CN107753941A - 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗 - Google Patents

基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗 Download PDF

Info

Publication number
CN107753941A
CN107753941A CN201610696322.3A CN201610696322A CN107753941A CN 107753941 A CN107753941 A CN 107753941A CN 201610696322 A CN201610696322 A CN 201610696322A CN 107753941 A CN107753941 A CN 107753941A
Authority
CN
China
Prior art keywords
ebola
research
vaccine
ebovgp
carrier
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Pending
Application number
CN201610696322.3A
Other languages
English (en)
Inventor
周东明
万里明
宋宇峰
杨茜
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Wuxi Sinosbio Biomedical Technology Co ltd
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Original Assignee
Wuxi Sinosbio Biomedical Technology Co ltd
Institut Pasteur of Shanghai of CAS
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Wuxi Sinosbio Biomedical Technology Co ltd, Institut Pasteur of Shanghai of CAS filed Critical Wuxi Sinosbio Biomedical Technology Co ltd
Priority to CN201610696322.3A priority Critical patent/CN107753941A/zh
Publication of CN107753941A publication Critical patent/CN107753941A/zh
Pending legal-status Critical Current

Links

Classifications

    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K39/00—Medicinal preparations containing antigens or antibodies
    • A61K39/12—Viral antigens
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N15/00—Mutation or genetic engineering; DNA or RNA concerning genetic engineering, vectors, e.g. plasmids, or their isolation, preparation or purification; Use of hosts therefor
    • C12N15/09—Recombinant DNA-technology
    • C12N15/63—Introduction of foreign genetic material using vectors; Vectors; Use of hosts therefor; Regulation of expression
    • C12N15/79—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts
    • C12N15/85—Vectors or expression systems specially adapted for eukaryotic hosts for animal cells
    • C12N15/86—Viral vectors
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2710/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA dsDNA viruses
    • C12N2710/00011—Details
    • C12N2710/10011—Adenoviridae
    • C12N2710/10041—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector
    • C12N2710/10043—Use of virus, viral particle or viral elements as a vector viral genome or elements thereof as genetic vector
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N2760/00—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA ssRNA viruses negative-sense
    • C12N2760/00011—Details
    • C12N2760/14011—Filoviridae
    • C12N2760/14111—Ebolavirus, e.g. Zaire ebolavirus
    • C12N2760/14134—Use of virus or viral component as vaccine, e.g. live-attenuated or inactivated virus, VLP, viral protein

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Mycology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Plant Pathology (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

本发明涉及基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗。本发明首次基于复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体构建了新型埃博拉病毒疫苗载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗，所述的埃博拉病毒疫苗制备简单、成本低、安全性好，无需添加佐剂。

Description

基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗
技术领域
本发明属于免疫学领域，更具体地，本发明涉及基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗。
背景技术
埃博拉病毒病(Ebola virus disease，EVD)也称为埃博拉出血热(Ebolahemorrhagic fever，EHF)是由埃博拉病毒(Ebola virus，EBOV)引起的高致命性传染病。1976年，埃博拉出血热首次在刚果民主共和国(前Zaire)的Yambuku地区和苏丹的Nzara地区同时爆发，此后，埃博拉病毒在全球范围内造成多次流行。2014-2016年在西非多个国家，包括几内亚、利比亚、塞拉利昂和尼日利亚等，出现了有史以来规模最大、感染和死亡人数最多的一次埃博拉出血热大爆发。据世界卫生组织(WHO)的统计数据，截止到2016年3月27日，此次爆发共有28,646例感染包括确诊和疑似病例，其中共11,323例死亡，病死率高达39.5％。可见，博拉病毒的流行或爆发在世界范围内造成了严重的公共卫生问题。
埃博拉病毒属于丝状病毒科(Filoviridae)、埃博拉病毒属(Ebolavirus)的无节段、有包膜、单股负链的RNA病毒。埃博拉病毒属共有5种亚型的病毒，包括本迪布焦型(Bundibugyoebolavirus，BDBV)，扎伊尔型(Zaire ebolavirus，EBOV)，苏丹型(Sudanebolavirus，SUDV)，雷斯顿型(Reston ebolavirus，RESTV)，塔伊森林型(Forestebolavirus，TAFV)。其中扎伊尔型埃博拉病毒的感染性最强，爆发的次数最多，死亡的人数也最多，此次西非爆发的也是由这一型病毒引起。
埃博拉病毒的基因组全长约为19kb，其结构为3’-UTR-NP-VP35-VP40-GP-VP30-VP24-L-5’-UTR.，包括两端的非翻译区(UTR)，还编码7种蛋白：核蛋白(NP)、聚合酶辅助因子(VP35，VP40)、糖蛋白(GP)、转录激活因子(VP30，VP24)、RNA聚合酶(L)。作为埃博拉病毒包膜表面上唯一的结构蛋白，GP棘突能与宿主细胞的受体结合介导病毒吸附以及与宿主细胞膜的融合。GP糖蛋白是诱导特异性中和抗体的主要免疫原，并且对于埃博拉病毒的致病性有至关重要影响，因此几乎所有埃博拉疫苗的开发都是利用GP糖蛋白；而且不同型埃博拉病毒的GP蛋白，在DNA序列和氨基酸序列都有很高的保守性。
至今尚无商业化的埃博拉疫苗，相关的疫苗研究进入临床阶段的包括：复制型病毒载体疫苗、复制缺陷型病毒载体疫苗、DNA疫苗和重组蛋白等。以Merck Sharp&DohmeCorp，NewLink Genetics和Public Health Agency of Canada共同开发的rVSV-ZEBOV作为代表的复制型病毒载体疫苗已经进入临床Ⅲ期，单次免疫具有很好的免疫原性，但存在安全性问题；由Glaxo Smith Kline和NIH联合研发的ChAd3.EBOZ/ChAd3.EBO为代表的复制缺陷型腺病毒载体疫苗已进入临床II期，不存在安全性方面的问题，但需要二次免疫以增加其免疫原性；基于复制缺陷型腺病毒载体的疫苗还有Ad26-ZEBOV、Ad5-EBOV等也已进入临床研究；以VRC-EBODNA023-00-VP、VRC-EBODNA012-00-VP和VRC-MARDNA025-00-VP等为代表的DNA重组疫苗进入临床I期，但其免疫时需要电穿孔技术及二次免疫。
埃博拉病毒属于一些危险性很高的病毒，本领域有必要对其进行深入的研究，制备出具有良好效果的埃博拉病毒疫苗。
发明内容
本发明的目的在于提供基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗。
在本发明的第一方面，提供一种埃博拉病毒疫苗，所述埃博拉病毒疫苗由如下方法制备获得：将埃博拉病毒疫苗载体进行包装，加工获得具有免疫原性的埃博拉病毒疫苗；较佳地，将病毒转染病毒生产细胞，从而病毒在细胞内包装；其中，所述的埃博拉病毒疫苗载体是复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，且其中包含埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)的表达盒(表达元件)。
在一个优选例中，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；较佳地，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。
在另一优选例中，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC7基因组序列，其中E1和E3缺失；较佳地，部分E1编码区与全部E3编码区被删除，E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点。
在另一优选例中，所述的埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)的表达盒***到所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I中。
在另一优选例中，所述的埃博拉病毒疫苗载体具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种埃博拉病毒疫苗载体，其是复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，且其中含有埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)的表达盒(表达元件)。
在一个优选例中，所述的埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
在另一优选例中，所述的埃博拉病毒疫苗载体具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
在本发明的另一方面，提供一种药盒，所述的药盒中含有所述的埃博拉病毒疫苗；较佳地，所述的药盒中同时含有所述的埃博拉病毒疫苗。
在本发明的另一方面，提供一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括：所述的埃博拉病毒疫苗载体。
在一个优选例中，所述试剂盒还包括：病毒生产细胞。
在另一优选例中，所述的病毒生产细胞是可以实现病毒包装的细胞；较佳地包括：HEK293细胞，293T细胞。
本发明的其它方面由于本文的公开内容，对本领域的技术人员而言是显而易见的。
附图说明
图1、重组黑猩猩腺病毒质粒图谱。
A、重组黑猩猩腺病毒质粒DNA pAdC68-EBOVgp；
B、重组黑猩猩腺病毒质粒DNA pAdC7-EBOVgp。
图2、重组黑猩猩腺病毒质粒构建与酶切鉴定。
A、1质粒DNA pUC57-EBOVgp经Xba I和Kpn I双酶切后的电泳图。
B、2为pShuttle-EBOVgp质粒DNA经I-Ceu I、PI-Sce I和Nsi I酶切后的电泳图。
C、3，4，5为重组腺病毒质粒DNA pAdC68-EBOVgp分别用Bgl II、Xho I、Mfe I酶切后的电泳图，6，7，8为重组腺病毒质粒DNA pAdC7-EBOVgp分别用Bgl II、Xho I、Mfe I酶切后的电泳图。
图3、Western Blot检测重组黑猩猩腺病毒表达EBOVgp。其中，检测用抗体为6D8。
图4、小鼠免疫实验时间表。
1)第0周初免小鼠，采用肌肉注射，第2周二免小鼠，同样采用肌肉注射；
2)分别在第0周，第2周(初免后两周)，第4周(二免后两周)和第6周(二免后四周)经眼睑取血；
3)将小鼠分为6个免疫处理组：第1组，初免注射重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp，二免注射PBS；第2组，初免注射黑猩猩腺病毒对照AdC68-empty，二免注射PBS；第3组，初免注射重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp，二免注射PBS；第4组，初免注射黑猩猩腺病毒对照AdC7-empty，二免注射PBS；第5组，初免注射重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp，二免注射重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp；第6组，空白对照组，初免，二免均注射PBS。
图5、小鼠血清ELISA检测结果。
A.初免2周后取不同处理组的小鼠血清检测抗埃博拉GP蛋白特异性抗体的表达水平；
B.4周(二免2周)后取不同处理组的小鼠血清检测抗埃博拉GP蛋白特异性抗体的表达水平；
C.6周(二免4周)后取不同处理组的小鼠血清检测抗埃博拉GP蛋白特异性抗体的表达水平；
D.免疫重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp后取不同时间点的小鼠血清检测抗埃博拉GP蛋白特异性抗体的表达水平；
E.免疫重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp后取不同时间点的小鼠血清检测抗埃博拉GP蛋白特异性抗体的表达水平；
F.初免为重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp，2周后加强免疫为重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp，检测不同时间点小鼠血清中抗埃博拉GP蛋白特异性抗体水平。
具体实施方式
本发明人经过深入的研究，首次基于复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒(载体)构建了新型埃博拉病毒疫苗载体。所述的疫苗载体可应用于制备可高效表达且具有良好免疫原性的病毒疫苗。
本发明利用复制缺陷型黑猩猩腺病毒质粒构建了新型埃博拉病毒疫苗载体。
作为一种优选方式，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；较佳地，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。针对腺病毒AdC68基因组，应用酶切位点I-CeuI和PI-Sce I作为外源基因的***位点，从而不会导致在腺病毒表达载体的其它位置造成剪切。较佳地，包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的制备方法为：将黑猩猩腺病毒AdC68基因组分成4个片段，依次装入到骨架载体中，并且，用连接序列替换AdC68基因组中E1的大部份编码序列；所述的4个片段分别是：黑猩猩腺病毒AdC68基因组第1-6025位；黑猩猩腺病毒AdC68基因组第6026-17279位；黑猩猩腺病毒AdC68基因组第17280-34196位；和黑猩猩腺病毒AdC68基因组第34197-36519位。
作为一种优选方式，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC7基因组序列，其中E1和E3缺失；较佳地，部分E1编码区与全部E3编码区被删除，E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点。所述的删除部分E1编码区是指删除野生型AdC7基因组中第458-3026位的序列。较佳地，E3区的全部序列被删除，也即删除野生型AdC7基因组中第27094-31799位的序列。较佳地，制备包括改造的黑猩猩腺病毒AdC7基因组序列的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的方法包括：(1)将来源于pNEB193的origin序列、来源于AdC7腺病毒基因组的LITR片段、来源于AdC7腺病毒基因组的Nde I-Age I片段通过融合PCR融合成片段OLN，用Spe I与Age I酶切片段OLN；用Nde I、Age I与Spe I酶切AdC7腺病毒基因组，将切下的片段Age(4028)-SpeI(10610)与已酶切过的片段OLN相连接形成质粒pOIN；(2)用Hind III和Avr II酶切AdC7基因组，将切下的目的片段Hind III(7153)-Avr II(23363)***到质粒pOIN的Hind III和Avr II位点中，获得的质粒命名为pOINH；(3)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中31800-36535之间的片段，在5’端引入Avr II与Rsr II酶切位点，在3’端引入Pac I与Asis I位点，将扩增的片段***到pOINH的Avr II与Asis I位点中，获得的质粒命名为pOINHR；和(4)从AdC7腺病毒基因组中扩增位于AdC7腺病毒基因中23165-27093之间的片段，在3’端引入Rsr II位点，将扩增的片段***到pOINHR的Avr II与Rsr II位点中，获得复制缺陷型的重组腺病毒表达载体。
由于黑猩猩腺病毒在人群中不流行，因此本发明的疫苗不会受人体中预存抗人血清型腺病毒中和抗体的影响，其免疫效果将优于常见人血清型腺病毒(如Ad5)为载体的疫苗；其次，AdC68和AdC7的免疫原性与Ad5类似，优于Ad26，因此，本发明的新型埃博拉疫苗不仅具有原创性，而且将具有较好的免疫原性和免疫保护效果。此外，腺病毒载体疫苗制备简单、成本低、安全性好，无需添加佐剂，可采用肌肉免疫、口服免疫或鼻腔免疫等免疫途径，将具有良好的市场竞争性。
本发明还提供了密码子优化的埃博拉病毒糖蛋白(EBOVgp)抗原的编码序列，如SEQ ID NO:1所示，其能够实现高效的表达。在密码子优化方面，本发明人遵循密码子在人细胞中的优势表达原则的基础上，还进行了个性化、独特的优化。经过综合考虑和特异性选择，使密码子优化后与优化前的重要参数达到最佳状态。
本发明中，所述的“包含埃博拉病毒糖蛋白的表达盒”是指包含有表达埃博拉病毒糖蛋白所需的所有必要元件的基因表达***，通常其包括以下元件：启动子、编码埃博拉病毒糖蛋白的基因序列，终止子；此外还可选择性包括信号肽编码序列等。这些元件是操作性相连的。
本发明还提供了一种制备埃博拉病毒疫苗的方法，所述方法包括：将埃博拉病毒疫苗载体进行包装，加工获得具有免疫原性的埃博拉病毒疫苗。
获得所述埃博拉病毒疫苗载体后，将之转染病毒生产细胞，进行病毒的繁殖。转染后的一段时间后，可以收获病毒。作为本发明的优选方式，收获的病毒可反复感染病毒生产细胞，持续传代。病毒滴度的测定可以根据本领域常规方法进行。
本发明还提供了一种用于制备疫苗的试剂盒，所述试剂盒包括所述的埃博拉病毒疫苗载体。
所述的试剂盒还可包括病毒生产细胞，如HEK293细胞。此外，所述的试剂盒中还可包括说明疫苗制备方法的使用说明书。
在本发明的具体实施例中，本发明人构建了表达扎伊尔型埃博拉病毒糖蛋白的两种重组黑猩猩腺病毒，即AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp，并通过酶切重组腺病毒质粒DNA、测定重组腺病毒滴度、鉴定目的糖蛋白的表达、免疫小鼠、测定免疫后小鼠血清中特异性抗体反应等实验，验证两种候选疫苗即AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp的免疫原性。结果证明，本发明人成功构建并鉴定了基于黑猩猩腺病毒载体的新型埃博拉候选疫苗AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp。然后，分别将AdC68-EBOVgp、AdC7-EBOVgp免疫小鼠，免疫2周、4周后小鼠血清中可检测到高滴度的抗埃博拉病毒特异性抗体；此外本发明人用AdC7-EBOVgp初次免疫小鼠，2周后再用AdC68-EBOVgp加强免疫小鼠，初免2周、加强免疫后2周、4周后都能检测到抗埃博拉病毒的特异性抗体。
目前市场上尚未成功获得临床可应用的埃博拉疫苗。本发明中采用的黑猩猩腺病毒具有高免疫原性，不仅能诱导特异性体液免疫反应，而且能诱导特异性细胞免疫反应，此外，不会受人体内预存抗人血清型腺病毒中和抗体的影响，因此是一种理想的疫苗载体。以此研发的新型埃博拉疫苗将诱导理想的免疫保护反应。本发明两种不同黑猩猩腺病毒载体的埃博拉疫苗，可作为初免-加强免疫使用。本发明人发现，使用AdC7-EBOVgp初免、间隔一段时间后(2周左右)，用AdC68-EBOVgp作为加强免疫，这样可以诱导更好的免疫反应和免疫保护效果。
下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如J.萨姆布鲁克等编著，分子克隆实验指南，第三版，科学出版社，2002中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。
材料与方法
1、实验材料
各种限制性内切酶、T4DNA连接酶、DNA ladder获自New England Biolabs。
质粒小提试剂盒获自TIANGEN Biotech。胶回收试剂盒获自xygen Biosciences。质粒中提试剂盒获自MACHEREY-NAGEL。
复制缺陷型黑猩猩腺病毒空载质粒pAdC68-empty(参见201310362921.8专利中的E1缺失的复制缺陷型腺病毒载体pAdC68(pAdC68-E1-deleted))和pAdC7-empty(pAdC7(参见201310364528.2专利中的pAdC7-ΔE1ΔE3)。
人胚胎肾细胞HEK 293获自中科院上海生科院细胞库。
转染试剂Lipofectamine2000获自Invitrogen。
抗埃博拉GP蛋白的6D8抗体和埃博拉GP蛋白参见Hart,M.K.,J.A.Wilson,andA.L.Schmaljohn.Oct.7,2003 2003.Monoclonal antibodies to Ebola glycoprotein.USpatent US 6,630,144B1。
氯化铯、脱盐柱、HRP标记的抗人和抗鼠IgG获自Sigma-Aldrich。
BALB/c雌性小鼠获自上海斯莱克动物实验中心。
2、重组黑猩猩腺病毒质粒构建及酶切鉴定
根据NCBI上公布的2014年从埃博拉病人体内分离的埃博拉扎伊尔株病毒序列(GI:674810552)，将其中编码EBOVgp蛋白的基因(GenBank:KJ660347.2，SEQ ID NO:4)进行密码子优化，并于5’端加入Xba I酶切位点(tctaga)和Kozak序列(gccacc)，3’端加入Kpn I酶切位点(ggtacc)。
本发明人发现，如将EBOVgp原始基因重组的质粒转入HEK293细胞，其密码子的翻译效率很低，从而导致重组黑猩猩腺病毒的表达量减少。经过大量的研究比较，本发明人针对EBOVgp在人(human)中表达进行了密码子优化并设计了独特的优化策略，如下：
(1)将原始序列中的PolyT(TTTTTT)结构域和抗病毒模块(Antiviral Motifs)等CIS作用位点(cis-acting sites)优化为没有，因为这些结构会影响核糖体的结合效率及mRNA的稳定性。
(2)将密码子适应指数(Codon Adaptation Index,CAI)提高为0.93，CAI为1.0认定为极好，CAI大于0.8认定为好。并调整了优化密码子的频率(Frequency of OptimalCodons)分布。
(3)将平均GC含量优化为57.55％，从而延长mRNA的半衰期。
(4)重复序列的调整(Remove Repeat Sequences)：将原始的最大直接重复(MaxDirect Repeat)调整为大小13、距离552、频率2。
(5)增加了高效翻译起始的Kozak序列(GCCACC)和高效翻译终止密码子(TGA)。
利用酶切将经密码子优化的EBOVgp片段克隆入pShuttle(Clonetech)载体，然后利用I-Ceu I和PI-Sce I酶切将包含CMV启动子的整个表达元件分别克隆入pAdC68和pAdC7载体中，获得重组腺病毒质粒DNA，即pAdC68-EBOVgp和pAdC7-EBOVgp。
用Bgl II、Xho I和Mfe I对重组腺病毒质粒pAdC68-EBOVgp和pAdC7-EBOVgp进行酶切鉴定。
3、重组黑猩猩腺病毒的包装和扩增
首先使用Pac I单酶切重组黑猩猩腺病毒质粒pAdC68-EBOVgp、pAdC7-EBOVgp和空载质粒pAdC68-empty、pAdC7-empty，将线性化的质粒用转染试剂Lipofectamine 2000转染密度为80％的HEK293细胞。转染前，换成无抗生素培养基，加入DNA/脂质体复合物，转染后5h换成正常的培养基。
在显微镜下每日观察细胞病变，当细胞出现明显病变且60％出现噬斑时收集细胞，在室温与-80℃超低温冰箱之间反复冻融3次，3500rpm/min离心5min，收集上清，感染HEK293细胞，感染24小时后按以上方法收获病毒，经3-4次扩增，最终收获约1.0L感染的HEK293细胞，经反复冻融3次，获得含有病毒的上清。
4、重组黑猩猩腺病毒纯化和滴度检测
取上述重组黑猩猩腺病毒上清，用氯化铯密度梯度离心，并使用脱盐柱纯化后获得大量的重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp，AdC7-EBOVgp，AdC68-empty及AdC7-empty。
用Nanodrop分光光度计测得重组黑猩猩腺病毒在A260的吸光值，将测得的吸光值乘以1.1×1012即获得重组黑猩猩腺病毒的滴度(vp/ml)，将重组黑猩猩腺病毒加入甘油分装冻存于-80℃超低温冰箱。
5、Western Blot检测EBOVgp表达
取不同滴度的重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp，AdC7-EBOVgp，AdC68-empty及AdC7-empty分别感染HEK293细胞，感染24小时后，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞，离心取上清。取适量蛋白上清与5×上样缓冲液混合，煮沸冷却后进行SDS-PAGE电泳，电泳结束后，将凝胶上的蛋白转印到PVDF膜上。转膜完成后，用5％的脱脂牛奶封闭2小时，用TBST将膜清洗3次后加入6D8抗埃博拉GP蛋白的抗体或β-Actin的抗体4℃孵育过夜。第2天将膜用TBST清洗3次后加入HRP标记的抗人IgG二抗室温作用1小时，用TBST将膜清洗3次后加入适量ECL化学发光剂，用LAS4000扫描分析仪获得western显影结果。
6、小鼠免疫实验
6-8周龄BALB/c雌性小鼠分为6组：
第1组，第0周初免，肌肉注射重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)，第2周二免肌肉注射相同体积的PBS；
第2组，第0周初免，肌肉注射黑猩猩腺病毒对照AdC68-empty(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)，第2周二免肌肉注射相同体积的PBS；
第3组，第0周初免，肌肉注射重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)，第2周二免肌肉注射相同体积的PBS；
第4组，第0周初免，肌肉注射黑猩猩腺病毒对照AdC7-empty(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)，第2周二免肌肉注射相同体积的PBS；
第5组，第0周初免，肌肉注射重组黑猩猩腺病毒AdC7-EBOVgp(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)，第2周二免，肌肉注射重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp(1×1010vp/只，左右腿各注射50ul)；
第6组，空白对照组，第0周初免、第2周二免均肌肉注射相同体积的PBS。
分别于第0周、第2周(初免后两周)、第4周(二免后两周)，第6周(二免后四周)经眼睑收集小鼠血清。
7、小鼠血清ELISA检测
采用ELISA检测免疫重组黑猩猩腺病毒后的小鼠产生的特异性抗体。用埃博拉病毒GP蛋白(100ng/孔)包被ELISA板，4℃孵育过夜。第2天，PBST洗板3次后用10％脱脂牛奶(200ul/孔)室温封闭1小时，PBST洗板3次后加入不同稀释度(1:10，1:100，1:1000，1:5000，1:10000)小鼠血清100ul，室温孵育2小时，PBST洗板5次后，每孔加入100ul经1:5000稀释的HRP标记的羊抗鼠IgG，室温孵育1小时，PBST洗板7次后每孔加入50ul TMB显色液，室温避光作用10分钟，每孔加入50ul1M磷酸终止反应。用Thermo多功能酶标仪测定样品在OD450的读数。
实施例1、重组黑猩猩腺病毒质粒DNA pAdC68-EBOVgp和pAdC7-EBOVgp的构建及病毒滴度检测
如图1所示，将EBOVgp的整个表达元件含CMV启动子和ploy A尾，分别克隆至AdC68和AdC7载体，以获重组黑猩猩腺病毒质粒DNA，即pAdC68-EBOVgp(图1A)和pAdC7-EBOVgp(图1B)。
pAdC68-EBOVgp的全长核苷酸序列如SEQ ID NO:2；pAdC7-EBOVgp的全长核苷酸序列如SEQ ID NO:3。
首先本发明人将EBOVgp片段(图2A得到的片段)克隆入pShuttle载体，然后利用I-Ceu I和PI-Sce I将整个表达元件(图2B得到的片段)分别克隆入AdC68和AdC7载体，并用多种酶切鉴定(图2C)，表明本发明人成功构建重组腺病毒质粒DNA pAdC68-EBOVgp和pAdC7-EBOVgp。经密码子优化并合成的EBOVgp的DNA序列如SEQ ID NO:1所示。
重组黑猩猩腺病毒经扩增、纯化及检测，两种重组腺病毒的滴度分别为AdC68-EBOVgp，6.82×1012vp/ml；AdC7-EBOVgp，2.5×1012vp/ml。
实施例2、重组黑猩猩腺病毒的EBOVgp蛋白的表达检测
本发明人用108，109，1010vp的重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp，以及109，1010vp的AdC68-empty及AdC7-empty空载对照分别感染HEK293细胞，感染24小时后，用含蛋白酶抑制剂的蛋白裂解液冰上裂解细胞，离心取蛋白上清，然后利用Western检测EBOVgp蛋白的表达。如图3所示，不同滴度的AdC68-empty及AdC7-empty空载对照感染的HEK293细胞检测不到EBOVgp表达；而感染109，1010vp的重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp的HEK293细胞均能检测到明显表达的EBOVgp蛋白。密码子优化后的EBOVgp序列用于重组黑猩猩腺病毒载体能够高效的表达。
上述结果说明，本发明人成功获得表达埃博拉病毒糖蛋白的重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp。
实施例3、小鼠免疫重组黑猩猩腺病毒后抗埃博拉GP蛋白的特异性抗体检测
本发明人按照图4所示的小鼠免疫时间表免疫不同处理组的小鼠。结果如图5所示，初免2周后AdC68-EBOVgp组(初免AdC68-EBOVgp，二免PBS)和AdC7-EBOVgp组(初免AdC7-EBOVgp，二免PBS)的小鼠血清中能检测到较高滴度的抗埃博拉GP蛋白特异性抗体(图5A)；4周(二免2周)后AdC68-EBOVgp组，AdC7-EBOVgp组和AdC7-EBOVgp+AdC68-EBOVgp组(初免AdC7-EBOVgp，二免AdC68-EBOVgp)的小鼠血清中同样能检测到较高滴度的抗埃博拉GP蛋白特异性抗体(图5B)；6周(二免4周)后AdC68-EBOVgp组，AdC7-EBOVgp组和AdC7-EBOVgp+AdC68-EBOVgp组的小鼠血清中依然能检测到较高滴度的抗埃博拉GP蛋白特异性抗体(图5C)；而相应的对照组(初免、二免均使用PBS)，AdC68-empty组(初免AdC68-empty、二免PBS)，AdC7-empty组(初免AdC7-empty、二免PBS)组均无法诱导特异性抗体的产生(图5A、5B、5C)。
上述结果说明，重组腺病毒黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp、AdC7-EBOVgp具有较好的免疫原性，能诱导特异性抗埃博拉病毒抗体。
在图5D、5E、5F中，本发明人比较了AdC68-EBOVgp组，AdC7-EBOVgp组和AdC7-EBOVgp+AdC68-EBOVgp组在不同的时间点，即初免2周，4周(二免2周)，6周(二免4周)后的小鼠血清中特异性抗体水平，可以发现4周，6周后小鼠血清中能检测到相比2周后更高滴度特异性抗体。这说明重组黑猩猩腺病毒AdC68-EBOVgp，AdC7-EBOVgp可以采用初免-加强免疫的策略以获得更强的免疫效果。
讨论
目前尚无商业化埃博拉疫苗，亦无其它有效的防治措施。为应对可能再次爆发的埃博拉病毒疫情，加快研发新型埃博拉疫苗成为当务之急。本发明人利用复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体成功构建并鉴定了新型埃博拉候选疫苗AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp。然后，本发明人采用单次或者初免-加强免疫的策略免疫小鼠，检测免疫后不同时点小鼠血清中抗埃博拉GP蛋白的特异性抗体，结果显示AdC68-EBOVgp和AdC7-EBOVgp单次免疫就能诱导良好的特异性免疫，初免-加强免疫后能诱导更强的特异性免疫反应。因此，本发明不仅提供两种新型埃博拉候选疫苗，而且提供了不同的免疫策略，为埃博拉疫苗的研制成功奠定了基础。
在本发明提及的所有文献都在本申请中引用作为参考，就如同每一篇文献被单独引用作为参考那样。此外应理解，在阅读了本发明的上述讲授内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或修改，这些等价形式同样落于本申请所附权利要求书所限定的范围。

Claims (12)

1.一种埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述埃博拉病毒疫苗由如下方法制备获得：将埃博拉病毒疫苗载体进行包装，加工获得具有免疫原性的埃博拉病毒疫苗；其中，所述的埃博拉病毒疫苗载体是复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，且其中包含埃博拉病毒糖蛋白的表达盒。
2.如权利要求1所述的埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC68基因组序列，其中E1缺失；较佳地，E1的大部份编码序列由连接序列替换；所述的连接序列中设置酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I。
3.如权利要求1所述的埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体包括改造的黑猩猩腺病毒AdC7基因组序列，其中E1和E3缺失；较佳地，部分E1编码区与全部E3编码区被删除，E1删除区增添I-Ceu I与PI-Sce I酶切位点。
4.如权利要求1所述的埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述的埃博拉病毒糖蛋白具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
5.如权利要求2或3所述的埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述的埃博拉病毒糖蛋白的表达盒***到所述的复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体的酶切位点I-Ceu I和PI-Sce I中。
6.如权利要求1所述的埃博拉病毒疫苗，其特征在于，所述的埃博拉病毒疫苗载体具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
7.一种埃博拉病毒疫苗载体，其特征在于，其是复制缺陷型黑猩猩腺病毒载体，且其中含有埃博拉病毒糖蛋白的表达盒。
8.如权利要求7所述的埃博拉病毒疫苗载体，其特征在于，所述的埃博拉病毒糖蛋白具有SEQ ID NO:1所示的核苷酸序列。
9.如权利要求7所述的埃博拉病毒疫苗载体，其特征在于，所述的埃博拉病毒疫苗载体具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3所示的核苷酸序列。
10.一种药盒，其特征在于，所述的药盒中含有权利要求1-6任一所述的埃博拉病毒疫苗；较佳地，所述的药盒中同时含有权利要求2和3所述的埃博拉病毒疫苗。
11.一种用于制备疫苗的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒包括：权利要求7-9任一项所述的埃博拉病毒疫苗载体。
12.如权利要求11所述的试剂盒，其特征在于，所述试剂盒还包括：病毒生产细胞。
CN201610696322.3A 2016-08-19 2016-08-19 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗 Pending CN107753941A (zh)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610696322.3A CN107753941A (zh) 2016-08-19 2016-08-19 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN201610696322.3A CN107753941A (zh) 2016-08-19 2016-08-19 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗

Publications (1)

Publication Number Publication Date
CN107753941A true CN107753941A (zh) 2018-03-06

Family

ID=61262907

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN201610696322.3A Pending CN107753941A (zh) 2016-08-19 2016-08-19 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN107753941A (zh)

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410375A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 苏州相奕生物技术有限公司 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用
CN112760341A (zh) * 2020-07-13 2021-05-07 中国科学院微生物研究所 重组载体、包装有该重组载体的黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用

Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101014613A (zh) * 2004-01-23 2007-08-08 P·安杰莱蒂分子生物学研究所 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
US20130101618A1 (en) * 2010-04-16 2013-04-25 Okairos Ag Chimpanzee adenoviral vector-based filovirus vaccines
CN103923943A (zh) * 2013-08-19 2014-07-16 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN105483140A (zh) * 2016-01-31 2016-04-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗

Patent Citations (5)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN101014613A (zh) * 2004-01-23 2007-08-08 P·安杰莱蒂分子生物学研究所 黑猩猩腺病毒疫苗载运体
US20130101618A1 (en) * 2010-04-16 2013-04-25 Okairos Ag Chimpanzee adenoviral vector-based filovirus vaccines
CN103923943A (zh) * 2013-08-19 2014-07-16 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法
CN103937835A (zh) * 2013-08-19 2014-07-23 中国科学院上海巴斯德研究所 一种基于腺病毒AdC68的表达载体及其构建方法
CN105483140A (zh) * 2016-01-31 2016-04-13 中国人民解放军军事医学科学院生物工程研究所 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的埃博拉病毒病疫苗

Non-Patent Citations (7)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
BAIZE,S.等: "Zaire ebolavirus isolate H.sapiens-wt/GIN/2014/Makona-Gueckedou-C07, complete genome", 《GENBANK》 *
DAPHNE A STANLEY等: "Chimpanzee adenovirus vaccine generates acute and durable protective immunity against ebolavirus challenge", 《NAT MED》 *
ELAHEH SABAGHIAN等: "In Silico Design of a Multimeric Polytope as a Highly munogenic DNA Vaccine Against Human Cytomegalovirus", 《JOURNAL OF APPLIED BIOTECHNOLOGY REPORTS》 *
KOBINGER, GP等: "Chimpanzee adenovirus vaccine protects against Zaire Ebola virus", 《VIROLOGY》 *
OLGADE SANTISMRES等: "Safety and immunogenicity of a chimpanzee adenovirus-vectored Ebola vaccine in healthy adults: a randomised, double-blind, placebo-controlled, dose-finding, phase 1/2a study", 《LANCET INFECT DIS》 *
XI YANG等: "Chimpanzee adenoviral vector prime-boost regimen elicits potent immune responses against Ebola virus in mice and rhesus macaques", 《EMERG MICROBES INFECT》 *
杨茜: "基于黑猩猩腺病毒载体的新型埃博拉疫苗研究", 《万方医学网》 *

Cited By (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112410375A (zh) * 2019-08-22 2021-02-26 苏州相奕生物技术有限公司 腺病毒载体AdC68XY、由其包装的病毒及应用
CN112760341A (zh) * 2020-07-13 2021-05-07 中国科学院微生物研究所 重组载体、包装有该重组载体的黑猩猩腺病毒在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用

Similar Documents

Publication Publication Date Title
RU2733832C1 (ru) Искусственный ген Stbl_RBD_TrM_SC2, кодирующий бицистронную структуру, образованную последовательностями рецепторсвязывающего домена гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2, трансмембранного региона, P2A-пептида и гликопротеина G VSV, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-Stbl_RBD_TrM_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
Mayr et al. Development of replication-defective adenovirus serotype 5 containing the capsid and 3C protease coding regions of foot-and-mouth disease virus as a vaccine candidate
Sun et al. Molecular characterization of infectious clones of the minute virus of canines reveals unique features of bocaviruses
Havenga et al. Novel replication-incompetent adenoviral B-group vectors: high vector stability and yield in PER. C6 cells
CN111218459A (zh) 一种以人复制缺陷腺病毒为载体的重组新型冠状病毒疫苗
Carter et al. Identification and sequence determination of the capsid protein gene of feline calicivirus
RU2733834C1 (ru) Искусственный ген EctoS_SC2, кодирующий эктодомен гликопротеина S коронавируса SARS-CoV-2 с C-концевым тримеризующим доменом, рекомбинантная плазмида pStem-rVSV-EctoS_SC2, обеспечивающая экспрессию искусственного гена, и рекомбинантный штамм вируса везикулярного стоматита rVSV-EctoS_SC2, используемый для создания вакцины против коронавируса SARS-CoV-2
CN109536461B (zh) 一种o型***病毒突变株及其制备方法和应用
Sanz-Parra et al. Evidence of partial protection against foot-and-mouth disease in cattle immunized with a recombinant adenovirus vector expressing the precursor polypeptide (P1) of foot-and-mouth disease virus capsid proteins.
CN104962580B (zh) 一种重组植物弹状病毒载体及其构建方法
CN103923943B (zh) 一种基于腺病毒AdC7的表达载体及其构建方法
CN106317208B (zh) 猴源gii.17型诺如病毒p结构域及其变体的目的蛋白
CN107190013A (zh) 一种以人Ad5复制缺陷型腺病毒为载体的寨卡病毒病疫苗
Belsham Influence of the Leader protein coding region of foot-and-mouth disease virus on virus replication
CN108504686A (zh) 一种表达非洲猪瘟病毒ep153r基因重组腺病毒载体、构建方法及重组腺病毒制备方法
CN103966263A (zh) 一种重组人3型腺病毒及其制备方法和应用
WO2023050484A1 (zh) 一种表达载体、重组腺相关病毒及其在制备2019新型冠状病毒疫苗中的应用
CN103468743B (zh) 一种狂犬病疫苗及其制备方法
CN110951699A (zh) 表达犬瘟热病毒结构蛋白的重组狂犬病病毒及其应用
CN110551757A (zh) 一种复制缺陷型重组人4型腺病毒及其制备方法和应用
CN107753941A (zh) 基于黑猩猩腺病毒载体的埃博拉病毒疫苗
CN110951778B (zh) 犬瘟热病毒CDV-3株感染性cDNA克隆及其构建方法和应用
CN108514635A (zh) 重组三价腺病毒疫苗及其构建方法
Kim et al. Full-length ORF2 sequence-based genetic and phylogenetic characterization of Korean feline caliciviruses
CN106636001B (zh) 一种重组肠道病毒表型混合***的构建方法和应用

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication

Application publication date: 20180306

WD01 Invention patent application deemed withdrawn after publication