。使用寡聚-(dT)-纤维素柱(Clontech,Palo Alto,CA)选择多聚(A)+RNA。本文将该RNA(和对应的cDNA)称为“激活DG”RNA或cDNA。

为进行减法分析、文库构建和cDNA探针检测(均在以下描述)，用DNA酶(无RNA酶；Promega,Madison,WI)处理所述RNA以消除任何污染性的基因组DNA。

使用与上述相同的方法，从同样周龄的未用红藻氨酸盐处理的雄性大鼠的正常齿状回组织和全脑组织制备多聚(A)+RNA。

在二个50μl反应中使用上述制备的激活-DG多聚(A)+RNA合成第一链cDNA。每个反应含有在约30μl逆转录酶缓冲液(Gubler等，(Gene,25:263-269[1983])中的约5μg RNA、约1μl RNA酶(4u/ul；Promega,Madison,WI)、约1ug寡聚-(dT)-XbaⅠ引物连接物(Promega,Madison,WI)、约30 uCi³²P dCTP(约3,000Ci/mmol,Amersham,Arlington Heights,IL)和约400u MLV克隆逆转录酶(BRL；GrandIsland,NY)。在约37℃约60分钟后，通过加入约10ul NaOH(1N)、约2ul EDTA(0.5M)和水至约100ul，将所述RNA在约68℃水解约20分钟。然后将所述RNA置于冰上，用约10ul 1M HCL中和。加入约5ug转移RNA，将此化合物通过Sephadex G-50旋转层析柱离心。通过比较柱洗脱液中的放射性与原先上柱的样品中的放射性可以确定cDNA的回收率。合并这二个cDNA样品，与乙酸铵进行乙醇沉淀，在水中再悬浮至约10ng/ul。

将该cDNA与预先使用二次光生物素化(Clontech,Palo Alto,CA；参见Sive等，Nucleic Acids Res.,16:10937[1988])而与生物素偶联的等体积大鼠全脑多聚(A)+RNA(1ug/ul)混合，然后与乙酸铵进行乙醇沉淀。在甲酰胺缓冲液(40％甲酰胺，50mM Hepes pH7.6,0.5M NaCl,2mM EDTA)中再悬浮至约100ng/ul cDNA和约10ug/ul RNA后，将所述溶液置于玻璃毛细管中(每个25μl)，将此管密封。将毛细管在68℃温育约3分钟，然后于52℃温育2天。打开毛细管，将其内容物加入约180μl缓冲液(Hepes pH7.6 50mM,NaCl0.5M,EDTA 2mM)中。每μl生物素化RNA加入约1μg链霉抗生物素(Vector Labs,Burlingame,CA)，将该化合物于室温温育约10分钟。温育后，进行二次酚/氯仿抽提(1体积：1体积)和一次氯仿抽提。回收的水相一般含有10-20％的用于减法克隆(substraction cloning)的总cDNA。将此单链cDNA乙醇沉淀，并再悬浮于约16μl水中。

将约1ul dATP(10mM)和约4μl 5 X TdT缓冲液(BoehringerManheim)加入该cDNA。在100℃约3分钟和在冰上冷却后，加入末端脱氧核苷酸转移酶(17μl,Boehringer,Manheim，德国)，将该混合物于约37℃温育约2小时。加入2微克的寡聚-(dT)-XbaⅠ(Promega,Madison WI)引物连接物，将该混合物于60℃温育约5分钟。在含有90mM Hepes缓冲液pH6.6、MgCl 10mM、每种浓度约为0.5mM的所有4种脱氧核苷三磷酸、约10mM DTT和10U Klenow(BoehringerManheim测序级)的约50ul总体积内进行第二链合成。于室温约6小时后，加入另一等分酶，将此混合物再温育3小时。用酚和氯仿抽提终止反应，然后加入5ug转移RNA，此cDNA与乙酸铵一起乙醇沉淀。将双链cDNA再悬浮于约9.6μl水中，用10U限制性酶XbaⅠ(Boehringer)于37℃消化5小时，然后将它上样至薄1％琼脂糖凝胶并进行电泳。切出含有大于约550碱基对(“bp”)的cDNA分子的胶条，用QIAEX(QiagenCorp.,Chatsworth,CA)提取cDNA，通过放射性计数确定回收率(约10％的总扣除cDNA)。将该cDNA连接入λ-ZAP(Stratagene,La Jolla,CA)载体臂，该载体臂预先用XbaⅠ消化，并用牛小肠磷酸酶(Boehringer Manheim)处理。使用约1ul噬菌体臂和各种浓度的cDNA(3-20ng)进行连接。包装连接物(Gigapack,Stratagene,LaJolla,CA)，测定噬菌体滴度。将文库以低密度铺平板，单独挑选单个噬菌斑，按照制造商程序从噬菌体切出载体pBluescript中的质粒(参见Short等，Nucleic Acids Res.16:7583-7600[1988])。使用标准小量制备程序，从用pBluescript质粒预先转化的大肠杆菌细胞制备质粒DNA(参见Sambrook等，分子克隆：实验室手册，冷泉港实验室出版社，冷泉港，NY[1989])。将从小量制备得到的约2-4微克质粒DNA用XbaⅠ消化，使用标准程序将其DNA印迹至Hybond N+滤膜(Amersham,Arlington Heights,IL)。

为制备筛选含有所述cDNA的滤膜的探针，将每种约100ng的单链cDNA(对照和DG激活)放射标记，方法是将其加入含有约12ul随机引物(Boehringer；约90A₂₆₀U/ml)、约2MCi³²P-dCTP(3,000Ci/mmol；Amersham,Arlington Heights,IL)、各约0.6mM的dATP、dTTP和dGTP和在800ul用于第二链cDNA合成的缓冲液(见上述)的40ul Klenow(Boehringer；约2U/ul)的混合物中进行标记。于室温以2400μl等分过夜进行温育。该反应产生约1.2×10⁹cpm的探针。

在杂交缓冲液(见下述)中于约42℃预杂交至少6小时后，将所述cDNA印迹与探针杂交。一个印迹与激活DG探针杂交，一个复制印迹与对照(正常DG cDNA)探针杂交。在溶液中进行杂交，该溶液含有50％甲酰胺、5X SSCPE(Sambrook等，1989)、10X Denhardt’s、0.5％SDS、0.5mg/ml鲱鱼精载体DNA和浓度为约1×10⁸cpm/ml的所述cDNA探针。将所述印迹在振荡的42℃水浴中温育约48小时。温育后，将印迹用0.1X SSC、0.2％SDS于68℃每次1小时清洗3次。对胶片曝光后，选择那些与激活DG探针杂交强于与对照探针杂交的cDNA克隆，用如上述制备的第二套激活DG和对照探针再筛选。将在这二次独立的筛选中与激活DG探针杂交强于与对照探针杂交的那些克隆，使用标准测序方法从两端测序(从每端约200-300bp)，通过FASTA分析(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA,85,2444-2448[1988])，在GenBank和其它公共DNA数据库中检索这些序列。根据序列比较，几个克隆看来是新的。将与本发明有关的克隆命名为：#784,#1441,#2090；#2268；#2282；#7547；#8032；#6734；和#7761。

为得到全长cDNA克隆，使用与上述类似的方法从激活DG RNA构建第二个cDNA文库。使用激活的DG多聚A RNA和寡聚-(dT)-XbaⅠ引物(Promega)如上述制备文库，但是只选择大于1.5kb的cDNA做为***物。将该文库以高密度铺平板并转移至尼龙滤膜(S&S,Keene,NH)。使用Qiagen纯化药盒(Qiagen,Chatsworth,CA)、按照制造商建议，从克隆#1441的约0.5kbp XbaⅠ入物通过分离该XbaⅠ限制片段产生探针。然后使用标准方法用α-³²P-dCTP(RediVue,Amersham,Arlington Heights,IL)放射标记该片段。使用上述条件将所述滤膜杂交。从此次筛选鉴别了几个阳性克隆。选择了二个阳性克隆144-10和1441-13，因为它们具有最长的***物(分别为约1.6kbp和1.4kbp)。使用双脱氧链终止法，用荧光双脱氧核苷酸(AppliedBiosystems Inc.,Foster City,CA)对这二个克隆在二条链上都进行测序。使用Genetics Computer Group软件(威斯康星大学，生物技术中心，Madison,WI)分析核苷酸序列。

发现克隆#1441-10具有约1604bp的***物，具有编码142个氨基酸的蛋白的长可读框(ORF)。在图1(SEQ ID NO:1)中陈述了从大鼠组织得到的该克隆的全长cDNA，命名为轴突素。在图3(SEQ ID NO:3)中陈述了大鼠轴突素的氨基酸序列。

使用聚合酶链式反应(Pwo DNA聚合酶和缓冲液；BoehringerManheim)，在如下条件下克隆人轴突素cDNA：于94℃变性5分钟，接着进行30个循环：于94℃30秒，于56℃30秒和于72℃30秒，使用以下寡聚核苷酸：

CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG(SEQ ID NO:5)

GGTATAGTCGACCCGTGCTCAGAA(SEQ ID NO:6)

用于该PCR反应的模板是使用Marathon cDNA扩增药盒(Clontech,Palo Alto,CA)按照制造商建议、从约2ug人皮质mRNA(Clontech,Palo Alto,CA)产生的双链cDNA。将预期大小(约435bp)的扩增产物亚克隆入pCR-Scirpt Amp SK(+)克隆载体(Stratagen,La Jolla,CA)，使用标准测序方法对二条链都测序。人轴突素cDNA序列示于图2(SEQ ID NO:2)。基于所述cDNA序列翻译的人轴突素推测氨基酸序列陈述于图4(SEQ ID NO:4)。

大鼠和人轴突素蛋白的分析揭示了约24个氨基酸的氨基末端疏水性推定信号肽。C-末端的27个氨基酸尾富含疏水性残基，并具有一个一般在GPI(糖基磷脂酰肌醇)膜锚定蛋白发现的共有酶切信号。成熟的膜结合蛋白有91个氨基酸(约12千道尔顿)和6个半胱氨酸残基。但是，通过在公共DNA和蛋白数据库(SWISS-PROT、PROSITE、GENBANK和PIR)中序列检索评价，该氨基酸序列不具有与任何已知蛋白的一般序列或甚至基序同源性，提示它代表新的分子类别或家族。实施例Ⅱ：轴突素蛋白和抗体的制备

将编码轴突素氨基酸30-113的大鼠轴突素cDNA(“轴突素30-113”)亚克隆入热诱导细菌表达载体pCFM1656(ATCC保藏号为69576)，以扩增和表达轴突素30-113。通过在每克细菌3ml溶菌缓冲液(50mM Tris,pH8.0、1mM EDTA和100mM NaCl，含有10mg溶菌酶和10mg脱氧胆酸钠)中裂解，分离含有轴突素30-113的包含体。用400μg DNA酶Ⅰ处理溶菌的细菌30分钟至1小时，然后于约4℃于约12000xg离心15分钟。然后在含有0.5％NP-40的9倍体积裂解缓冲液中清洗沉淀的包含体2-4次。通过SDS-PAGE评价包含体中轴突素30-113的纯度。将纯化的包含体于室温溶解(1∶20)于8M尿素、50mMTris pH8.0、50mM NaCl和5mM二硫苏糖醇(DTT)中1-2小时。于室温于约14kg离心10分钟除去不溶物质。使用以下时间过程和尿素浓度将尿素对1升上述缓冲液缓慢透析(所有的透析均在4℃进行)：8M至6M尿素，1小时；6M至4M，过夜；4M至2M,1小时；2M至1M,1小时；1M至0.5M，1小时；0.5M至0.25M,1小时，0.25M至0M,1小时。在非还原性SDS-PAGE凝胶上分析重折叠的轴突素30-113。

为制备轴突素抗体，通过标准方法合成包含成熟轴突素蛋白内部区的轴突素片段：

DCQEGAKDMWDKLRK SEQ ID NO:7)并用于免疫兔子(由Berkeley Antibody Company,Berkeley,CA准备)，导致产生多克隆抗血清，命名为AS419。亦制备抗细菌表达的如上述从溶解的包含体纯化的轴突素30-113片段的第二个多克隆兔抗血清(命名为AMG20)(Cocalico Biologicals Inc.,Reamstown,PA)。对在CHO细胞中制备的重组轴突素蛋白质印迹分析中特异性反应的抗血清进行亲和纯化，即使用含有适当固定化轴突素肽的琼脂糖珠(Pierce Chemicals,Rockford,IL)，接着通过A/G蛋白柱(PierceChemicals)浓缩抗体制剂。

通过用含有或者大鼠或者人轴突素cDNA的质粒pGREG转染中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞；ATCC保藏号为CRL-9096)，在该细胞中表达跨越氨基酸1-115的大鼠和人重组轴突素。从哺乳动物表达载体pDSRa2(描述于PCT专利申请号WO90/14363，公布于1990年11月29日)制备pGREG。

pGREG从5’至3’含有编码XhoⅠ限制性酶位点、凝血酶酶切位点(参见SEQ ID NO:8)、由Novagen(Madison,WI)单克隆抗体识别的单纯疱疹病毒表位(参见SEQ ID NO:9)、用于金属螯合层析的六聚组氨酸表位、终止密码予和SalⅠ限制性酶位点的序列。

LVPRGS(SEQ ID NO:8)

QPELAPEDPEDVE(SEQ ID NO:9)

通过使用四个在轴突素3’末端重叠的寡聚核苷酸和上述5’寡聚核苷酸(SEQ ID NO:5)的交错PCR，将该HSV/组氨酸标记加入pDSRα2。做为PCR的模板，使用p1441-10。对大鼠轴突素编码区3’端特异性的起始寡聚核苷酸加入了所述XhoⅠ凝血酶酶切位点。三次连续的PCR反应逐渐地将该标记序列加入大鼠轴突素的C末端。将产生的产物亚克隆入pDSRα2的XbaⅠ和SalⅠ位点。使用含有XbaⅠ和XhoⅠ限制性位点的PCR产物产生另外的标记构建物。

使用编码氨基酸1-115(并缺失羧基末端GPI信号肽)的人cDNA表达具有凝血酶酶切位点、单纯疱疹病毒(HSV)和位于其C末端的六聚组氨酸(HIS)表位的分泌的人轴突素。通过使用标准条件和以下寡聚核苷酸的PCR产生缺失GPI信号肽的人轴突素cDNA(即，编码氨基酸1-115):

CTAGTCTAGAACCATGGGACTTAAG(SEQ ID NO:10)

GGTATACTCGAGCCCGTTGCCGCT(SEQ ID NO:11)

将得到的373bp产物亚克隆入pGREG的XbaⅠ和XhoⅠ位点。将产生的载体命名为pDSRαhv15Tag.1。六聚组氨酸标记使得可以容易地在含有镍(Ni²⁺)的树脂(Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)上纯化轴突素。

如下述准备CHO/轴突素条件培养液。在无血清Dulbecco极限必需培养基(DMEM)中，培养含有稳定表达人标记类型的轴突素1-115(命名为hu15t36)的CHO细胞的滚瓶至约80％汇合(约48小时)。通过于约2500g离心沉淀细胞碎片，收获所述条件培养液；将上清液储存于-20℃。通过温育1ml PBS平衡的Ni²⁺/NTA树脂/100ml条件培养液(Ni²⁺/NTA树脂供应商：Qiagen Inc.,Chatsworth,CA)，分批纯化轴突素。通过用含有递增量的咪唑(20、40、80和100mM)的清洗缓冲液(20mM磷酸钠，pH6.0，和500mM NaCl)清洗树脂，除去非特异性蛋白。用500mM咪唑洗脱特异性结合HSV-组氨酸标记的轴突素。将纯化的蛋白(通过银染SDS-PAGE[BioRad Labortatories,Hercules,CA]测定纯度超过95％)浓缩约10倍并渗滤(Millipore Corp.,[Ultrafree15,5K截留分子量]Bedford,MA)到1X PBS中。使用Bio-Rad/Lowry蛋白测定，用牛血清白蛋白做为标准，估计蛋白最终浓度为30-50ng/ml。实施例Ⅲ：轴突素的组织表达A．RNA印迹分析

为评价轴突素的表达型式，从Clonetch(Palo Alto,CA)购买含有各种大鼠组织包括心脏、大脑、脾脏、肺脏、肝脏、肌肉、肾脏和睾丸的RNA的RNA印迹，用³²P标记的cRNA探针探测。如下述从亚克隆入pBluescript(Stratagene,La Jolla,CA)的大鼠轴突素cDNA制备cRNA探针。通过用PvuⅡ和SmaⅠ消化轴突素克隆1441-10，得到轴突素克隆1441-10的约430bp片段。将该片段亚克隆入质粒pBluescriptSK+(Stratagene,La Jolla,CA)，然后将其命名为cpg15subclone#2。为制备反义RNA探针，将所述质粒用BamHⅠ线性化，之后使用T7聚合酶(Promega,Madisom,WI)和³²P-UTP进行体外转录，使用约1ml异硫氰酸鈲溶菌缓冲液基本如上述分离。

通过监测溴化乙锭染色的大小分离的RNA，评价每个印迹上RNA的量，通过用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(GAPDH)的随机引物标记的cDNA片段与印迹杂交确认。

示于图5A中的RNA印迹分析鉴别了在大鼠大脑中表达的约1.6千碱基的单个mRNA条带；在肺脏组织中观察到强度较低的一个条带，其它组织的mRNA几乎没有或没有杂交。

为评价大脑各种区域中轴突素的表达，用PBS中的10mg/ml红藻氨酸盐储存溶液约8mg/kg腹膜内注射成年大鼠。约6小时后，杀死大鼠，解剖出脑组织。每100mg粉碎的组织使用约1ml异硫氰酸鈲裂解缓冲液(Chomczynski等，Anal.Biochem.,162:156[1987])，从大脑的各种区域分离RNA。裂解后，将所述溶液通过硅胶膜柱(RNeasy旋转柱，Qiagen,Chatsworth,CA)。通过在0.8-1％甲醛琼脂糖凝胶上分离将RNA进行大小分级分离，并毛细吸印至尼龙膜(Hybond-N,Amersham,Arlington Heights,IL)。用上述³²P标记的cRNA探针检测该RNA印迹。如图5中可见，大脑齿状回区的轴突素表达水平最高。B．原位杂交还免疫组织化学

在如下述用多聚甲醛固定并用石蜡包埋的大鼠胚胎组织和成年大鼠大脑组织切片上进行原位杂交和免疫组织化学。分离妊娠大鼠的胚胎，于脱水和石蜡包埋之前，在PBS中的新鲜4％多聚甲醛(4％PFA/PBS)于4℃固定过夜。通过用PBS中的4％多聚甲醛穿心灌注麻醉动物准备成年大鼠的大脑。将解剖出的大脑于4℃在PBS中的4％多聚甲醛中固定过夜，脱水并包埋于石蜡中。按照已建立的方法(Simonet,等，J.Biol.Chem.,11:8221-8229[1993])，使用如上述为RNA印迹制备的大鼠轴突素cRNA探针(除了用³⁵S-UTP替换³²P-UTP)在这些组织切片上进行原位杂交。将杂交的载玻片对柯达照相乳胶曝光，3-6周后显影，然后将所述切片用苏木精复染，使用暗视场光镜使银粒显现。

使用对在哺乳动物细胞中制备的人重组轴突素特异性的各种稀释度的亲和纯化的抗血清(AS419或AMG20，如上述)，在脱石蜡PFA固定的组织切片上进行轴突素的免疫组织化学定位。使用VectastainElite ABC染色药盒(Vector Labs,Burlingame,CA)、按照制造商说明书，用生物素化山羊抗-兔免疫球蛋白和辣根过氧化物酶标记的抗生物素蛋白检测，结合的轴突素抗体。

原位杂交分析显示，轴突素mRNA存在于早至胚胎第14天(E14)的发育中的大鼠大脑的神经上皮和分化区域之间的交界处。所述信息亦定位于包括脊神经节和三叉神经节的外周的发育中的神经元结构中。看来表达在发育期间增加，看起来随着CNS中的各个结构越明确，它就越集中于分化区内。

在成年大脑的大多数结构中都检测到轴突素mRNA。在皮质的Ⅱ-Ⅳ层、海马结构、丘脑、松果体缰和脑干中发现了最丰富的信号。在海马中，表达集中于锥体和颗粒细胞层的神经元，在齿状的下托和门区神经元中发现了丰富的水平。在小脑中，低水平的轴突素信使定位于颗粒细胞层，浦肯野细胞有分散点状标记。

上述使用轴突素抗体AS419或AMG20的大脑组织免疫组织化学染色显示轴突素集中于神经元细胞体，并且不均匀地沿着大脑无髓区的轴突凸出物分布。不均匀染色导致免疫反应区的颗粒状外观，沿着海马的下脚(subicular)复合体中的神经元凸起特别明显。轴突素沿着轴突的集中在阳性浦肯野细胞树的染色中亦有文献记录。DG的门区具有分散的强免疫反应性细胞，与轴突素mRNA原位杂交所观察到的型式一致。浦肯野神经元的不规则染色亦与点状信息定位一致。实施例Ⅳ：轴突素生物化学和表达调节

轴突素羧基末端氨基酸序列提示轴突素是膜锚定的可能性。为评价这种可能性，用或者空白质粒(称为“亲代”，不含有轴突素基因)或者用含有编码人轴突素的基因的质粒转染约1×10⁶CHO细胞，将该细胞按照已发表的方法(Kodukula等，J.Cell Biol.120:657[1993])，或者用在0.5ml释放缓冲液(25 mM Tris-HCl,pH7.5,1mM EDTA,10mM葡萄糖，250mM蔗糖)中制备的约0.4U/ml PI-PLC(磷脂酰肌醇-磷脂酶C；Calbiochem,La Jolla,CA)处理，或者仅用释放缓冲液(无PI-PLC)处理。温育后，将细胞离心以沉淀细胞碎片。通过SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)分析上清液。电泳后，将凝胶转印至硝酸纤维素纸上，用轴突素特异性亲和纯化的抗血清探测。结果示于图8A。可以看到，发现所有可检测的轴突素都存在于已用PI-PLC处理的表达轴突素的CHO细胞的上清液中，提示轴突素确实是GPI锚定的。

按照Borchelt等描述的方法(Glycobiol.3:319[1993])，用去污剂Triton X-114(Calbiochem,San Diego,CA)提取组织以得到天然轴突素，进行内源GPI-锚定轴突素的分析。将约100mg粉碎的组织悬浮于含有蛋白酶抑制剂(0.5mM苯甲酰胺，1mM PMSF和各为1μg/ml的胃酶抑制剂、亮抑蛋白酶肽、抑酶肽)的0.5ml 1X TNE缓冲液(50mM Tris-HCl,pH7.5,150mM NaCl,5mM EDTA)，并于4℃与约0.25倍体积的用1X TNE预先平衡的Triton X-114混合。通过将该混合物于30℃温育约15分钟，接着于室温以约3000g离心5分钟沉淀大的含有亲脂蛋白的去污剂微团，从溶液提取Triton X-114可溶性蛋白。重复该提取，合并含有去污剂的可溶性部分。为通过蛋白质印迹分析提取的蛋白，通过将每等分与10倍体积甲醇温育(于4℃ 10分钟，接着于14,000g于4℃离心15分钟)，沉淀20-40μl的去污剂等分。将沉淀再悬浮于约40ul的SDS-PAGE样品缓冲液(含有β-巯基乙醇)，在16％SDS-PAGE凝胶(Novex,San Diego,CA)上按大小分级分离。电泳后，使用标准蛋白质印迹程序，将蛋白转移至硝酸纤维素纸上。使用轴突素特异性亲和纯化的抗血清(AS419或AMG20，如上述)做为第一抗体、辣根过氧化物酶缀合山羊-抗-兔抗血清做为第二抗体(稀释约1∶10⁴，得自Southern Biotechnology Associates,Inc.,Birmingham,Alabama)，检测轴突素。使用过氧化物酶敏感增强化学发光(“ECL”,Amersham,Arlington Heights,IL)，检测抗体。结果示于图8B。明显的是，大脑皮质区和海马区表达最高水平的轴突素。将如上述用PI-PLC制备的重组CHO细胞的轴突素示于泳道1做为对比。蛋白质印迹的泳道中轴突素迁移的差异，推测是因为连接了一些脂质的轴突素迁移率改变。

为研究轴突素mRNA表达的调节，将重组人BDNF、NT-3、NGF或FGF(约10ng/ml)、KCl(约50mM)或钙通道阻断物AMPA或NMDA(约10μM)加入如下述实施例V中制备的7DIV E18大鼠海马或皮质培养物中。温育约6小时后，通过RNeasy方法(Qiagen,Chatsworth,CA)从每个培养物分离RNA。将约5μg的该RNA上样至凝胶，通过电泳分离，然后进行RNA印迹。用跨越编码区的大鼠轴突素cRNA探针(如上述)检测该印迹。结果示于图6A。可以看到，NMDA和AMPA处理导致轴突素mRNA水平增加约5倍，使用去极化浓度的KCl时观察到类似程度的诱导。

为评价BDNF对体内轴突素表达水平的影响，将BDNF(10mg/ml,1-2μl)或盐水(对照)心室内注射入出生后4天的大鼠幼仔。给予BDNF或盐水约6小时后，杀死幼仔，从皮质或海马大脑组织分离总RNA。如在图6B中看到的，BDNF主要在海马中体内诱导轴突素信息，在皮质中程度小。实施例Ⅴ：轴突素生物活性检测

通过从胚胎第18天的大鼠胚胎解离解剖的大脑区，制备初生海马和皮质胚胎大鼠神经元培养物。使用基于木瓜蛋白酶的组织解离药盒(Worthington Biochemical Corp.,Freehold,NJ)，进行胚胎神经元的解离和纯化。将10-30个胚胎的解剖组织再悬浮于2.5mlEarles平衡盐溶液(EBSS)中，该溶液含有：50单位木瓜蛋白酶、1mML-半胱氨酸、0.5mM EDTA和500单位DNA酶Ⅰ。温和振荡，将组织解离10-15分钟。将解离的细胞于300g离心5分钟沉淀，再悬浮于2.7mlEBSS、0.3ml卵类粘蛋白抑制剂溶液(10mg/ml卵类粘蛋白蛋白酶抑制剂和10mg/ml牛血清白蛋白)和250单位DNA酶Ⅰ。将该悬浮液加至5ml卵类粘蛋白抑制剂溶液上面，于70g离心6分钟沉淀。将沉淀的细胞再悬浮于10ml含有神经基础培养基(Neurobasal medium)(Gibco/BRL,Grand Island,NY)的B27中，并通过一个40μm尼龙网细胞渗滤器(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)。为进行RNA分析，将解离的神经元铺平板于用多聚L-鸟氨酸(得自Sigma,St.Louis,MO，使用浓度为150mM硼酸钠中约0.1mg/ml,pH8.4)和层粘连蛋白(得自Gibco/BRL,Grand Island,NY，使用浓度为PBS中约1μg/ml)预先包被的6孔Falcon组织培养板(Becton Dickinson,Lincoln Park,NJ)中。神经元铺平板密度为海马神经元约2×10⁵/cm²、皮质神经元约3×10⁵/cm²。将细胞在补加了1X B-27补充物(Gibco/BRL,GrandIsland,NY)和50mg/ml硫酸庆大霉素(Gibco/BRL,Grand Island,NY)的神经基础培养基(Gibco/BRL,Grand Island,NY)中生长。培养7天后，每个培养物的神经胶质细胞含量小于5％，神经胶质细胞含量的评价是通过计数由使用对该神经胶质细胞特异性标记特异性的抗体的间接免疫荧光染色鉴别的胶质原纤维酸性蛋白(GFAP)阳性细胞进行。培养7-8天后如所述处理细胞。

使用如上述制备的海马和皮质神经元进行轴突突起检测。将细胞铺平板于多聚赖氨酸(PBS中20μg/ml)包被的35mm平板，密度为约5×10³细胞/cm²，存在或不存在Ni²⁺纯化的轴突素(如上述制备)。培养4天后，在分析之前，通过用非特异性亲脂性染料DiI(10uM，用565nm滤光片显现)于37℃染色约30分钟对活培养物染色、接着在补加神经基础培养基的B-27(见上述)中清洗3次，评价轴突突起。

为检验轴突素的生物学功能，在中国仓鼠卵巢(CHO)细胞中产生缺失羧基末端27个氨基酸的组氨酸标记类型的轴突素，通过Ni²⁺亲和层析从无血清条件培养基纯化至同质性超过90％，同质性通过银染SDS-聚丙烯酰胺凝胶(见上述)测定。在存在约150ng/ml该重组轴突素的情况下，将E18大鼠胚胎海马和皮质神经元铺平板于多聚赖氨酸包被培养皿中。将同样的体积加入对照中，该对照使用相当的源自用空白表达载体转染的CHO细胞的条件培养基的Ni²⁺亲和部分。培养4天后，在存在轴突素时铺平板的神经元显示比对照培养物更广泛的轴突发生，如图9中所示。与对照细胞相比，轴突素处理的细胞具有较长、更加分枝的轴突树，并且从胞体延伸的轴突数量增加。用亲脂性荧光染料DiI非特异性染色的细胞，在胞体和轴突板状伪足的组织上显示显著的区别(图9)。未处理的对照细胞具有扁平的细胞胞体和宽阔的明显不集中的、沿着许多轴突的长度或朝着其末端的板状伪足，而轴突素处理的细胞具有良好分化的细胞胞体和纤细的明确的突起。使用纯化的细菌轴突素观察到类似的生轴突活性。轴突素cDNA保藏

编码全长人轴突素的cDNA已于1996年8月9日保藏于ATCC(美国典型培养物保藏中心，12301Parklawn Drive,Rockville,MD,USA)，保藏号是98134。

           序列表(1)一般资料

(ⅰ)受让人：Amgen Inc.

(ⅱ)发明名称：新神经基因

(ⅲ)序列数：11

(ⅳ)通信地址：

   (A)收信人：AMGEN INC.

   (B)街道：1840 DEHAVILLAND DRIVE

   (C)城市：THOUSAND OAKS

   (D)州：CA

   (E)国家：美国

   (F)邮政编码：91320-1789

(ⅴ)计算机可读形式

   (A)媒体类型：软盘

   (B)计算机：IBM兼容机

   (C)操作***：PC-DOS/MS-DOS

   (D)软件：PatentIn Release#1.0，版本1.30

(ⅵ)当前申请数据

   (A)申请号：08/694.579

   (B)提交日期：1996年8月9日

   (C)分类：

(ⅷ)代理律师/代理人资料

   (A)姓名：OLESKI,NANCY A.

   (B)注册号：34,688

   (C)参考/档案号：A-413(2)SEQ ID NO:1的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：1604个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:1:ACTCTCTCGC TCTCTTTCTG TCTCTTCCTC GCTCCCTCTC TTTCTCTCCT CCCTCTGCCT       60TCCCAGTGCA TAAAGTCTCT GTCGCTCCCG GAACTTGTTG GCAATGCCTA TTTTTCAGCT      120TTCCCCCGCG TTCTCTAAAC TAACTATTTA AAGGTCTGCG GTCGCAAATG GTTTGACTAA      180ACGTAGGATG GGACTTAAGT TGAACGGCAG ATATATTTCA CTGATCCTCG CGGTGCAAAT      240AGCTTACCTG GTGCAGGCCG TGAGAGCAGC AGGCAAGTGC GATGCAGTCT TTAAGGGCTT      300TTCAGACTGT TTGCTCAAGC TGGGTGACAG CATGGCCAAC TACCCGCAGG GCCTGGACGA      360CAAGACGAAC ATCAAGACCG TGTGCACATA CTGGGAGGAT TTCCACAGCT GCACGGTCAC      420AGCTCTTACG GATTGCCAGG AAGGGGCGAA AGATATGTGG GATAAACTGA GAAAAGAATC      480GAAAAACCTC AATATCCAAG GCAGCTTATT CGAACTCTGC GGCAGCGGCA ACGGGGCGGC      540GGGGTCCCTG CTCCCGGCGC TTTCCGTGCT CCTGGTGTCT CTCTCGGCAG CTTTAGCGAC      600CTGGCTTTCC TTCTGACTTC TGAGCACGGG GCCGGGTCCC CCCTCCGCTC ACCCACCCAC      660ACTCACTCCA TGCTCCCGGA AATCGAGAGG AAGAGCCATT CGTTCTCTAA GGACGTTGTG      720ATTCTCTGTG ATATTGAAAA CACTCATATG GGATTGTGGG AAATCCTGTT TCTCTCTTTT      780TTTTTTTTTA ATTTTTTTTT ATTTTGGTTG AGTCCTTGTG TTTTAGTTGC CAAATGTTAC      840CGATCAGTGA GCAAAGCAAG CACAGCCAAA ATCGGACCTC ACCTTAAGTC CGTCTTCACA      900CAAAAATAAG AAAACGGCAA ACTCACCCCC ATTTTTAATT TTGTTTTTAA TTTTACTTAC      960TTATTTATTT ATTTATTTTT TGGCAAAAGA ATCTCAGGAA TGGCCCTGGG CCACCTACTA     1020TATTAATCAT GTTGATAACA TGAAAAATGA TGGGCTCCTC CTAATGAGAA AGCGAGGAGA     1080GGAGAAGGCC AGGGGAATGA GCTCAAGAGT GATGCCCACG TGGGAATAAT CGCTCACGTC     1140TTTCTTCCAC AGTACCTTGT TTTGATCATT TCCACAGCAC ATTTCTCCTC CAGAAACGCG     1200AAAAACACAA GCGTGTGGGT TCTGCATTTT TAAGGATAAG AGAGAGAAAG AGGTTGGGTA     1260TAGTAGGACA GGTTGTCAGA AGAGATGCTG CTATGGTCAC GAGGGGCCGG TTTCACCTGC     1320TATTGTCGTC GCCTCCTTCA GTTCCACTGC CTTTATGTCC CCTCCTCTCT CTTGTTTTAG     1380CTGTTACACA TACAGTAATA CCTGAATATC CAACGGTATA GTTCACAAGG GGGTAATCAA     1440TGTTAAATCT AAAATAGAAT TTAAAAAAAA AAGATTTTGA CATAAAAGAG CCTTGATTTT     1500AAAAAAAAAG AGAGAGATGT AATTTAAAAA GTTTATTATA AATTAAATTC AGCAAAAATT     1560TGCTACAAAG TATAGAGAAG TATAAAATAA AAGTTATTGT TTGA                      1604(2)SEQ ID NO:2的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：435个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：cDNA

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:2:ATGGGACTTA AGTTGAACGG CAGATATATT TCACTGATCC TCGCGGTGCA AATAGCGTAT       60CTGGTGCAGG CCGTGAGAGC AGCGGGCAAG TGCGATGCGG TCTTCAAGGG CTTTTCGGAC      120TGTTTGCTCA AGCTGGGCGA CAGCATGGCC AACTACCCGC AGGGCCTGGA CGACAAGACG      180AACATCAAGA CCGTGTGCAC ATACTGGGAG GATTTCCACA GCTGCACGGT CACAGCCCTT      240ACGGATTGCC AGGAAGGGGC GAAAGATATG TGGGATAAAC TGAGAAAAGA ATCCAAAAAC      300CTCAACATCC AAGGCAGCTT ATTCGAACTC TGCGGCAGCG GCAACGGGGC GGCGGGGTCC      360CTGCTCCCGG CGTTCCCGGT GCTCCTGGTG TCTCTCTCGG CAGCTTTAGC GACCTGGCTT      420TCCTTCTGAG CACGG                                                       435(2)SEQ ID NO:3的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：142个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:3:Met Gly Leu Lys Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Ser Leu Ile Leu Ala Val1               5                   10                  15Gln Ile Ala Tyr Leu Val Gln Ala Val Arg Ala AIa Gly Lys Cys Asp

        20                  25                  30Ala Val Phe Lys Gly Phe Ser Asp Cys Leu Leu Lys Leu Gly Asp Ser

    35                  40                  45Met Ala Asn Tyr Pro Gln Gly Leu Asp Asp Lys Thr Asn Ile Lys Thr

50                  55                  60Val Cys Thr Tyr Trp Glu Asp Phe His Ser Cys Thr Val Thr Ala Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys

            85                  90                      95Glu Ser Lys Asn Leu Asn Ile Gln Gly Ser Leu Phe Glu Leu Cys Gly

        100                 105                 110Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Leu Ser Val Leu

    115                 120                 125Leu Val Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Trp Leu Ser Phe

130                 135                 140(2)SEQ ID NO:4的信息：

  (ⅰ)顺序特征：

      (A)长度：142个氨基酸

      (B)类型：氨基酸

      (C)链型：单链

      (D)拓扑学：线性

  (ⅱ)分子类型：蛋白

  (ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:4:Met Gly Leu Lys Leu Asn Gly Arg Tyr Ile Ser Leu Ile Leu Ala Val1               5                   10                  15Gln Ile Ala Tyr Leu Val Gln Ala Val Arg Ala Ala Gly Lys Cys Asp

        20                  25                  30Ala Val Phe Lys Gly Phe Ser Asp Cys Leu Leu Lys Leu Gly Asp Ser

    35                  40                  45Met Ala Asn Tyr Pro Gln Gly Leu Asp Asp Lys Thr Asn Ile Lys Thr

50                  55                  60Val Cys Thr Tyr Trp Glu Asp Phe His Ser Cys Thr Val Thr Ala Leu65                  70                  75                  80Thr Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys

            85                  90                  95Glu Ser Lys Asn Leu Asn Ile Gln Gly Ser Leu Phe Glu Leu Cys Gly

       100                  105                 110Ser Gly Asn Gly Ala Ala Gly Ser Leu Leu Pro Ala Phe Pro Val Leu

    115                 120                 125Leu Val Ser Leu Ser Ala Ala Leu Ala Thr Trp Leu Ser Phe

130                 135                 140(2)SEQ ID NO:5的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：25个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc=“合成DNA”

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:5:CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG                                             25(2)SEQ ID NO:6的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：24个碱基对

    (B)类型：核酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：其它核酸

    (A)描述：/desc=“合成DNA”

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:6:GGTATAGTCG ACCCGTGCTC AGAA                                             24(2)SEQ ID NO:7的信息：

(ⅰ)顺序特征：

    (A)长度：15个氨基酸

    (B)类型：氨基酸

    (C)链型：单链

    (D)拓扑学：线性

(ⅱ)分子类型：蛋白

(ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:7:

Asp Cys Gln Glu Gly Ala Lys Asp Met Trp Asp Lys Leu Arg Lys

1               5                    10                  15(2)SEQ ID NO:8的信息：

 (ⅰ)顺序特征：

     (A)长度：6个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑学：线性

 (ⅱ)分子类型：蛋白

 (ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:8:

Leu Val Pro Arg Gly Ser

l               5(2)SEQ ID NO:9的信息：

 (ⅰ)顺序特征：

     (A)长度：13个氨基酸

     (B)类型：氨基酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑学：线性

 (ⅱ)分子类型：蛋白

 (ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:9:

Gln Pro Glu Leu Ala Pro Glu Asp Pro Glu Asp Val Glu

1               5                   10(2)SEQ ID NO:10的信息：

 (ⅰ)顺序特征：

     (A)长度：25个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑学：线性

 (ⅱ)分子类型：其它核酸

     (A)描述：/desc=“合成DNA”

 (ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:10:CTAGTCTAGA ACCATGGGAC TTAAG                                           25(2)SEQ ID NO:11的信息：

 (ⅰ)顺序特征：

     (A)长度：24个碱基对

     (B)类型：核酸

     (C)链型：单链

     (D)拓扑学：线性

 (ⅱ)分子类型：其它核酸

     (A)描述：/desc=“合成DNA”

 (ⅹⅰ)顺序描述：SEQ ID NO:11:GGTATACTCG AGCCCGTTGC CGCT                                            24

Claims (23)

1．编码多肽、选自以下的核酸分子：

(a)SEQ ID NO:1的核酸分子；

(b)SEQ ID NO:2的核酸分子；

(c)编码SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子；

(d)编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子；

(e)编码与SEQ ID NO:3或SEQ ID NO:4的多肽至少70％相同的多肽的核酸分子；和

(f)是上述(a)-(e)的任何一个的互补物的核酸分子。

2．是SEQ ID NO:1的核酸分子。

3．是SEQ ID NO:2的核酸分子。

4．编码SEQ ID NO:3的多肽的核酸分子。

5．编码SEQ ID NO:4的多肽的核酸分子。

6．包含权利要求1的核酸分子的载体。

7．包含权利要求2的核酸分子的载体。

8．包含权利要求3的核酸分子的载体。

9．包含权利要求4的核酸分子的载体。

10．包含权利要求5的核酸分子的载体。

11．包含权利要求6的载体的宿主细胞。

12．包含权利要求7的载体的宿主细胞。

13．包含权利要求8的载体的宿主细胞。

14．包含权利要求9的载体的宿主细胞。

15．包含权利要求10的载体的宿主细胞。

16．产生轴突素多肽的方法，包括以下步骤：

(a)在合适宿主中表达由权利要求1的核酸编码的多肽；和

(b)分离该多肽。

17．权利要求16的方法，其中该多肽是SEQ ID NO:3或SEQ IDNO:4。

18．选自以下的轴突素多肽：

(a)SEQ ID NO:3的多肽；

(b)SEQ ID NO:4的多肽；和

(c)与(a)或(b)的多肽至少70％相同的多肽。

19．是SEQ ID NO:4的多肽或其生物学活性片段的轴突素多肽。

20．不具有氨基末端甲硫氨酸的权利要求19的轴突素多肽。

21．选自以下的权利要求20的轴突素多肽：氨基酸25-115；氨基酸1-115；和氨基酸1-113。

22．特异性结合人轴突素的抗体或其片段。

23．权利要求22的抗体，它是单克隆抗体。

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