CN112430584B

CN112430584B - 一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用

Info

Publication number: CN112430584B
Application number: CN202011430369.8A
Authority: CN
Inventors: 黄小三; 王春孟; 戴雨沁; 董慧珍; 陈紫龄; 朱雨; 胡文洁; 罗婧; 张绍铃; 许鑫文; 王海旭
Original assignee: Nanjing Agricultural University
Current assignee: Nanjing Agricultural University
Priority date: 2020-12-07
Filing date: 2020-12-07
Publication date: 2022-05-13
Anticipated expiration: 2040-12-07
Also published as: CN112430584A

Abstract

本发明提供了杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用，属于分子生物学技术领域。杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示。一种编码所述杜梨泛素连接酶的基因PbPUB21核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物，使杜梨泛素连接酶基因在拟南芥中超表达，获得的转基因植株具有调控拟南芥的抗旱性的功能。同时通过病毒诱导基因PbPUB21沉默杜梨幼苗，与对照野生型相比抗旱能力下降，表明杜梨泛素连接酶及其对应的编码基因的存在具有提高植物抗旱能力的生物学功能。

Description

一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用。

背景技术

梨是当今世界上主要栽培的经济果树树种之一，而中国又是梨重要的起源地之一，是全世界梨产量位居第一的大国。梨在中国是仅次于苹果和柑橘的第三大水果，种植面积尤为广泛。虽然我国梨优势产区的布局与规划极大地促进了梨产业的快速发展，梨产区在我国分布广泛，形成了从东北到广西，云南到山东都有种植的“三区四点”产区布局模式。梨树的生长和发育很容易受到地理和气候条件等环境因素的影响。盐、干旱、低温等非生物逆境胁迫严重影响梨的产量和品质，研究植物耐/抗非生物逆境胁迫的分子生物学机理，提高作物耐(抗)非生物逆境特性，对确保梨高产、稳产显得尤为重要。由于梨在育种方面存在遗传杂合度高，童期长、大多数自交不亲和、育种目标不可确定性等问题，导致梨育种进展缓慢，常规的育种方法已经不能满足现代梨产业栽培对品种的需求。随着植物组织培养技术与植物生物技术的迅速进步，如今可以利用组织培养技术育种、遗传转化育种、体细胞杂交等方法选育植物新品种。利用植物基因工程技术对植物的性状进行改良，培养抗性强的品种，对梨抗逆育种有着广阔的应用和发展前景。

作为固生作物，植物的一生都处在不利的生长环境中。干旱、温度变化、高盐、辐射和养分缺失等非生物胁迫严重的影响植物的生长发育和产量。为了有效的感知、响应和适应这些一直在变的环境，植物通过精准地调节它们的生理变化来最大化避免非生物胁迫带来的伤害(吴慧娟等，2006)。当胁迫发生后，植物可以从分子水平、细胞水平和生理生化水平对胁迫做出反应，从而能够得以生存。目前，通过突变体筛选、反向遗传学功能验证、转录组分析、蛋白组分析以及代谢组分析等手段，已归纳总结出植物非生物胁迫信号调控的四个途径，包括转录调控、转录后修饰、表观遗传学调控及翻译后修饰调控(Hirayama etal.,2010)。翻译后调控包括泛素化修饰、SUMO化修饰及磷酸化修饰等(Hirayama et al.,2010)，是目前植物对非生物胁迫调控机制研究的一个热点。

泛素/26S蛋白酶体***(ubiquitin/26S proteasome system,UPS)广泛存在于所有的真核细胞中，其作用途径具有高度的保守性(王庆敏等，2001)。26S蛋白酶体介导的蛋白质降解途径是真核生物体内最普遍、最有效的蛋白质降解途径之一(McClellan et al.,2005)。蛋白质的泛素化需要多个蛋白的共同参与，其中主要有泛素蛋白Ub(Ubiquitin)、泛素活化酶E1(ubiquitin activating enzyme)、泛素结合酶E2(ubiquitin conjugatingenzyme)和泛素连接酶E3(ubiquitin ligase)。泛素蛋白作为蛋白降解的分子标签被共价连接到底物分子上，这一过程需要泛素激活酶E1、泛素结合酶E2、泛素连接酶E3三个不同作用的酶参与(倪晓光等，2007)。在拟南芥中至少有6％的基因编码26S蛋白酶体途径中的组分，其中有16个基因编码泛素蛋白；有23个基因编码20S核心蛋白颗粒；有31个基因编码19S调控亚基蛋白；有2个基因编码泛素激活酶E1；45个基因编码泛素结合酶E2；有至少1300个基因编码泛素连接酶E3(Smalle et al.,2004)，其中泛素连接酶主要决定了底物特异性。

泛素蛋白酶体***广泛存在于真核生物的细胞质和细胞核中，它们通过调控调节蛋白的丰度，降解错误折叠和受损蛋白来响应非生物胁迫(郭启芳，2007)。U-box区域控制蛋白(PUB)在非生物胁迫中发挥了重要的作用，包括参与调控植物耐旱性，耐低温及盐胁迫反应。

在拟南芥中，2个PUB基因PUB22和PUB23的过表达使其对盐胁迫和干旱胁迫更为敏感，它们的泛素化作用破坏了26S蛋白酶体级联，使植物易受环境的影响(Cho S K et al.,2008)。同样，PUB基因PUB46和PUB48在抗干旱胁迫反应中也发挥了正调控作用(Adler G etal.,2017)。在水稻中，ZFRGI基因负调控植株抗干旱(方慧敏等，2014)。马铃薯U-box型E3连接酶StPUB27含66个基因，过表达使其叶片气孔增大，电导率升高，使气孔开度减小，表明StPUB27可能通过蛋白修饰来调节植株抗性。同时StPUBl7负调控植株耐旱性(唐勋等，2018)。VaPUB为山葡萄(Vitis amurensis)中U-box型E3连接酶，将VaPUB在拟南芥中过表达可提高ICE-CBF冷反应通路中的正调控基因的表达，从而显著提高植物的抗寒性及耐盐性(缴莉，2017)。在拟南芥中，U-box型E3基因AtPUB18、AtPUB19和AtPUB31均正调控其耐盐性。且在盐胁迫中，atpubl8、atpubl9双突变体表现出更高的敏感性。此外，拟南芥中还含有耐盐性的负调控基因AtPUB30(李龙，2016；Bergler J et al.,2011)。但在梨中尚未见该基因克隆及功能验证的报道，更未见应用其基因转化植物提高抗旱的文献报道。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用。

本发明提供了一种杜梨泛素连接酶，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。

本发明提供了一种编码所述杜梨泛素连接酶的基因PbPUB21，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。

本发明提供了一种用于扩增所述基因PbPUB21的引物对，包括核苷酸序列如SEQID NO：3所示的正向引物和核苷酸序列如SEQ ID NO：4所示的反向引物。

本发明提供了一种包含所述基因PbPUB21的重组植物表达载体。

优选的，在植物表达载体pCAM1300-GFP的基础上***所述基因PbPUB21。

优选的，所述植物表达载体pCAM1300-GFP的***所述基因PbPUB21的多克隆位点包括Xba I和BamHI。

本发明提供了所述杜梨泛素连接酶、所述基因PbPUB21、所述引物对或所述重组植物表达载体在植物抗旱中的应用。

本发明提供了所述杜梨泛素连接酶、所述基因PbPUB21、所述引物对或所述重组植物表达载体在抗旱植物育种中的应用。

本发明提供了所述杜梨泛素连接酶、所述基因PbPUB21、所述引物对或所述重组植物表达载体在构建抗旱转基因植物中的应用。

优选的，所述植物包括草本植物或木本植物；更优选所述草本植物包括拟南芥；所述木本植物包括杜梨。

本发明提供了一种杜梨泛素连接酶，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。本发明利用农杆菌介导的遗传转化方法转化模式植物(拟南芥)，使杜梨泛素连接酶基因在拟南芥中超表达，获得的转基因植株，经生物学功能验证，表明本发明提供的杜梨泛素连接酶和对应的编码基因PbPUB21具有调控拟南芥的抗旱性的功能。同时通过病毒诱导基因PbPUB21沉默(VIGS)杜梨幼苗，获得的沉默株系经生物学功能验证，与对照野生型相比抗旱能力下降，表明杜梨泛素连接酶及其对应的编码基因的存在具有提高植物抗旱能力的生物学功能。

附图说明

图1为本发明转基因抗旱植物构建方法的技术流程示意图；

图2为实施例2中PbPUB21编码基因在脱水(图2-A)、低温(图2-B)、高盐(图2-C)和脱落酸(图2-D)胁迫下的表达示意图；

图3是实施例3中PbPUB21基因的亚细胞定位，其中；图3-A，35s：GFP基因(对照)在暗场、紫外线光、明场下的成像，其中图(最右)为叠加后的成像；图3-B，PbPUB21-GFP在暗场、紫外线光、明场下的成像，其中图(最右)为叠加后的成像；

图4是实施例4中转PbPUB21拟南芥植株鉴定图，图4-A为利用基因特异引物进行PCR鉴定拟南芥T0代转基因植株，其中M：Marker，+：质粒，-：野生型植株，#4～#8：转基因株系，图4-B为T1代拟南芥mRNA水平的半定量PCR检测，图4-C为RT-PCR鉴定转基因拟南芥T1代植株的超表达分析；

图5是本发明中实施例4转PbPUB21基因拟南芥株系(#4和#5)及非转基因植株(WT)脱水处理后表型和生理指标测定，其中，图5-A是20天大的拟南芥植株脱水处理120min前后的表型；测定了脱水后植株的失水率(5-B)、电导率(5-C)以及丙二醛含量(5-D)；

图6是本发明中实施例4转PbPUB21基因株系(#4和#5)及非转基因植株(WT)干旱处理前后及复水3天后表型和生理指标测定，其中，图6-A是30天大的拟南芥植株在干旱处理14天及复水3天后的表型图；图6-B是对应的荧光叶绿素的表型图；图6-C～图6-E依次表示干旱处理后的电导率、丙二醛含量以及Fv/Fm结果；

图7是本发明中实施例4转PbPUB21基因株系(#4和#5)及野生型(WT)植株干旱处理后组织化学染色分析H₂O₂和O^2-积累的测定结果图；图7-A是30天大的拟南芥植株干旱处理14天后未转化植株和两个转基因株系活性氧组织化学染色图，采用二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑(NBT)分别对H₂O₂(图上)和O^2-(图下)进行染色；并测量了样品中的H₂O₂(图7-B)和抗O^2-(图7-C)含量；

图8为实施例5中PbPUB21的编码基因沉默的杜梨幼苗株系(pTRV2-1，pTRV2-2和pTRV2-3)及野生型植株(WT)干旱处理15天的表型和生理指标测定结果图，其中图8-A是生长正常生长的盆栽植株表型图(处理前)、干旱处理15天后表型图；图8-B是3个沉默株系及野生型植株在处理前和干旱处理后荧光叶绿素照片，图8-C是干旱处理后电导率测定结果图，图8-D是干旱处理后丙二醛测定结果图；图8-E为实时定量PCR分析杜梨不同病毒沉默株系中的PbPUB21的编码基因的表达量；图8-F是干旱处理前后Fv/Fm结果图；

图9是本发明中实施例5中PbPUB21的编码基因沉默的杜梨幼苗株系(pTRV2-1，pTRV2-2和pTRV2-3)及野生型植株(WT)干旱处理后H₂O₂和O^2-积累的测定结果图；图9-A和图9-B分别是样品中的H₂O₂和抗O^2-含量。

具体实施方式

本发明提供了一种杜梨泛素连接酶，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ IDNO：1所示。SEQ ID NO：1所示的杜梨泛素连接酶编码444个氨基酸，等电点为6.01，分子量为49.81KDa。

本发明提供了一种编码所述杜梨泛素连接酶的基因PbPUB21，所述编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。实验表明，随着处理时间的延长，在9h内编码基因的表达量呈现递增的趋势，12个小时后表达量开始下降，所述编码基因受干旱胁迫的影响，从而响应抗旱机制，使杜梨实现抗旱功能；转PbPUB21超表达纯系应对脱水胁迫处理后，从表型上看，转基因株系的叶片失水程度明显比未转化植株低。同时过表达的PbPUB21基因的株系通过有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。

在本发明中，所述编码杜梨泛素连接酶基因PbPUB21的克隆方法，优选包括以下步骤：

提取获得杜梨的RNA；

将所述RNA反转录获得cDNA；

以所述cDNA为模板，用正向引物F1和反向引物R1进行PCR扩增获得所述杜梨泛素连接酶基因PbPUB21。

在本发明中，所述正向引物F1的序列如SEQ ID NO:3所示(5'-atgggtttaggctggagaagga-3')所述反向引物R1的序列如SEQ ID NO:4所示(5'-aaacgaccttctaatactcttgaaatctacag-3')。所述引物对的来源没有特殊限制，采用本领域所熟知的生物合成公司合成即可。在本发明实施例中，所述引物对委托上海生工生物工程有限公司合成。PCR扩增使用的体系优选每50μL包括：5×Q5反应缓冲液10μL，10mM dNTP 1μL，10μM上游引物F12.5μL，10μM下游引物2.5μL，模板cDNA 0.5μL，Q5高保真DNA聚合酶0.5μL，dd H₂O补足50μL。所述PCR扩增的程序优选包括:94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。

本发明提供了一种包含所述基因PbPUB21的重组植物表达载体。

本发明对植物表达载体的种类不做具体限定，采用本领域所熟知的植物表达载体即可。在本发明实施例中，优选在植物表达载体pCAM1300-GFP的基础上***所述基因PbPUB21。所述植物表达载体pCAM1300-GFP的***所述基因PbPUB21的多克隆位点优选包括XbaI和BamHI。

在本发明中，所述重组植物表达载体的构建方法优选包括以下步骤：

A.将上述扩增得到的基因PbPUB21和载体分别采用相同的内切酶进行酶切；得到含有粘性末端的基因PbPUB21片段和线性质粒；

B.将所述含有粘性末端的基因PbPUB21片段和线性质粒进行连接，得到包含所述基因PbPUB21的重组植物表达载体。

在本发明中，所述内切酶的种类根据载体的种类选择，根据所述载体的外源性片段***的位置选择对应的内切酶。在本发明实施例中，当植物表达载体为pCAM1300-GFP时，采用的内切酶包括Xba I和BamHI。本发明对所述酶切的条件不做具体限定，采用本领域所熟知的酶切条件即可，例如37℃酶切3～4h。本发明对所述连接的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的连接方法即可，例如采用T7连接酶进行连接；所述连接的条件优选为37℃连接12h。连接后，本发明还优选对连接产物进行鉴定。所述鉴定的方法优选将所述连接产物转化入大肠杆菌菌株中，经培养，筛选，得到菌落经扩大培养，涂平板，挑取单菌落后得到的菌液进行菌落PCR。所述菌落PCR扩增用引物为正向引物F1(SEQ ID NO:3)和反向引物R1(SEQ ID NO:4)。

在本发明中，所述植物抗旱的方法，优选包括以下步骤：

S1.以杜梨的cDNA为模板，采用所述引物对进行PCR扩增，得到PCR产物；

S2.将所述PCR产物***植物表达载体中构建重组植物表达载体；

S3.所述重组植物表达载体以农杆菌介导转入植物组织中，诱导培养，得到重组植物植株。

本发明对所述PCR扩增、构建重组植物表达载体以及农杆菌介导转入植物组织的方法不做具体限定，采用本领域所熟知的转基因植物的构建方法相同。所述植物优选包括草本植物或木本植物；本发明实施例中，以拟南芥作为草本植物的代表，以杜梨为木本植物的代表进行举例说明，但不应理解为对本发明保护范围的限制。

在本发明中，基因PbPUB21在构建的重组植物植株中超表达，使其抗脱水和抗旱能力比未转化植株(WT)有显著增强。过表达PbPUB21基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。利用病毒介导的VIGS技术将杜梨中PbPUB21基因瞬时沉默后，沉默PbPUB21基因的株系与对照野生型相比抗旱能力明显下降。因此本发明还提供了所述杜梨泛素连接酶、所述基因PbPUB21、所述引物对或所述重组植物表达载体在构建抗旱转基因植物中的应用。

在本发明中，在所述抗旱植物育种中的应用，优选包括以基因PbPUB21为筛选标记或采用所述引物对对培育后代进行扩增鉴定，以高表达基因PbPUB21的培育后代作为育种目标。

下面结合实施例对本发明提供的杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。

实施例1

杜梨PbPUB21基因全长cDNA的克隆方法

从杜梨中筛选到一个泛素连接酶基因PbPUB21，根据PbPUB21基因的序列和premier 5.0设计引物，用RT-PCR方法从杜梨上扩出其全长。详细步骤如下：cDNA第一链的合成参照TIANGEN反转录试剂盒的操作说明进行。所得的第一链cDNA用于PbPUB21基因的PCR扩增。所述PCR扩增的反应总体积50μl，其中杜梨cDNA 1μl，上下游引物各2.5μl，TaqDNA聚合酶1μl，Buffer缓冲液25μl，灭菌ddH₂O 18μl。PCR扩增的反应程序如下：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火90s，72℃延伸90s，35个循环，循环完成后72℃延伸10min。扩增完成后产生单一条带的PCR产物经1％的琼脂糖凝胶电泳后，切下目的条带，按AxyPrep胶回收试剂盒使用说明步骤回收特异目的条带。

回收纯化的溶液与pEASY-T1载体进行连接,连接体系中总体积是10μl，其中5μlbuffer，4.5μl PCR纯化的产物，25℃连接30min后采用热击法转化到大肠杆菌感受态DH5α中，以目的基因序列引物进行PCR验证并测序(由上海生工生物工程有限公司完成)。测序结果如SEQ ID NO:2所示(atgggtttaggctggagaaggaggagaaccggccatcgcgccgcgaaaaaccagccaggggacctcgacatggaagtcctgatcccggaccattttctctgcccgatatcgcttgatttgatgaaggatccggtcacattgtcatccggaataacctacgatagacagagcatcgacacttggctcgaaggtgggaactttacttgccctgtgacaaatcaggtgttgagaagctttgatcagattcccaaccatagtctcagaaaaatgattcaagaatggtgcaccgaaaacaagcgctacggaatcgaacgtgttccaacgccgcgagttcctgttatgccgatcgaggtctctgagaatcttttcagtttagcgggctcagctcgaagtttggatcaccaagggtgcttggaatatgtgcgcagaatcaagaattgggccgctgagagtgagcgaaacaagcggtgcatattggagaacggggctgcatctgtactctctgccgcctttgattcttttgcgggcgattgcgaaaagaaaaatgcagttgtgtgcgaagaattactctctgcgttgagttggatgcttccagctttcgatgaagaatcacacaaatacttgggatcgaaggcatcgttgcgttgcatggtttggtttctcaaggaaaccgatgatcttttggtcaagcaaaactcccttctagcattgaaacagcttctttcttgcgatgatcacactaaacatgctgaagcgttggcggaaattggtggggtgaatgacattctgttcaagctcatcagagagaaaatttcgccggcgattaccaaggcatctctgatggtagttttctacttgatttcatcatcttcttccgccggtgagaagatcaagttatcatatttggagatgggattggtttctgtgttgctggaaatgcttgtggactcggaaaggggcgtaagcgagggggcattggcggttatcgacagtctttgtgattgcgaagaagggagggaaaaggcgtacgctgatgcgctaaccataccggttttagtgaagaaaattttgaggatatcggaaatggcgactgagtattcgatttcagcgatttggaagctgtgtaaatgtgcaagcaggcaagaagaaagagtgctggttgaggcccttcaagtcggtacatttcagaagctcttgttggttttacaggttcgttgcggggatgatcacacgaaggagaagacgaacgagcttctgaagctcttgaatccttacagagctggattggaatgcattgagtctgtagatttcaagagtattagaaggtcgttttga)，经过密码子转化得到的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示(MGLGWRRRRTGHRAAKNQPGDLDMEVLIPDHFLCPISLDLMKDPVTLSSGITYDRQSIDTWLEGGNFTCPVTNQVLRSFDQIPNHSLRKMIQEWCTENKRYGIERVPTPRVPVMPIEVSENLFSLAGSARSLDHQGCLEYVRRIKNWAAESERNKRCILENGAASVLSAAFDSFAGDCEKKNAVVCEELLSALSWMLPAFDEESHKYLGSKASLRCMVWFLKETDDLLVKQNSLLALKQLLSCDDHTKHAEALAEIGGVNDILFKLIREKISPAITKASLMVVFYLISSSSSAGEKIKLSYLEMGLVSVLLEMLVDSERGVSEGALAVIDSLCDCEEGREKAYADALTIPVLVKKILRISEMATEYSISAIWKLCKCASRQEERVLVEALQVGTFQKLLLVLQVRCGDDHTKEKTNELLKLLNPYRAGLECIESVDFKSIRRSF)。

实施例2

不同逆境条件处理下PbPUB21编码基因的qRT-PCR分析

为了分析杜梨中PbPUB21基因对脱水、低温、高盐和脱落酸(ABA)胁迫下的响应模式，使用Real-time PCR技术对PbPUB21编码基因的表达模式进行分析。采用成都福际生物技术有限公司Plant Total RNAIsolation Kit Plus提取RNA，DNA第一链的合成参照TANGEN反转录试剂盒的操作手册进行。10μl的反应体系如下：5μl2×SYBR Premix ExTaq，0.1μl cDNA，0.4μl引物(SEQ ID NO:5，5'-GCCAGGGGACCTCGACATGGAAGTCC-3'和SEQ ID NO:6，5'-CGATCGGCATAACAGGAACTCGCGGCG-3)，4.5μl ddH₂O。以Tublin为内参引物(引物对的序列为SEQ ID NO:7，5'-TGGGCTTTGCTCCTCTTAC-3'和SEQ ID NO:8，5'-CCTTCGTGCTCATCTTACC-3')，实时定量PCR的反应程序如表1。

表1实时定量PCR程序

qRT-PCR的检测结果见图2。图2为一种本发明的PbPUB21编码基因在脱水、低温、高盐和脱落酸(ABA)胁迫下的表达示意图，其中，图2-A是杜梨的实生苗(未转基因)室温下脱水相应时间点取样，采用实时定量PCR分析所述编码基因相对表达量；图2-B是杜梨的实生苗在4℃低温处理下，不同时间点的表达模式；图2-C是所述编码基因在杜梨实生苗在200mMNaCl溶液处理下，相应的时间点取样，采用实时定量PCR分析本发明基因的相对表达量；图2-D是杜梨的实生苗在100μMABA溶液处理下，相应时间点取样，采用实时定量PCR分析所述编码基因的相对表达量；由图2-A可以看出，随着处理时间的延长，在9h内编码基因的表达量呈现递增的趋势，12个小时后表达量开始下降。这表明所述编码基因受干旱胁迫的影响，从而响应抗旱机制，使杜梨实现抗旱功能。

实施例3

PbPUB21基因的亚细胞定位

根据PbPUB21基因的核苷酸序列和pCAM1300-GFP载体图，在基因序列前后分别加入XbaI和BamHI酶切位点。将测序结果正确的目的基因提取质粒作为模板，用加入酶切位点的引物(SEQ ID NO:9:5'-GAGAACACGGGGGACTCTAGAATGGGTTTAGGCTGGAGAAGGA-3'，SEQ IDNO:10：5'-GCCCTTGCTCACCATGGATCCAAACGACCTTCTAATACTCTTGAAATCTACAG-3')扩增。所用PCR程序为：94℃预变性3min；94℃变性30s，58℃退火60s，72℃延伸90s，35个循环；72℃延伸10min。基因3′去除了终止密码子TAG，目的是让基因与GFP融合。PCR产物经1％琼脂糖凝胶电泳后，利用凝胶试剂盒回收目的条带。用XbaI和BamHI限制性内切酶对pCAM1300-GFP载体质粒进行酶切，37℃酶切4h后纯化回收。酶切过后的pCAM1300-GFP载体与凝胶回收PbPUB21片段经重组连接酶连接，37℃连接30min，转化至大肠杆菌感受态DH5α中。将转化后的菌液用PCR检测，PCR鉴定呈阳性的菌液送至公司测序，提取测序结果正确菌液的质粒，将得到的重组载体命名为pCAM1300-GFP-PbPUB21。

农杆菌介导烟草瞬时转化：将pCAM1300-GFP-PbPUB21重组载体转化至含农杆菌感受态GV3101中，将活化的含重组质粒的农杆菌在含505mg/mL卡那霉素和50mg/mL利福平的LB液体培养基中在250rpm、28℃的条件下恒温摇床振荡培养。在6000rpm条件下离心10min，并用侵染液(每100mL包括以下组分：10mL 100mM MgCl₂，10mL 100mM MES，75μL200 mMAS，ddH₂O补足100mL)重悬至OD₆₀₀为0.8。室温孵育3～4h注射烟草，去掉针头的注射器将侵染液从烟草叶背面注射，至叶片水渍状。将注射的烟草避光培养24h，然后在25℃人工气候室培养48h～72h内进行观察，叶片剪成1cm²小方块状，并利用注射器负压法将叶片细胞核DAPI染色，用于标记细胞核，并制片。使用倒置激光扫描共聚焦显微镜(Zeiss LSM 780)拍照。

结果见图3。图3为PbPUB21基因亚细胞定位结果图，其中；图3-A，35s:GFP基因(对照)在暗场、紫外线光、明场下的成像，其中最右侧图为叠加后的成像；图3-B，PbPUB21-GFP在暗场、紫外线光、明场下的成像，其中最右侧图为叠加后的成像；根据细胞定位图能够得到PbPUB21基因定位在细胞核。

实施例4

拟南芥的遗传转化

1.植物转化载体采用实例3中已构建的重组载体pCAM1300-GFP-PbPUB21。

2.农杆菌介导的拟南芥遗传转化步骤如下：

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液，在添加了卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB的平板上划线，置于28℃培养箱培养36～48h，刮取划线菌斑，加入液体MS(2.37g/LMS+50g/L蔗糖+0.1mg/L IBA，pH值5.8)培养基中，28℃转30min振荡培养，菌液浓度达到OD₆₀₀＝0.8～1.0时加入表面活性剂silwet L-77 200μl/L进行浸染。

(2)浸染：取茎高约为10cm的野生型拟南芥植株，去除全部种荚，然后倒置于含有制备好的根癌农杆菌菌液的玻璃瓶中，抽真空，维持0.05Mpa压力5min，避光侧放24h。

(3)培养：按常规方法培育植株至结实，收获成熟种子(T₀代)。

3.转基因阳性苗的的筛选

按照上述方法得到转PbPUB21基因拟南芥T₀代种子，将T₀代种子表面灭菌，均匀的散布于含50mg/L潮霉素和50mg/L特美汀的MS选择培养基上，置于22℃光照16h/d培养，生长一周后挑选生长快、根长较长的植株，移栽至灭菌的营养土中，生长一段时间。

3.1转基因拟南芥DNA提取方法

按照上述方法得到转PbPUB21基因拟南芥，把每株拟南芥提取DNA，设计引物基因内引物进行PCR扩增鉴定阳性苗。

(1)取适量拟南芥叶片用液氮研磨至粉末状，然后加入500μl 65℃预热的CTAB(100mmol/LTris-HCl溶液pH值8.0，1.5mmol/L NaCl，50mmol/L EDTA pH＝8.0，2％w/vCTAB，65℃水浴充分溶解备用)和10μlβ-巯基乙醇，混匀。

(2)在65℃水浴锅中加热30min，每隔10min取出上下轻轻颠倒混匀；10000g常温离心10min；取上清，加500μl氯仿异戊醇(氯仿：异戊醇体积比为24：1)，颠倒混匀；

(3)10000g离心10min，取上清液450μl至新的1.5ml离心管，加入450μl异丙醇，上下颠倒混匀；

(4)10000g，离心10min，弃去上清，用1mL 75％的乙醇水溶液漂洗2次，在10000g条件下离心10min，将乙醇彻底去除，放在超净工作台通风干燥，直至DNA呈无色透明状；

(5)加入50μl超纯水，放置于65℃培养箱中溶解40min，做胶检测。

3.2阳性转基因植株检测

采用引物基因特异引物和载体下游引物进行PCR扩增。反应程序及体系分别见表2、表3。采用基因上游引物和载体下游引物(SEQ ID NO:11，5'-GCGATGATCACACTAAACATGCT-3'和SEQ ID NO:12，5'-CGTCGTCCTTGAAGAAGATG-3')进行PCR，在选取的转基因株系中能扩增出预期大小的片段的，表明它们为阳性转基因株系。

表2 PCR反应程序

表3 PCR反应体系

每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过跑胶检测其结构完整，如图4-B，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，以拟南芥的AtActin基因作为内参基因进行qPCR扩增。AtActin引物核苷酸序列为：AtActin正向引物：5'-GGTGTCATGGTTGGTATGGGTC-3'(SEQ ID NO:15)；AtActin反向引物：5'-CCTCTGTGAGTAGAACTGGGTGC-3'(SEQ ID NO:16)。

用AtActin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PbPUB21特异引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)和拟南芥的AtActin基因进行qRT-PCR检测，分析待检测株系的表达量，根据PbPUB21基因的表达量，选择表达量较高的2个植株(#4和#5)作为超表达阳性株系。图4-A为利用基因特异引物进行PCR鉴定拟南芥T₀代转基因植株，其中M：Marker，+：质粒，-：野生型植株，#4-#8：转基因株系，图4-B为T₁代拟南芥mRNA水平的半定量PCR检测，图4-C为RT-PCR鉴定转基因拟南芥T₁代植株的超表达分析。

实施例5

杜梨幼苗的瞬时转化

1.病毒诱导基因沉默(VIGS)载体构建

按照实施例4的方法构建病毒沉默载体。病毒沉默载体载体pTRV2双酶切位点为XbaI和Smal，按照引物设计一般原则用primer primier5.0软件设计上、下游引物(SEQ IDNO:13，5'-AAGGTTACCGAATTCTCTAGATGATCCCGGACCAGTTTCTC-3'和SEQ ID NO:14，5'-TGTCTTCGGGACATGCCCGGGATTGGCATAACAGGAACTCGC-3')将PbPUB21的编码基因扩增并***至该载体上的两个酶切位点中间，得到重组载体pTRV2-PbPUB21，并转入农杆菌GV3101感受态中。

2.病毒诱导杜梨幼苗基因沉默

(1)农杆菌培养：取超低温冰箱中保存的根癌农杆菌菌液在含卡那霉素50mg/L和利福平50mg/L的LB液体培养基中28℃，220rpm条件下振荡培养12h。将培养后的菌液6000g离心10min收集菌体，用侵染液(10mM MgCl₂、10mM MES、200mM乙酰丁香酮，pH值5.6)重悬沉淀，至浓度达到OD₆₀₀＝0.8～1.0；

(2)菌液诱导：将调好OD值的菌液放在黑暗条件下，100rpm常温诱导4h；

(3)梨苗注射：pTRV1和pTRV2菌液按照1:1比例混合作为对照组，pTRV1和pTRV2-PbPUB21菌液按照1:1比例混合作为实验组，分别注射苗龄35天，生长状况一致且健康状况良好的杜梨实生苗幼苗。

3.病毒诱导基因沉默抑制阳性苗鉴定

将注射完成后的梨苗在常温下黑暗处理12h，然后恢复正常培养5天，每个株系独立取样，提取对照组和实验组梨苗样品RNA，通过跑胶检测其结构完整，如图5，利用Nanodrop测定其浓度后(浓度均在200～1000ng/μl)，将RNA总量调整为3μg后进行反转录成cDNA，以梨的Tublin基因(SEQ ID NO:7和SEQ ID NO:8)作为内参基因进行qPCR扩增。

用Tublin扩增出来的条带亮度均一致，说明反转录的cDNA浓度相同，然后用PbPUB21特异引物和梨内参引物Tublin进行qRT-PCR检测，分析待检测株系的表达量，PbPUB21特异引物(SEQ ID NO:5和SEQ ID NO:6)。

根据PbPUB21基因的表达量，选择表达量较低的三个植株作为病毒沉默阳性株系，命名为pTRV2-1，pTRV2-2和pTRV2-3。

结果见图8所示。图8-E是实时定量PCR分析杜梨不同病毒沉默株系中的PbPUB21的编码基因的表达量。

实施例6

PbPUB21转基因抗性植株抗性鉴定

1.转基因拟南芥植株的抗旱分析

同批收的拟南芥未转化植株(WT)和转PbPUB21超表达纯系(#4,#5)种子灭菌处理后播于常用的MS基本培养基，取每个系20天大的幼苗，剪去根后置于培养皿上自然脱水120分钟，每20分钟测定鲜重，以脱水前的材料为对照，计算失水率；并测定最后一个时间点(脱水120分钟)的电导率。结果表明，在120分钟的失水过程中，#4和#5失水均较WT慢(图5-B)，失水120分钟后#4和#5电导率较WT低(图5-C)，MDA含量也较野生型低(图5-D)，从表型上看，2个转基因株系的叶片失水程度明显比未转化植株低(图5-A)。

将30d大的WT、#4和#5先正常浇水3天，然后开始控水进行干旱胁迫。结果表明，停止浇水10d后，#4和#5下部叶片部分萎蔫，而WT此时开始死亡；两个转基因超表达系(#4和#5)的光合效率比WT更加明显(图6-B)，复水3天后，两个转基因超表达系(#4和#5)都能正常生长而WT仅有一株存活(图8-F)；干旱14天后，#4和#5株系的丙二醛含量(图6-D)和电导率(图6-C)都比WT低；而超表达系的Fv/Fm显著高于WT(图6-E)。上述测定结果表明，转PbPUB21基因的拟南芥植株抗脱水和抗旱能力比未转化植株(WT)明显增强。

2.转基因拟南芥植株活性氧积累分析

在转基因拟南芥株系中，电导率较低和丙二醛含量较低表明他们可能具有比WT有更强的抗ROS的能力。那么通过鉴定植株中ROS的积累量便成为必要。30天大的拟南芥植株干旱处理14天后未转化植株和两个转基因株系活性氧组织化学染色图，采用二氨基联苯胺(DAB)和硝基四氮唑(NBT)分别对H₂O₂(图7-A的上部)和O^2-(图7-A的下部)进行染色；明显看到WT的染色程度较2个转基因系高。干旱胁迫14天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量，野生株系型的过氧化氢含量显著地高于2个转基因株系(图7-B)，且2个转基因株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量高于对照系(图7-C)。这些证据表明，转基因烟草株系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系少，细胞损伤更小。进而表明，过表达的PbPUB21基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，从而提高了植株的抗旱性。

实施例7

PbPUB21病毒沉默植株抗性鉴定

1.病毒沉默杜梨幼苗的抗旱分析

为了鉴定病毒沉默PbPUB21基因的杜梨是否和抗旱胁迫有关，将对照系和病毒沉默系进行干旱处理，干旱处理采用自然控干法，将实验所需材料放在26℃日光灯培养室，光照强度为20500lux，空气温度是44.0％，让其自然干旱控水，待其出现表型时拍照并取样。

将PbPUB21基因病毒沉默的杜梨沉默株系(pTRV2-1，pTRV2-2和pTRV2-3)及对照植株(WT)，在室温下干旱处理15天后的表型和生理指标测定。其中：图8-A是室温下干旱处理15天后的表型。图8-B是室温下干旱处理15天后荧光叶绿素照片；图8-C是室温下干旱处理15天后电导率测定。图8-F是干旱处理前后Fv/Fm结果图，Fv/Fm越低，说明植株受损伤程度越大。结果表明，在处理过程中，说明病毒载体pTRV2沉默PbPUB21基因降低了其在干旱条件下的抗性。

2.病毒沉默杜梨幼苗活性氧积累分析

对干旱处理后对照植株及病毒沉默株系活性氧积累进行分析，如图9-A和图9-B所示，将杜梨干旱胁迫15天之后，测定了其组织中的过氧化氢含量，抗超氧阴离子含量，3个沉默株系的过氧化氢含量显著地高于对照株系，且三个沉默株系组织中的抗超氧阴离子自由基含量低于对照系。这些证据表明，沉默烟草株系在受到干旱胁迫后体内所积累的活性氧残留量较对照系多，细胞损伤更大。说明病毒载体pTRV2沉默PbPUB21基因降低了其在干旱条件下清除ROS的能力。

综合分析表明，分别将PbPUB21转入拟南芥和利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbPUB21转入杜梨中后鉴定其功能，发现以下试验结果：在拟南芥中转基因PbPUB21超表达株系与对照野生型相比抗旱能力有了很大提升。转基因拟南芥中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量均要比野生型要低，植株体内活性氧残留更低，细胞损伤更小，抗氧化能力更强；在杜梨中利用病毒介导的VIGS技术瞬时沉默PbPUB21的株系与对照野生型相比抗旱能力明显下降。pTRV2-PbPUB21转基因杜梨株系中的过氧化氢(H₂O₂)及超氧阴离子(O^2-)的含量均要比野生型要高，植株体内活性氧残留更高，细胞损伤更大，抗氧化能力更差。这些结果表明，过表达的PbPUB21基因能够有效的增强转基因植株的活性氧清除能力，而沉默该基因植株的活性氧清除能力下降，说明PbPUB21能够提高植株的抗旱性。

以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。

序列表

<110> 南京农业大学

<120> 一种杜梨泛素连接酶基因、编码蛋白及其在植物抗旱遗传改良中的应用

<160> 16

<170> SIPOSequenceListing 1.0

<210> 1

<211> 444

<212> PRT

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 1

Met Gly Leu Gly Trp Arg Arg Arg Arg Thr Gly His Arg Ala Ala Lys

1 5 10 15

Asn Gln Pro Gly Asp Leu Asp Met Glu Val Leu Ile Pro Asp His Phe

20 25 30

Leu Cys Pro Ile Ser Leu Asp Leu Met Lys Asp Pro Val Thr Leu Ser

35 40 45

Ser Gly Ile Thr Tyr Asp Arg Gln Ser Ile Asp Thr Trp Leu Glu Gly

50 55 60

Gly Asn Phe Thr Cys Pro Val Thr Asn Gln Val Leu Arg Ser Phe Asp

65 70 75 80

Gln Ile Pro Asn His Ser Leu Arg Lys Met Ile Gln Glu Trp Cys Thr

85 90 95

Glu Asn Lys Arg Tyr Gly Ile Glu Arg Val Pro Thr Pro Arg Val Pro

100 105 110

Val Met Pro Ile Glu Val Ser Glu Asn Leu Phe Ser Leu Ala Gly Ser

115 120 125

Ala Arg Ser Leu Asp His Gln Gly Cys Leu Glu Tyr Val Arg Arg Ile

130 135 140

Lys Asn Trp Ala Ala Glu Ser Glu Arg Asn Lys Arg Cys Ile Leu Glu

145 150 155 160

Asn Gly Ala Ala Ser Val Leu Ser Ala Ala Phe Asp Ser Phe Ala Gly

165 170 175

Asp Cys Glu Lys Lys Asn Ala Val Val Cys Glu Glu Leu Leu Ser Ala

180 185 190

Leu Ser Trp Met Leu Pro Ala Phe Asp Glu Glu Ser His Lys Tyr Leu

195 200 205

Gly Ser Lys Ala Ser Leu Arg Cys Met Val Trp Phe Leu Lys Glu Thr

210 215 220

Asp Asp Leu Leu Val Lys Gln Asn Ser Leu Leu Ala Leu Lys Gln Leu

225 230 235 240

Leu Ser Cys Asp Asp His Thr Lys His Ala Glu Ala Leu Ala Glu Ile

245 250 255

Gly Gly Val Asn Asp Ile Leu Phe Lys Leu Ile Arg Glu Lys Ile Ser

260 265 270

Pro Ala Ile Thr Lys Ala Ser Leu Met Val Val Phe Tyr Leu Ile Ser

275 280 285

Ser Ser Ser Ser Ala Gly Glu Lys Ile Lys Leu Ser Tyr Leu Glu Met

290 295 300

Gly Leu Val Ser Val Leu Leu Glu Met Leu Val Asp Ser Glu Arg Gly

305 310 315 320

Val Ser Glu Gly Ala Leu Ala Val Ile Asp Ser Leu Cys Asp Cys Glu

325 330 335

Glu Gly Arg Glu Lys Ala Tyr Ala Asp Ala Leu Thr Ile Pro Val Leu

340 345 350

Val Lys Lys Ile Leu Arg Ile Ser Glu Met Ala Thr Glu Tyr Ser Ile

355 360 365

Ser Ala Ile Trp Lys Leu Cys Lys Cys Ala Ser Arg Gln Glu Glu Arg

370 375 380

Val Leu Val Glu Ala Leu Gln Val Gly Thr Phe Gln Lys Leu Leu Leu

385 390 395 400

Val Leu Gln Val Arg Cys Gly Asp Asp His Thr Lys Glu Lys Thr Asn

405 410 415

Glu Leu Leu Lys Leu Leu Asn Pro Tyr Arg Ala Gly Leu Glu Cys Ile

420 425 430

Glu Ser Val Asp Phe Lys Ser Ile Arg Arg Ser Phe

435 440

<210> 2

<211> 1335

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 2

atgggtttag gctggagaag gaggagaacc ggccatcgcg ccgcgaaaaa ccagccaggg 60

gacctcgaca tggaagtcct gatcccggac cattttctct gcccgatatc gcttgatttg 120

atgaaggatc cggtcacatt gtcatccgga ataacctacg atagacagag catcgacact 180

tggctcgaag gtgggaactt tacttgccct gtgacaaatc aggtgttgag aagctttgat 240

cagattccca accatagtct cagaaaaatg attcaagaat ggtgcaccga aaacaagcgc 300

tacggaatcg aacgtgttcc aacgccgcga gttcctgtta tgccgatcga ggtctctgag 360

aatcttttca gtttagcggg ctcagctcga agtttggatc accaagggtg cttggaatat 420

gtgcgcagaa tcaagaattg ggccgctgag agtgagcgaa acaagcggtg catattggag 480

aacggggctg catctgtact ctctgccgcc tttgattctt ttgcgggcga ttgcgaaaag 540

aaaaatgcag ttgtgtgcga agaattactc tctgcgttga gttggatgct tccagctttc 600

gatgaagaat cacacaaata cttgggatcg aaggcatcgt tgcgttgcat ggtttggttt 660

ctcaaggaaa ccgatgatct tttggtcaag caaaactccc ttctagcatt gaaacagctt 720

ctttcttgcg atgatcacac taaacatgct gaagcgttgg cggaaattgg tggggtgaat 780

gacattctgt tcaagctcat cagagagaaa atttcgccgg cgattaccaa ggcatctctg 840

atggtagttt tctacttgat ttcatcatct tcttccgccg gtgagaagat caagttatca 900

tatttggaga tgggattggt ttctgtgttg ctggaaatgc ttgtggactc ggaaaggggc 960

gtaagcgagg gggcattggc ggttatcgac agtctttgtg attgcgaaga agggagggaa 1020

aaggcgtacg ctgatgcgct aaccataccg gttttagtga agaaaatttt gaggatatcg 1080

gaaatggcga ctgagtattc gatttcagcg atttggaagc tgtgtaaatg tgcaagcagg 1140

caagaagaaa gagtgctggt tgaggccctt caagtcggta catttcagaa gctcttgttg 1200

gttttacagg ttcgttgcgg ggatgatcac acgaaggaga agacgaacga gcttctgaag 1260

ctcttgaatc cttacagagc tggattggaa tgcattgagt ctgtagattt caagagtatt 1320

agaaggtcgt tttga 1335

<210> 3

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 3

atgggtttag gctggagaag ga 22

<210> 4

<211> 32

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 4

aaacgacctt ctaatactct tgaaatctac ag 32

<210> 5

<211> 26

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 5

gccaggggac ctcgacatgg aagtcc 26

<210> 6

<211> 27

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 6

cgatcggcat aacaggaact cgcggcg 27

<210> 7

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 7

tgggctttgc tcctcttac 19

<210> 8

<211> 19

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 8

ccttcgtgct catcttacc 19

<210> 9

<211> 43

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 9

gagaacacgg gggactctag aatgggttta ggctggagaa gga 43

<210> 10

<211> 53

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 10

gcccttgctc accatggatc caaacgacct tctaatactc ttgaaatcta cag 53

<210> 11

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 11

gcgatgatca cactaaacat gct 23

<210> 12

<211> 20

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 12

cgtcgtcctt gaagaagatg 20

<210> 13

<211> 41

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 13

aaggttaccg aattctctag atgatcccgg accagtttct c 41

<210> 14

<211> 42

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 14

tgtcttcggg acatgcccgg gattggcata acaggaactc gc 42

<210> 15

<211> 22

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 15

ggtgtcatgg ttggtatggg tc 22

<210> 16

<211> 23

<212> DNA

<213> 人工序列(Artificial Sequence)

<400> 16

cctctgtgag tagaactggg tgc 23

Claims

1.一种杜梨泛素连接酶、基因PbPUB21或重组植物表达载体在植物抗旱中的应用，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

所述基因PbPUB21为编码所述杜梨泛素连接酶的基因，核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示；

所述重组植物表达载体为包含所述基因PbPUB21的重组植物表达载体。

2.一种杜梨泛素连接酶、基因PbPUB21或重组植物表达载体在抗旱植物育种中的应用，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

3.一种杜梨泛素连接酶、基因PbPUB21或重组植物表达载体在构建抗旱转基因植物中的应用，所述杜梨泛素连接酶的氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

4.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，在植物表达载体pCAM1300-GFP的基础上***所述基因PbPUB21得到重组植物表达载体。

5.根据权利要求1～3任意一项所述应用，其特征在于，所述植物包括草本植物或木本植物。

6.根据权利要求5所述应用，其特征在于，所述草本植物包括拟南芥；所述木本植物包括杜梨。