CN112410375A - 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 - Google Patents
腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 Download PDFInfo
- Publication number
- CN112410375A CN112410375A CN201910777937.2A CN201910777937A CN112410375A CN 112410375 A CN112410375 A CN 112410375A CN 201910777937 A CN201910777937 A CN 201910777937A CN 112410375 A CN112410375 A CN 112410375A
- Authority
- CN
- China
- Prior art keywords
- sequence
- genome
- adenovirus
- adc68
- recombinant
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Granted
Links
- 241000701161 unidentified adenovirus Species 0.000 title claims abstract description 134
- 239000013598 vector Substances 0.000 title claims abstract description 85
- 241000700605 Viruses Species 0.000 title claims abstract description 38
- 108090000623 proteins and genes Proteins 0.000 claims abstract description 81
- 239000013604 expression vector Substances 0.000 claims abstract description 24
- 102000004169 proteins and genes Human genes 0.000 claims description 47
- 238000000034 method Methods 0.000 claims description 29
- 238000012217 deletion Methods 0.000 claims description 25
- 230000037430 deletion Effects 0.000 claims description 25
- 230000014509 gene expression Effects 0.000 claims description 24
- 101710087110 ORF6 protein Proteins 0.000 claims description 20
- 101710095001 Uncharacterized protein in nifU 5'region Proteins 0.000 claims description 20
- 230000000694 effects Effects 0.000 claims description 18
- 238000012986 modification Methods 0.000 claims description 14
- 230000004048 modification Effects 0.000 claims description 14
- 238000003780 insertion Methods 0.000 claims description 13
- 230000037431 insertion Effects 0.000 claims description 13
- 238000004806 packaging method and process Methods 0.000 claims description 13
- 239000012634 fragment Substances 0.000 claims description 12
- 108090000790 Enzymes Proteins 0.000 claims description 11
- 102000004190 Enzymes Human genes 0.000 claims description 11
- 241001217856 Chimpanzee adenovirus Species 0.000 claims description 10
- 239000002773 nucleotide Substances 0.000 claims description 8
- 125000003729 nucleotide group Chemical group 0.000 claims description 8
- 238000004519 manufacturing process Methods 0.000 claims description 7
- 210000002966 serum Anatomy 0.000 claims description 7
- 241001135569 Human adenovirus 5 Species 0.000 claims description 6
- 108700008625 Reporter Genes Proteins 0.000 claims description 6
- 101710172711 Structural protein Proteins 0.000 claims description 5
- 230000004927 fusion Effects 0.000 claims description 5
- 108090000765 processed proteins & peptides Proteins 0.000 claims description 5
- 102000004196 processed proteins & peptides Human genes 0.000 claims description 5
- 230000005847 immunogenicity Effects 0.000 claims description 4
- 108091008146 restriction endonucleases Proteins 0.000 claims description 4
- 208000015181 infectious disease Diseases 0.000 abstract description 4
- 210000004027 cell Anatomy 0.000 description 33
- 108020004414 DNA Proteins 0.000 description 24
- 150000007523 nucleic acids Chemical group 0.000 description 10
- 239000013612 plasmid Substances 0.000 description 9
- 230000003612 virological effect Effects 0.000 description 9
- 229960005486 vaccine Drugs 0.000 description 7
- 241000282577 Pan troglodytes Species 0.000 description 6
- 238000003776 cleavage reaction Methods 0.000 description 6
- 230000007017 scission Effects 0.000 description 6
- 230000015572 biosynthetic process Effects 0.000 description 5
- 238000010276 construction Methods 0.000 description 5
- 238000013461 design Methods 0.000 description 5
- 238000010369 molecular cloning Methods 0.000 description 5
- 108020004707 nucleic acids Proteins 0.000 description 5
- 102000039446 nucleic acids Human genes 0.000 description 5
- 230000010076 replication Effects 0.000 description 5
- 238000011160 research Methods 0.000 description 5
- 238000001890 transfection Methods 0.000 description 5
- 108010043121 Green Fluorescent Proteins Proteins 0.000 description 4
- 108091028043 Nucleic acid sequence Proteins 0.000 description 4
- 238000005520 cutting process Methods 0.000 description 4
- 238000001976 enzyme digestion Methods 0.000 description 4
- 239000002609 medium Substances 0.000 description 4
- 239000000203 mixture Substances 0.000 description 4
- 230000007505 plaque formation Effects 0.000 description 4
- 230000008569 process Effects 0.000 description 4
- 238000003786 synthesis reaction Methods 0.000 description 4
- 101000768957 Acholeplasma phage L2 Uncharacterized 37.2 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000823746 Acidianus ambivalens Uncharacterized 17.7 kDa protein in bps2 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000916369 Acidianus ambivalens Uncharacterized protein in sor 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000769342 Acinetobacter guillouiae Uncharacterized protein in rpoN-murA intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000823696 Actinobacillus pleuropneumoniae Uncharacterized glycosyltransferase in aroQ 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000786513 Agrobacterium tumefaciens (strain 15955) Uncharacterized protein outside the virF region Proteins 0.000 description 3
- 101000618005 Alkalihalobacillus pseudofirmus (strain ATCC BAA-2126 / JCM 17055 / OF4) Uncharacterized protein BpOF4_00885 Proteins 0.000 description 3
- 102100020724 Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Human genes 0.000 description 3
- 101000967489 Azorhizobium caulinodans (strain ATCC 43989 / DSM 5975 / JCM 20966 / LMG 6465 / NBRC 14845 / NCIMB 13405 / ORS 571) Uncharacterized protein AZC_3924 Proteins 0.000 description 3
- 101000823761 Bacillus licheniformis Uncharacterized 9.4 kDa protein in flaL 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000819719 Bacillus methanolicus Uncharacterized N-acetyltransferase in lysA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000789586 Bacillus subtilis (strain 168) UPF0702 transmembrane protein YkjA Proteins 0.000 description 3
- 101000792624 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YbxH Proteins 0.000 description 3
- 101000790792 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YckC Proteins 0.000 description 3
- 101000819705 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YlxR Proteins 0.000 description 3
- 101000948218 Bacillus subtilis (strain 168) Uncharacterized protein YtxJ Proteins 0.000 description 3
- 101000718627 Bacillus thuringiensis subsp. kurstaki Putative RNA polymerase sigma-G factor Proteins 0.000 description 3
- 101000641200 Bombyx mori densovirus Putative non-structural protein Proteins 0.000 description 3
- 101000947633 Claviceps purpurea Uncharacterized 13.8 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 102000053602 DNA Human genes 0.000 description 3
- 101000948901 Enterobacteria phage T4 Uncharacterized 16.0 kDa protein in segB-ipI intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000805958 Equine herpesvirus 4 (strain 1942) Virion protein US10 homolog Proteins 0.000 description 3
- 101000790442 Escherichia coli Insertion element IS2 uncharacterized 11.1 kDa protein Proteins 0.000 description 3
- 101000788354 Escherichia phage P2 Uncharacterized 8.2 kDa protein in gpA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000770304 Frankia alni UPF0460 protein in nifX-nifW intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 108700039691 Genetic Promoter Regions Proteins 0.000 description 3
- 101000797344 Geobacillus stearothermophilus Putative tRNA (cytidine(34)-2'-O)-methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101000748410 Geobacillus stearothermophilus Uncharacterized protein in fumA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000772675 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) UPF0438 protein HI_0847 Proteins 0.000 description 3
- 101000631019 Haemophilus influenzae (strain ATCC 51907 / DSM 11121 / KW20 / Rd) Uncharacterized protein HI_0350 Proteins 0.000 description 3
- 101000768938 Haemophilus phage HP1 (strain HP1c1) Uncharacterized 8.9 kDa protein in int-C1 intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000785414 Homo sapiens Ankyrin repeat, SAM and basic leucine zipper domain-containing protein 1 Proteins 0.000 description 3
- 101000782488 Junonia coenia densovirus (isolate pBRJ/1990) Putative non-structural protein NS2 Proteins 0.000 description 3
- 101000811523 Klebsiella pneumoniae Uncharacterized 55.8 kDa protein in cps region Proteins 0.000 description 3
- 101000818409 Lactococcus lactis subsp. lactis Uncharacterized HTH-type transcriptional regulator in lacX 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000878851 Leptolyngbya boryana Putative Fe(2+) transport protein A Proteins 0.000 description 3
- 101000758828 Methanosarcina barkeri (strain Fusaro / DSM 804) Uncharacterized protein Mbar_A1602 Proteins 0.000 description 3
- 101001122401 Middle East respiratory syndrome-related coronavirus (isolate United Kingdom/H123990006/2012) Non-structural protein ORF3 Proteins 0.000 description 3
- 101001055788 Mycolicibacterium smegmatis (strain ATCC 700084 / mc(2)155) Pentapeptide repeat protein MfpA Proteins 0.000 description 3
- 101000740670 Orgyia pseudotsugata multicapsid polyhedrosis virus Protein C42 Proteins 0.000 description 3
- 101000769182 Photorhabdus luminescens Uncharacterized protein in pnp 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000961392 Pseudescherichia vulneris Uncharacterized 29.9 kDa protein in crtE 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000731030 Pseudomonas oleovorans Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase 2 Proteins 0.000 description 3
- 101001065485 Pseudomonas putida Probable fatty acid methyltransferase Proteins 0.000 description 3
- 101000711023 Rhizobium leguminosarum bv. trifolii Uncharacterized protein in tfuA 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000948156 Rhodococcus erythropolis Uncharacterized 47.3 kDa protein in thcA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101000917565 Rhodococcus fascians Uncharacterized 33.6 kDa protein in fasciation locus Proteins 0.000 description 3
- 101000790284 Saimiriine herpesvirus 2 (strain 488) Uncharacterized 9.5 kDa protein in DHFR 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000936719 Streptococcus gordonii Accessory Sec system protein Asp3 Proteins 0.000 description 3
- 101000788499 Streptomyces coelicolor Uncharacterized oxidoreductase in mprA 5'region Proteins 0.000 description 3
- 101001102841 Streptomyces griseus Purine nucleoside phosphorylase ORF3 Proteins 0.000 description 3
- 101000708557 Streptomyces lincolnensis Uncharacterized 17.2 kDa protein in melC2-rnhH intergenic region Proteins 0.000 description 3
- 101000649826 Thermotoga neapolitana Putative anti-sigma factor antagonist TM1081 homolog Proteins 0.000 description 3
- 101000827562 Vibrio alginolyticus Uncharacterized protein in proC 3'region Proteins 0.000 description 3
- 101000778915 Vibrio parahaemolyticus serotype O3:K6 (strain RIMD 2210633) Uncharacterized membrane protein VP2115 Proteins 0.000 description 3
- 208000026555 breast adenosis Diseases 0.000 description 3
- 238000011161 development Methods 0.000 description 3
- 238000005516 engineering process Methods 0.000 description 3
- 230000001900 immune effect Effects 0.000 description 3
- 230000002401 inhibitory effect Effects 0.000 description 3
- 239000003550 marker Substances 0.000 description 3
- 230000003472 neutralizing effect Effects 0.000 description 3
- 230000036961 partial effect Effects 0.000 description 3
- 238000002360 preparation method Methods 0.000 description 3
- 239000006144 Dulbecco’s modified Eagle's medium Substances 0.000 description 2
- 201000011001 Ebola Hemorrhagic Fever Diseases 0.000 description 2
- 102000004144 Green Fluorescent Proteins Human genes 0.000 description 2
- 101000833492 Homo sapiens Jouberin Proteins 0.000 description 2
- 101000651236 Homo sapiens NCK-interacting protein with SH3 domain Proteins 0.000 description 2
- 102100024407 Jouberin Human genes 0.000 description 2
- 241001465754 Metazoa Species 0.000 description 2
- 108700026244 Open Reading Frames Proteins 0.000 description 2
- 101710159752 Poly(3-hydroxyalkanoate) polymerase subunit PhaE Proteins 0.000 description 2
- 101710130262 Probable Vpr-like protein Proteins 0.000 description 2
- 206010060862 Prostate cancer Diseases 0.000 description 2
- 208000000236 Prostatic Neoplasms Diseases 0.000 description 2
- 206010037742 Rabies Diseases 0.000 description 2
- 230000003321 amplification Effects 0.000 description 2
- 230000009286 beneficial effect Effects 0.000 description 2
- 230000037396 body weight Effects 0.000 description 2
- AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M caesium chloride Chemical compound [Cl-].[Cs+] AIYUHDOJVYHVIT-UHFFFAOYSA-M 0.000 description 2
- 238000005119 centrifugation Methods 0.000 description 2
- 238000010367 cloning Methods 0.000 description 2
- 239000003814 drug Substances 0.000 description 2
- 239000003937 drug carrier Substances 0.000 description 2
- 108010048367 enhanced green fluorescent protein Proteins 0.000 description 2
- 230000002708 enhancing effect Effects 0.000 description 2
- 239000012091 fetal bovine serum Substances 0.000 description 2
- 239000005090 green fluorescent protein Substances 0.000 description 2
- 239000001963 growth medium Substances 0.000 description 2
- 230000002163 immunogen Effects 0.000 description 2
- 206010022000 influenza Diseases 0.000 description 2
- 230000002147 killing effect Effects 0.000 description 2
- 201000004792 malaria Diseases 0.000 description 2
- 201000001441 melanoma Diseases 0.000 description 2
- 108020004999 messenger RNA Proteins 0.000 description 2
- 238000003199 nucleic acid amplification method Methods 0.000 description 2
- 239000000047 product Substances 0.000 description 2
- 230000002829 reductive effect Effects 0.000 description 2
- 230000003362 replicative effect Effects 0.000 description 2
- 241000894007 species Species 0.000 description 2
- 238000006467 substitution reaction Methods 0.000 description 2
- 238000013518 transcription Methods 0.000 description 2
- 230000035897 transcription Effects 0.000 description 2
- 108010056962 Adenovirus E4 Proteins Proteins 0.000 description 1
- 108091003079 Bovine Serum Albumin Proteins 0.000 description 1
- 108091026890 Coding region Proteins 0.000 description 1
- 102100031725 Cortactin-binding protein 2 Human genes 0.000 description 1
- 230000006820 DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 101150029662 E1 gene Proteins 0.000 description 1
- 208000001613 Gambling Diseases 0.000 description 1
- 108700007698 Genetic Terminator Regions Proteins 0.000 description 1
- WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N Glucose Natural products OC[C@H]1OC(O)[C@H](O)[C@@H](O)[C@@H]1O WQZGKKKJIJFFOK-GASJEMHNSA-N 0.000 description 1
- 241000282412 Homo Species 0.000 description 1
- 102100021244 Integral membrane protein GPR180 Human genes 0.000 description 1
- 239000012097 Lipofectamine 2000 Substances 0.000 description 1
- 241000124008 Mammalia Species 0.000 description 1
- 108091005461 Nucleic proteins Chemical group 0.000 description 1
- 241000282579 Pan Species 0.000 description 1
- 101710197985 Probable protein Rev Proteins 0.000 description 1
- 108010076504 Protein Sorting Signals Proteins 0.000 description 1
- 108020004511 Recombinant DNA Proteins 0.000 description 1
- 108020004682 Single-Stranded DNA Proteins 0.000 description 1
- 108700005077 Viral Genes Proteins 0.000 description 1
- 230000004913 activation Effects 0.000 description 1
- 239000004480 active ingredient Substances 0.000 description 1
- 108700019030 adenovirus E4orf6 Proteins 0.000 description 1
- 239000002671 adjuvant Substances 0.000 description 1
- 230000002411 adverse Effects 0.000 description 1
- 239000011543 agarose gel Substances 0.000 description 1
- 238000000246 agarose gel electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 208000026935 allergic disease Diseases 0.000 description 1
- 238000004458 analytical method Methods 0.000 description 1
- 239000008365 aqueous carrier Substances 0.000 description 1
- 239000007864 aqueous solution Substances 0.000 description 1
- 230000008901 benefit Effects 0.000 description 1
- 238000004113 cell culture Methods 0.000 description 1
- 230000000295 complement effect Effects 0.000 description 1
- 238000007796 conventional method Methods 0.000 description 1
- 230000000120 cytopathologic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000593 degrading effect Effects 0.000 description 1
- 238000000432 density-gradient centrifugation Methods 0.000 description 1
- 238000010586 diagram Methods 0.000 description 1
- 230000029087 digestion Effects 0.000 description 1
- 239000003085 diluting agent Substances 0.000 description 1
- 201000010099 disease Diseases 0.000 description 1
- 208000037265 diseases, disorders, signs and symptoms Diseases 0.000 description 1
- 238000001962 electrophoresis Methods 0.000 description 1
- 230000003631 expected effect Effects 0.000 description 1
- 238000002474 experimental method Methods 0.000 description 1
- 238000001476 gene delivery Methods 0.000 description 1
- 238000001415 gene therapy Methods 0.000 description 1
- 239000008103 glucose Substances 0.000 description 1
- 230000036541 health Effects 0.000 description 1
- 238000002744 homologous recombination Methods 0.000 description 1
- 230000006801 homologous recombination Effects 0.000 description 1
- 230000007440 host cell apoptosis Effects 0.000 description 1
- 238000000338 in vitro Methods 0.000 description 1
- 238000001727 in vivo Methods 0.000 description 1
- 230000002458 infectious effect Effects 0.000 description 1
- 239000004615 ingredient Substances 0.000 description 1
- 239000007924 injection Substances 0.000 description 1
- 238000002347 injection Methods 0.000 description 1
- 230000003993 interaction Effects 0.000 description 1
- 230000007794 irritation Effects 0.000 description 1
- 230000002045 lasting effect Effects 0.000 description 1
- 239000002502 liposome Substances 0.000 description 1
- 239000007788 liquid Substances 0.000 description 1
- 230000007774 longterm Effects 0.000 description 1
- 231100000053 low toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 210000004962 mammalian cell Anatomy 0.000 description 1
- 231100000252 nontoxic Toxicity 0.000 description 1
- 230000003000 nontoxic effect Effects 0.000 description 1
- 230000000174 oncolytic effect Effects 0.000 description 1
- 239000002245 particle Substances 0.000 description 1
- 239000008194 pharmaceutical composition Substances 0.000 description 1
- 239000000546 pharmaceutical excipient Substances 0.000 description 1
- 239000002504 physiological saline solution Substances 0.000 description 1
- 230000001124 posttranscriptional effect Effects 0.000 description 1
- 238000004321 preservation Methods 0.000 description 1
- 230000001902 propagating effect Effects 0.000 description 1
- 229940023143 protein vaccine Drugs 0.000 description 1
- 238000000746 purification Methods 0.000 description 1
- 238000002708 random mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 238000010188 recombinant method Methods 0.000 description 1
- 230000006798 recombination Effects 0.000 description 1
- 238000005215 recombination Methods 0.000 description 1
- 230000000717 retained effect Effects 0.000 description 1
- 239000012679 serum free medium Substances 0.000 description 1
- 238000002741 site-directed mutagenesis Methods 0.000 description 1
- 239000007787 solid Substances 0.000 description 1
- 239000000243 solution Substances 0.000 description 1
- 238000003860 storage Methods 0.000 description 1
- 239000006228 supernatant Substances 0.000 description 1
- 230000002194 synthesizing effect Effects 0.000 description 1
- 229940124597 therapeutic agent Drugs 0.000 description 1
- 238000002560 therapeutic procedure Methods 0.000 description 1
- 210000001519 tissue Anatomy 0.000 description 1
- 231100000419 toxicity Toxicity 0.000 description 1
- 230000001988 toxicity Effects 0.000 description 1
- 238000010361 transduction Methods 0.000 description 1
- 230000026683 transduction Effects 0.000 description 1
- 230000014621 translational initiation Effects 0.000 description 1
- 210000004881 tumor cell Anatomy 0.000 description 1
- 230000002476 tumorcidal effect Effects 0.000 description 1
- 238000010200 validation analysis Methods 0.000 description 1
- 239000003981 vehicle Substances 0.000 description 1
- 230000007442 viral DNA synthesis Effects 0.000 description 1
- 230000029812 viral genome replication Effects 0.000 description 1
- 239000013603 viral vector Substances 0.000 description 1
Images
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
- C12N15/09—Recombinant DNA-technology
- C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
- C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
- C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
- C12N15/86—Viral vectors
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N7/00—Viruses; Bacteriophages; Compositions thereof; Preparation or purification thereof
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10021—Viruses as such, e.g. new isolates, mutants or their genomic sequences
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
- C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
- C12N2710/00011—Details
- C12N2710/10011—Adenoviridae
- C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
- C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
Landscapes
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Zoology (AREA)
- Biomedical Technology (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Medicinal Chemistry (AREA)
- Immunology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Plant Pathology (AREA)
- Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
- Medicines Containing Material From Animals Or Micro-Organisms (AREA)
Abstract
本发明提供了一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用。本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强。同时，本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有很大的应用价值。
Description
技术领域
本发明属于生物医学以及病毒学领域，更具体地，本发明涉及一种新型腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒，它们的制备方法及应用；较佳地，所述腺病毒载体AdC68XY基于合成生物学技术构建。
背景技术
腺病毒载体是目前最有应用前景的病毒载体之一。腺病毒是一种无包膜、线性的双链DNA病毒，基因组大小约为36kb。自1953年首次发现腺病毒至今，已分离出57种人血清型(分为A～G 7个亚属)及多种其它种属来源的腺病毒，其中最常见的是人血清5型腺病毒，即AdHu5。腺病毒由于转导效率高、可携带外源基因，易于扩增及纯化，被视为优良的基因运载工具，广泛应用于各种基础研究或临床应用，包括研发针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、***癌、黑色素瘤等疾病的疫苗，以及用于溶瘤治疗。然而，由于75-80％的个体中存在抗AdHu5的预存中和抗体，以AdHu5为载体的疫苗，其免疫效果受预存中和抗体的影响，不仅削弱其免疫效果，而且可能增强副反应。为避免这一问题，本发明人之前选择稀有血清型或其它种属来源的腺病毒作为疫苗载体，如黑猩猩型腺病毒等。黑猩猩型腺病毒只流行于非洲的黑猩猩中，人群中一般不含抗黑猩猩型腺病毒的中和抗体，故以黑猩猩型腺病毒为疫苗载体，其综合免疫效果优于AdHu5载体。
由于腺病毒基因组相对较大，一般的分子生物学方法难以完成重组腺病毒载体的构建，因此，腺病毒载体的构建依然是一个技术瓶颈。传统的腺病毒载体构建策略主要为同源重组和基因组直接克隆，这些策略费时费力，最快也需要2个多月时间。进一步改良的策略为等温组装法，虽然这种方法声称只需要1周左右，但这只是指将多个片断用等温组装法连接在一起成为一个克隆所需的时间，尚不包括获得接头部位存在互补序列的多个小片段所需的时间以及验证过程。而且，以上这些策略都必须首先获得野生型病毒，并扩增纯化病毒，获得其基因组DNA。如果只知腺病毒基因序列，则无法完成腺病毒载体的构建。
综上，本领域还需要进行进一步的研究探索，来获得改进的腺病毒载体以及腺病毒，增强其临床上的应用性。
发明内容
本发明的目的在于提供基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体AdC68XY。
在本发明的第一方面，提供一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列和E3序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
在一个优选例中，前述方法或载体中，所述改造选自：
(a)以AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第32914-35641位序列；
(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第32914-34077位序列；或
(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第33193-34703位序列。
在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列；和/或酶切位点；较佳地包括(但不限于)：HpaI，I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。
在另一优选例中，所述报告基因的表达盒具有SEQ ID NO:2所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述酶切位点包括用于***外源基因的酶切位点。
在另一优选例中，所述外源基因表达盒可表达获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。
在另一优选例中，所述外源基因为长度在30bp～8.5kb的外源基因，如长度为50bp，100bp，200bp，500bp，1kb，2kb，3kb，4kb，5kb，6kb，7kb，8kb。
在另一优选例中，所述的腺病毒表达载体是利用人工合成技术构建。
在另一优选例中，所述的重组腺病毒载体具有SEQ ID NO:1(AdC68XY1-EGFP)所示的核苷酸序列，但，其中第29278～31865位由SEQ ID NO:3替换；其中第29278～30431位由SEQ ID NO:4替换；或其中第29278～31865位由SEQ ID NO:5替换。
在本发明的另一方面，提供前面任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于***外源基因、从而表达外源基因。
在本发明的另一方面，提供一种重组腺病毒，其由前面任一所述的重组腺病毒载体包装获得。
在本发明的另一方面，提供一种制备所述的重组腺病毒的方法，所述方法包括：(1)制备前面任一所述的重组腺病毒载体；和(2)将(1)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
在一个优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞。
在本发明的另一方面，提供所述的重组腺病毒的用途，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤活性的蛋白(如杀肿瘤的蛋白))，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。
在一个优选例中，所述的具有免疫原性的蛋白包括但不限于：针对HIV、流感、埃博拉、疟疾、狂犬病、***癌、黑色素瘤等疾病的蛋白疫苗。
在本发明的另一方面，提供一种试剂盒，包括：前面任一所述的重组腺病毒载体；前面所述的重组腺病毒；和/或病毒生产细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP的载体构建示意图图中，E1区已完全删除；E3区域部分删除，加入SwaI酶切位点，用于后续外源基因***。
图2、重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP酶切鉴定结果。其中，M:1kb plus DNA ladder；1-3：BglII、XhoΙ、MfeI酶切结果。
图3A重组腺病毒AdC68XY1-EGFP的病毒噬斑形成。
图3B重组腺病毒AdC68XY2-EGFP的病毒噬斑形成。
图3C重组腺病毒AdC68XY3-EGFP的病毒噬斑形成。
图3D重组腺病毒AdC68XY4-EGFP的病毒噬斑形成。
图4、重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP基因组酶切鉴定结果。其中，M:1kb plus DNA ladder；1-3：BglII、XhoΙ、MfeI酶切结果。
具体实施方式
腺病毒的基因组比较大，以其进行外源基因的表达较为困难。为此，本发明人经过深入的研究，揭示了基于合成生物学技术构建的新型腺病毒载体，称为AdC68XY系列载体。一方面，本发明的腺病毒表达载体能够高效地包装，病毒产量高，且获得的病毒感染能力强；另一方面，本发明的腺病毒表达载体可容纳较大的外源基因，具有较大的应用价值。
如本文所用，所述的“元件”是指一些对于蛋白的表达有用的一系列功能性的核酸序列，本发明中，所述的“元件”被***地构建以形成一种表达构建体。所述的“元件”的序列可以是本发明中所提供的那些，也包括它们的变体，只要这些变体基本上保留了所述“元件”的功能，其通过***或删除一些碱基(如1-50bp；较佳地1-30bp，更佳地1-20bp，更佳地1-10bp)，或进行随机或定点突变等来获得。
如本文所用，所述的“操作性连接”或“可操作性相连”是指两个或多个核酸区域或核酸序列的功能性的空间排列。例如：启动子区被置于相对于目的基因核酸序列的特定位置，使得核酸序列的转录受到该启动子区域的引导，从而，启动子区域被“可操作地连接”到该核酸序列上。
如本文所用，所述的“表达盒”是指包含有表达目的基因所需的所有必要元件的基因表达***，通常其包括以下元件：启动子、目的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
如本文所用，所述的“构建物(或称构建体)”指一种已经通过人为干预，使其含有按照自然界中不存在的序列所组合和排列的DNA片段的单链或者双链DNA分子。所述的“构建物”包括表达载体；或者，所述的“构建物”被包含在表达载体中、作为表达载体的一部分。
如本文所用，所述的“外源”或“异源”是指来自不同来源的两条或多条核酸或蛋白质序列之间的关系，或来自不同来源的核酸与宿主细胞之间的关系。例如，如果核酸与宿主细胞的组合通常不是天然存在的，则核酸对于该宿主细胞来说是异源的。特定序列对于其所***的细胞或生物体来说是“外源的”。
腺病毒载体
腺病毒的基因组比较大，在先前的技术中，本发明人尝试了较多的改造策略，包括针对其基因组中E1和E3进行全部或部分改造，删除部分的基因，但是鉴于其E4区域的重要作用，现有技术中尚没有针对其E4进行成功改造的先例。而本发明人发现，可以针对E4进行全部或部分改造，以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的区域进行替换、或有限地进行序列删减，可以获得复制能力、感染能力增强的病毒，甚至还可以实现外源基因***容量的增大。
在本发明中，以黑猩猩型腺病毒AdC68为模板，利用其基因组序列，设计新型的E1/E3删除的复制缺陷型重组腺病毒载体。腺病毒基因组包含E1-E4早期基因，E1A可激活E1B、E2A、E2B、E3和E4的启动子。腺病毒E4区包括7个开放阅读框，其产物分别为ORF1、ORF2、ORF3、ORF4、ORF3/4、ORF6和ORF6/7。其中，E4ORF6是一个多功能蛋白，参与病毒复制的多个过程，对于腺病毒的复制极为重要。ORF6可与E1B 55-kDa结合，形成ORF6-E1B复合物，该复合物在转录后阶段促进主要晚期病毒mRNA的输出，从而加强晚期病毒基因的表达，同时抑制宿主蛋白的合成。在腺病毒感染的细胞中，ORF6-E1B复合物还参与抑制E1A诱导的p53激活，从而使p53降解，抑制宿主细胞凋亡。而且，ORF6可间接提高病毒DNA合成效率。ORF3与ORF6功能相似，可部分或完全补偿彼此的缺失。为了提高安全性，用作疫苗载体的腺病毒通常为复制缺陷型，即删除了E1基因。因此，通常用整合了AdHu5E1基因的HEK 293细胞包装和扩增非复制型腺病毒。尽管AdHu5E1B 55k和E4ORF6蛋白之间的相互作用相对保守，但黑猩猩型腺病毒E4ORF6蛋白与AdHu5E1B 55k的结合可能不稳定或效率降低，导致非复制型黑猩猩腺病毒产量降低。为避免出现以上问题，提高重组腺病毒AdC68的产量，本发明人将AdC68的E4序列全部或部分替换成AdHu5的E4序列，设计成多个分别带有不同E4序列的重组AdC68载体，分别命名为AdC68XY1、AdC68XY2、AdC68XY3、AdC68XY4；在重组载体的E1删除区，***绿色荧光蛋白基因。然后，本发明人采用合成生物学技术，全基因组合成带有绿色荧光标记的新型重组腺病AdC68XY1，线性化后在HEK 293细胞中成功包装，并扩增出遗传稳定的重组腺病毒AdC68XY1。在获得重组腺病毒载体AdC68XY1基础上，本发明人按既定设计方案，对AdC68的E4序列作其它多种替换，分别获得AdC68XY2、AdC68XY3、AdC68XY4等载体。这一方法不仅省时省力，而且不需依赖野生型腺病毒基因组DNA。
基于本发明人的新发现，提供了一种重组腺病毒载体(质粒)，该重组腺病毒载体包括：改造的黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列；其中E1全部序列和E3部分序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
作为本发明的优选方式，所述改造选自：(a)AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；或(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列。
作为本发明的优选方式，还包括选自以下操作性相连的元件或基因：外源基因表达盒；报告基因的表达盒；反向末端重复序列和/或酶切位点。应理解，报告基因、酶切位点等元件的设计有时候是为了在进行研究时提供方便观测或检测的途径，而当将本发明的重组腺病毒载体或重组腺病毒应用于临床药学领域时，其并非是必要的；或者，可以在所述报告基因的位置上以能表达具有药学活性的目的蛋白的基因替代。
所述的表达载体通常还含有复制起点和/或标记基因等。根据本发明的提示，本领域的技术人员熟知的方法能用于构建本发明所需的表达载体。这些方法包括体外重组DNA技术、DNA合成技术、体内重组技术等。所述的DNA序列可有效连接到表达载体中的适当启动子(如CMV)上，以指导mRNA合成。表达载体还包括翻译起始用的核糖体结合位点和转录终止子。此外，表达载体优选地包含一个或多个选择性标记基因，以提供用于选择转化的宿主细胞的表型性状。
本发明所述的表达载体中，可以***外源基因的表达盒，从而表达人们感兴趣的目的蛋白。本发明的腺病毒表达载体可以作为一个表达载体平台，适用于表达多种目的蛋白，所述的目的蛋白没有特别的限制。作为一些可选的实施方式，所述的目的蛋白包括(但不限于)：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。所述的目的蛋白可以是单条，也可以是两条或多条，只要其编码基因的长度在所述腺病毒可容纳的包装容量内。
本发明所述的表达载体中，外源基因表达盒***位置不唯一，较佳地包括(但不限于)：E1区域，E3区域，E4区域蛋白。
本发明的表达载体中的各元件是可操作性连接的，从而有利于病毒的包装或目的蛋白的有效表达。
作为本发明的优选方式，采用基于合成生物学的技术构建本发明的新型腺病毒载体。与传统生物学的研究方向相反，合成生物学是从最基本的要素开始一步步建立零部件，在此过程中设计、修改遗传物质，最终获得理想的新生物体。但是，应理解，除了合成生物学的技术，在获得了本发明的技术方案后，其它构建本发明的腺病毒载体的方法也应被包含在本发明中。
本发明为新型腺病毒载体的构建提供了一种快速有效的方法，有利于拓展腺病毒载体的应用，同时获得新型重组腺病毒AdC68XY系列载体。
腺病毒
获得所述腺病毒表达载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。所述的病毒生产细胞可以是本领域公知的各种能够繁殖腺病毒的细胞，例如HEK293细胞等。
作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度(TCID50)的测定可以根据本领域常规方法进行。所获得的重组腺病毒也包含在本发明中。
本发明的腺病毒载体表达获得的腺病毒，在转染病毒生产细胞4天后，就能够在细胞培养物表面形成清晰而显著的噬菌斑，数量较多，显著由于改造前的腺病毒载体。
本发明的重组腺病毒载体生成的重组腺病毒能高效转染哺乳动物细胞、易于扩增及纯化、毒性低，其表达效率高且长久。本发明的腺病毒载体表达重组工艺简单、价格低廉、疗效持久。
组合物、试剂盒或药盒
本发明还提供了一种组合物，它含有有效量的所述的腺病毒，以及药学上可接受的载体。较佳地，所述的腺病毒表达有意义的目的蛋白。例如，所述的目的蛋白包括但不限于：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白(如抗体，具有杀伤肿瘤细胞活性的蛋白)，具有诊断活性的蛋白(如抗体)，结构蛋白，酶，融合肽。
如本文所用，“含有”表示各种成分可一起应用于本发明的混合物或组合物中。因此，术语“主要由...组成”和“由...组成”包含在术语“含有”中。
如本文所用，“有效量”或“有效剂量”是指可对人和/或动物产生功能或活性的且可被人和/或动物所接受的如本文所用。
如本文所用，“药学上可接受的”的成分是适用于人和/或哺乳动物而无过度不良副反应(如毒性、刺激和***反应)的，即具有合理的效益/风险比的物质。术语“药学上可接受的载体”指用于治疗剂给药的载体，包括各种赋形剂和稀释剂。
通常，可将所述腺病毒配制于无毒的、惰性的和药学上可接受的水性载体介质中，其中pH通常约为5-8，较佳地，pH约为6-8。
本发明的药物组合物可以被制成针剂形式，例如用生理盐水或含有葡萄糖和其他辅剂的水溶液通过常规方法进行制备。活性成分(腺病毒)的给药量是治疗有效量，例如每天约0.1微克/千克体重-约10毫克/千克体重。当然，具体剂量还应考虑给药途径、病人健康状况等因素，这些都是熟练医师技能范围之内的。
基于本发明的新发现，还提供了一种试剂盒/药盒，其中包括所述的腺病毒表达载体或所述的腺病毒。所述的试剂盒/药盒还可包括病毒生产细胞(如293细胞)，培养基等。此外，所述的试剂盒/药盒中还可包括说明表达方法后腺病毒使用方法的使用说明书。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
细胞
HEK 293细胞株购自中国科学院上海细胞库，培养液为含有10％胎牛血清的DMEM。
限制性内切酶、感受态细胞、基因组序列
所有限制性内切酶购自New England Biolabs；Stbl2菌种购自苏州新赛美生物科技有限公司(苏州)。
黑猩猩型腺病毒AdC68序列参照GenBank公布序列，即GenBank登录号：AC_000011.1。
腺病毒人血清型5型(AdHu5)的E4序列参照GenBank登录号：AC_000008.1。
实施例1、腺病毒载体AdC68XY及重组腺病毒的制备
1、腺病毒载体AdC68XY的设计
首先，本发明人将AdC68基因组序列中的部分E1和E3序列删除。E1删除大小为2552bp(删除区域为459bp-3010bp)，从而可获得复制缺陷型腺病毒载体。E3删除大小为3721bp(删除区域为AC_000011.1，27615bp-31335bp)。E1/E3删除可使外源基因***的容量达7.5kb左右。
其次，本发明人将AdC68的E4序列以不同的方式改造或替换成AdHu5的E4序列，获得不同的重组载体，一些优化的重组载体具体如下：
AdC68XY1载体：其中E1/E3删除，在33517bp和36106bp处(对应AC_000011.1)加入酶切位点HpaI，E4序列未改动。同时，本发明人在E1删除区***了稀有酶切位点I-CeuI和PI-SceI，便于在此区域***外源基因。在E3删除区***酶切位点SwaI，以便在此区域也可***外源基因。在E4区两端加入酶切位点HpaI，以便后续对E4区域进行改造。将以上经修改的AdC68基因组的两侧ITR分别加上PacI酶切位点(便于将重组腺病毒质粒用PacI线性化)，从而获得重组腺病毒载体AdC68XY1。为了便于观察该新型重组腺病毒的包装，本发明人在E1删除区的I-CeuI和PI-SceI酶切位点之间***CMV-EGFP序列(CMV启动子驱动EGFP表达，SEQ ID NO:2)，使获得的重组腺病毒带有绿色荧光标记(AdC68XY1-EGFP)。AdC68XY1-EGFP序列如SEQ ID NO:1，其元件构成如图1。
AdC68XY2载体：其中E1/E3删除，E4序列全部替换成AdHu5的E4序列：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-36105bp(对应AC_000011.1)；AdHu5E4序列的***区域(SEQ ID NO:3)为32914bp-35641bp(对应AC_000008.1)。
AdC68XY3载体：其中E1/E3删除，E4区域ORF6/7和ORF6替换成AdHu5：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-34671bp(对应AC_000011.1)；AdHu5E4序列的***区域(SEQ ID NO:4)为32914bp-34077bp(对应AC_000008.1)。其中，保留了AdC68的ORF1-4序列。
AdC68XY4载体：其中E1/E3删除，E4区域替换成AdHu5的ORF3-6(即ORF1-2和6/7被删除)：AdC68E4序列的删除区域为33518bp-36105bp(对应AC_000011.1)，AdHu5E4序列的***区域(SEQ ID NO:5)为33193bp-34703bp(对应AC_000008.1)。
2、重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆的合成
将以上设计的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆序列送至通用生物***(安徽)有限公司，由该公司合成该分子克隆。
在合成的pAdC68XY1-EGFP载体的序列的基础上，进行进一步改造，分别获得AdC68XY2载体、AdC68XY3载体、AdC68XY4载体。
3、重组腺病毒AdC68XY1-EGFP包装和扩增
将以上合成获得的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP分子克隆(质粒DNA)用PacI酶切线性化，根据Lipofectamine 2000转染试剂盒的使用说明，将酶切后的AdC68XY1-EGFP质粒DNA转染密度为60-70％的HEK293细胞(6孔板)。转染前，换成无血清培养基，加入DNA/脂质体复合物，转染5小时后，换含10％FBS、1％双抗的DMEM培养基。在荧光显微镜下隔日观察EGFP荧光强度及细胞病变，直至HEK293细胞出现大量噬斑时收集细胞，在室温与-80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，3500rpm/min离心10min，收集上清置于-80℃超低温冰箱保种。
4、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP的分子克隆及病毒包装
在获得重组腺病毒载体pAdC68XY1-EGFP基础上，本发明人按既定设计方案，对AdC68的E4序列作其它多种替换，先将pAdC68XY1-EGFP载体用HpaI酶切，再利用等温重组分子克隆方法，分别获得pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP载体，并按如前所述方法包装、扩增并纯化病毒。
5、重组腺病毒AdC68XY-EGFP鉴定
各重组腺病毒经扩增后，用氯化铯密度梯度离心法纯化病毒液，测定病毒的滴度并分装置于-80℃超低温冰箱保存。取部分纯化的各重组腺病毒AdC68XY-EGFP，根据DNeasyTissue Kit(QIAGEN，Valencia，CA)试剂盒的使用说明，分离纯化各重组腺病毒基因组DNA，然后作多酶切鉴定。
实施例2、重组腺病毒pAdC68XY-EGFP分子克隆的鉴定
将合成获得的重组腺病毒pAdC68XY1-EGFP质粒DNA用多种酶(MfeI、BglII、XhoI)酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过DNA条带证明pAdC68XY1-EGFP分子克隆是完整、正确的，见图2。
其它经进一步改造获得的重组腺病毒pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP的质粒DNA作相同的酶切鉴定，见图2。
实施例3、重组腺病毒AdC68XY-EGFP的病毒包装与拯救
脂质体转染法将经PacI线性化的pAdC68XY1-EGFP、pAdC68XY2-EGFP、pAdC68XY3-EGFP、pAdC68XY4-EGFP质粒DNA转染到密度约为70％的HEK 293细胞(培养于6孔板)，定期观察绿色荧光蛋白表达情况并拍照记录。随着时间的变化，绿色荧光表达会发生变化，荧光逐渐富集并形成簇状，最终形成噬斑，说明在HEK 293细胞中黑猩猩来源的复制缺陷型腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP都成功包装并复制出具有感染性的病毒颗粒，见图3。
根据图3，E4区域未改造的腺病毒AdC68XY1-EGFP在第10天出现噬斑，噬斑数量为3个。
E4区域删除的AdC68XY2-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为11个。
E4区域改造的AdC68XY3-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为12个。
E4区域改造的AdC68XY4-EGFP在第4天出现噬斑，噬斑数量为15个。
根据这一结果，E4区域改造后，腺病毒拯救所需时间明显短于未改造组，且噬斑数量明显多于未改造组，证实了E4区域被部分或完全替换成AdHu5源的腺病毒相应区域后，复制能力得到了增强。
并且，对于进一步增加了外源基因***容量组AdC68XY4-EGFP，E4区域ORF1、ORF2和ORF6/7删除后，其比AdC68XY1少970bp，从而其外源基因***容量增大，外源基因的***容量可达8.5kb左右。同时，AdC68XY4在***容量增加的同时，腺病毒的复制能力、病毒包装等没有受到影响，产量没有受到影响。
实施例4、重组腺病毒AdC68XY-EGFP鉴定
将扩增的重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP经氯化铯梯度离心法纯化，纯化后的各重组病毒滴度分别为6×1012vp/L、2×1013vp/L、1×1013vp/L、2×1013vp/L。均可获得较高的滴度。
此实验结果中，E4区域被部分或完全替换成Hu5源的重组腺病毒，病毒产量相对最高，达到了预期的效果，其它E4区域被部分改造的重组腺病毒，病毒产量也有显著提高。因此，本发明的改造，获得了更利于在HEK293细胞中生长的各种重组腺病毒，提高了产量。
分离病毒基因组DNA，用MfeI、BglII、XhoΙ酶切后，经1％琼脂糖凝胶电泳，通过酶切后的基因组DNA条带证明重组腺病毒AdC68XY1-EGFP、AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP为正确的病毒基因组。见图3。
结论
本发明中，通过对腺病毒AdC68基因组序列进行分析、设计，并利用生物合成技术，整体合成重组腺病毒载体AdC68XY1。为了体现效果，本发明人在质粒中加入绿色荧光蛋白，经转染、病毒包装、扩增、纯化，可直接获得重组腺病毒AdC68XY1-EGFP。经酶切鉴定分析，获得了正确的重组腺病毒载体AdC68XY。在此基础上，本发明人通过常规的分子克隆，对AdC68XY1的E4作进一步替换，获得重组腺病毒AdC68XY2-EGFP、AdC68XY3-EGFP、AdC68XY4-EGFP，并获得相应的重组腺病毒。所述载体可应用于各种基础研究和临床应用，譬如作为表达载体、疫苗研发、基因治疗等。
本发明不仅获得了一系列基于黑猩猩型腺病毒的新型载体AdC68XY，改造后的载体较传统的AdC68载体更适宜在包装细胞HEK293中生长、繁殖，产量高，从而可降低产品的生产成本；而且本发明建立了以合成生物学制备重组腺病毒载体的新策略，这种策略无需获得野生型腺病毒，避免复杂的克隆过程，直接合成重组腺病毒的分子克隆，省时省力。这一策略解决了构建重组腺病毒载体的技术瓶颈，为重组腺病毒载体的发展和推广应用提供了坚实的理论和技术支撑。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。
序列表
<110> 苏州相奕生物技术有限公司
<120> 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用
<130> 196276
<160> 5
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 35048
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(35048)
<223> 重组腺病毒AdC68XY1-EGFP核苷酸序列
<400> 1
gtcgagggat gagcgaccgt taggggcggg gcgagtgacg ttttgatgac gtggttgcga 60
ggaggagcca gtttgcaagt tctcgtggga aaagtgacgt caaacgaggt gtggtttgaa 120
cacggaaata ctcaattttc ccgcgctctc tgacaggaaa tgaggtgttt ctgggcggat 180
gcaagtgaaa acgggccatt ttcgcgcgaa aactgaatga ggaagtgaaa atctgagtaa 240
tttcgcgttt atggcaggga ggagtatttg ccgagggccg agtagacttt gaccgattac 300
gtgggggttt cgattaccgt gtttttcacc taaatttccg cgtacggtgt caaagtccgg 360
tgtttttacg tacgatatca tttccccgaa aagtgccacc tgaccgtaac tataacggtc 420
ctaaggtagc gaaagctcag atctcccgat cccctatggt gcactctcag tacaatctgc 480
tctgatgccg catagttaag ccagtatctg ctccctgctt gtgtgttgga ggtcgctgag 540
tagtgcgcga gcaaaattta agctacaaca aggcaaggct tgaccgacaa ttgcatgaag 600
aatctgctta gggttaggcg ttttgcgctg cttcgcgatg tacgggccag atatacgcgt 660
tgacattgat tattgactag ttattaatag taatcaatta cggggtcatt agttcatagc 720
ccatatatgg agttccgcgt tacataactt acggtaaatg gcccgcctgg ctgaccgccc 780
aacgaccccc gcccattgac gtcaataatg acgtatgttc ccatagtaac gccaataggg 840
actttccatt gacgtcaatg ggtggactat ttacggtaaa ctgcccactt ggcagtacat 900
caagtgtatc atatgccaag tacgccccct attgacgtca atgacggtaa atggcccgcc 960
tggcattatg cccagtacat gaccttatgg gactttccta cttggcagta catctacgta 1020
ttagtcatcg ctattaccat ggtgatgcgg ttttggcagt acatcaatgg gcgtggatag 1080
cggtttgact cacggggatt tccaagtctc caccccattg acgtcaatgg gagtttgttt 1140
tggcaccaaa atcaacggga ctttccaaaa tgtcgtaaca actccgcccc attgacgcaa 1200
atgggcggta ggcgtgtacg gtgggaggtc tatataagca gagctctctg gctaactaga 1260
gaacccactg cttactggct tatcgaaatt aatacgactc actataggga gacccaagct 1320
ggctagcgtt taaacgggcc cgcccgggct tataagccac catggtgagc aagggcgagg 1380
agctgttcac cggggtggtg cccatcctgg tcgagctgga cggcgacgta aacggccaca 1440
agttcagcgt gtccggcgag ggcgagggcg atgccaccta cggcaagctg accctgaagt 1500
tcatctgcac caccggcaag ctgcccgtgc cctggcccac cctcgtgacc accctgacct 1560
acggcgtgca gtgcttcagc cgctaccccg accacatgaa gcagcacgac ttcttcaagt 1620
ccgccatgcc cgaaggctac gtccaggagc gcaccatctt cttcaaggac gacggcaact 1680
acaagacccg cgccgaggtg aagttcgagg gcgacaccct ggtgaaccgc atcgagctga 1740
agggcatcga cttcaaggag gacggcaaca tcctggggca caagctggag tacaactaca 1800
acagccacaa cgtctatatc atggccgaca agcagaagaa cggcatcaag gtgaacttca 1860
agatccgcca caacatcgag gacggcagcg tgcagctcgc cgaccactac cagcagaaca 1920
cccccatcgg cgacggcccc gtgctgctgc ccgacaacca ctacctgagc acccagtccg 1980
ccctgagcaa agaccccaac gagaagcgcg atcacatggt cctgctggag ttcgtgaccg 2040
ccgccgggat cactctcggc atggacgagc tgtacaagta attataagcc cgggcaagct 2100
taagtttaaa ccgctgatca gcctcgactg tgccttctag ttgccagcca tctgttgttt 2160
gcccctcccc cgtgccttcc ttgaccctgg aaggtgccac tcccactgtc ctttcctaat 2220
aaaatgagga aattgcatcg cattgtctga gtaggtgtca ttctattctg gggggtgggg 2280
tggggcagga cagcaagggg gaggattggg aagacaatag caggcatgct ggggatgcgg 2340
tgggctctat ggcttctgag gcggaaagaa ccagcagatc tgcagatctg aattcatcta 2400
tgtcgggtgc ggagaaagag gtaatgaaat ggcattatgg gtattatggg tctgcattaa 2460
tgaatcggcc agatatcgac atatgctggc caccgtacat gtggcttccc atgctcgcaa 2520
gccctggccc gagttcgagc acaatgtcat gaccaggtgc aatatgcatc tggggtcccg 2580
ccgaggcatg ttcatgccct accagtgcaa cctgaattat gtgaaggtgc tgctggagcc 2640
cgatgccatg tccagagtga gcctgacggg ggtgtttgac atgaatgtgg aggtgtggaa 2700
gattctgaga tatgatgaat ccaagaccag gtgccgagcc tgcgagtgcg gagggaagca 2760
tgccaggttc cagcccgtgt gtgtggatgt gacggaggac ctgcgacccg atcatttggt 2820
gttgccctgc accgggacgg agttcggttc cagcggggaa gaatctgact agagtgagta 2880
gtgttctggg gcgggggagg acctgcatga gggccagaat aactgaaatc tgtgcttttc 2940
tgtgtgttgc agcagcatga gcggaagcgg ctcctttgag ggaggggtat tcagccctta 3000
tctgacgggg cgtctcccct cctgggcggg agtgcgtcag aatgtgatgg gatccacggt 3060
ggacggccgg cccgtgcagc ccgcgaactc ttcaaccctg acctatgcaa ccctgagctc 3120
ttcgtcgttg gacgcagctg ccgccgcagc tgctgcatct gccgccagcg ccgtgcgcgg 3180
aatggccatg ggcgccggct actacggcac tctggtggcc aactcgagtt ccaccaataa 3240
tcccgccagc ctgaacgagg agaagctgtt gctgctgatg gcccagctcg aggccttgac 3300
ccagcgcctg ggcgagctga cccagcaggt ggctcagctg caggagcaga cgcgggccgc 3360
ggttgccacg gtgaaatcca aataaaaaat gaatcaataa ataaacggag acggttgttg 3420
attttaacac agagtctgaa tctttatttg atttttcgcg cgcggtaggc cctggaccac 3480
cggtctcgat cattgagcac ccggtggatc ttttccagga cccggtagag gtgggcttgg 3540
atgttgaggt acatgggcat gagcccgtcc cgggggtgga ggtagctcca ttgcagggcc 3600
tcgtgctcgg gggtggtgtt gtaaatcacc cagtcatagc aggggcgcag ggcatggtgt 3660
tgcacaatat ctttgaggag gagactgatg gccacgggca gccctttggt gtaggtgttt 3720
acaaatctgt tgagctggga gggatgcatg cggggggaga tgaggtgcat cttggcctgg 3780
atcttgagat tggcgatgtt accgcccaga tcccgcctgg ggttcatgtt gtgcaggacc 3840
accagcacgg tgtatccggt gcacttgggg aatttatcat gcaacttgga agggaaggcg 3900
tgaaagaatt tggcgacgcc tttgtgcccg cccaggtttt ccatgcactc atccatgatg 3960
atggcgatgg gcccgtgggc ggcggcctgg gcaaagacgt ttcgggggtc ggacacatca 4020
tagttgtggt cctgggtgag gtcatcatag gccattttaa tgaatttggg gcggagggtg 4080
ccggactggg ggacaaaggt accctcgatc ccgggggcgt agttcccctc acagatctgc 4140
atctcccagg ctttgagctc ggaggggggg atcatgtcca cctgcggggc gataaagaac 4200
acggtttccg gggcggggga gatgagctgg gccgaaagca agttccggag cagctgggac 4260
ttgccgcagc cggtggggcc gtagatgacc ccgatgaccg gctgcaggtg gtagttgagg 4320
gagagacagc tgccgtcctc ccggaggagg ggggccacct cgttcatcat ctcgcgcacg 4380
tgcatgttct cgcgcaccag ttccgccagg aggcgctctc cccccaggga taggagctcc 4440
tggagcgagg cgaagttttt cagcggcttg agtccgtcgg ccatgggcat tttggagagg 4500
gtttgttgca agagttccag gcggtcccag agctcggtga tgtgctctac ggcatctcga 4560
tccagcagac ctcctcgttt cgcgggttgg gacggctgcg ggagtagggc accagacgat 4620
gggcgtccag cgcagccagg gtccggtcct tccagggtcg cagcgtccgc gtcagggtgg 4680
tctccgtcac ggtgaagggg tgcgcgccgg gctgggcgct tgcgagggtg cgcttcaggc 4740
tcatccggct ggtcgaaaac cgctcccgat cggcgccctg cgcgtcggcc aggtagcaat 4800
tgaccatgag ttcgtagttg agcgcctcgg ccgcgtggcc tttggcgcgg agcttacctt 4860
tggaagtctg cccgcaggcg ggacagagga gggacttgag ggcgtagagc ttgggggcga 4920
ggaagacgga ctcgggggcg taggcgtccg cgccgcagtg ggcgcagacg gtctcgcact 4980
ccacgagcca ggtgaggtcg ggctggtcgg ggtcaaaaac cagtttcccg ccgttctttt 5040
tgatgcgttt cttacctttg gtctccatga gctcgtgtcc ccgctgggtg acaaagaggc 5100
tgtccgtgtc cccgtagacc gactttatgg gccggtcctc gagcggtgtg ccgcggtcct 5160
cctcgtagag gaaccccgcc cactccgaga cgaaagcccg ggtccaggcc agcacgaagg 5220
aggccacgtg ggacgggtag cggtcgttgt ccaccagcgg gtccaccttt tccagggtat 5280
gcaaacacat gtccccctcg tccacatcca ggaaggtgat tggcttgtaa gtgtaggcca 5340
cgtgaccggg ggtcccggcc gggggggtat aaaagggtgc gggtccctgc tcgtcctcac 5400
tgtcttccgg atcgctgtcc aggagcgcca gctgttgggg taggtattcc ctctcgaagg 5460
cgggcatgac ctcggcactc aggttgtcag tttctagaaa cgaggaggat ttgatattga 5520
cggtgccggc ggagatgcct ttcaagagcc cctcgtccat ctggtcagaa aagacgatct 5580
ttttgttgtc gagcttggtg gcgaaggagc cgtagagggc gttggagagg agcttggcga 5640
tggagcgcat ggtctggttt ttttccttgt cggcgcgctc cttggcggcg atgttgagct 5700
gcacgtactc gcgcgccacg cacttccatt cggggaagac ggtggtcagc tcgtcgggca 5760
cgattctgac ctgccagccc cgattatgca gggtgatgag gtccacactg gtggccacct 5820
cgccgcgcag gggctcatta gtccagcaga ggcgtccgcc cttgcgcgag cagaaggggg 5880
gcagggggtc cagcatgacc tcgtcggggg ggtcggcatc gatggtgaag atgccgggca 5940
ggaggtcggg gtcaaagtag ctgatggaag tggccagatc gtccagggca gcttgccatt 6000
cgcgcacggc cagcgcgcgc tcgtagggac tgaggggcgt gccccagggc atgggatggg 6060
taagcgcgga ggcgtacatg ccgcagatgt cgtagacgta gaggggctcc tcgaggatgc 6120
cgatgtaggt ggggtagcag cgccccccgc ggatgctggc gcgcacgtag tcatacagct 6180
cgtgcgaggg ggcgaggagc cccgggccca ggttggtgcg actgggcttt tcggcgcggt 6240
agacgatctg gcggaaaatg gcatgcgagt tggaggagat ggtgggcctt tggaagatgt 6300
tgaagtgggc gtggggcagt ccgaccgagt cgcggatgaa gtgggcgtag gagtcttgca 6360
gcttggcgac gagctcggcg gtgactagga cgtccagagc gcagtagtcg agggtctcct 6420
ggatgatgtc atacttgagc tgtccctttt gtttccacag ctcgcggttg agaaggaact 6480
cttcgcggtc cttccagtac tcttcgaggg ggaacccgtc ctgatctgca cggtaagagc 6540
ctagcatgta gaactggttg acggccttgt aggcgcagca gcccttctcc acggggaggg 6600
cgtaggcctg ggcggccttg cgcagggagg tgtgcgtgag ggcgaaagtg tccctgacca 6660
tgaccttgag gaactggtgc ttgaagtcga tatcgtcgca gcccccctgc tcccagagct 6720
ggaagtccgt gcgcttcttg taggcggggt tgggcaaagc gaaagtaaca tcgttgaaga 6780
ggatcttgcc cgcgcggggc ataaagttgc gagtgatgcg gaaaggttgg ggcacctcgg 6840
cccggttgtt gatgacctgg gcggcgagca cgatctcgtc gaagccgttg atgttgtggc 6900
ccacgatgta gagttccacg aatcgcggac ggcccttgac gtggggcagt ttcttgagct 6960
cctcgtaggt gagctcgtcg gggtcgctga gcccgtgctg ctcgagcgcc cagtcggcga 7020
gatgggggtt ggcgcggagg aaggaagtcc agagatccac ggccagggcg gtttgcagac 7080
ggtcccggta ctgacggaac tgctgcccga cggccatttt ttcgggggtg acgcagtaga 7140
aggtgcgggg gtccccgtgc cagcgatccc atttgagctg gagggcgaga tcgagggcga 7200
gctcgacgag ccggtcgtcc ccggagagtt tcatgaccag catgaagggg acgagctgct 7260
tgccgaagga ccccatccag gtgtaggttt ccacatcgta ggtgaggaag agcctttcgg 7320
tgcgaggatg cgagccgatg gggaagaact ggatctcctg ccaccaattg gaggaatggc 7380
tgttgatgtg atggaagtag aaatgccgac ggcgcgccga acactcgtgc ttgtgtttat 7440
acaagcggcc acagtgctcg caacgctgca cgggatgcac gtgctgcacg agctgtacct 7500
gagttccttt gacgaggaat ttcagtggga agtggagtcg tggcgcctgc atctcgtgct 7560
gtactacgtc gtggtggtcg gcctggccct cttctgcctc gatggtggtc atgctgacga 7620
gcccgcgcgg gaggcaggtc cagacctcgg cgcgagcggg tcggagagcg aggacgaggg 7680
cgcgcaggcc ggagctgtcc agggtcctga gacgctgcgg agtcaggtca gtgggcagcg 7740
gcggcgcgcg gttgacttgc aggagttttt ccagggcgcg cgggaggtcc agatggtact 7800
tgatctccac cgcgccattg gtggcgacgt cgatggcttg cagggtcccg tgcccctggg 7860
gtgtgaccac cgtcccccgt ttcttcttgg gcggctgggg cgacgggggc ggtgcctctt 7920
ccatggttag aagcggcggc gaggacgcgc gccgggcggc aggggcggct cggggcccgg 7980
aggcaggggc ggcaggggca cgtcggcgcc gcgcgcgggt aggttctggt actgcgcccg 8040
gagaagactg gcgtgagcga cgacgcgacg gttgacgtcc tggatctgac gcctctgggt 8100
gaaggccacg ggacccgtga gtttgaacct gaaagagagt tcgacagaat caatctcggt 8160
atcgttgacg gcggcctgcc gcaggatctc ttgcacgtcg cccgagttgt cctggtaggc 8220
gatctcggtc atgaactgct cgatctcctc ctcttgaagg tctccgcggc cggcgcgctc 8280
cacggtggcc gcgaggtcgt tggagatgcg gcccatgagc tgcgagaagg cgttcatgcc 8340
cgcctcgttc cagacgcggc tgtagaccac gacgccctcg ggatcgccgg cgcgcatgac 8400
cacctgggcg aggttgagct ccacgtggcg cgtgaagacc gcgtagttgc agaggcgctg 8460
gtagaggtag ttgagcgtgg tggcgatgtg ctcggtgacg aagaaataca tgatccagcg 8520
gcggagcggc atctcgctga cgtcgcccag cgcctccaaa cgttccatgg cctcgtaaaa 8580
gtccacggcg aagttgaaaa actgggagtt gcgcgccgag acggtcaact cctcctccag 8640
aagacggatg agctcggcga tggtggcgcg cacctcgcgc tcgaaggccc ccgggagttc 8700
ctccacttcc tcttcttcct cctccactaa catctcttct acttcctcct caggcggcag 8760
tggtggcggg ggagggggcc tgcgtcgccg gcggcgcacg ggcagacggt cgatgaagcg 8820
ctcgatggtc tcgccgcgcc ggcgtcgcat ggtctcggtg acggcgcgcc cgtcctcgcg 8880
gggccgcagc gtgaagacgc cgccgcgcat ctccaggtgg ccgggggggt ccccgttggg 8940
cagggagagg gcgctgacga tgcatcttat caattgcccc gtagggactc cgcgcaagga 9000
cctgagcgtc tcgagatcca cgggatctga aaaccgctga acgaaggctt cgagccagtc 9060
gcagtcgcaa ggtaggctga gcacggtttc ttctggcggg tcatgttggt tgggagcggg 9120
gcgggcgatg ctgctggtga tgaagttgaa ataggcggtt ctgagacggc ggatggtggc 9180
gaggagcacc aggtctttgg gcccggcttg ctggatgcgc agacggtcgg ccatgcccca 9240
ggcgtggtcc tgacacctgg ccaggtcctt gtagtagtcc tgcatgagcc gctccacggg 9300
cacctcctcc tcgcccgcgc ggccgtgcat gcgcgtgagc ccgaagccgc gctggggctg 9360
gacgagcgcc aggtcggcga cgacgcgctc ggcgaggatg gcttgctgga tctgggtgag 9420
ggtggtctgg aagtcatcaa agtcgacgaa gcggtggtag gctccggtgt tgatggtgta 9480
ggagcagttg gccatgacgg accagttgac ggtctggtgg cccggacgca cgagctcgtg 9540
gtacttgagg cgcgagtagg cgcgcgtgtc gaagatgtag tcgttgcagg tgcgcaccag 9600
gtactggtag ccgatgagga agtgcggcgg cggctggcgg tagagcggcc atcgctcggt 9660
ggcgggggcg ccgggcgcga ggtcctcgag catggtgcgg tggtagccgt agatgtacct 9720
ggacatccag gtgatgccgg cggcggtggt ggaggcgcgc gggaactcgc ggacgcggtt 9780
ccagatgttg cgcagcggca ggaagtagtt catggtgggc acggtctggc ccgtgaggcg 9840
cgcgcagtcg tggatgctct atacgggcaa aaacgaaagc ggtcagcggc tcgactccgt 9900
ggcctggagg ctaagcgaac gggttgggct gcgcgtgtac cccggttcga atctcgaatc 9960
aggctggagc cgcagctaac gtggtattgg cactcccgtc tcgacccaag cctgcaccaa 10020
ccctccagga tacggaggcg ggtcgttttg caactttttt ttggaggccg gatgagacta 10080
gtaagcgcgg aaagcggccg accgcgatgg ctcgctgccg tagtctggag aagaatcgcc 10140
agggttgcgt tgcggtgtgc cccggttcga ggccggccgg attccgcggc taacgagggc 10200
gtggctgccc cgtcgtttcc aagaccccat agccagccga cttctccagt tacggagcga 10260
gcccctcttt tgttttgttt gtttttgcca gatgcatccc gtactgcggc agatgcgccc 10320
ccaccaccct ccaccgcaac aacagccccc tccacagccg gcgcttctgc ccccgcccca 10380
gcagcaactt ccagccacga ccgccgcggc cgccgtgagc ggggctggac agagttatga 10440
tcaccagctg gccttggaag agggcgaggg gctggcgcgc ctgggggcgt cgtcgccgga 10500
gcggcacccg cgcgtgcaga tgaaaaggga cgctcgcgag gcctacgtgc ccaagcagaa 10560
cctgttcaga gacaggagcg gcgaggagcc cgaggagatg cgcgcggccc ggttccacgc 10620
ggggcgggag ctgcggcgcg gcctggaccg aaagagggtg ctgagggacg aggatttcga 10680
ggcggacgag ctgacgggga tcagccccgc gcgcgcgcac gtggccgcgg ccaacctggt 10740
cacggcgtac gagcagaccg tgaaggagga gagcaacttc caaaaatcct tcaacaacca 10800
cgtgcgcacc ctgatcgcgc gcgaggaggt gaccctgggc ctgatgcacc tgtgggacct 10860
gctggaggcc atcgtgcaga accccaccag caagccgctg acggcgcagc tgttcctggt 10920
ggtgcagcat agtcgggaca acgaagcgtt cagggaggcg ctgctgaata tcaccgagcc 10980
cgagggccgc tggctcctgg acctggtgaa cattctgcag agcatcgtgg tgcaggagcg 11040
cgggctgccg ctgtccgaga agctggcggc catcaacttc tcggtgctga gtttgggcaa 11100
gtactacgct aggaagatct acaagacccc gtacgtgccc atagacaagg aggtgaagat 11160
cgacgggttt tacatgcgca tgaccctgaa agtgctgacc ctgagcgacg atctgggggt 11220
gtaccgcaac gacaggatgc accgtgcggt gagcgccagc aggcggcgcg agctgagcga 11280
ccaggagctg atgcatagtc tgcagcgggc cctgaccggg gccgggaccg agggggagag 11340
ctactttgac atgggcgcgg acctgcactg gcagcccagc cgccgggcct tggaggcggc 11400
ggcaggaccc tacgtagaag aggtggacga tgaggtggac gaggagggcg agtacctgga 11460
agactgatgg cgcgaccgta tttttgctag atgcaacaac aacagccacc tcctgatccc 11520
gcgatgcggg cggcgctgca gagccagccg tccggcatta actcctcgga cgattggacc 11580
caggccatgc aacgcatcat ggcgctgacg acccgcaacc ccgaagcctt tagacagcag 11640
ccccaggcca accggctctc ggccatcctg gaggccgtgg tgccctcgcg ctccaacccc 11700
acgcacgaga aggtcctggc catcgtgaac gcgctggtgg agaacaaggc catccgcggc 11760
gacgaggccg gcctggtgta caacgcgctg ctggagcgcg tggcccgcta caacagcacc 11820
aacgtgcaga ccaacctgga ccgcatggtg accgacgtgc gcgaggccgt ggcccagcgc 11880
gagcggttcc accgcgagtc caacctggga tccatggtgg cgctgaacgc cttcctcagc 11940
acccagcccg ccaacgtgcc ccggggccag gaggactaca ccaacttcat cagcgccctg 12000
cgcctgatgg tgaccgaggt gccccagagc gaggtgtacc agtccgggcc ggactacttc 12060
ttccagacca gtcgccaggg cttgcagacc gtgaacctga gccaggcttt caagaacttg 12120
cagggcctgt ggggcgtgca ggccccggtc ggggaccgcg cgacggtgtc gagcctgctg 12180
acgccgaact cgcgcctgct gctgctgctg gtggccccct tcacggacag cggcagcatc 12240
aaccgcaact cgtacctggg ctacctgatt aacctgtacc gcgaggccat cggccaggcg 12300
cacgtggacg agcagaccta ccaggagatc acccacgtga gccgcgccct gggccaggac 12360
gacccgggca acctggaagc caccctgaac tttttgctga ccaaccggtc gcagaagatc 12420
ccgccccagt acgcgctcag caccgaggag gagcgcatcc tgcgttacgt gcagcagagc 12480
gtgggcctgt tcctgatgca ggagggggcc acccccagcg ccgcgctcga catgaccgcg 12540
cgcaacatgg agcccagcat gtacgccagc aaccgcccgt tcatcaataa actgatggac 12600
tacttgcatc gggcggccgc catgaactct gactatttca ccaacgccat cctgaatccc 12660
cactggctcc cgccgccggg gttctacacg ggcgagtacg acatgcccga ccccaatgac 12720
gggttcctgt gggacgatgt ggacagcagc gtgttctccc cccgaccggg tgctaacgag 12780
cgccccttgt ggaagaagga aggcagcgac cgacgcccgt cctcggcgct gtccggccgc 12840
gagggtgctg ccgcggcggt gcccgaggcc gccagtcctt tcccgagctt gcccttctcg 12900
ctgaacagta tccgcagcag cgagctgggc aggatcacgc gcccgcgctt gctgggcgaa 12960
gaggagtact tgaatgactc gctgttgaga cccgagcggg agaagaactt ccccaataac 13020
gggatagaaa gcctggtgga caagatgagc cgctggaaga cgtatgcgca ggagcacagg 13080
gacgatcccc gggcgtcgca gggggccacg agccggggca gcgccgcccg taaacgccgg 13140
tggcacgaca ggcagcgggg acagatgtgg gacgatgagg actccgccga cgacagcagc 13200
gtgttggact tgggtgggag tggtaacccg ttcgctcacc tgcgcccccg tatcgggcgc 13260
atgatgtaag agaaaccgaa aataaatgat actcaccaag gccatggcga ccagcgtgcg 13320
ttcgtttctt ctctgttgtt gttgtatcta gtatgatgag gcgtgcgtac ccggagggtc 13380
ctcctccctc gtacgagagc gtgatgcagc aggcgatggc ggcggcggcg atgcagcccc 13440
cgctggaggc tccttacgtg cccccgcggt acctggcgcc tacggagggg cggaacagca 13500
ttcgttactc ggagctggca cccttgtacg ataccacccg gttgtacctg gtggacaaca 13560
agtcggcgga catcgcctcg ctgaactacc agaacgacca cagcaacttc ctgaccaccg 13620
tggtgcagaa caatgacttc acccccacgg aggccagcac ccagaccatc aactttgacg 13680
agcgctcgcg gtggggcggc cagctgaaaa ccatcatgca caccaacatg cccaacgtga 13740
acgagttcat gtacagcaac aagttcaagg cgcgggtgat ggtctcccgc aagaccccca 13800
atggggtgac agtgacagag gattatgatg gtagtcagga tgagctgaag tatgaatggg 13860
tggaatttga gctgcccgaa ggcaacttct cggtgaccat gaccatcgac ctgatgaaca 13920
acgccatcat cgacaattac ttggcggtgg ggcggcagaa cggggtgctg gagagcgaca 13980
tcggcgtgaa gttcgacact aggaacttca ggctgggctg ggaccccgtg accgagctgg 14040
tcatgcccgg ggtgtacacc aacgaggctt tccatcccga tattgtcttg ctgcccggct 14100
gcggggtgga cttcaccgag agccgcctca gcaacctgct gggcattcgc aagaggcagc 14160
ccttccagga aggcttccag atcatgtacg aggatctgga ggggggcaac atccccgcgc 14220
tcctggatgt cgacgcctat gagaaaagca aggaggatgc agcagctgaa gcaactgcag 14280
ccgtagctac cgcctctacc gaggtcaggg gcgataattt tgcaagcgcc gcagcagtgg 14340
cagcggccga ggcggctgaa accgaaagta agatagtcat tcagccggtg gagaaggata 14400
gcaagaacag gagctacaac gtactaccgg acaagataaa caccgcctac cgcagctggt 14460
acctagccta caactatggc gaccccgaga agggcgtgcg ctcctggacg ctgctcacca 14520
cctcggacgt cacctgcggc gtggagcaag tctactggtc gctgcccgac atgatgcaag 14580
acccggtcac cttccgctcc acgcgtcaag ttagcaacta cccggtggtg ggcgccgagc 14640
tcctgcccgt ctactccaag agcttcttca acgagcaggc cgtctactcg cagcagctgc 14700
gcgccttcac ctcgcttacg cacgtcttca accgcttccc cgagaaccag atcctcgtcc 14760
gcccgcccgc gcccaccatt accaccgtca gtgaaaacgt tcctgctctc acagatcacg 14820
ggaccctgcc gctgcgcagc agtatccggg gagtccagcg cgtgaccgtt actgacgcca 14880
gacgccgcac ctgcccctac gtctacaagg ccctgggcat agtcgcgccg cgcgtcctct 14940
cgagccgcac cttctaaatg tccattctca tctcgcccag taataacacc ggttggggcc 15000
tgcgcgcgcc cagcaagatg tacggaggcg ctcgccaacg ctccacgcaa caccccgtgc 15060
gcgtgcgcgg gcacttccgc gctccctggg gcgccctcaa gggccgcgtg cggtcgcgca 15120
ccaccgtcga cgacgtgatc gaccaggtgg tggccgacgc gcgcaactac acccccgccg 15180
ccgcgcccgt ctccaccgtg gacgccgtca tcgacagcgt ggtggcggac gcgcgccggt 15240
acgcccgcgc caagagccgg cggcggcgca tcgcccggcg gcaccggagc acccccgcca 15300
tgcgcgcggc gcgagccttg ctgcgcaggg ccaggcgcac gggacgcagg gccatgctca 15360
gggcggccag acgcgcggct tcaggcgcca gcgccggcag gacccggaga cgcgcggcca 15420
cggcggcggc agcggccatc gccagcatgt cccgcccgcg gcgagggaac gtgtactggg 15480
tgcgcgacgc cgccaccggt gtgcgcgtgc ccgtgcgcac ccgcccccct cgcacttgaa 15540
gatgttcact tcgcgatgtt gatgtgtccc agcggcgagg aggatgtcca agcgcaaatt 15600
caaggaagag atgctccagg tcatcgcgcc tgagatctac ggccctgcgg tggtgaagga 15660
ggaaagaaag ccccgcaaaa tcaagcgggt caaaaaggac aaaaaggaag aagaaagtga 15720
tgtggacgga ttggtggagt ttgtgcgcga gttcgccccc cggcggcgcg tgcagtggcg 15780
cgggcggaag gtgcaaccgg tgctgagacc cggcaccacc gtggtcttca cgcccggcga 15840
gcgctccggc accgcttcca agcgctccta cgacgaggtg tacggggatg atgatattct 15900
ggagcaggcg gccgagcgcc tgggcgagtt tgcttacggc aagcgcagcc gttccgcacc 15960
gaaggaagag gcggtgtcca tcccgctgga ccacggcaac cccacgccga gcctcaagcc 16020
cgtgaccttg cagcaggtgc tgccgaccgc ggcgccgcgc cgggggttca agcgcgaggg 16080
cgaggatctg taccccacca tgcagctgat ggtgcccaag cgccagaagc tggaagacgt 16140
gctggagacc atgaaggtgg acccggacgt gcagcccgag gtcaaggtgc ggcccatcaa 16200
gcaggtggcc ccgggcctgg gcgtgcagac cgtggacatc aagattccca cggagcccat 16260
ggaaacgcag accgagccca tgatcaagcc cagcaccagc accatggagg tgcagacgga 16320
tccctggatg ccatcggctc ctagtcgaag accccggcgc aagtacggcg cggccagcct 16380
gctgatgccc aactacgcgc tgcatccttc catcatcccc acgccgggct accgcggcac 16440
gcgcttctac cgcggtcata ccagcagccg ccgccgcaag accaccactc gccgccgccg 16500
tcgccgcacc gccgctgcaa ccacccctgc cgccctggtg cggagagtgt accgccgcgg 16560
ccgcgcacct ctgaccctgc cgcgcgcgcg ctaccacccg agcatcgcca tttaaacttt 16620
cgccagcttt gcagatcaat ggccctcaca tgccgccttc gcgttcccat tacgggctac 16680
cgaggaagaa aaccgcgccg tagaaggctg gcggggaacg ggatgcgtcg ccaccaccac 16740
cggcggcggc gcgccatcag caagcggttg gggggaggct tcctgcccgc gctgatcccc 16800
atcatcgccg cggcgatcgg ggcgatcccc ggcattgctt ccgtggcggt gcaggcctct 16860
cagcgccact gagacacact tggaaacatc ttgtaataaa cccatggact ctgacgctcc 16920
tggtcctgtg atgtgttttc gtagacagat ggaagacatc aatttttcgt ccctggctcc 16980
gcgacacggc acgcggccgt tcatgggcac ctggagcgac atcggcacca gccaactgaa 17040
cgggggcgcc ttcaattgga gcagtctctg gagcgggctt aagaatttcg ggtccacgct 17100
taaaacctat ggcagcaagg cgtggaacag caccacaggg caggcgctga gggataagct 17160
gaaagagcag aacttccagc agaaggtggt cgatgggctc gcctcgggca tcaacggggt 17220
ggtggacctg gccaaccagg ccgtgcagcg gcagatcaac agccgcctgg acccggtgcc 17280
gcccgccggc tccgtggaga tgccgcaggt ggaggaggag ctgcctcccc tggacaagcg 17340
gggcgagaag cgaccccgcc ccgatgcgga ggagacgctg ctgacgcaca cggacgagcc 17400
gcccccgtac gaggaggcgg tgaaactggg tctgcccacc acgcggccca tcgcgcccct 17460
ggccaccggg gtgctgaaac ccgaaaagcc cgcgaccctg gacttgcctc ctccccagcc 17520
ttcccgcccc tctacagtgg ctaagcccct gccgccggtg gccgtggccc gcgcgcgacc 17580
cgggggcacc gcccgccctc atgcgaactg gcagagcact ctgaacagca tcgtgggtct 17640
gggagtgcag agtgtgaagc gccgccgctg ctattaaacc taccgtagcg cttaacttgc 17700
ttgtctgtgt gtgtatgtat tatgtcgccg ccgccgctgt ccaccagaag gaggagtgaa 17760
gaggcgcgtc gccgagttgc aagatggcca ccccatcgat gctgccccag tgggcgtaca 17820
tgcacatcgc cggacaggac gcttcggagt acctgagtcc gggtctggtg cagtttgccc 17880
gcgccacaga cacctacttc agtctgggga acaagtttag gaaccccacg gtggcgccca 17940
cgcacgatgt gaccaccgac cgcagccagc ggctgacgct gcgcttcgtg cccgtggacc 18000
gcgaggacaa cacctactcg tacaaagtgc gctacacgct ggccgtgggc gacaaccgcg 18060
tgctggacat ggccagcacc tactttgaca tccgcggcgt gctggatcgg ggccctagct 18120
tcaaacccta ctccggcacc gcctacaaca gtctggcccc caagggagca cccaacactt 18180
gtcagtggac atataaagcc gatggtgaaa ctgccacaga aaaaacctat acatatggaa 18240
atgcacccgt gcagggcatt aacatcacaa aagatggtat tcaacttgga actgacaccg 18300
atgatcagcc aatctacgca gataaaacct atcagcctga acctcaagtg ggtgatgctg 18360
aatggcatga catcactggt actgatgaaa agtatggagg cagagctctt aagcctgata 18420
ccaaaatgaa gccttgttat ggttcttttg ccaagcctac taataaagaa ggaggtcagg 18480
caaatgtgaa aacaggaaca ggcactacta aagaatatga catagacatg gctttctttg 18540
acaacagaag tgcggctgct gctggcctag ctccagaaat tgttttgtat actgaaaatg 18600
tggatttgga aactccagat acccatattg tatacaaagc aggcacagat gacagcagct 18660
cttctattaa tttgggtcag caagccatgc ccaacagacc taactacatt ggtttcagag 18720
acaactttat cgggctcatg tactacaaca gcactggcaa tatgggggtg ctggccggtc 18780
aggcttctca gctgaatgct gtggttgact tgcaagacag aaacaccgag ctgtcctacc 18840
agctcttgct tgactctctg ggtgacagaa cccggtattt cagtatgtgg aatcaggcgg 18900
tggacagcta tgatcctgat gtgcgcatta ttgaaaatca tggtgtggag gatgaacttc 18960
ccaactattg tttccctctg gatgctgttg gcagaacaga tacttatcag ggaattaagg 19020
ctaatggaac tgatcaaacc acatggacca aagatgacag tgtcaatgat gctaatgaga 19080
taggcaaggg taatccattc gccatggaaa tcaacatcca agccaacctg tggaggaact 19140
tcctctacgc caacgtggcc ctgtacctgc ccgactctta caagtacacg ccggccaatg 19200
ttaccctgcc caccaacacc aacacctacg attacatgaa cggccgggtg gtggcgccct 19260
cgctggtgga ctcctacatc aacatcgggg cgcgctggtc gctggatccc atggacaacg 19320
tgaacccctt caaccaccac cgcaatgcgg ggctgcgcta ccgctccatg ctcctgggca 19380
acgggcgcta cgtgcccttc cacatccagg tgccccagaa atttttcgcc atcaagagcc 19440
tcctgctcct gcccgggtcc tacacctacg agtggaactt ccgcaaggac gtcaacatga 19500
tcctgcagag ctccctcggc aacgacctgc gcacggacgg ggcctccatc tccttcacca 19560
gcatcaacct ctacgccacc ttcttcccca tggcgcacaa cacggcctcc acgctcgagg 19620
ccatgctgcg caacgacacc aacgaccagt ccttcaacga ctacctctcg gcggccaaca 19680
tgctctaccc catcccggcc aacgccacca acgtgcccat ctccatcccc tcgcgcaact 19740
gggccgcctt ccgcggctgg tccttcacgc gtctcaagac caaggagacg ccctcgctgg 19800
gctccgggtt cgacccctac ttcgtctact cgggctccat cccctacctc gacggcacct 19860
tctacctcaa ccacaccttc aagaaggtct ccatcacctt cgactcctcc gtcagctggc 19920
ccggcaacga ccggctcctg acgcccaacg agttcgaaat caagcgcacc gtcgacggcg 19980
agggctacaa cgtggcccag tgcaacatga ccaaggactg gttcctggtc cagatgctgg 20040
cccactacaa catcggctac cagggcttct acgtgcccga gggctacaag gaccgcatgt 20100
actccttctt ccgcaacttc cagcccatga gccgccaggt ggtggacgag gtcaactaca 20160
aggactacca ggccgtcacc ctggcctacc agcacaacaa ctcgggcttc gtcggctacc 20220
tcgcgcccac catgcgccag ggccagccct accccgccaa ctacccctac ccgctcatcg 20280
gcaagagcgc cgtcaccagc gtcacccaga aaaagttcct ctgcgacagg gtcatgtggc 20340
gcatcccctt ctccagcaac ttcatgtcca tgggcgcgct caccgacctc ggccagaaca 20400
tgctctatgc caactccgcc cacgcgctag acatgaattt cgaagtcgac cccatggatg 20460
agtccaccct tctctatgtt gtcttcgaag tcttcgacgt cgtccgagtg caccagcccc 20520
accgcggcgt catcgaggcc gtctacctgc gcaccccctt ctcggccggt aacgccacca 20580
cctaagctct tgcttcttgc aagccatggc cgcgggctcc ggcgagcagg agctcagggc 20640
catcatccgc gacctgggct gcgggcccta cttcctgggc accttcgata agcgcttccc 20700
gggattcatg gccccgcaca agctggcctg cgccatcgtc aacacggccg gccgcgagac 20760
cgggggcgag cactggctgg ccttcgcctg gaacccgcgc tcgaacacct gctacctctt 20820
cgaccccttc gggttctcgg acgagcgcct caagcagatc taccagttcg agtacgaggg 20880
cctgctgcgc cgcagcgccc tggccaccga ggaccgctgc gtcaccctgg aaaagtccac 20940
ccagaccgtg cagggtccgc gctcggccgc ctgcgggctc ttctgctgca tgttcctgca 21000
cgccttcgtg cactggcccg accgccccat ggacaagaac cccaccatga acttgctgac 21060
gggggtgccc aacggcatgc tccagtcgcc ccaggtggaa cccaccctgc gccgcaacca 21120
ggaggcgctc taccgcttcc tcaactccca ctccgcctac tttcgctccc accgcgcgcg 21180
catcgagaag gccaccgcct tcgaccgcat gaatcaagac atgtaaaccg tgtgtgtatg 21240
ttaaatgtct ttaataaaca gcactttcat gttacacatg catctgagat gatttattta 21300
gaaatcgaaa gggttctgcc gggtctcggc atggcccgcg ggcagggaca cgttgcggaa 21360
ctggtacttg gccagccact tgaactcggg gatcagcagt ttgggcagcg gggtgtcggg 21420
gaaggagtcg gtccacagct tccgcgtcag ttgcagggcg cccagcaggt cgggcgcgga 21480
gatcttgaaa tcgcagttgg gacccgcgtt ctgcgcgcgg gagttgcggt acacggggtt 21540
gcagcactgg aacaccatca gggccgggtg cttcacgctc gccagcaccg tcgcgtcggt 21600
gatgctctcc acgtcgaggt cctcggcgtt ggccatcccg aagggggtca tcttgcaggt 21660
ctgccttccc atggtgggca cgcacccggg cttgtggttg caatcgcagt gcagggggat 21720
cagcatcatc tgggcctggt cggcgttcat ccccgggtac atggccttca tgaaagcctc 21780
caattgcctg aacgcctgct gggccttggc tccctcggtg aagaagaccc cgcaggactt 21840
gctagagaac tggttggtgg cgcacccggc gtcgtgcacg cagcagcgcg cgtcgttgtt 21900
ggccagctgc accacgctgc gcccccagcg gttctgggtg atcttggccc ggtcggggtt 21960
ctccttcagc gcgcgctgcc cgttctcgct cgccacatcc atctcgatca tgtgctcctt 22020
ctggatcatg gtggtcccgt gcaggcaccg cagcttgccc tcggcctcgg tgcacccgtg 22080
cagccacagc gcgcacccgg tgcactccca gttcttgtgg gcgatctggg aatgcgcgtg 22140
cacgaagccc tgcaggaagc ggcccatcat ggtggtcagg gtcttgttgc tagtgaaggt 22200
cagcggaatg ccgcggtgct cctcgttgat gtacaggtgg cagatgcggc ggtacacctc 22260
gccctgctcg ggcatcagct ggaagttggc tttcaggtcg gtctccacgc ggtagcggtc 22320
catcagcata gtcatgattt ccataccctt ctcccaggcc gagacgatgg gcaggctcat 22380
agggttcttc accatcatct tagcgctagc agccgcggcc agggggtcgc tctcgtccag 22440
ggtctcaaag ctccgcttgc cgtccttctc ggtgatccgc accggggggt agctgaagcc 22500
cacggccgcc agctcctcct cggcctgtct ttcgtcctcg ctgtcctggc tgacgtcctg 22560
caggaccaca tgcttggtct tgcggggttt cttcttgggc ggcagcggcg gcggagatgt 22620
tggagatggc gagggggagc gcgagttctc gctcaccact actatctctt cctcttcttg 22680
gtccgaggcc acgcggcggt aggtatgtct cttcgggggc agaggcggag gcgacgggct 22740
ctcgccgccg cgacttggcg gatggctggc agagcccctt ccgcgttcgg gggtgcgctc 22800
ccggcggcgc tctgactgac ttcctccgcg gccggccatt gtgttctcct agggaggaac 22860
aacaagcatg gagactcagc catcgccaac ctcgccatct gcccccaccg ccgacgagaa 22920
gcagcagcag cagaatgaaa gcttaaccgc cccgccgccc agccccgcca cctccgacgc 22980
ggccgtccca gacatgcaag agatggagga atccatcgag attgacctgg gctatgtgac 23040
gcccgcggag cacgaggagg agctggcagt gcgcttttca caagaagaga tacaccaaga 23100
acagccagag caggaagcag agaatgagca gagtcaggct gggctcgagc atgacggcga 23160
ctacctccac ctgagcgggg gggaggacgc gctcatcaag catctggccc ggcaggccac 23220
catcgtcaag gatgcgctgc tcgaccgcac cgaggtgccc ctcagcgtgg aggagctcag 23280
ccgcgcctac gagttgaacc tcttctcgcc gcgcgtgccc cccaagcgcc agcccaatgg 23340
cacctgcgag cccaacccgc gcctcaactt ctacccggtc ttcgcggtgc ccgaggccct 23400
ggccacctac cacatctttt tcaagaacca aaagatcccc gtctcctgcc gcgccaaccg 23460
cacccgcgcc gacgcccttt tcaacctggg tcccggcgcc cgcctacctg atatcgcctc 23520
cttggaagag gttcccaaga tcttcgaggg tctgggcagc gacgagactc gggccgcgaa 23580
cgctctgcaa ggagaaggag gagagcatga gcaccacagc gccctggtcg agttggaagg 23640
cgacaacgcg cggctggcgg tgctcaaacg cacggtcgag ctgacccatt tcgcctaccc 23700
ggctctgaac ctgcccccca aagtcatgag cgcggtcatg gaccaggtgc tcatcaagcg 23760
cgcgtcgccc atctccgagg acgagggcat gcaagactcc gaggagggca agcccgtggt 23820
cagcgacgag cagctggccc ggtggctggg tcctaatgct agtccccaga gtttggaaga 23880
gcggcgcaaa ctcatgatgg ccgtggtcct ggtgaccgtg gagctggagt gcctgcgccg 23940
cttcttcgcc gacgcggaga ccctgcgcaa ggtcgaggag aacctgcact acctcttcag 24000
gcacgggttc gtgcgccagg cctgcaagat ctccaacgtg gagctgacca acctggtctc 24060
ctacatgggc atcttgcacg agaaccgcct ggggcagaac gtgctgcaca ccaccctgcg 24120
cggggaggcc cggcgcgact acatccgcga ctgcgtctac ctctacctct gccacacctg 24180
gcagacgggc atgggcgtgt ggcagcagtg tctggaggag cagaacctga aagagctctg 24240
caagctcctg cagaagaacc tcaagggtct gtggaccggg ttcgacgagc gcaccaccgc 24300
ctcggacctg gccgacctca ttttccccga gcgcctcagg ctgacgctgc gcaacggcct 24360
gcccgacttt atgagccaaa gcatgttgca aaactttcgc tctttcatcc tcgaacgctc 24420
cggaatcctg cccgccacct gctccgcgct gccctcggac ttcgtgccgc tgaccttccg 24480
cgagtgcccc ccgccgctgt ggagccactg ctacctgctg cgcctggcca actacctggc 24540
ctaccactcg gacgtgatcg aggacgtcag cggcgagggc ctgctcgagt gccactgccg 24600
ctgcaacctc tgcacgccgc accgctccct ggcctgcaac ccccagctgc tgagcgagac 24660
ccagatcatc ggcaccttcg agttgcaagg gcccagcgaa ggcgagggtt cagccgccaa 24720
ggggggtctg aaactcaccc cggggctgtg gacctcggcc tacttgcgca agttcgtgcc 24780
cgaggactac catcccttcg agatcaggtt ctacgaggac caatcccatc cgcccaaggc 24840
cgagctgtcg gcctgcgtca tcacccaggg ggcgatcctg gcccaattgc aagccatcca 24900
gaaatcccgc caagaattct tgctgaaaaa gggccgcggg gtctacctcg acccccagac 24960
cggtgaggag ctcaaccccg gcttccccca ggatgccccg aggaaacaag aagctgaaag 25020
tggagctgcc gcccgtggag gatttggagg aagactggga gaacagcagt caggcagagg 25080
aggaggagat ggaggaagac tgggacagca ctcaggcaga ggaggacagc ctgcaagaca 25140
gtctggagga agacgaggag gaggcagagg aggaggtgga agaagcagcc gccgccagac 25200
cgtcgtcctc ggcgggggag aaagcaagca gcacggatac catctccgct ccgggtcggg 25260
gtcccgctcg accacacagt agatgggacg agaccggacg attcccgaac cccaccaccc 25320
agaccggtaa gaaggagcgg cagggataca agtcctggcg ggggcacaaa aacgccatcg 25380
tctcctgctt gcaggcctgc gggggcaaca tctccttcac ccggcgctac ctgctcttcc 25440
accgcggggt gaactttccc cgcaacatct tgcattacta ccgtcacctc cacagcccct 25500
actacttcca agaagaggca gcagcagcag aaaaagacca gcagaaaacc agcagctaga 25560
aaatccacag cggcggcagc aggtggactg aggatcgcgg cgaacgagcc ggcgcaaacc 25620
cgggagctga ggaaccggat ctttcccacc ctctatgcca tcttccagca gagtcggggg 25680
caggagcagg aactgaaagt caagaaccgt tctctgcgct cgctcacccg cagttgtctg 25740
tatcacaaga gcgaagacca acttcagcgc actctcgagg acgccgaggc tctcttcaac 25800
aagtactgcg cgctcactct taaagagtag cccgcgcccg cccagtcgca gaaaaaggcg 25860
ggaattacgt cacctgtgcc cttcgcccta gccgcctcca cccatcatca tgagcaaaga 25920
gattcccacg ccttacatgt ggagctacca gccccagatg ggcctggccg ccggtgccgc 25980
ccaggactac tccacccgca tgaattggct cagcgccggg cccgcgatga tctcacgggt 26040
gaatgacatc cgcgcccacc gaaaccagat actcctagaa cagtcagcgc tcaccgccac 26100
gccccgcaat cacctcaatc cgcgtaattg gcccgccgcc ctggtgtacc aggaaattcc 26160
ccagcccacg accgtactac ttccgcgaga cgcccaggcc gaagtccagc tgactaactc 26220
aggtgtccag ctggcgggcg gcgccaccct gtgtcgtcac cgccccgctc agggtataaa 26280
gcggctggtg atccggggca gaggcacaca gctcaacgac gaggtggtga gctcttcgct 26340
gggtctgcga cctgacggag tcttccaact cgccggatcg gggagatctt ccttcacgcc 26400
tcgtcaggcc gtcctgactt tggagagttc gtcctcgcag ccccgctcgg gtggcatcgg 26460
cactctccag ttcgtggagg agttcactcc ctcggtctac ttcaacccct tctccggctc 26520
ccccggccac tacccggacg agttcatccc gaacttcgac gccatcagcg agtcggtgga 26580
cggctacgat tgaatgtccc atggtggcgc agctgaccta gctcggcttc gacacctgga 26640
ccactgccgc cgcttccgct gcttcgctcg ggatctcgcc gagtttgcct actttgagct 26700
gcccgaggag caccctcagg gcccggccca cggagtgcgg atcgtcgtcg aagggggcct 26760
cgactcccac ctgcttcgga tcttcagcca gcgtccgatc ctggtcgagc gcgagcaagg 26820
acagaccctt ctgactctgt actgcatctg caaccacccc ggcctgcatg aaagtctttg 26880
ttgtctgctg tgtactgagt ataataaaag ctgagatcag cgactactcc ggacttccgt 26940
gtgttcctga atccatcaac cagtctttgt tcttcaccgg gaacgagacc gagctccagc 27000
tccagtgtaa gccccacaag aagtacctca cctggctgtt ccagggctcc ccgatcgccg 27060
ttgtcaacca ctgcgacaac gactatttaa atccacaata catgcccata ttagactatg 27120
aggccgagcc acagcgaccc atgctccccg ctattagtta cttcaatcta accggcggag 27180
atgactgacc cactggccaa caacaacgtc aacgaccttc tcctggacat ggacggccgc 27240
gcctcggagc agcgactcgc ccaacttcgc attcgccagc agcaggagag agccgtcaag 27300
gagctgcagg atgcggtggc catccaccag tgcaagagag gcatcttctg cctggtgaaa 27360
caggccaaga tctcctacga ggtcactcca aacgaccatc gcctctccta cgagctcctg 27420
cagcagcgcc agaagttcac ctgcctggtc ggagtcaacc ccatcgtcat cacccagcag 27480
tctggcgata ccaaggggtg catccactgc tcctgcgact cccccgactg cgtccacact 27540
ctgatcaaga ccctctgcgg cctccgcgac ctcctcccca tgaactaatc acccccttat 27600
ccagtgaaat aaagatcata ttgatgatga ttttacagaa ataaaaaata atcatttgat 27660
ttgaaataaa gatacaatca tattgatgat ttgagtttaa caaaaaaata aagaatcact 27720
tacttgaaat ctgataccag gtctctgtcc atgttttctg ccaacaccac ttcactcccc 27780
tcttcccagc tctggtactg caggccccgg cgggctgcaa acttcctcca cacgctgaag 27840
gggatgtcaa attcctcctg tccctcaatc ttcattttat cttctatcag atgtccaaaa 27900
agcgcgtccg ggtggatgat gacttcgacc ccgtctaccc ctacgatgca gacaacgcac 27960
cgaccgtgcc cttcatcaac ccccccttcg tctcttcaga tggattccaa gagaagcccc 28020
tgggggtgtt gtccctgcga ctggccgacc ccgtcaccac caagaacggg gaaatcaccc 28080
tcaagctggg agagggggtg gacctcgatt cctcgggaaa actcatctcc aacacggcca 28140
ccaaggccgc cgcccctctc agtttttcca acaacaccat ttcccttaac atggatcacc 28200
ccttttacac taaagatgga aaattatcct tacaagtttc tccaccatta aatatactga 28260
gaacaagcat tctaaacaca ctagctttag gttttggatc aggtttagga ctccgtggct 28320
ctgccttggc agtacagtta gtctctccac ttacatttga tactgatgga aacataaagc 28380
ttaccttaga cagaggtttg catgttacaa caggagatgc aattgaaagc aacataagct 28440
gggctaaagg tttaaaattt gaagatggag ccatagcaac caacattgga aatgggttag 28500
agtttggaag cagtagtaca gaaacaggtg ttgatgatgc ttacccaatc caagttaaac 28560
ttggatctgg ccttagcttt gacagtacag gagccataat ggctggtaac aaagaagacg 28620
ataaactcac tttgtggaca acacctgatc catcaccaaa ctgtcaaata ctcgcagaaa 28680
atgatgcaaa actaacactt tgcttgacta aatgtggtag tcaaatactg gccactgtgt 28740
cagtcttagt tgtaggaagt ggaaacctaa accccattac tggcaccgta agcagtgctc 28800
aggtgtttct acgttttgat gcaaacggtg ttcttttaac agaacattct acactaaaaa 28860
aatactgggg gtataggcag ggagatagca tagatggcac tccatatacc aatgctgtag 28920
gattcatgcc caatttaaaa gcttatccaa agtcacaaag ttctactact aaaaataata 28980
tagtagggca agtatacatg aatggagatg tttcaaaacc tatgcttctc actataaccc 29040
tcaatggtac tgatgacagc aacagtacat attcaatgtc attttcatac acctggacta 29100
atggaagcta tgttggagca acatttgggg ctaactctta taccttctca tacatcgccc 29160
aagaatgaac actgtatccc accctgcatg ccaacccttc ccaccccact ctgtggaaca 29220
aactctgaaa cacaaaataa aataaagttc aagtgtttta ttgattcaac agttaactta 29280
caggattcga gcagttattt ttcctccacc ctcccaggac atggaataca ccaccctctc 29340
cccccgcaca gccttgaaca tctgaatgcc attggtgatg gacatgcttt tggtctccac 29400
gttccacaca gtttcagagc gagccagtct cgggtcggtc agggagatga aaccctccgg 29460
gcactcccgc atctgcacct cacagctcaa cagctgagga ttgtcctcgg tggtcgggat 29520
cacggttatc tggaagaagc agaagagcgg cggtgggaat catagtccgc gaacgggatc 29580
ggccggtggt gtcgcatcag gccccgcagc agtcgctgcc gccgccgctc cgtcaagctg 29640
ctgctcaggg ggtccgggtc cagggactcc ctcagcatga tgcccacggc cctcagcatc 29700
agtcgtctgg tgcggcgggc gcagcagcgc atgcggatct cgctcaggtc gctgcagtac 29760
gtgcaacaca gaaccaccag gttgttcaac agtccatagt tcaacacgct ccagccgaaa 29820
ctcatcgcgg gaaggatgct acccacgtgg ccgtcgtacc agatcctcag gtaaatcaag 29880
tggtgccccc tccagaacac gctgcccacg tacatgatct ccttgggcat gtggcggttc 29940
accacctccc ggtaccacat caccctctgg ttgaacatgc agccccggat gatcctgcgg 30000
aaccacaggg ccagcaccgc cccgcccgcc atgcagcgaa gagaccccgg gtcccggcaa 30060
tggcaatgga ggacccaccg ctcgtacccg tggatcatct gggagctgaa caagtctatg 30120
ttggcacagc acaggcatat gctcatgcat ctcttcagca ctctcaactc ctcgggggtc 30180
aaaaccatat cccagggcac ggggaactct tgcaggacag cgaaccccgc agaacagggc 30240
aatcctcgca cagaacttac attgtgcatg gacagggtat cgcaatcagg cagcaccggg 30300
tgatcctcca ccagagaagc gcgggtctcg gtctcctcac agcgtggtaa gggggccggc 30360
cgatacgggt gatggcggga cgcggctgat cgtgttcgcg accgtgtcat gatgcagttg 30420
ctttcggaca ttttcgtact tgctgtagca gaacctggtc cgggcgctgc acaccgatcg 30480
ccggcggcgg tctcggcgct tggaacgctc ggtgttgaaa ttgtaaaaca gccactctct 30540
cagaccgtgc agcagatcta gggcctcagg agtgatgaag atcccatcat gcctgatggc 30600
tctgatcaca tcgaccaccg tggaatgggc cagacccagc cagatgatgc aattttgttg 30660
ggtttcggtg acggcggggg agggaagaac aggaagaacc atgattaact tttaatccaa 30720
acggtctcgg agtacttcaa aatgaagatc gcggagatgg cacctctcgc ccccgctgtg 30780
ttggtggaaa ataacagcca ggtcaaaggt gatacggttc tcgagatgtt ccacggtggc 30840
ttccagcaaa gcctccacgc gcacatccag aaacaagaca atagcgaaag cgggagggtt 30900
ctctaattcc tcaatcatca tgttacactc ctgcaccatc cccagataat tttcattttt 30960
ccagccttga atgattcgaa ctagttcgtg aggtaaatcc aagccagcca tgataaagag 31020
ctcgcgcaga gcgccctcca ccggcattct taagcacacc ctcataattc caagatattc 31080
tgctcctggt tcacctgcag cagattgaca agcggaatat caaaatctct gccgcgatcc 31140
ctgagctcct ccctcagcaa taactgtaag tactctttca tatcctctcc gaaattttta 31200
gccataggac caccaggaat aagattaggg caagccacag tacagataaa ccgaagtcct 31260
ccccagtgag cattgccaaa tgcaagactg ctataagcat gctggctaga cccggtgata 31320
tcttccagat aactggacag aaaatcgccc aggcaatttt taagaaaatc aacaaaagaa 31380
aaatcctcca ggtggacgtt tagagcctcg ggaacaacga tgaagtaaat gcaagcggtg 31440
cgttccagca tggttagtta gctgatctgt agaaaaaaca aaaatgaaca ttaaaccatg 31500
ctagcctggc gaacaggtgg gtaaatcgtt ctctccagca ccaggcaggc cacggggtct 31560
ccggcgcgac cctcgtaaaa attgtcgcta tgattgaaaa ccatcacaga gagacgttcc 31620
cggtggccgg cgtgaatgat tcgacaagat gaatacaccc ccggaacatt ggcgtccgcg 31680
agtgaaaaaa agcgcccgag gaagcaataa ggcactacaa tgctcagtct caagtccagc 31740
aaagcgatgc catgcggatg aagcacaaaa ttctcaggtg cgtacaaaat gtaattactc 31800
ccctcctgca caggcagcaa agcccccgat ccctccaggt acacatacaa agcctcagcg 31860
tccatgttaa cagcttaccg agcagcagca cacaacaggc gcaagagtca gagaaaggct 31920
gagctctaac ctgtccaccc gctctctgct caatatatag cccagatcta cactgacgta 31980
aaggccaaag tctaaaaata cccgccaaat aatcacacac gcccagcaca cgcccagaaa 32040
ccggtgacac actcaaaaaa atacgcgcac ttcctcaaac gcccaaaact gccgtcattt 32100
ccgggttccc acgctacgtc atcaaaacac gactttcaaa ttccgtcgac cgttaaaaac 32160
gtcacccgcc ccgcccctaa cggtcgcccg tctctcagcc aatcagcgcc ccgcatcccc 32220
aaattcaaac acctcatttg catattaacg cgcacaaaaa gtttgaggta tattattgat 32280
gatggttaat taagaattca ctggccgtcg ttttacaacg tcgtgactgg gaaaaccctg 32340
gcgttaccca acttaatcgc cttgcagcac atcccccttt cgccagctgg cgtaatagcg 32400
aagaggcccg caccgatcgc ccttcccaac agttgcgcag cctgaatggc gaatggcgcc 32460
tgatgcggta ttttctcctt acgcatctgt gcggtatttc acaccgcata tggtgcactc 32520
tcagtacaat ctgctctgat gccgcatagt taagccagcc ccgacacccg ccaacacccg 32580
ctgacgcgcc ctgacgggct tgtctgctcc cggcatccgc ttacagacaa gctgtgaccg 32640
tctccgggag ctgcatgtgt cagaggtttt caccgtcatc accgaaacgc gcgagacgaa 32700
agggcctcgt gatacgccta tttttatagg ttaatgtcat gataataatg gtttcttaga 32760
cgtcaggtgg cacttttcgg ggaaatgtgc gcggaacccc tatttgttta tttttctaaa 32820
tacattcaaa tatgtatccg ctcatgagac aataaccctg ataaatgctt caataatatt 32880
gaaaaaggaa gagtatgagt attcaacatt tccgtgtcgc ccttattccc ttttttgcgg 32940
cattttgcct tcctgttttt gctcacccag aaacgctggt gaaagtaaaa gatgctgaag 33000
atcagttggg tgcacgagtg ggttacatcg aactggatct caacagcggt aagatccttg 33060
agagttttcg ccccgaagaa cgttttccaa tgatgagcac ttttaaagtt ctgctatgtg 33120
gcgcggtatt atcccgtatt gacgccgggc aagagcaact cggtcgccgc atacactatt 33180
ctcagaatga cttggttgag tactcaccag tcacagaaaa gcatcttacg gatggcatga 33240
cagtaagaga attatgcagt gctgccataa ccatgagtga taacactgcg gccaacttac 33300
ttctgacaac gatcggagga ccgaaggagc taaccgcttt tttgcacaac atgggggatc 33360
atgtaactcg ccttgatcgt tgggaaccgg agctgaatga agccatacca aacgacgagc 33420
gtgacaccac gatgcctgta gcaatggcaa caacgttgcg caaactatta actggcgaac 33480
tacttactct agcttcccgg caacaattaa tagactggat ggaggcggat aaagttgcag 33540
gaccacttct gcgctcggcc cttccggctg gctggtttat tgctgataaa tctggagccg 33600
gtgagcgtgg gtctcgcggt atcattgcag cactggggcc agatggtaag ccctcccgta 33660
tcgtagttat ctacacgacg gggagtcagg caactatgga tgaacgaaat agacagatcg 33720
ctgagatagg tgcctcactg attaagcatt ggtaactgtc agaccaagtt tactcatata 33780
tactttagat tgatttaaaa cttcattttt aatttaaaag gatctaggtg aagatccttt 33840
ttgataatct catgaccaaa atcccttaac gtgagttttc gttccactga gcgtcagacc 33900
ccgtagaaaa gatcaaagga tcttcttgag atcctttttt tctgcgcgta atctgctgct 33960
tgcaaacaaa aaaaccaccg ctaccagcgg tggtttgttt gccggatcaa gagctaccaa 34020
ctctttttcc gaaggtaact ggcttcagca gagcgcagat accaaatact gttcttctag 34080
tgtagccgta gttaggccac cacttcaaga actctgtagc accgcctaca tacctcgctc 34140
tgctaatcct gttaccagtg gctgctgcca gtggcgataa gtcgtgtctt accgggttgg 34200
actcaagacg atagttaccg gataaggcgc agcggtcggg ctgaacgggg ggttcgtgca 34260
cacagcccag cttggagcga acgacctaca ccgaactgag atacctacag cgtgagcttt 34320
gagaaagcgc cacgcttccc gaagggagaa aggcggacag gtatccggta agcggcaggg 34380
tcggaacagg agagcgcacg agggagcttc cagggggaaa cgcctggtat ctttatagtc 34440
ctgtcgggtt tcgccacctc tgacttgagc gtcgattttt gtgatgctcg tcaggggggc 34500
ggagcctatg gaaaaacgcc agcaacgcgg cctttttacg gttcctggcc ttttgctggc 34560
cttttgctca catgttcttt cctgcgttat cccctgattc tgtggataac cgtattaccg 34620
cctttgagtg agctgatacc gctcgccgca gccgaacgac cgagcgcagc gagtcagtga 34680
gcgaggaagc ggaagagcgc ccaatacgca aaccgcctct ccccgcgcgt tggccgattc 34740
attaatgcag ctggcacgac aggtttcccg actggaaagc gggcagtgag cgcaacgcaa 34800
ttaatgtgag ttagctcact cattaggcac cccaggcttt acactttatg cttccggctc 34860
gtatgttgtg tggaattgtg agcggataac aatttcacac aggaaacagc tatgaccatg 34920
attacgccaa gcttgcatgc ctgcaggttt aaacttaatt aaccatcttc aataatatac 34980
ctcaaacttt ttgtgcgcgt taatatgcaa atgaggcgtt tgaatttggg gaggaagggc 35040
ggtgattg 35048
<210> 2
<211> 1426
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1426)
<223> CMV-EGFP核苷酸序列
<400> 2
cgcgttgaca ttgattattg actagttatt aatagtaatc aattacgggg tcattagttc 60
atagcccata tatggagttc cgcgttacat aacttacggt aaatggcccg cctggctgac 120
cgcccaacga cccccgccca ttgacgtcaa taatgacgta tgttcccata gtaacgccaa 180
tagggacttt ccattgacgt caatgggtgg actatttacg gtaaactgcc cacttggcag 240
tacatcaagt gtatcatatg ccaagtacgc cccctattga cgtcaatgac ggtaaatggc 300
ccgcctggca ttatgcccag tacatgacct tatgggactt tcctacttgg cagtacatct 360
acgtattagt catcgctatt accatggtga tgcggttttg gcagtacatc aatgggcgtg 420
gatagcggtt tgactcacgg ggatttccaa gtctccaccc cattgacgtc aatgggagtt 480
tgttttggca ccaaaatcaa cgggactttc caaaatgtcg taacaactcc gccccattga 540
cgcaaatggg cggtaggcgt gtacggtggg aggtctatat aagcagagct ctctggctaa 600
ctagagaacc cactgcttac tggcttatcg aaattaatac gactcactat agggagaccc 660
aagctggcta gcgtttaaac gggcccgccc gggcttataa gccaccatgg tgagcaaggg 720
cgaggagctg ttcaccgggg tggtgcccat cctggtcgag ctggacggcg acgtaaacgg 780
ccacaagttc agcgtgtccg gcgagggcga gggcgatgcc acctacggca agctgaccct 840
gaagttcatc tgcaccaccg gcaagctgcc cgtgccctgg cccaccctcg tgaccaccct 900
gacctacggc gtgcagtgct tcagccgcta ccccgaccac atgaagcagc acgacttctt 960
caagtccgcc atgcccgaag gctacgtcca ggagcgcacc atcttcttca aggacgacgg 1020
caactacaag acccgcgccg aggtgaagtt cgagggcgac accctggtga accgcatcga 1080
gctgaagggc atcgacttca aggaggacgg caacatcctg gggcacaagc tggagtacaa 1140
ctacaacagc cacaacgtct atatcatggc cgacaagcag aagaacggca tcaaggtgaa 1200
cttcaagatc cgccacaaca tcgaggacgg cagcgtgcag ctcgccgacc actaccagca 1260
gaacaccccc atcggcgacg gccccgtgct gctgcccgac aaccactacc tgagcaccca 1320
gtccgccctg agcaaagacc ccaacgagaa gcgcgatcac atggtcctgc tggagttcgt 1380
gaccgccgcc gggatcactc tcggcatgga cgagctgtac aagtaa 1426
<210> 3
<211> 2728
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(2728)
<223> AdHu5 E4核苷酸序列
<400> 3
tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 60
ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 120
tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 180
gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 240
ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 300
atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 360
ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 420
ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 480
agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 540
gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 600
gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat 660
gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac 720
caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg 780
actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat 840
gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 900
ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac 960
actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg 1020
cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg 1080
atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 1140
aaatggaacg ccggacgtag tcatatttcc tgaagcaaaa ccaggtgcgg gcgtgacaaa 1200
cagatctgcg tctccggtct cgccgcttag atcgctctgt gtagtagttg tagtatatcc 1260
actctctcaa agcatccagg cgccccctgg cttcgggttc tatgtaaact ccttcatgcg 1320
ccgctgccct gataacatcc accaccgcag aataagccac acccagccaa cctacacatt 1380
cgttctgcga gtcacacacg ggaggagcgg gaagagctgg aagaaccatg tttttttttt 1440
tattccaaaa gattatccaa aacctcaaaa tgaagatcta ttaagtgaac gcgctcccct 1500
ccggtggcgt ggtcaaactc tacagccaaa gaacagataa tggcatttgt aagatgttgc 1560
acaatggctt ccaaaaggca aacggccctc acgtccaagt ggacgtaaag gctaaaccct 1620
tcagggtgaa tctcctctat aaacattcca gcaccttcaa ccatgcccaa ataattctca 1680
tctcgccacc ttctcaatat atctctaagc aaatcccgaa tattaagtcc ggccattgta 1740
aaaatctgct ccagagcgcc ctccaccttc agcctcaagc agcgaatcat gattgcaaaa 1800
attcaggttc ctcacagacc tgtataagat tcaaaagcgg aacattaaca aaaataccgc 1860
gatcccgtag gtcccttcgc agggccagct gaacataatc gtgcaggtct gcacggacca 1920
gcgcggccac ttccccgcca ggaaccatga caaaagaacc cacactgatt atgacacgca 1980
tactcggagc tatgctaacc agcgtagccc cgatgtaagc ttgttgcatg ggcggcgata 2040
taaaatgcaa ggtgctgctc aaaaaatcag gcaaagcctc gcgcaaaaaa gaaagcacat 2100
cgtagtcatg ctcatgcaga taaaggcagg taagctccgg aaccaccaca gaaaaagaca 2160
ccatttttct ctcaaacatg tctgcgggtt tctgcataaa cacaaaataa aataacaaaa 2220
aaacatttaa acattagaag cctgtcttac aacaggaaaa acaaccctta taagcataag 2280
acggactacg gccatgccgg cgtgaccgta aaaaaactgg tcaccgtgat taaaaagcac 2340
caccgacagc tcctcggtca tgtccggagt cataatgtaa gactcggtaa acacatcagg 2400
ttgattcaca tcggtcagtg ctaaaaagcg accgaaatag cccgggggaa tacatacccg 2460
caggcgtaga gacaacatta cagcccccat aggaggtata acaaaattaa taggagagaa 2520
aaacacataa acacctgaaa aaccctcctg cctaggcaaa atagcaccct cccgctccag 2580
aacaacatac agcgcttcca cagcggcagc cataacagtc agccttacca gtaaaaaaga 2640
aaacctatta aaaaaacacc actcgacacg gcaccagctc aatcagtcac agtgtaaaaa 2700
agggccaagt gcagagcgag tatatata 2728
<210> 4
<211> 1164
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1164)
<223> AdHu5 E4 ORF6/7核苷酸序列
<400> 4
tcacagaacc ctagtattca acctgccacc tccctcccaa cacacagagt acacagtcct 60
ttctccccgg ctggccttaa aaagcatcat atcatgggta acagacatat tcttaggtgt 120
tatattccac acggtttcct gtcgagccaa acgctcatca gtgatattaa taaactcccc 180
gggcagctca cttaagttca tgtcgctgtc cagctgctga gccacaggct gctgtccaac 240
ttgcggttgc ttaacgggcg gcgaaggaga agtccacgcc tacatggggg tagagtcata 300
atcgtgcatc aggatagggc ggtggtgctg cagcagcgcg cgaataaact gctgccgccg 360
ccgctccgtc ctgcaggaat acaacatggc agtggtctcc tcagcgatga ttcgcaccgc 420
ccgcagcata aggcgccttg tcctccgggc acagcagcgc accctgatct cacttaaatc 480
agcacagtaa ctgcagcaca gcaccacaat attgttcaaa atcccacagt gcaaggcgct 540
gtatccaaag ctcatggcgg ggaccacaga acccacgtgg ccatcatacc acaagcgcag 600
gtagattaag tggcgacccc tcataaacac gctggacata aacattacct cttttggcat 660
gttgtaattc accacctccc ggtaccatat aaacctctga ttaaacatgg cgccatccac 720
caccatccta aaccagctgg ccaaaacctg cccgccggct atacactgca gggaaccggg 780
actggaacaa tgacagtgga gagcccagga ctcgtaacca tggatcatca tgctcgtcat 840
gatatcaatg ttggcacaac acaggcacac gtgcatacac ttcctcagga ttacaagctc 900
ctcccgcgtt agaaccatat cccagggaac aacccattcc tgaatcagcg taaatcccac 960
actgcaggga agacctcgca cgtaactcac gttgtgcatt gtcaaagtgt tacattcggg 1020
cagcagcgga tgatcctcca gtatggtagc gcgggtttct gtctcaaaag gaggtagacg 1080
atccctactg tacggagtgc gccgagacaa ccgagatcgt gttggtcgta gtgtcatgcc 1140
aaatggaacg ccggacgtag tcat 1164
<210> 5
<211> 1511
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<220>
<221> misc_feature
<222> (1)..(1511)
<223> AdHu5 E4 ORF3-6核苷酸序列
<400> 5
ctacatgggg gtagagtcat aatcgtgcat caggataggg cggtggtgct gcagcagcgc 60
gcgaataaac tgctgccgcc gccgctccgt cctgcaggaa tacaacatgg cagtggtctc 120
ctcagcgatg attcgcaccg cccgcagcat aaggcgcctt gtcctccggg cacagcagcg 180
caccctgatc tcacttaaat cagcacagta actgcagcac agcaccacaa tattgttcaa 240
aatcccacag tgcaaggcgc tgtatccaaa gctcatggcg gggaccacag aacccacgtg 300
gccatcatac cacaagcgca ggtagattaa gtggcgaccc ctcataaaca cgctggacat 360
aaacattacc tcttttggca tgttgtaatt caccacctcc cggtaccata taaacctctg 420
attaaacatg gcgccatcca ccaccatcct aaaccagctg gccaaaacct gcccgccggc 480
tatacactgc agggaaccgg gactggaaca atgacagtgg agagcccagg actcgtaacc 540
atggatcatc atgctcgtca tgatatcaat gttggcacaa cacaggcaca cgtgcataca 600
cttcctcagg attacaagct cctcccgcgt tagaaccata tcccagggaa caacccattc 660
ctgaatcagc gtaaatccca cactgcaggg aagacctcgc acgtaactca cgttgtgcat 720
tgtcaaagtg ttacattcgg gcagcagcgg atgatcctcc agtatggtag cgcgggtttc 780
tgtctcaaaa ggaggtagac gatccctact gtacggagtg cgccgagaca accgagatcg 840
tgttggtcgt agtgtcatgc caaatggaac gccggacgta gtcatatttc ctgaagcaaa 900
accaggtgcg ggcgtgacaa acagatctgc gtctccggtc tcgccgctta gatcgctctg 960
tgtagtagtt gtagtatatc cactctctca aagcatccag gcgccccctg gcttcgggtt 1020
ctatgtaaac tccttcatgc gccgctgccc tgataacatc caccaccgca gaataagcca 1080
cacccagcca acctacacat tcgttctgcg agtcacacac gggaggagcg ggaagagctg 1140
gaagaaccat gttttttttt ttattccaaa agattatcca aaacctcaaa atgaagatct 1200
attaagtgaa cgcgctcccc tccggtggcg tggtcaaact ctacagccaa agaacagata 1260
atggcatttg taagatgttg cacaatggct tccaaaaggc aaacggccct cacgtccaag 1320
tggacgtaaa ggctaaaccc ttcagggtga atctcctcta taaacattcc agcaccttca 1380
accatgccca aataattctc atctcgccac cttctcaata tatctctaag caaatcccga 1440
atattaagtc cggccattgt aaaaatctgc tccagagcgc cctccacctt cagcctcaag 1500
cagcgaatca t 1511
Claims (10)
1.一种制备腺病毒表达载体的方法，包括：基于黑猩猩型腺病毒AdC68基因组序列，删除其E1序列和E3序列，改造其E4序列；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
2.一种重组腺病毒载体，包括以黑猩猩型腺病毒AdC68基因组为基础的序列，其中E1序列和E3序列被删除，E4序列被改造；所述改造包括以人血清5型腺病毒AdHu5基因组中相应的E4序列或其片段替换AdC68基因组中E4序列或其片段。
3.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，所述改造选自：
(a)以AdHu5基因组E4序列替换AdC68基因组E4序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第32914-35641位序列；
(b)以AdHu5基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列替换AdC68基因组E4序列中ORF6及ORF6/7区序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-34671位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第32914-34077位序列；或
(c)以AdHu5基因组E4序列中ORF3～ORF6序列替换AdC68基因组E4序列中ORF1～ORF6/7序列；更佳地，删除区域为AdC68基因组第33518-36105位序列，在该删除区域***AdHu5基因组第33193-34703位序列。
4.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，该载体中还包括选自以下操作性相连的元件或基因：
外源基因表达盒；
报告基因的表达盒；
反向末端重复序列；和/或
酶切位点；较佳地包括：HpaI，I-CeuI，PI-SceI，SwaI，PacI。
5.如权利要求1所述的方法或权利要求2所述的重组腺病毒载体，其特征在于，其具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列，但，
其中第29278～31865位由SEQ ID NO:3替换；
其中第29278～30431位由SEQ ID NO:4替换；或
其中第29278～31865位由SEQ ID NO:5替换。
6.权利要求1-5任一所述的重组腺病毒载体的用途，用于制备重组腺病毒；或，用于***外源基因、从而表达外源基因。
7.一种重组腺病毒，其由权利要求1～5任一所述的重组腺病毒载体包装获得。
8.一种制备权利要求7所述的重组腺病毒的方法，其特征在于，所述方法包括：
(1)制备权利要求1～5任一所述的重组腺病毒载体；
(2)将(1)的重组腺病毒载体转染病毒生产细胞，从而包装获得重组腺病毒。
9.权利要求7所述的重组腺病毒的用途，其特征在于，用于：表达外源基因，从而获得目的蛋白；较佳地，所述的目的蛋白包括：具有免疫原性的蛋白，具有药学活性的蛋白，具有诊断活性的蛋白，结构蛋白，酶，融合肽，报告蛋白。
10.一种试剂盒，包括：
权利要求1～5任一所述的重组腺病毒载体；
权利要求7所述的重组腺病毒；和/或
病毒生产细胞。
Priority Applications (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910777937.2A CN112410375B (zh) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 |
Applications Claiming Priority (1)
| Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
|---|---|---|---|
| CN201910777937.2A CN112410375B (zh) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 |
Publications (2)
| Publication Number | Publication Date |
|---|---|
| CN112410375A true CN112410375A (zh) | 2021-02-26 |
| CN112410375B CN112410375B (zh) | 2024-06-14 |
Family
ID=74780309
Family Applications (1)
| Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
|---|---|---|---|
| CN201910777937.2A Active CN112410375B (zh) | 2019-08-22 | 2019-08-22 | 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 |
Country Status (1)
| Country | Link |
|---|---|
| CN (1) | CN112410375B (zh) |
Cited By (1)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114891830A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-08-12 | 武汉博沃生物科技有限公司 | 基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途 |
Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN103937835A (zh) * | 2013-08-19 | 2014-07-23 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法 |
| CN107686843A (zh) * | 2017-09-11 | 2018-02-13 | 南方医科大学 | 一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法 |
| CN107723298A (zh) * | 2004-01-23 | 2018-02-23 | Msd意大利有限公司 | 黑猩猩腺病毒疫苗载运体 |
| CN107753941A (zh) * | 2016-08-19 | 2018-03-06 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗 |
| CN109797168A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-05-24 | 广州佰芮慷生物科技有限公司 | 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L |
-
2019
- 2019-08-22 CN CN201910777937.2A patent/CN112410375B/zh active Active
Patent Citations (5)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN107723298A (zh) * | 2004-01-23 | 2018-02-23 | Msd意大利有限公司 | 黑猩猩腺病毒疫苗载运体 |
| CN103937835A (zh) * | 2013-08-19 | 2014-07-23 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法 |
| CN107753941A (zh) * | 2016-08-19 | 2018-03-06 | 中国科学院上海巴斯德研究所 | 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗 |
| CN107686843A (zh) * | 2017-09-11 | 2018-02-13 | 南方医科大学 | 一种基于腺病毒AdC6的表达载体及其构建方法 |
| CN109797168A (zh) * | 2018-09-28 | 2019-05-24 | 广州佰芮慷生物科技有限公司 | 一种重组腺病毒的表达载体SAd23-L |
Non-Patent Citations (2)
| Title |
|---|
| CHUAN WANG ET AL.: ""A simian-adenovirus-vectored rabies vaccine suitable for thermostabilisation and clinical development for low-cost single-dose preexposure prophylaxis"", 《PLOS NEGLECTED TROPICAL DISEASES》, vol. 12, no. 10, pages 1 - 19 * |
| N TATSIS ET AL.: ""Chimpanzee-origin adenovirus vectors as vaccine carriers"", 《GENE THERAPY》, vol. 13, pages 421 - 429, XP037773039, DOI: 10.1038/sj.gt.3302675 * |
Cited By (2)
| Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
|---|---|---|---|---|
| CN114891830A (zh) * | 2022-04-02 | 2022-08-12 | 武汉博沃生物科技有限公司 | 基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途 |
| CN114891830B (zh) * | 2022-04-02 | 2024-03-01 | 武汉博沃生物科技有限公司 | 基于水痘-带状疱疹病毒的重组表达载体、重组病毒及用途 |
Also Published As
| Publication number | Publication date |
|---|---|
| CN112410375B (zh) | 2024-06-14 |
Similar Documents
| Publication | Publication Date | Title |
|---|---|---|
| AU2019202081B2 (en) | Adenovirus polynucleotides and polypeptides | |
| JP4495587B2 (ja) | 組換えアデノウイルスベクターおよびその使用 | |
| KR100379654B1 (ko) | 동물세포의형질감염을위한재조합dna바이러스벡터 | |
| KR20080052512A (ko) | 아데노바이러스-무함유 재조합 아데노바이러스 벡터의 급속생산 | |
| JP3842818B2 (ja) | 組換えアデノウイルスゲノムの製造方法 | |
| CN112552380B (zh) | 一种SARS-CoV-2病毒的免疫原及其应用 | |
| RU2745500C2 (ru) | Эффективный и сбалансированный двунаправленный промотор | |
| FR2726285A1 (fr) | Adenovirus depourvus de particules contaminantes viables, preparation et utilisation | |
| CZ302895A3 (en) | The use of recombinant adenovirus of animal origin for preparing a pharmaceutical preparation | |
| FR2707664A1 (fr) | Vecteurs viraux et utilisation en thérapie génique. | |
| WO1996025506A9 (fr) | Procede de preparation de genome d'adenovirus recombinants | |
| CN113583978A (zh) | 3种重组腺病毒以及SARS-CoV-2 Spike蛋白的RBD以及它们的应用 | |
| US20030157688A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| CN112138152A (zh) | 基于aav载体的冠状病毒感染通用型基因治疗药物及制备方法 | |
| WO2009111738A2 (en) | Single cycle replicating adenovirus vectors | |
| CA2359795A1 (en) | Adenovirus vectors, packaging cell lines, compositions, and methods for preparation and use | |
| CN112410375B (zh) | 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用 | |
| JP7407099B2 (ja) | 大きな核酸をクローニングするためのアデノウイルスベクターを作製する手段 | |
| CN115572735A (zh) | 构建重组腺病毒载体的方法与以其构建的重组腺病毒载体及应用 | |
| JP7385742B2 (ja) | ヘルパープラスミドベースのガットレスアデノウイルス生産システム | |
| JP7046835B2 (ja) | 強力でバランスのとれた双方向性プロモーター | |
| KR20220076497A (ko) | 아데노바이러스 벡터 및 이의 용도 | |
| WO2023201411A1 (en) | Composition for regulating production of ribonucleic acid |
Legal Events
| Date | Code | Title | Description |
|---|---|---|---|
| PB01 | Publication | ||
| PB01 | Publication | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| SE01 | Entry into force of request for substantive examination | ||
| GR01 | Patent grant | ||
| GR01 | Patent grant |