JP4495587B2 - 組換えアデノウイルスベクターおよびその使用 - Google Patents

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Description

(発明の分野)本発明は核酸搬送ベヒクルおよびその使用に関し、より一層詳しくは、本発明は組換えアデノウイルスベクターおよびその使用に関する。
(発明の背景)現在までに51種のヒトアデノウイルスの血清型(serotype、抗原型ともいう)が同定され、それは血球凝集反応の性質と配列相同性に基づいて6つのサブグループ(A, B, C, D, EおよびF)に分けられる(Francki et al.(フランキ等) 1991年)。アデノウイルス感染サイクルは早期相(初期相)と後期相(遅延相)に分けられる。早期相において、ウイルスは被覆されず、早期の遺伝子(初期遺伝子)領域(E1, E2, E3およびE4)が転写的に活性となった後に、ゲノムは核に輸送される。E1領域は2つの転写領域: E1AとE1Bを含む。E1Aは宿主細胞サイクルの修飾と、他のウイルス転写領域の活性化に関与した蛋白質(タンパク質)をコードする(Russell(ラッセル)の2000によって概説された)。E1B領域は2つの主要蛋白質: E1B-19KおよびE1B-55Kをコード(コード化)し、それはE1A蛋白質の活性により生じるアポトーシスの誘導を防ぐ(Rao(ラオ)et al. 1992; Yew(イユー)およびBerk(バーク)の1992; Shenk(シェンク)の1996)。加えて、E1B-55K蛋白質は選択的なウイルスmRNA輸送と宿主蛋白質発現のために後期相において必要とされる(Pilder(パイルダー) et al. 1986)。E2も2つのサブドメイン: E2AとE2Bに分けられ、それは共に3つの蛋白質をコードし(DNA結合蛋白質、ウイルスポリメラーゼおよび末端前(pre-terminal、前終端)蛋白質)、それは全てウイルスゲノムの複製に関与している(Van der Vliet(ファン・デル・フリート) 1995)。E3はインビトロにおける複製には必須でないが、ウイルス感染に対抗する宿主防御機構を覆すいくつかの蛋白質をコードしている(Hoewitz(ホウウィッツ) 2001)。E4は少なくとも6つの読み枠(orf)を有し、それはウイルスmRNAスプライシングおよび輸送、宿主細胞mRNA輸送、ウイルスと細胞の転写および形質転換に関連する、いくつかの異なった機能に関連している(Leppard(レパード)の1999によって概説された)。ウイルスカプシドとウイルスゲノムのパッケージングの形成に必要な後期蛋白質は、主要な後期転写単位(MLTU)から全て生成し、それは複製が始まった後に完全に活性となる。ディファレンシャル・スプライシングおよびポリアデニル化の複雑な過程は、三者からなる(tripartite)リーダー配列を分かち合う15以上のmRNA種を生じる。E1B-55K、E4-orf3とE4-orf6の蛋白質は、後期ウイルスmRNAプロセッシングと核からの輸送の調節において極めて重要な役割を果たす。この過程のために、E1B-55KはE4-orf6と相互作用し、ウイルスmRNAの細胞質への輸送を刺激する機能的な複合体を形成し、一方その複合体は、核から細胞質への細胞のmRNAの輸送の抑制にも関与している(Leppardの1997と1998において概説された)。
サブグループC抗原型Ad5またはAd2に基づいたE1欠失ベクターの作製(産生)は、293(Graham(グラハム)ら1970)、911(Fallaux(ファルオー)ら1996)、およびPER. C6 TM (商標)(Fallauxら1998; ECACC寄託番号96022940)のようなE1相補(補足性)細胞株(細胞系)において達成される。WO 99/55132とWO 01/05945において開示されているように、ベクターと細胞株を適合させ、細胞株中のアデノウイルス配列とベクターの相同組み換え(組換え)を介して、複製能を有するアデノウイルスが生成するのを避ける事ができる。複製能を有さないグループCから導き出される(由来の)アデノウイルスの十分な産生のために、細胞株PER. C6(商標)が好んで使用される。この細胞株を使用してアデノウイルスベクターを適合させることができ、それによって複製能を有するアデノウイルスの非存在下(不存在下)で、グループCのアデノウイルスベクターを産生することが可能となる(Fallaux et al. 1998; 米国特許第6,033,908号)。しかし、グループCベクターは直接的なインビボ適用のためには必ずしも理想的なベヒクルではない。なぜならば、ほとんどのヒトにおいて高い力価の中和活性が存在する事と、特定の一次標的細胞(例えば、内皮細胞、平滑筋細胞、シノビオサイト(滑膜細胞)、単球および樹状細胞)上に十分な量の細胞受容体(コクサッキーアデノウイルス受容体、CAR)が存在しない事により、感染効率は大きく妨害されるからである。より(一層)高い量のウイルスを投与して形質導入の増加を行うと、治療された被験者の中和力価にバラツキがあることにより、毒性の増加と予期されない臨床の結果がもたらされるかもしれない。これらの制限は他の抗原型のアデノウイルスを使用することによって克服されるかもしれない。例えば、サブグループBウイルスのファイバー組織の受容体結合部位は(特に抗原型16において)、Ad5に基づいたベクター上に発現した時に、ヒト内皮細胞と平滑筋細胞(WO 00/31825)およびヒトシノビオサイト(WO 00/52186)の顕著な感染の増加を仲介した。他のサブグループBのアデノウイルス、Ad35のファイバーは、ヒト単球と樹状細胞の感染を仲介するのに最も効率的であった(WO 00/03029)。更にAd35は、ヒト集団の大部分が中和活性を有さないウイルスであると同定(識別)してある(WO 00/70071)。
本分野において、より広い抗原型の有用性を持つ技術を開発する概して切実な必要性が存在する。特定の問題は、これらの他の抗原型のために適したパッケージング細胞株の欠如である。Ad5ベクターのためのパッケージング細胞株は、典型的にはアデノウイルス抗原型5由来のE1にコードされた蛋白質を備える。そのような‘標準的’パッケージング細胞株の例は、293、911およびPER. C6(商標)である。これらの標準的なパッケージング細胞株において他の抗原型由来のベクターを産生しようという試みは、不成功でない場合には、非常に努力を要することが証明される。使用される特定の抗原型に依り、時にはいくつかの産生が見られる。しかし、サブグループC以外のアデノウイルスサブグループから得られる組み換えアデノウイルスベクターは、Ad5由来のE1によって形質転換され、および不死化される細胞株上で産生され、その収率は乏しい。Abrahamsen(アブラハムセン)ら(1997)による論文において、Ad5由来のorf-6配列を欠く293細胞と比較して、アデノウイルス抗原型5由来のE4-orf6を備えた293細胞において、E1Aが欠失したアデノウイルス抗原型7ベクター(サブグループB)のプラーク精製が改良されていることが観察された。しかし、ベクターの安定性の問題に遭遇し、それはプラーク精製されたストックにおいて、予期せぬ再組み換えが観察されたからである。産生の間の野生型アデノウイルスのウイルス汚染の付加的な問題に遭遇した。更に、アデノウイルスの大規模な産生のために、E4-orf6を共トランスフェクト(同時形質移入)して適用のために十分に高い力価を得るというのは有用ではない。そのようなアデノウイルスを生育(増殖)させるための一つのオプションは、細胞に、相補/パッケージの細胞株のゲノム中に安定に結合されたE4-orf6遺伝子を提供する事である。そのような細胞はその技術分野で記載されている(例えば、WO 96/22378)。そのシステムの不利益は、新たな安定な細胞株を生成させなければならず、および安定であって適切な細胞が生成される前には膨大な選抜ラウンドを行わなければならないという事実である。この過程は骨がおれるものであり、時間もかかる。概して、サブグループBウイルスのような、抗原型5(サブグループC)以外の抗原型由来のアデノウイルスの生成と増殖(繁殖)は、Ad5相補細胞においては困難であると証明されたと言うことができる。WO 00/70071において本出願人によって開示してあるように、サブグループBウイルスAd35に基づいた組み換えウイルスは、Ad35早期領域-1配列(Ad35-E1)を含む発現コンストラクト(構築物)の共トランスフェクションによって作ることができる。更に、E1A配列についてのみが欠失し、E1B配列については欠失していないAd35に基づいたウイルスは、PER. C6細胞上で効率的に発現する事が示され、Ad5のE1A蛋白質がAd35-E1A機能を相補することができると示唆している(本出願人の国際出願PCT/NL01/00824、未公開)。更にその実験により、Ad5-E1Bの欠如が、Ad5相補細胞上の乏しい収率を招く事を示す。WO 00/70071はまた、E1が除去された非クループCのアデノウイルスベクターの産生のための細胞株を開示し、アデノウイルス抗原型5を相補できる細胞株を更に修飾することによる。WO 00/70071は更に、Ad35-E1配列を有している新たな細胞株を、E1領域を欠いている組み換えアデノウイルス抗原型35ベクターを相補するために確立すべきであることを示唆する(本出願人の国際出願PCT/NL01/00824も見よ)。しかし、また上記でも議論したように、もし特定の必要性のために特定の抗原型の適用を望むならば、あらゆる特定の抗原型のために新たな細胞株を確立しなければならず、あるいは、興味の対象である抗原型を相補するために、アデノウイルス抗原型5を相補できる利用可能な細胞株を改変しなければならないであろう。この技術において入手可能な確立された細胞株を使用し、およびこれらを改変(修飾)することなく、及びそれらを他のすべての、非-Ad5の抗原型の産生のために、この技術において既知の確立された、および効率的な方法を適用し、用いることは、明白に利益となるであろう。本発明までは、サブグループCの抗原型とは異なったアデノウイルス抗原型の有用な収率(生産量)を産生することを可能とさせる、柔軟性に富み且つ適切な‘産生基盤’はこの技術において利用可能でないと結論付けられる。
(発明の概要)
本発明は第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組換えアデノウイルスベクターを提供するものであり、ここで前記ベクターはE4-orf6蛋白質をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、a)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列; b)前記第1抗原型のアデノウイルスから一つまたはそれ以上のコドンにおける欠失、変異、付加および/または置換の方法により得られたE4-orf6コード配列、およびc)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部と、第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても、異なっていてもよいものからなる群より選ばれる。
本発明は更に、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備えるような組み換えアデノウイルスベクターを作製するための方法を提供するものであり、前記方法は、a)第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列を発現可能な型で有する相補細胞に、前記相補細胞により前記組換えアデノウイルスのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第1抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程; b)アデノウイルスベクターの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c)該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組換えアデノウイルスを回収する過程、を備え、ここで適合性があるE4-orf6蛋白質をコードする配列が、そのような作製された組換えアデノウイルス中に存在する。
本発明は更に、本発明のアデノウイルスベクターを含む薬剤組成物、および本発明により提供されたアデノウイルスベクターを用いた個体の治療方法に関する。本発明はまた、本発明により提供された方法を実行するための、本発明により提供された細胞株とアデノウイルスベクターを備えた部品のキットに関する。
（発明の詳細な説明）
本発明は、Ad5パッケージ/相補細胞における非グループCアデノウイルスベクターの相補の低下に関連するある困難を解決するための方法および手段を開示するものである。Ad5相補細胞株において機能を有するAd5 E1B-55Kの発現が存在するが、アデノウイルスの骨格が非グループCアデノウイルス起源であるとき、アデノウイルスベクターにより作製される力価は非常に低いことが見出され；この発見はE1B-55Kと他の（ウイルス）蛋白質の相互作用における抗原型特異性を意味する。この抗原型依存性は、相補細胞株によって提供されたE1B-55K蛋白質と適合するE4-orf6蛋白質を提供することにより回避できることがこの中で述べられている。この中で議論されるようにE1B-55KとE4-orf6は、核から細胞質へのmRNAの細胞内輸送の阻害に関与している複合体を形成し、一方その複合体は核から細胞質へのウイルスmRNAの輸送の刺激にも関与している。本発明者らによって、パッケージング細胞中のウイルスベクターの適切な相補には、適合性を有するE1B-55KとE4-orf6の遺伝子産物の存在が必要である事が観察された。もし細胞がパッケージされるべきベクターにより提供されない機能を補う蛋白質をコードするある配列を備えるならば、パッケージングは相補細胞とも呼ばれる。そこで本願明細書中で「適合する」とは、利用可能なE1B-55K遺伝子産物の間の複合体が利用可能なE4-orf6の遺伝子産物と機能を有する複合体を形成できる事を意味し、それは、野生型の場合に匹敵する、あるいは組み換えアデノウイルス抗原型5ベクターが293またはPER.C6などのAd5相補細胞株で作製された時に見出される場合に匹敵する程度まで、この蛋白質複合体はウイルスの複製、増殖、および/またはパッケージングを支援するという意味である。もしウイルスが形成される産生期間の間に、細胞が適合するE1B-55K蛋白質とE4-orf6蛋白質を少なくとも備えるならば、パッケージング細胞中におけるベクター複製は効率的である。好ましくは、E1B-55KとE4-orf6配列は同じアデノウイルスサブグループ（A,B,C,D,EまたはFなど）中のアデノウイルス由来である。より好ましくは、E1B-55KとE4-orf6配列は同じ抗原型に由来する。抗原型5のようなサブグループCのアデノウイルスの成長を支持することが可能な、確立された細胞株を本技術分野で入手することが可能であり、E1B-55KとE4-orf6遺伝子がアデノウイルス抗原型5から得られる事はより好ましい。当業者に理解されるように、適合性とは、アデノウイルスベクター産生の技術分野の当業者の範囲内である、相補試験またはアッセイによって測定される。本技術分野の当業者は、E1B-55KとE4-orf6蛋白質が適合性を有する限り、任意の相補細胞株における任意のアデノウイルス抗原型の産生のために、本発明を使用できる事も理解するであろう。
更に、相補細胞株中のE1Bと「マッチング」するE4-orf6遺伝子産物は、アデノウイルスベクターにより、最適なアデノウイルスベクター中のE4-orf6を、パッケージング細胞株中に存在するE1B遺伝子と適合するE4-orf6コード配列と置き換えることにより提供されることが、観察された。驚くべきことにこの改変は、ベクターの安定性、複製、パッケージング、アッセンブリーおよび産生に重大な影響を及ぼさないことが見出された。
本発明のある観点は、アデノウイルス抗原型5またはサブルグープC由来の他の抗原型（アデノウイルス抗原型1,2,6など）の産生のために普通に適用される細胞株上で、サブルグープC由来のものとは異なったアデノウイルス抗原型を、今や効率的に産生できるというものである。本発明は、E4-orf6を有する相補（パッケージ）細胞を別途提供する必要なく、非グループCアデノウイルスを産生するための方法を提供するものであり、なぜならば、相補E1B-55K配列と適合するE4-orf6配列がアデノウイルスの骨格中に導入されるからである。
本発明は、第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを提供するものであり、ここで前記ベクターは機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を更に備え、ここで前記配列は、a)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列コード配列；b)一つまたはそれ以上のコドンにおいて欠失、変異、付加および/または置換を有する、前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列コード配列；およびc)前記第1抗原型とは異なる第2抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部と、第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても、異なっていてもよい、上記E4-orf6コード配列、からなる群から選択される。一つの態様において本発明は、前記第1抗原型と前記第2抗原型は異なったアデノウイルスサブグループに由来する、本発明による組み換えアデノウイルスベクターを提供する。好適な態様において、前記第1抗原型はサブグループC以外のサブグループに由来し、前記E4-orf6コード配列はサブグループCの抗原型のアデノウイルスから得られる、本発明の組み換えアデノウイルスベクターが提供される。より好適なのは、前記第1抗原型はサブグループBに由来し、前記第2の抗原型はサブグループCから得られる、本発明の組み換えアデノウイルスである。更により好適には、前記E4-orf6コード配列はアデノウイルス抗原型5から得られる、
異なった抗原型に対して向けられた、異なったレベルの中和抗体がヒトの中で循環していることが、本技術分野の当業者により認識されている。あるアデノウイルス抗原型がそのような中和抗体の高い力価と遭遇し、異なった集団中の多くの個体がそのような抗原型に対する中和抗体を有することが見出されている。ある抗原型は少数のサンプルにおいてのみ中和されることも見出されている（WO 00/70071）。あきらかに、サブグループB由来のある抗原型は小グループのサンプルにおいてのみ中和された。そこで本発明の好適な態様において、前記第1の抗原型はアデノウイルス抗原型11,14,16,21,34,35と50からなる群から選択される、本発明の組み換えアデノウイルスベクターが提供される。特に好ましい組み換えアデノウイルスベクターは、前記第1抗原型は抗原型11または35であり、一方、これらは試験したサンプルにおいて非常に少量のパーセンテージのみが中和抗体と遭遇した。
本発明のベクターは遺伝子治療、機能的ゲノム学、癌ワクチン接種および/または抗ウイルスワクチン接種など、種々の状況で使用することができる。このために、アデノウイルスベクターが遺伝子運搬ベヒクルとして機能する必要があり、ここで非天然遺伝子がアデノウイルスゲノム中へ導入される。引き続いてアデノウイルス微粒子を興味の対象である標的細胞へ特異的に標的化することができ；アデノウイルスはその特定の細胞と、カプシド受容体結合あるいは他の手段のいずれかを介して結合し、その導入遺伝子を運搬する。アデノウイルスの標的化を多くの異なった方法で行うことができる。アデノウイルスベクター標的化の分野の当業者は、アデノウイルスベクターを興味の対象である細胞へ運搬するために適用される、種々の可能性の全てに気が付くであろう。そのような可能性にはカプシド改変（ファイバー、ヘキソンおよび/またはペントン修飾であって、欠失、異なった抗原型のファイバーとの交換、およびペプチドおよび/または他の結合部分の付加など）が含まれるが、それに限定されるものではなく、ここでキメラファイバーは興味の対象である細胞上に存在する受容体を認識するように作製され、またはここでペントン塩基（penton-base）の結合が利用される。他の可能性は標的部分をカプシド蛋白質と連結させることであり、ここで例えば結合ペプチド、既知で強力な結合蛋白質あるいは抗体またはその一部分がカプシド蛋白質に連結され、特定の標的化を達成する。そのようなベクターは全て、本発明により提供される方法および手段を用いて産生することができる。そこで、本発明は、非アデノウイルス蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドをコードする配列を更に備える本発明による組み換えアデノウイルスベクターも開示するものである。そのような配列はアデノウイルス骨格中の種々の位置の中に存在することも可能であるが、好ましくはそれは、本発明のアデノウイルスベクター中で欠いているE1領域中に位置する。E1領域は相補細胞中に存在する要素により補なわれる（相補）。プロモーター、導入遺伝子および他の制御配列の方向性は左に向けてのみならず、右逆方向末端反復へ方向付けられることができる。
本発明はアデノウイルスおよび/またはアデノ随伴ウイルス（AAV）などの他のウイルスに基づいたウイルスベクターの産生のために使用することも可能であり、ここでAd-AAVキメラウイルスなどの組み合わせを宿主細胞ゲノム中へ結合することができる。結合したアデノウイルスを産生するためのいくつかの方法が、本技術分野で知られている。一般的に、本発明は結合できる型（特異的に、または非特異的に）のアデノウイルスの産生に有用である。
述べたように、いくつかの非アデノウイルス導入遺伝子を、本発明の組み換えアデノウイルスベクター中にクローン化することができる。これらはエンハンサー、プロモーター（例えば、サイトメガロウイルスプロモーター、SV40プロモーターおよびRSVプロモーターなどの強力な非アデノウイルスプロモーター）およびポリアデニル化シグナルなどの制御核酸配列のみを含むのではなく、治療目的のための異種遺伝子も含む。そこで本発明の一態様において本発明の組み換えアデノウイルスが提供され、ここで前記非アデノウイルス蛋白質、ポリペプチド、またはペプチドは下記の；細胞死誘導ポリペプチド、病原生物の抗原決定基、癌特異的抗原、ウイルス蛋白質、ホルモンおよびサイトカイン、からなる群から選択される。病原生物の例には細菌、ウイルスおよび真菌が含まれるが、それらに限定されるものではない。非アデノウイルス因子、蛋白質、ポリペプチドおよびペプチドの非限定的な例は、転写因子、細胞内シグナリング蛋白質、フォスファターゼ、キナーゼ、アポトーシス阻害因子、受容体アンタゴニスト、膜結合受容体の可溶性型、RNA阻害剤、アンチセンスRNA、デコイ因子、リボゾーム、およびより特異的にはチミジンキナーゼ、エリスロポエチン、新規赤血球産生刺激蛋白質（NESP）、IL3、ceNOS、ガンマ-インターフェロンおよびgp100である。ワクチン接種の目的で、本発明の方法と手段によって提供される組み換えアデノウイルスベクター中へ、非アデノウイルスのウイルス蛋白質をクローン化できる。そのようなウイルス蛋白質にはHIVワクチンのためのgag, pol, env, nefなど、ヒト乳頭腫ウイルスワクチンのためのE6およびE7蛋白質、マラリアワクチンのためのプラスモジウム原虫由来のスポロゾイト周囲蛋白質、ロタウイルスワクチンのためのロタウイルス成分、エボラワクチンのためのエボラ蛋白質、呼吸器合胞体ウイルス（RSV）ワクチンのためのRSV由来のFおよびG遺伝子産物、インフルエンザワクチンのためのHAおよびNAなどが含まれるが、それらに限定されるものではない。
本発明の組み換えアデノウイルスは構造的および非構造的な要素を備える。構造的な要素の例は、ファイバー、ヘキソン、およびペントン蛋白質などのカプシド蛋白質をコードする遺伝子のみならず、その遺伝子産物そのものである。非構造的な要素の例は早期遺伝子であり、早期遺伝子は細胞中へ感染することにより発現し、感染サイクルが進行する時にダウンレギュレートされる。非構造的な要素の他の例は、polおよびpTPなどの、複製の間に活性な蛋白質をコードする遺伝子である。組み換えアデノウイルスベクターは、異なった抗原型に由来する構造的および非構造的な要素を備えることがあると理解されるべきである。そのようなベクターの例には、例えばキメラファイバーを有するアデノウイルス微粒子がある（出願人の特許出願WO 00/03029を見よ）。分子生物学の技術により、核酸配列の組み合わせを無制限に構築することが可能となった。分子生物学の分野の当業者にとって、ポリメラーゼ鎖反応（PCR）のみならず直接的なサブクローニングなど、種々の分子技術を使用して種々の配列の組み合わせを行うことが可能であることは明らかである。本発明において使用される配列の多くのみならず、本分野で知られている配列およびキメラのコンストラクトも種々のアデノウイルス抗原型から得られる。そこで本願明細書で「得られた」とは、そのような配列の組み合わせが、野生型のウイルスから得られる野生型配列からの直接的なクローニングを通じて得られることを意味するが、一方それらは例えば種々のDNA断片を鋳型として用いてPCRを通じて得ることもできる。これは、そのような配列は野生型の形態のみならず、改変された形態であることも可能である事も意味している。同じ結果に到達する他の選択肢は、合成DNAを組みあわせることを通じてのものである。「得られた」は野生型DNAの直接的なクローニングを排他的に意味するものではないことを理解するべきである。本技術分野の当業者は、ある核酸断片の変異型を得るという分子生物学の可能性にも気が付くであろう。これらの変異は異なった機能性を付与するかもしれないが、それらはある意味では、ある変異がその特定のDNA断片とそれにコードされる蛋白質の機能性を変えないということにも沈黙している。そこで「機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物」という用語は、それらが関連している核酸の同等物であると理解されるべきである。本技術分野の当業者は、ある欠失、交換、（点）変異、付加などはなお、元の核酸と類似した機能を有する核酸をもたらす結果となるかもしれない事実を理解するであろう。そのために、E4-orf6とE1B-55K遺伝子産物などの機能性を顕著に変化させないような改変も、本発明の範囲内であることは理解されるべきである。
一つまたはそれ以上のコドンにおける欠失、変異、付加および/または置換などの核酸におけるいくつかの改変は、コードされた遺伝子産物の構造および/または機能性も顕著に変えるかもしれない。そこで本発明は、例えば構造的および非構造的な要素などの遺伝子を有する骨格と同じアデノウイルス抗原型から得られたE4-orf6によりコードされた配列にも関連するが、E4-orf6コード配列は変異し、アデノウイルスベクターがその中で産生される相補細胞中に存在するE1蛋白質（E1B-55K遺伝子産物など）と適合するようになっている。そのコドンは変異してコードされるアミノ酸を完全に変化させることもあるが、それは部分的に変異してコードされたアミノ酸を変化させてもよい。核酸が欠失するとコードされたアミノ酸を一つまたはそれ以上損失するという結果となり；一方、それはフレームシフトを起こす結果となってもよい。本発明は、種々の抗原型から得られた種々の部分を備えるアデノウイルス核酸中に存在するE4-orf6配列にも関連し、ここで蛋白質に適合した中で機能を付与するドメインは、一つの抗原型から使用されてもよく、一方、E4-orf6配列の残りの部分またはその一部分は、他の関連した（関連していない）抗原型（例えば、同じサブクループから、異なったサブクループからまたは異なった種から、あるいはその組合わせ）から得られる。そこで、適合性を有するE4-orf6融合蛋白質を適用することも本発明の範囲内である。そのような融合蛋白質は核酸のいくつかの断片の産物であってもよい。
本技術分野の当業者は、全てのヒトアデノウイルスに加えて、多くの非ヒトアデノウイルスが本技術分野で同定されてきた事実に気が付くであろう。明らかに、本発明により開示されたのと同じ結果に到達するために、非ヒトアデノウイルスを利用することもできる。E1B-55KとE4-orf6の間の適合性はヒトアデノウイルスに限定されないが、種々の種において特異的なアデノウイルス由来の要素も適合性を有することができることは、当業者に明らかであろう。そこで、E1B-55KとE4-orf6遺伝子産物が適合性を有する限り、非ヒトアデノウイルスを、本技術分野において入手可能な既知のパッケージング細胞株において高力価に産生できるというのも、本発明の他の観点である。本発明の方法および手段を用いて産生できる非ヒトアデノウイルスの非限定的な例は、イヌ、ウシ、ヒツジ、カエル、ブタ、ウマ、サルおよび鳥のアデノウイルスである。そこで本願明細書中における抗原型とは、種に限定された抗原型を超えるものである。例えば、もしサルのアデウイルスE4-orf6遺伝子産物がパッケージング細胞により提供されるE1B-55Kと適合するならば、この組合わせは本発明の範囲内である。また異なった抗原型の間に、または、例えばヒトとパッケージング細胞のE1B遺伝子と適合する鳥のアデノウイルスから得られたE4-orf6配列の間に融合が適用されるならば、その特定の組み合わせも本発明の範囲内であろう。
本発明は第1型のアデノウイルスの構造的および非構造的要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを産生するための方法を提供するものであり、前記方法は下記の過程：a) 第2抗原型のアデノウイルスから得られたE1B-55Kコード配列、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で有する相補細胞に、前記相補細胞により前記組み換えアデノウイルスのアッセンブリーを可能とするようなアデノウイルスの必要な要素を提供する過程であって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なる前記第１抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、前記E4-orf6蛋白質は前記相補細胞において前記発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する、上記提供過程；b) アデノウイルスベクターの生成およびアッセンブリーが起こるのを可能とする条件下で、前記相補細胞を培地中で培養する過程、および、c) 該培地および/または該相補細胞からそのように作製された組み換えアデノウイルスを回収する過程、を備え、ここで適合性を有するE4-orf6蛋白質をコードする配列が、そのような作製された組み換えアデノウイルス中に存在する。
本発明の一つの観点において本発明の方法が提供され、ここで前記E4-orf6コード配列は下記の群：i)前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；ii)前記第1および第2抗原型とは異なっている第3抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；iii)前記第1抗原型のアデノウイルスから得られ、一つまたはそれ以上のコドンにおいて欠失、変異、付加および/または置換を有するE4-orf6コード配列；およびiv)第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部分と、前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列の一部分の間に融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同じであってもよく、異なっていてもよい。好ましい態様において、前記第1および前記第2抗原型は異なったサブグループに由来する。より好ましい態様において、前記第2抗原型はサブグループCのアデノウイルス抗原型である。尚より好ましい態様においては、前記第2抗原型はアデノウイルス抗原型5である。本発明の他の特定の観点において、前記第1抗原型はサブグループBのアデノウイルス抗原型である。好ましくは、前記第1の抗原型はアデノウイルス抗原型11, 14, 16, 21, 34, 35および50からなる群から選択される。
組み換えアデノウイルスベクターを相補し、アデノウイルス微粒子を産生し、アッセンブリーし、およびパッケージするために使用されるパッケージング細胞は、本技術分野においていくつか知られている。そのような細胞株の非限定的な例は、HER-293, 911およびPER.C6（登録商標）細胞である。高力価のアデノウイルスのストックを運搬することが既に証明されている細胞株を使用することは好ましい。そのような細胞株は安定した態様でE1蛋白質を発現し、そこで、それは細胞株と方法を使用するための本発明の好適な態様であり、ここで前記E1B-55Kコード配列は、前記相補細胞のゲノム中に結合する。より好ましいのは、初代の、二倍体のヒト細胞、またはその前駆細胞から得られた相補細胞である。尚更に好ましくは前記相補細胞は、初代ヒト網膜芽細胞、初代ヒト胚腎臓細胞、初代ヒト神経細胞、または初代ヒト羊膜細胞から得られる。非常に好ましいのは、本発明により提供された方法において相補細胞を使用することであり、ここで前記相補細胞はPER.C6細胞またはその誘導体である。PER.C6細胞は、その細胞により提供された核酸と重複を有さないアデノウイルスDNAを使用したときに、複製可能なアデノウイルスを起こすことがないと本技術分野でよく知られている。本技術分野で使用されるアデノウイルスベクターの多くはE1領域を欠き、そこで本発明の一つの観点において、前記相補細胞は、そのゲノム中に結合した、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする核酸を備える。好ましくは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、サブグループBとは異なったサブグループのアデノウイルス抗原型から得られる。より好ましくは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、サブタイプCのアデノウイルス抗原型から得られる。非常に好ましいのは、少なくとも一つのアデノウイルスE1A蛋白質をコードする前記核酸は、アデノウイルス抗原型5から得られるという態様である。本発明の他の態様において、本発明は方法を提供するものであり、その方法において、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列が異なったアデノウイルス抗原型から得られ、前記異なったアデノウイルス抗原型は同じアデノウイルスサブグループのメンバーである。好ましくは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列は異なったアデノウイルス抗原型から得られ、ここで前記異なったアデノウイルス抗原型は両者ともサブグループCのメンバーである。より好ましくは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列は同じアデノウイルス抗原型から得られる。非常に好適なのは、前記E4-orf6コード配列および前記E1B-55Kコード配列がアデノウイルス抗原型5から得られる方法である。
本発明は、本発明によるアデノウイルスベクター、または本発明により提供された方法により得られる組み換えアデノウイルスベクターを含む薬剤組成物にも関する。該薬剤組成物は、薬剤調製の分野の当業者によって一般的に適用される、受容可能な薬学的担体を更に備える。更に本発明は、本発明による組み換えアデノウイルスベクター、または本発明により提供された薬剤組成物を人体に投与することよりなる、人体の治療方法に関する。本発明は、適切な相補/パッケージング細胞および興味の対象であるアデノウイルスベクターを用いて、アデノウイルスベクターを作製することができる方法にも関する。効率的な作製工程のために、適切なアデノウイルスベクターと共に正しい細胞を適用することは有用である。そこで本発明は部品のキットにも関連し、その部品のキットは、a) 第1抗原型のアデノウイルスの構造的および非構造的な要素を備える組み換えアデノウイルスベクターを産生するための相補細胞であって、前記細胞は、第2抗原型のアデノウイルスから得られた、E1B-55Kコード配列、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物を発現可能な型で有する、上記相補細胞；および、b) 前記相補細胞によって前記組み換えアデノウイルスベクターのアッセンブリーを可能とするような、全て必要なアデノウイルスの要素である一つまたはそれ以上の複製可能な核酸ベクターであって、ここで前記要素は、前記第2抗原型とは異なっている前記第1抗原型のアデノウイルスに由来する少なくともいくつかの構造的および非構造的な要素、および機能を有するE4-Orf6蛋白質、または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似物をコードする配列を備え、該E4-Orf6蛋白質は前記相補細胞中で発現可能なE1B-55K蛋白質と適合性を有する上記核酸ベクターを備える。好ましくは部品のキットが使用され、ここで前記E4-orf6コード配列は下記の群：a)前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；b)前記第1および第2抗原型とは異なった第3抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；c)一つ又はその以上のコドンの欠失、変異、付加および/または置換を有する前記第1抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列；および、d)第3抗原型から得られたE4-orf6コード配列の一部分と前記第2抗原型のアデノウイルスから得られたE4-orf6コード配列の一部分の間の融合を備えるE4-orf6コード配列であって、ここで前記第3抗原型は前記第1抗原型と同一であっても、異なっていてもよい上記E4-orf6コード配列、から選択される。
本発明は特に、殆ど全てがアデノウイルス5以外の抗原型から得られた、E1欠損キメラアデノウイルスの複製のために有用である。そのようなベクターは、アデノウイルス5 E4-orf6または機能を有するその一部分、誘導体および/または類似体をコードする核酸から提供される事のみが必要である。一度それが提供されると正常なアデノウイルス5 E1相補パッケージング細胞株上で効率的にベクターを複製することができる。ベクターの安定性が改善され、そしてE1AとE1Bの両者においてベクターの欠失は相補されるであろう。そのようなベクターにアデノウイルスE4-orf6をコードする核酸を提供することにより、293または911細胞上で生育させたときに、効率的なプラーク精製、および加えての野生型の混入の問題なしに良い収率を得ることが可能となる。PER.C6細胞において、もちろん、野生型アデノウイルス混入は他の方法でも防ぐことができる。
本発明の組み換えベクターの更なる利点は、核酸由来のアデノウイルスE4-orf6がゲノム中に結合した、特別の細胞株を産生する必要がないということである。そのような細胞株は存在するが、それらを良好な状態に維持することは容易ではない。その少なくとも一部分は、より多くの外来遺伝子が細胞株のゲノム中に挿入されることにより、全ての外来配列の安定性（またはその発現）を維持することは困難となるいう事実による。本発明において、非アデノウイルス抗原型5に基づいたベクターの収率の低さと、アデノウイルス抗原型5パッケージ細胞株上のアデノウイルス抗原型７, 11および35のような、サブグループB由来のアデノウイルス抗原型ベクターの安定性に関連した問題の少なくともいくつかは、本発明の組み換えアデノウイルスによって克服できることが見出された。
実施例１ Ad5 E4-orf6を発現しているE1-欠失Ad35ウイルスのAd5相補細胞株上での作製
アデノウイルス抗原型35ゲノムの配列決定のみならず、プラスミドに基づいたベクターシステムの構築と組み換えたAd35に基づいたウイルスの作製は、WO 00/70071において詳細に述べられている。
Ad5-E4-orf6コード配列の、pAdApt35IP1（ECACC寄託番号P02041228、このプラスミドのクローニングの詳細はWO 00/70071を見よ）へのクローニングは下記のように行われた。プラスミドをNheIとAvrIIで消化し、子牛腸フォスファターゼで脱リン酸化した（ニューイングランド・バイオラボス）。消化されたDNAをジェネクリーン・キットを用いてゲルから単離した。プラスミドp△MT,Orf6.Hygroを（図１、ECACC寄託番号P02041226）をNheIで消化し、引き続いてXbaIで部分消化した。得られたバンドをゲル上で分離した後、E4-orf6配列に連結した△MTプロモーターに相当する1350塩基対の断片をゲルから精製した。次に、両者の単離した断片を連結し、エレクトロ−コンピーテントなDH10B細胞（インビトロゲン/ライフテクノロジーズ）中に形質転換し、その後にSV40ポリ(A)シグナルに関して正しい方向性の挿入物を有するコロニーを、大規模なDNA調製のために選択した。これはpAd35.△MT,Orf6（図２）を構築する結果となり、それは変異したメタロチオネインプロモーター（△MT）に機能を有して連結したAd5 E4-orf6コード配列をを含んでいる。△MTプロモーターはHagmeyerら（1996）により述べられている。Ad5配列（Genbank accession number M73260）中のヌクレオチド33193からヌクレオチド34077は、Ad5 E4-orf6配列に相当する。Ad5 E4-orf6蛋白質の発現は、Ad5相補細胞上で可能な、E1が十分に欠失したAd35ベクターを産生するかどうか試験するために、pAd35.△MT,Orf6をAd35骨格コンストラクトpWE.Ad35.pIX-rITRと、PCR.C6細胞上で共トランスフェクトした。ここでpAd35.△MT,Orf6をPI-Psp-1で消化し、pWE.Ad35.pIX-rITRをNotIで消化し、骨格からアデノウイルス挿入物を遊離させた。消化されたpAd35.△MT.Orf6の2μgと、消化されたpWE.Ad35.pIX-rITRの6μgを、リポフェクタミンを用いてトランスフェクトした。トランスフェクション混合液を、前日にT25フラスコあたり3.5×106細胞の密度で播種したPER.C6細胞へ添加した。次の日に、PER.C6培養培地（10%FBSと10mM MgCl2を有するDMEM）について培地を交換し、37℃/10％CO2で細胞を更にインキュベートした。pWE.Ad35.pIX-rITRで共トランスフェクトしたpAdApt35.Lucにより、およびpWE.Ad35.pIX-rITR単独で、コントロールのトランスフェクションを行った。トランスフェクションの2日後、細胞をT25からT80フラスコへ移し、上記のようにインキュベートした。3日後に再び、Ad35骨格と共にpAd35.△MT.Orf6によりトランスフェクトした培養物は、ウイルス複製を示唆する細胞変性効果（CPE）を示し、更に2日インキュベートした後に回収した（細胞と培地を含む）。細胞懸濁液を2ラウンドの凍結/解凍サイクルにかけ、得られた物質（粗溶解物）を使用するまで-20℃で更に維持した。他のフラスコはCPEを示さず、T80に移して6日後にT80中で1：3で過ごした。再び5日後に、pAdApt35.Luc + pWE.Ad35.pIX-rITRでトランスフェクトしたフラスコは僅かにCPE様の事象を示したが、これが更に進むことはなかった。pAd35.△MT.Orf6トランスフェクションから得られる粗溶解物の0.2および0.5mlを、T80フラスコ中でおよそ85％の集密度でPER.C6細胞を再感染させるのに使用した。これは1日インキュベートした後に完全なCPEが起こる結果となり、この事はその粗溶解物中に感染性のウイルスが存在している事を示唆している。これらの培養物も、2回の凍結/解凍サイクルによって回収した。コンストラクトpAd35.△MT.Orf6単独によるPER.C6上へのコントロールトランスフェクションを加えて行い、Orf6の発現はそれ自体では細胞毒性とCPE様の細胞死の結果とはならないことを確認した。結論として、pWE.Ad35.pIX-rITRと共にpAd35.△MT.Orf6でトランスフェクトしたときのみ、CPEとウイルス複製が起こった。
Ad5-E4-orf6が先のE1領域と置き換わったAd35に基づくウイルスゲノムの存在を確認するために、PCR解析を行った。ここで、下記のようにして粗溶解物サンプルからウイルスDNAを単離した。粗溶解物の275μlを10μlのDnaseI（10mg/ml）と、37℃で30分間インキュベートした。続いて6.0μlの0.5M EDTA(pH8.0)、7.5μlの20％SDSおよび1.5μlの20mg/mlのプロテイナーゼKを添加し、ボルテックスを行うことにより混合した。その混合液を50℃で1時間インキュベートした。最終的に、ジェネクリーン・スピンキット（バイオ101社）を用いてウイルスDNAを単離した。単離したDNAの2μlを、プライマー35spi-Forと35R4（表１）を用いてPCRで増幅した。そのプログラムは、94℃で2分間、続いて94℃で30秒間を30サイクル、58℃で30秒間および72℃で5分間に設定され、72℃で10分間でのインキュベーションにより終了した。そのプライマーはAd35配列に特異的であって2.9kbの断片を生成し、その2.9kb断片はパッケージ配列からヌクレオチド4669（野生型Ad35配列のように番号をふる）へと至っているので、Ad5 orf6導入遺伝子カセットを含んでいる。得られたPCR断片を電気泳動すると、その断片は、アダプタープラスミドpAd35.△MT.Orf6上に生成したコントロールPCR断片とマッチングする、予期された長さを有していることが示された。そこで、もしウイルスもAd5-E1orf6を発現するならば、Ad5相補細胞上で十分にE1が欠失したAd35に基づくベクターを作製することができる。
実施例２ pWE.Ad35.pIX-rITR5E4の構築
プライマーDF35-1と35FR（表１）を用いて第1のPCR断片を増幅した。pWE.Ad35.pIX-rITR（WO 00/70071を見よ）を鋳型DNAとし、Pwo DNAポリメラーゼ（ロッシュ）を別途のDMSO（シグマ、最終濃度3％）と共に用いて増幅を行った。プログラムは以下のようである。94℃で2分間、続いて（94℃で30秒間、52℃で30秒間、72℃で3分間を）30サイクル、および完全な断片を保証するための72℃で8分間の最終工程である。増幅はAd35配列のヌクレオチド30224から31805に相当する1.6kbを得る結果となった。3‘末端にBamHI部位を導入した。ジェネクリーンキットを用いて増幅されたDNAをゲルから精製し、pCRScript/Ampクローニングベクターキット（ストラタジーン）へ結合させた。エレクトロコンピーテントなDH10B細胞への形質転換に続いて、更に解析を行うために白いコロニーを選択した。これはコンストラクトpCR-fiber35を得る結果となった。ブラントなクローニングであるために、そのPCR断片は2つの方向性で挿入されることが可能であった。5’末端においてpCRScript/Ampベクターのポリリンカー中にBamHI部位の挿入を有するクローンが選択された。そこでBamHIによる消化の結果、1.6kb断片となった。PCR断片を正しく増幅することにより配列が確認された。第2のPCR断片は、プライマー5E4Fおよび5E4R（表１）を用いて増幅された。pWE.Ad5.Af1II-rITRspによる増幅が行われたが、それはpWE.Ad5.Af1II-rITR（出願人の国際特許出願PCT/NL01/00824中に記載された、ECACC寄託番号P97082116）中に余分なPacI部位を含んでいるコスミドベクターである。上記で述べたようにPwo DNAポリメラーゼを用いてpWE.Ad5.Af1II-rITRspを鋳型として作用させたが、pWE.Ad5.Af1II-rITRも同じ目的に使用することができた。ゲルから精製した後、DNAをSstIとBamHIにより消化し（PCRの間に両部位を導入した）、ジェネクリーンキットを用いてアガロースゲルから3kb断片を精製した。増幅されたAd5 E4領域は、Ad5配列のbp 32794からbp 35828に対応した。プライマー355ITRと353ITR（表１）を用いて、pWE.Ad35.pIX-rITR上に第3のPCR断片を生成させた。PCR増幅は上記のように行われた。得られた160bpの断片はSstI部位（5‘末端）とEcoRI部位（3’末端）によってフランキングされていた。上記のようにゲルから精製した後に、DNAをSstIとEcoRIにより消化した。Ad35の右ITRに対応している160bpの断片を、低融点アガロースゲル上で消化された末端から分離し、ゲル中で収集した。次に、BamHIとEcoRIによりpUC119を消化し、ジェネクリーンキットを用いて3.1kbの断片をゲルから精製した。上記で処理された第2と第3のPCR断片を、BamHI/EcoRI消化されたpUC119と結合し、pUC.Ad5E4-35ITRが得られる結果となった。クローン化されたPCR由来の挿入物の配列を決定し、正しい増幅を証明した。次に、pCR-fiber35中の1.6塩基対の挿入物をBamHIで切り出し、その断片を上記のようにゲルから精製した。pUC.Ad5E4-35ITRもBamHIで消化され、平滑断片をゲルから精製した。両断片を結合し、互いに対して正しい方向性を有するクローンを選択した結果、pUC.35-5E4が得られた（図３）。pUC.35-5E4の構築へと至る工程を模式的に図４に示す。pUC.35-5E4中のアデノウイルス挿入物を、Ad35の3‘配列を有するコンストラクトであるpBr.Ad35.PRn（図５；WO 00/70071を見よ）中にサブクローン化した。ここでコンストラクトpUC.35-5E4をMluIとNotIにより消化し、ジェネクリーンキットを用いて4.7塩基対の断片を消化した。その後この断片を、コンストラクトpBr.Ad35.PRnをMluIとNotIで消化して得られるベクター断片と結合させた。この16.3kbの断片を、アガロース酵素（ロシュ）を用いて精製した。その後、結合物をコンピーテントなDH10B細胞へ形質転換した。得られたコンストラクトをpBr.Ad35.PR5E4と名付けた（図６、ECACC寄託番号P02041229）。最後の工程は、Ad35配列の改変された3’末端の、ウイルスのコスミドクローンpWE.Ad35.pIX-rITRへのクローン化を伴っていた。ここで製造者の指示に従って、ラムダ・ファージ・パッケージング・リアクション（ストラタジーン）中で2つの断片を混合した。第1は、PacIとSwaIで消化することによりpBr,Ad35.PR5E4から得られた16.8kbの修飾されたAd35挿入物であり、第2は、pWE.Ad35.pIX-rITRをPacIとSwaIで消化することによって得られた22.8kbの断片である。2つの断片を正しく組合わせると、pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4が得られた（図７）。そこでこのコンストラクトにおいて、Ad35骨格中のE4領域はAd5から得られた対応する領域と置換されている。
実施例３ pWE.Ad35.pIX-rITR5Orf6の構築
Ad35配列をpIX遺伝子から（Ad35配列中のヌクレオチド3401）から右ITRの末端までを含んでいるが、E4-orf6と-orf6/7の配列がAd5の対応する配列と置換されたアデノウイルス骨格コンストラクトを得るために、Ad35およびAd5配列をPCR増幅して下記のように混合した。PCR断片をDMSOを3％まで添加したPwo DNAポリメラーゼによって生成した。鋳型としてのpBr.Ad35.PRn（図５；WO 00/70071を見よ）およびプライマーE4-F1とE4-2（表１）を用いて、第1のPCRを行った。プログラムを以下のように設定した。94℃で2分間、（94℃で30秒間、50℃で30秒間、72℃で1分間を）5サイクル、続いて（94℃で30秒間、60℃で30秒間、72℃で1分間を）30サイクル、そして68℃で8分間の最終工程で終了。得られた1.8kbの断片をジェネクリーンキットを用いて精製した。第2のPCRは、pWE.Ad5.Af1II-rITR（ECACC寄託番号P97082116、出願人の未公開の国際特許出願PCT/NL01/00824中に述べられている）中のPacI部位を含んでいるコスミドベクターであるpWE.Ad5.Af1II-rITRspを鋳型として、プライマーE4-F3とE4-R4（表１）を使用して行われた。プログラムを以下のように設定した。94℃で2分間、（94℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で1分間を）30サイクル、そして68℃で8分間の最終工程で終了。1.1kbの断片を上記のようにして精製した。第3のPCRは、鋳型としてのpBr,Ad35.PRnと、プライマーE4-F5とE4-R6（表１）により行われた。プログラムを以下のように設定した。94℃で2分間、（94℃で30秒間、48℃で30秒間、72℃で45秒間を）5サイクル、続いて（94℃で30秒間、56℃で30秒間、72℃で45秒間を）30サイクル、そして68℃で8分間の最終工程で終了。上記のようにして366bpの断片が精製された。精製された断片のサンプルをゲル上に搭載して濃度を評価し、そしてその断片を共に混合し、全体の30μl中に700ngのPCR-1、650ngのPCR-2、430ngのPCR-3を含むようにした。この混合液に3μlのEcoPol緩衝液（ニューイングランド・バイオラブス）、3μlの2mM dNTP溶液、および3μlのミリQ水を添加した。得られた混合液を94℃で3分間インキュベートし、その後にPCR装置中で0.5℃/秒の速度で65℃まで冷却した。65℃で10分間のインキュベートに続き、その混合液を毎秒0.05℃の速度で20℃まで更に冷却し、20℃で10分間インキュベートした。その後1μl（5単位）のクレノウ酵素（ニューイングランド・バイオラブス）を添加し、続いて37℃で60分間インキュベートした。5μlのこのクレノウ混合液を鋳型として使用し、下記のように2つの断片を別個に増幅した。プライマーセット1：NF-1およびNcoI-R（表１）を3％の最終濃度までDMSOを添加したPwo DNAポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応中で使用し、その反応に下記の設定のPCR装置を用いた。94℃で2分間、続いて（94℃で30秒間、66℃で30秒間、72℃で3分間を）30サイクル、続いて68℃で8分間の最終インキュベ−ション。プライマーセット2：NcoI-FおよびNR-2（表１）を、3％の最終濃度までDMSOを添加したPwo DNAポリメラーゼ（ロシュ）を用いた反応中で使用し、その反応に下記の設定のPCR装置を用いた。94℃で2分間、続いて（94℃で30秒間、62℃で30秒間、72℃で90秒間を）30サイクル、続いて68℃で8分間の最終インキュベ−ション。得られた2.7kb（プライマーセット1）と1.1kb（プライマーセット2）の断片をジェネクリーンキットを用いてゲルから精製し、それぞれをpCRscriptAmpベクター（ストラタジーン）と結合し、DH10Bエレクトロコンピーテントな細胞中へ形質転換した。これにより、コンストラクトpCRscriptAmp.NFI-NcoIR（図８）とコンストラクトpCRscriptAmp.NcoIF-NR2（図９）が得られる結果となった。その挿入物はブラント末端を含んでいるので、各クローニングについて2つの方向性が得られた。KpnI消化物を使用し、更にクローニングする必要がある方向性が選択された（図８と９を見よ）。その後、正しい増幅を証明するために挿入物の配列決定を行った。次に、BamHIとNcoIを用いてpCRscriptAmp-NcoIF-NR2由来の挿入物の一部分を切り出し、上記のようにゲルから精製した。PCRscriptAmp-NFI-NcoIRを同じ酵素で消化し、断片を含んでいるベクターもゲルから精製した。これらの断片を結合させると、pCR.NF1-NR2（図１０）が得られる結果となった。pCR.NF1-NR2は、Ad35配列のヌクレオチド30162と33234の間にAd35配列を含み、ヌクレオチド31879と32974の間のE4-orf6とE4-orf6/7配列は、公表されたAd5配列（Genbank Accession Number M73260）由来の32968と34077の間に位置しているAd5由来の配列により置換されている。そこで、図１１と図１２に示されたアミノ酸アラインメントに見られるように、クローン化されたE4-orf6蛋白質のアミノ酸配列は、クローン化されたE4-orf6蛋白質のアミノ酸配列はAd5中に見出されるE4-orf6配列と同一であり、E4-orf6/7アミノ酸配列については、Ad5中に存在しているE4-orf6/7アミノ酸配列と大部分が同一である。明らかに、本発明から離れることなく、上記で概説した通常の方法を用いて異なったハイブリッドAd35-Ad5 E4コンストラクトを設計できる。pCR.NF1-NR2由来のこのキメラ挿入物をその後、pWE.Ad35.pIX-rITR中にクローン化し：pCR.NF1-NR2をMluIとNdeIにより消化し、得られた2.8kbの断片をジェネクリーンキットを用いてゲルから精製した。コンストラクトpBr.Ad35.PRnもMluIとNdeIにより消化し、アガロース酵素（ロシュ）を用いてゲルから18kbのベクター断片が単離された。両断片の結合することにより、コンストラクトpBr.Ad35.PR.5Orf6（図１３、ECACC寄託番号P02041227）が得られる結果となった。このコンストラクト中でキメラE4領域を含んでいるPacIとSwaIの間のAd35配列をその後、上記のようにラムダ-ファージ・パッケージングを用いて、コンストラクトpWE.Ad35.pIX-rITR中へクローン化した。その後、得られたpWE.Ad35pIX-rITR.5Orf6（図１４）を、Ad35アダプタープラスミドによってPER.C6パッケージング細胞上で共トランスフェクトすることにより、組み換えたAd35に基づいたウイルスを作製するのに使用した。
実施例４ pWE.Ad35.pIX-rITR△E3、pWE.Ad35.pIX-rITR△E3.5E4およびpWE.Ad35.pIX-rITR△E35Orf6の構築
E3配列を除去することによりAd35骨格を更に改変した。E3蛋白質はアデノウイルス感染に対する宿主免疫反応を調節すると知られており、そのために、組み換えウイルスのインビトロにおける増殖には不必要である。更にE3配列の欠失により、パッケージング効率を妥協することがないベクター中で、より大きな異種配列を挿入することが可能となる。また、アデノウイルスベクターをワクチン接種のベヒクルとして適用するために、E3領域によりコードされる免疫調節的な遺伝子が発現することは好ましくない。pBr.Ad35.PRnプラスミド（図５）の中でE3配列を欠失させるための方法を下記に述べる。
第一にプライマー35E3forと35E3rev（表１）により、製造業者の指示に従ってPwo DNAポリメラーゼ（ロシュ）および鋳型DNAとしてpBr.Ad35.PRnを用いて、PCR産物を作製した。プログラムは、94℃で2分間、および94℃で30秒間、58℃で30秒間、72℃で1分間を30サイクル、続いて68℃で8分間に設定した。増幅された断片は、ヌクレオチド26814から27647までのAd35配列（WO 00/70071を見よ）を含み、3’末端においてMluI部位によりフランキングしている。得られた833bpの断片をキアクイックPCR精製キット（キアゲン）を用いて精製し、MluIとStuIによって消化した。その後消化されたPCR断片を、キアクイック・ゲル抽出キット（キアゲン）を用いてLMPアガロースゲルから精製した。コンストラクトpBr.Ad35.PRnもMluIとStuIによって消化し、断片を含んでいる17.3kbのベクターを、本技術分野で当業者に知られた方法により、アガロース酵素（ロシュ）を用いてアガロースゲルから単離した。両者の単離されたDNAを結合し、最大効率のDH5αコンピーテントな細菌（インビトロゲン/LTI）中へ形質転換し、pBr.Ad35.PRn△E3を与えた（図１５）。欠失した配列はAd35配列のヌクレオチド27648から30320を包含し、2673bpが欠失するという結果となった。その後、ラムダ-ファージ・パッケージング抽出物（ストラタジーン）を用いて、E3欠失物をコンストラクトpWE.Ad35.pIX-rITR中へ導入した。ここで、pWE.Ad35.pIX-rITRとpBr.Ad35.PRn△E3の両者をPacIとSwaIによって消化し、アガロース酵素（ロシュ）を用いて、低融点アガロースゲルから22.8kbと14kbの断片のそれぞれを単離した。STBL-2細胞（インビトロゲン/LTI）を用いてライゲーションとパッケージングを行った後、コンストラクトpWE.Ad35.pIX-rITR△E3が得られた。
上記で述べたE3を欠失したバージョンのE4-改変骨格コンストラクトを構築するために、下記のようにしてpBr.Ad35.PRn△E3コンストラクトの中にE4改変を導入した。コンストラクトpUC.35-5E4（図３）をMluIとNotIにより消化し、ジェネクリーンIIキットを用いて4.7kbの断片をゲルから単離した。コンストラクトpBr.Ad35.PRn△E3もMluIとNotIにより消化し、ジェネクリーンスピンキットを用いて13.6kbのベクター断片をゲルから単離した。これらの断片の結合により、コンストラクトpBr.Ad35.△E3.PR5E4（図１６）が得られる結果となった。コンストラクトpCR.NF1-NR2（図１０）をMluI、NdeIおよびBglI（後者はベクター断片をより小さな断片へ消化するために）により消化し、ジェネクリーンスピンキットを用いて2.8kbの断片をゲルから単離した。コンストラクトpBr.Ad35.PRn△E3をMluIとNdeIにより消化し、CIP酵素（ニューイングランドバイオラブス）を用いて脱リン酸化し、ジェネクリーンスピンキットを用いて15.2kbベクター断片も単離した。これらの断片を結合させることにより、コンストラクトpBr.Ad35.△E3.PR5Orf6が与えられた（図１７）。その後pBr.Ad35.△E3.PR5E4とpBr.Ad35.△E3.PR5Orf6を用いて、中で述べたように、pWE.Ad35.pIX-rITR中の3’ PacI-SwaI断片を、pBr.Ad35.△E3.PR5E4とpBr.Ad35.△E3.PR5Orf6由来の対応する領域と交換した。これにより、pWE.Ad35.pIX-rITR△E3.5E4およびpWE.Ad35.pIX-rITR△E3.Orf6の構築に至った。これらの大きなコスミドを作製する代わりの方法は、パッケージングのためのライゲーション反応中で3つの断片を使用することであり：pWE.Ad35.pIX-rITR由来の14.7kbのNotI-PacI断片、pBr.Ad35.△E3.PR5E4またはpBr.Ad35.△E3.PR5Orf6由来のPacI-NotI挿入物、およびNotI消化されたpWE15コスミドベクター断片（ストラタジーン）である。この後者の断片は、pWE.Ad35.pIX-rITRのNotI/PacI消化物から単離することもできる。
実施例５ PER.C6細胞上でのE1-およびE1/E3-欠失したAd35に基づいたベクターの作製
pBr.Ad35.PRnに基づいたコンストラクトを用いて、相補性細胞株PER.C6上で組み換えAd35ウイルスを産生することを可能とするために、Ad35配列（WO 00/70071）bp 3401からbp 24650を含んでおり、そのためにアダプタープラスミドおよびpBr.Ad35.PRnに基づいたコンストラクトの両者と重複している新たなコンストラクトを、我々は最初に作製した。これら3つのプラスミドのPER.C6細胞中へのトランスフェクションと二重相同的組み換えの事象により、完全なウイルスゲノムと図１８において概説した組み換えウイルスの複製へ至った。pWE.Ad35.pIX-rITRの中のAd35配列の大きな部分を欠失させることにより、必要とされるプラスミドを作った。ここで、pWE.Ad35.pIX-rITRをEcoRVで消化し、断片を含んでいる29kbのベクターを、ジェネクリーン・スピンキットを用いて低融点ゲルから精製した。精製されたDNAを自己結合させ、DH10Bエレクトロコンピーテントな細菌（インビトローゲン/LTI）を形質転換するのに使用し、pWE.Ad35.pIX-EcoRVを得た（図１９）。
トランスフェクションのために使用した全てのDNAを表２に示したように消化し、65℃で15分間熱不活性化し、更に処理をすることなくトランスフェクションに使用した。トランスフェクションの日に先立ってフラスコあたり3×106細胞の密度でPER.C6細胞をT25フラスコに播種し、血清なしのDMEM培地（ギブコ/BRL）中のトランスフェクション混合液を5時間後にPER.C6培養培地（DMEM、10％ウシ胎児血清および10mM MgCl2）に置き換えたことを除き、製造業者の指示に従ってリポフェクタミン（インビトローゲン/LTI）を用いて表２に示されたようにトランスフェクトした。次の日に、蛍光顕微鏡によってトランスフェクション効率は50％であると評価された。2日後、細胞をトリプシン処理し、T80フラスコ中に再播種し、37℃/10％CO2で更にインキュベートした。トランスフェクションから6日後、Ad35.AdApt.eGEF + pWE.Ad35.pIX-rITRでトランスフェクトしたPER.C6細胞を除いて、全ての培養物は十分な細胞変性効果（CPE、ウイルス増殖を示唆する）を示した。1日後、CPEを有するフラスコ中の細胞と培地を回収し、凍結/解凍のサイクルに2回かけ、遠心分離（10分、1500rpm）によって細胞残渣を除き、これらの粗溶解物の100μlを使用し、T80フラスコ中で85％の集密度で新たなPER.C6細胞を再感染させた。CPEの兆候を示さなかったAd35.AdApt.eGEF + pWE.Ad35.pIX-rITRのトランスフェクションをトリプシン処理によって回収し、やはり上記のように処理した。新たなPER.C6細胞を感染させてから2日後に、最初の回収の時にはCPEの兆候を示さなかった一つを除き、全てのフラスコは十分なCPEを示した。これは明らかに、Ad5 E4-orf6遺伝子産物をd35骨格から発現させるときに、十分にE1が欠失したAd35に基づいたウイルスをPER.C6細胞において作ることができることを示している。
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参考文献
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図１は、プラスミドp△MT.Orf6.Hygro（ECACC寄託番号P02041226）の模式図である。明確にするために大文字のDがデルタ（△）を現している。 図２は、プラスミドpAd35.△MT.Orf6の模式図である。明確にするために大文字のDがデルタ（△）を現している。 図３は、pUC.35-5E4の模式図である。 図４は、pUC.35-5E4へ至るクローニング過程の表示である。 図５は、pBr.Ad35.PRnの模式図である。 図６は、pBr.Ad35.PR5E4（ECACC寄託番号P02041229）の模式図である。 図７は、pWE.Ad35.pIX-rITR.5E4の模式図である。 図８は、pCRscriptAmp.NF1-NcoIRの模式図である。 図９は、pCRscriptAmp.NcoIF-NR2の模式図である。 図１０は、pCR.NF1-NR2の模式図である。 図１１は、アデノウイルス抗原型5のE4-Orf6のアミノ酸配列（配列番号２１；上段の配列）と、ヌクレオチドの順序の決定により得られたAd35骨格中へクローン化されたアデノウイルス抗原型5由来のE4-Orf6蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２１；中段の配列；注意せよ、上段配列のAd5のE4-Orf6と同一）、およびアデノウイルス抗原型35のE4-Orf6蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２２；下段の配列）の間のアラインメントを示し、アデノウイルス抗原型35骨格中のE4-Orf6蛋白質をコードする断片全体は、アデノウイルス抗原型5のE4-Orf6蛋白質をコードする断片により置換されていることを示している。 図１２は、アデノウイルス抗原型5のE4-Orf6/7蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２３；上段の配列）と、アデノウイルス抗原型35骨格の中でアデノウイルス抗原型35 E4-Orf6/7断片の対応する部分によって置換されている、アデノウイルス抗原型5 E4-Orf6/7断片によって部分的にコードされた、E4-Orf6/7融合蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２４；中段の配列）、およびアデノウイルス抗原型35のE1-Orf6/7蛋白質のアミノ酸配列（配列番号２５；下段の配列）の間のアラインメントを示し、Orf6/7配列は部分的にキメラ的であり、およそ138の位置のリジン（K）において融合を有することを示している。明確にするために、Orf6+7という表記は読み枠Orf6/7として読むべきであり、それはOrf6とOrf7もまたアデノウイルスのE4領域中の分離した読み枠であって、本技術分野の当業者には良く知られた表記である。 図１３は、pBr.Ad35.PR.5Orf6（ECACC寄託番号P02041227）の模式図である。 図１４は、pWE.Ad35.pIX-rITR.5Orf6の模式図である。 図１５は、pBr.Ad35.PRn△E3の模式図である。明確にするために大文字のDがデルタ（△）を現している。 図１６は、pBr.Ad35.△E3.PR5E4の模式図である。明確にするために大文字のDがデルタ（△）を現している。 図１７は、pBr.Ad35.△E3.PR5Orf6の模式図である。明確にするために大文字のDがデルタ（△）を現している。 図１８は、二重相同的組み換えの事象を通じてPER.C6のような細胞において組み換えアデノウイルス微粒子を作製するためのシステムを示す。 図１９は、pWE.Ad35.pIX-EcoRVの模式図である。
配列表
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Claims (19)

  1. 第１の血清型のアデノウイルスの構造的及び非構造的な要素を備える組換えアデノウイルスベクターであって、前記ベクターは更に、機能的なＥ４−ｏｒｆ６のタンパク質をコード化する配列を備えており、前記配列は、前記第１の血清型とは異なる第２の血清型のアデノウイルスに由来するＥ４−ｏｒｆ６コード化配列であり、前記第１の血清型はアデノウイルス血清型３５であり、前記ベクターはＥ１における欠失をもち、前記Ｅ４−ｏｒｆ６コード化配列は前記ベクターの生産及び組立てのための相補細胞において発現されたＥ１Ｂ−５５Ｋコード化配列と同じ血清型のアデノウイルスに由来する、組換えアデノウイルスベクター。
  2. 前記Ｅ４−ｏｒｆ６コード化配列はサブグループＣのアデノウイルスの血清型に由来する、請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター。
  3. 前記Ｅ４−ｏｒｆ６コード化配列はアデノウイルスの血清型５に由来する、請求項１記載の組換えアデノウイルスベクター。
  4. さらに、非アデノウイルスのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドをコード化する配列を備える、請求項１〜３のいずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター。
  5. 前記非アデノウイルスのタンパク質、ポリペプチド又はペプチドが、次のもの、即ち、細胞死誘導ポリペプチド、病原生物の抗原決定基、癌特異的抗原、ウイルスタンパク質、ホルモン及びサイトカインからなる群より選ばれる、請求項４記載の組換えアデノウイルスベクター。
  6. 第１の血清型のアデノウイルスの構造的及び非構造的な要素を備える組換えアデノウイルスベクターを生産するための方法であって、前記方法は次の工程、即ち
    （ａ）第２の血清型のアデノウイルスに由来するＥ１Ｂ−５５Ｋコード化配列を発現可能な形態において収容する相補細胞を、前記相補細胞による前記組換えアデノウイルスの組立てを許容するようなアデノウイルスの必要な要素と共に提供する工程であり、前記要素は、前記第２の血清型とは異なる前記第１の血清型のアデノウイルスからの少なくとも若干の構造的及び非構造的な要素、及び機能的なＥ４−ｏｒｆ６のタンパク質をコード化する配列であって、前記相補細胞において前記発現可能なＥ１Ｂ−５５Ｋのタンパク質と適合するものを備える工程、
    （ｂ）前記相補細胞を、媒体において、アデノウイルスベクターの生産及び組立てが起こるのを許容する条件下に培養する工程、及び
    （ｃ）媒体及び／又は相補細胞からそのようにして生産される組換えアデノウイルスベクターを収集する工程であり、適合するＥ４−ｏｒｆ６のタンパク質をコード化する配列が、そのようにして生産される組換えアデノウイルスベクターにおいて存在する工程
    を具え、前記第１の血清型はアデノウイルス血清型３５であり、前記ベクターはＥ１における欠失をもち、前記Ｅ４−ｏｒｆ６コード化配列は前記Ｅ１Ｂ−５５Ｋコード化配列と同じ血清型のアデノウイルスに由来する、方法。
  7. 前記第２の血清型はサブグループＣのアデノウイルスの血清型である、請求項６記載の方法。
  8. 前記第２の血清型はアデノウイルスの血清型５である、請求項７記載の方法。
  9. 前記Ｅ１Ｂ−５５Ｋコード化配列は前記相補細胞のゲノム中に組込まれる、請求項６〜８のいずれか１項記載の方法。
  10. 前記相補細胞は、初代の、二倍体のヒト細胞、又はその原種の細胞から導き出される細胞である、請求項６〜９のいずれか１項記載の方法。
  11. 前記相補細胞は、初代ヒト網膜芽細胞（retinoblast cell）、初代ヒト胚腎臓細胞、初代ヒト神経細胞、又は初代ヒト羊膜細胞から導き出される、請求項６〜１０のいずれか１項記載の方法。
  12. 前記相補細胞は、そのゲノム中に組込まれる、少なくとも１種のアデノウイルスＥ１Ａのタンパク質をコード化する核酸を備える、請求項６〜１１のいずれか１項記載の方法。
  13. 少なくとも１種のアデノウイルスＥ１Ａのタンパク質をコード化する前記核酸は、サブグループＢとは異なるサブグループのアデノウイルスの血清型に由来する、請求項１２記載の方法。
  14. 少なくとも１種のアデノウイルスＥ１Ａのタンパク質をコード化する前記核酸は、サブグループＣのアデノウイルスの血清型に由来する、請求項１２記載の方法。
  15. 少なくとも１種のアデノウイルスＥ１Ａのタンパク質をコード化する前記核酸は、アデノウイルスの血清型５に由来する、請求項１３記載の方法。
  16. 前記相補細胞はＰＥＲ．Ｃ６細胞である、請求項６記載の方法。
  17. 製薬上の組成物であって、請求項１〜５のいずれか１項記載の、又は請求項６〜１６のいずれか１項記載の方法によって得られ得る組換えアデノウイルスベクターを備える、組成物。
  18. 人体を処置するためのキットであって、請求項１〜５のいずれか１項記載の組換えアデノウイルスベクター、又は請求項１７記載の製薬上の組成物を、人体に投与するために備える、キット。
  19. キットのパーツであって、次のもの、即ち
    （ａ）第１の血清型のアデノウイルスの構造的及び非構造的な要素を備える組換えアデノウイルスベクターを生産するための相補細胞であり、前記細胞は、第２の血清型のアデノウイルスに由来するＥ１Ｂ−５５Ｋコード化配列を発現可能な形態において収容するもの、及び
    （ｂ）前記相補細胞による前記組換えアデノウイルスベクターの組立てを許容するようなすべての必要なアデノウイルスの要素を備える１種又はそれよりも多い複製可能な核酸ベクターであり、前記要素は、前記第２の血清型とは異なる前記第１の血清型のアデノウイルスからの少なくとも若干の構造的及び非構造的な要素、及び機能的なＥ４−ｏｒｆ６のタンパク質をコード化する配列であって、前記相補細胞において前記発現可能なＥ１Ｂ−５５Ｋのタンパク質に適合するものを備えるもの
    を具え、前記第１の血清型はアデノウイルス血清型３５であり、前記ベクターはＥ１における欠失をもち、前記Ｅ４−ｏｒｆ６コード化配列は前記Ｅ１Ｂ−５５Ｋコード化配列と同じ血清型のアデノウイルスに由来する、キットのパーツ。
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