JP2022027498A - さまざまなウイルスのための多重迅速検出キットおよび方法 - Google Patents

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Abstract

【課題】高感度、良好な特異性、高速、簡単、且つ安価という利点を備え、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルスを検出し得る多重迅速検出キット及びその調整方法を提供する。【解決手段】ヒトＡＣＥ２の遺伝子のＣ末端を人工的に設計された配列とするステップ；前記人工的に設計された配列をＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築するステップ；前記ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立するステップ；前記安定トランスフェクト細胞株を培養し増殖させるステップ；前記ＡＣＥ２融合タンパク質を含む培養上清を回収するステップ；前記培養上清からＡＣＥ２融合タンパク質を得るステップ；前記ＡＣＥ２融合タンパク質からＡＣＥ２－ビオチンを得るステップ；等により調製されるウイルス多重迅速検出キットとする。【選択図】図１

Description

［関連出願］
本出願は、２０２０年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５０，７１７号、２０２０年７月１０日に出願された米国仮特許出願第６３／０５０，７２２号、および２０２０年３月２７日に出願されたＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／０８１６３６号明細書、ならびにＰＣＴ出願番号ＰＣＴ／中国特許出願公開第２０２０／０８１６３６号明細書が優先権を主張する２０２０年２月２６日に出願された中国国内特許の利益を主張するものであり、かかるすべての出願は、以下に具体的に記載する部分を含むがこれに限定されないその全体が参照により本明細書に援用され、この参照による援用は以下を例外として行われる：上記の出願のいずれかの部分が本出願と矛盾する場合、本出願は上記の仮出願に優先する。
［連邦政府による資金提供を受けた研究開発の記載］
該当なし。
配列表は本明細書の一部であり、かつ参照により本明細書に援用される。
本開示は特にバイオテクノロジーの領域に関する。具体的には、本開示はウイルス検出のシステムと方法に関する。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、ヒトに感染することが知られている７番目のコロナウイルスである。残りの６つは、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、およびＭＥＲＳ－ＣｏＶである。研究から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、およびＨＣｏＶ－ＮＬ６３は、ウイルスのスパイク糖タンパク質（Ｓタンパク質）の媒介により、ウイルスと宿主細胞膜上のＡＣＥ２受容体との相互作用を通じてヒトに感染することがわかっている。新型コロナウイルス感染症（ＣＯＶＩＤ－１９）は、新型コロナウイルス感染による急性呼吸器感染症である。一般的な症状は発熱で、乾性咳、疲労、呼吸困難などの症状を伴う。頭痛、めまいなどの症状を訴える人もいるが、特に目立った症状を示さない人もいる。ＭＥＲＳ－ＣｏＶはサブグループＣに属するコロナウイルスである。感染後、中東呼吸器症候群（ＭＥＲＳ）を引き起こす。ＭＥＲＳウイルス感染は大部分が中東で発生する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２と異なり、ＭＥＲＳ－ＣｏＶはエンベロープＳタンパク質と宿主細胞膜上のＤＰＰ４受容体との相互作用によりヒトに感染する。
インフルエンザはインフルエンザウイルスによって引き起こされる急性気道感染症である。感染力が強く、伝播速度が速い疾患である。典型的な臨床症状は、急性高熱、全身痛、著明な疲労、および軽度の呼吸器症状である。一般に秋冬に発生率が高く、合併症を引き起こし、死亡事象は非常に深刻である。この疾患はインフルエンザウイルスによって引き起こされ、Ａ型（Ａ）・Ｂ型（Ｂ）・Ｃ型（Ｃ）の３種類に分類できる。Ａ型ウイルスは抗原変異が頻繁に起こり、感染性で、急速に伝播し、広範な流行病が発生しやすい。
ＣＯＶＩＤ－１９とＭＥＲＳとインフルエンザの症状は区別が難しく、重大な交差反応を示す検査キットもある。そのため、自宅で使用できながらも、ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、およびインフルエンザを迅速に区別できる検出キットの開発は、コロナウイルスおよびインフルエンザウイルスの世界的な流行や伝染病監視にとって非常に重要である。
例示的な実施形態は、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットを含み得る。キット法が、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を含むことを特徴とし、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質の調製方法は以下のステップを含む：
１．１ ヒトＡＣＥ２遺伝子のＣ末端を、ＡＶＩタグ配列および６×Ｈｉｓタグに順に接続させ、人工的に設計された配列を形成した。人工的に設計された配列は宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングした。ＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、これをＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。
１．２ ステップ１．１で構築したＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立した。安定トランスフェクト細胞を培養、増殖させ、ＡＣＥ２融合タンパク質を含む上清を回収した。
１．３ Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋カラムなどのＨｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムによって、ステップ１．２で調製した培養上清からＡＣＥ２融合タンパク質を得て、ＡＣＥ２タンパク質を得た。
１．４ ステップ１．３で得たＡＣＥ２タンパク質は、ビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＣ末端で部位特異的ビオチン化した。また、ＡＣＥ２－ビオチンを得た。
１．５ ストレプトアビジンＳＡは、カルボキシル基を有する着色ラテックスと結合させ、Ｌ－ＳＡを得た。ステップ１．４で得たＡＣＥ２－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２を得た。
本出願／特許ファイルは、カラーで作成された少なくとも１つの図面を含む。カラー図面を含む本特許または特許出願公開のコピーは、請求のうえ必要な料金を支払うことにより米国特許庁から提供される。
ｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰのプラスミドマップである。 ｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰのプラスミドマップである。 本明細書で考察する実施形態に従ったＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型およびＢ型インフルエンザウイルス検査キットの検出原理の概略図を示す。 本明細書に記載する実施形態による試料検査ストリップを示す。
本明細書に開示する実施形態は、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットのための装置および方法を含む。本明細書に開示する実施形態は、１種または複数種のウイルス、本明細書に教示するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルスを検出し得る。
本開示に従った原理の理解を促進する目的で、以下に、本明細書に記載する実施形態を参照し、特定の言語を用いてこれを説明していく。しかしながら、それにより本開示の範囲が限定されるものではないことが理解されよう。本明細書に例示する本発明の特徴の任意の変更およびさらなる改変、ならびに本明細書に例示する本開示の原理の任意の追加的な適用は、本開示を所持する当業者であれば通常なし得るものであり、請求する開示の範囲内で考慮され得る。
本発明のウイルス迅速検査キットを開示し、説明する前に、本開示は、本明細書に開示する特定の構成、プロセスステップ、および材料に限定されず、したがって構成、プロセスステップ、および材料が多少異なる場合があることを理解されたい。また、本開示の範囲は、添付の特許請求の範囲およびその等価物によってのみ限定されるため、本明細書で使用する用語は、特定の実施形態を説明する目的でのみ使用され、限定することを意図していないことも理解されたい。
本明細書および添付の特許請求の範囲で使用する単数形「ａ」、「ａｎ」、および「ｔｈｅ」は、文脈上別段の明示がない限り、複数の指示対象を含むことに留意する必要がある。
本開示の説明および特許請求にあたり、以下の用語は、以下に記載する定義に従って使用する。
本明細書で使用する用語「構成する」、「含む」、「含有する」、「特徴とする」、およびこれらの文法的等価物は、追加的な未記載の要素または方法のステップを除外しない総称またはオープンエンドの用語である。
本明細書で使用する句「から成る」およびその文法的等価物は、請求項に記載されていない任意の要素、ステップ、または成分を除外する。
本明細書で使用する句「から本質的に成る」およびその文法的等価物は、請求の範囲を、特定の材料またはステップ、および請求された開示の基本的かつ新規の１つまたは複数の特徴に実質的に影響を与えないものに限定する。
用語「重量百分率」、「重量パーセント」、および「重量％」はすべて、構成成分の濃度を、構成成分の重量を組成物の重量で除したものに１００を乗じて表す。本明細書で言及する重量％および定量的な用語は、１～２、２～３、１～３の範囲、およびその間のすべての値を含むものとみなされるべきである。したがって、重量％が１０である場合、７および１３の値、およびこれらの間のすべての値を含み得る。
既存の技術における前述の技術的課題を鑑みて、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットを本明細書に開示する。いくつかの実施形態は、コロナウイルスのスパイクタンパク質に２つのサブユニット、Ｓ１およびＳ２を含み得、Ｓ１サブユニットはリガンドとして働き、ヒト細胞膜上の受容体と相互作用して特異的結合を形成する。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２は、そのＳ１タンパク質（リガンド）がヒト細胞膜上のＡＣＥ２受容体と高親和性で特異的に結合することにより、ヒト細胞に侵入する（ＫＤの測定値が１５ｎＭで、ＳＡＲＳ－ＣｏＶより１０～２０倍高い）。サンドイッチ法の免疫クロマトグラフィー原理に従って、いくつかの実施形態では組み換えヒトＡＣＥ２タンパク質を用いて、抗Ｓタンパク質モノクローナル抗体の１つを交換して着色ラテックスで標識し、検査ストリップの剥離パッドにこれを噴霧する。
いくつかの実施形態では、検査ストリップ上のＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２検査線（Ｔ線）をＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質で被覆し、これを用いて、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２とラテックス標識したＡＣＥ２の複合体をクロマトグラフィーで捕獲する。検査試料にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在すれば、Ｔ線は着色ラテックス凝集を生じる。検査試料にＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が存在しなければ、Ｔ線は発色しない。ＭＥＲＳ－ＣｏＶは、そのＳ１タンパク質（リガンド）がヒト細胞膜上のＤＰＰ４受容体と特異的に結合することにより、ヒト細胞に侵入する。同様に、例示的な実施形態に従って、組み換えヒトＤＰＰ４タンパク質を用いて、抗Ｓ１タンパク質モノクローナル抗体の１つを交換して着色ラテックスで標識し、検査ストリップの剥離パッドにこれを噴霧する。検査ストリップ上のＭＥＲＳ－ＣｏＶ検査線をＭＥＲＳ－ＣｏＶポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質で被覆し、これを用いて、ＭＥＲＳ－ＣｏＶとラテックス標識したＤＰＰ４の複合体をクロマトグラフィーで捕獲し得る。実施形態は、検査試料にＭＥＲＳ－ＣｏＶが存在すれば、Ｔ線は着色ラテックス凝集を生じ、検査試料にＭＥＲＳ－ＣｏＶが存在しなければ、Ｔ線の色が発色しないように構成し得る。
いくつかの例示的な実施形態は、Ａ型インフルエンザ検査を含み得る。Ａ型インフルエンザ検査では、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体、抗ＩＦＶＡ ｍＡｂ（捕獲）をそれぞれ着色ラテックスで標識し、検査ストリップの剥離パッドにこれを噴霧し得る。検査ストリップ上のＡ型インフルエンザ検査線を抗ＩＦＶＡ ｍＡｂ（検出）で被覆し、これを用いて、Ａ型インフルエンザウイルスとラテックス抗ＩＦＶＡ ｍＡｂ（捕獲）の複合体をクロマトグラフィーで捕獲し得る。いくつかの実施形態では、検出時に検査試料にＡ型インフルエンザウイルスが存在すれば、Ｔ線は着色ラテックス凝集を生じる。検査試料にＡ型インフルエンザウイルスが存在しなければ、Ｔ線は発色しなくてもよい。いくつかの実施形態では、Ｂ型インフルエンザの検査に同様の手順を使用し得る。
いくつかの例示的な実施形態では、検査キットは２つの検査ストリップを含む（図３参照）。検査ストリップの１つで、ニトロセルロース（ＮＣ）膜上の検査領域（Ｔ１）に抗ＩＦＶＡ ｍＡｂ（検出）を被覆し、検査領域（Ｔ２）に新型コロナウイルス抗体のウサギ抗Ｓ１タンパク質を被覆し、対照領域（Ｃ１）にヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を被覆し得る。ラテックス標識したＡＣＥ２タンパク質、ラテックス標識した抗ＩＦＶＡ ｍＡｂ（捕獲）、およびラテックス標識したウサギＩｇＧを剥離パッドに埋め込み得る。もう１つの検査ストリップで、ニトロセルロース（ＮＣ）膜上の検査領域（Ｔ３）に抗ＩＦＶＢ ｍＡｂ（検出）を被覆し、検査領域（Ｔ４）にＭＥＲＳ－ＣｏＶ抗体のウサギ抗Ｓ１タンパク質を被覆し、対照領域（Ｃ２）にヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を被覆し得る。ラテックス標識したＤＰＰ４タンパク質、ラテックス標識した抗ＩＦＶＢ ｍＡｂ（捕獲）、およびラテックス標識したウサギＩｇＧを剥離パッドに埋め込み得る。
いくつかの例示的な実施形態では、検査方法は、試料を試料ウェルに投入するステップを含み得る。他の例示的な実施形態では、方法は試料約３滴を添加するステップを含み得、試料は毛細管現象により下部から上部に側方に流動し得る。試料がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有している場合、ラテックス標識したＡＣＥ２タンパク質はウイルスのＳ１タンパク質と結合し得、次いで、検査領域（Ｔ２）に被覆された抗Ｓ１タンパク質抗体に捕獲され得、Ｔ２線が現れ得る。試料がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を含有していない場合、ラテックス標識したＡＣＥ２タンパク質は、検査領域（Ｔ２）に被覆された抗Ｓ１タンパク質抗体に捕獲されなくてもよく、したがってＴ２線が現れなくてもよい。
いくつかの例示的な実施形態では、試料がＡ型インフルエンザウイルスを含有していない場合、ラテックス標識したＡ型インフルエンザモノクローナル抗体は、クロマトグラフィープロセスで、検査領域（Ｔ１）に被覆されたＡ型インフルエンザモノクローナル抗体によって捕獲、結合されなくてもよく、Ｔ１領域に線が現れない。試料がＡ型インフルエンザウイルスを含有している場合、ラテックス標識したＡ型インフルエンザモノクローナル抗体は、まず試料中のＡ型インフルエンザウイルスと結合し得る。次いでクロマトグラフィープロセス中に、Ｔ１領域に被覆されたＡ型インフルエンザモノクローナル抗体と結合し得、Ｔ１領域に着色線が現れ得る。
試料がＢ型インフルエンザウイルスを含有していない場合、ラテックス標識したＢ型インフルエンザモノクローナル抗体は、クロマトグラフィープロセスで、検査領域（Ｔ３）に被覆されたＢ型インフルエンザモノクローナル抗体によって捕獲、結合されなくてもよく、Ｔ３領域に線が現れなくてもよい。試料がＢ型インフルエンザウイルスを含有している場合、ラテックス標識したＢ型インフルエンザモノクローナル抗体は、まず試料中のＢ型インフルエンザウイルスと結合し得る。次いでクロマトグラフィープロセス中に、Ｔ３領域に被覆されたＢ型インフルエンザモノクローナル抗体と結合し得、Ｔ３領域に着色線が現れ得る。
試料がＭＥＲＳウイルスを含有していない場合、ラテックス標識したウサギ抗ＭＥＲＳウイルスＳ１タンパク質ポリクローナル抗体は、クロマトグラフィー中に、Ｔ４領域に被覆されたＤＰＰ４によって捕獲、結合されなくてもよく、Ｔ４領域に線が現れなくてもよい。試料がＭＥＲＳウイルスを含有している場合、ラテックス標識したウサギ抗ＭＥＲＳウイルスＳ１タンパク質ポリクローナル抗体は、まず試料中のＭＥＲＳウイルスと結合し得る。次いでクロマトグラフィープロセス中に捕獲され、Ｔ４領域に被覆されたＤＰＰ４と結合し得る。Ｔ４領域に着色線が現れ得る。
対照領域（Ｃ）はヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体で被覆され得、試料中に新型コロナウイルス／ＩＦＶＡ／Ｂ／ＭＥＲＳ－ＣｏＶが存在するか否かにかかわらず、ラテックス標識したウサギＩｇＧは、Ｃ領域に被覆されたヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体と結合し得、Ｃ線が現れ得る。
いくつかの例示的な実施形態では、検査終了時に、Ｔ線上で結合したラテックスタンパク質の量は、試料中の新型コロナウイルス、ＩＦＶＡ、ＩＦＶＢ、またはＭＥＲＳ－ＣｏＶの濃度に比例し得るのに対し、対照線Ｃ上で結合したラテックスの量は、試料中のウイルスの量とは無関係であり得る。
本開示の例示的な実施形態には、速く、簡単で、安価で、安定し、かつヒトＡＣＥ２受容体と相互作用する新型コロナウイルススパイクタンパク質Ｓ１リガンドに基づいた、自宅で実施できる検査を提供するという利点に加え、モノクローナル抗体の開発サイクルが長く、抗体と交差反応を起こすという問題が回避されるという利点があり、そのため検出の特異性が改善され、効果的なキットが迅速に提供される。実施形態は、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２およびそのすべての変異体の検出に好適であり得る。このウイルスは、Ｓ１タンパク質の変異（例えばＤ６１４Ｇ）によって感染力の強い変異体となり、ＡＣＥ２受容体とより強く結合することがわかっている。ゆえに、ＡＣＥ２受容体に基づいた本明細書に記載する検出キットの例示的な実施形態は、そのような変異体に対して感度がより高い可能性がある。ＭＥＲＳ－ＣｏＶを検出するのにＤＰＰ４受容体を用いる実施形態も良好な感度と特異性を有し得、抗体検出を用いることによる交差反応を回避し得る。一般市民には、インフルエンザをＣＯＶＩＤ－１９やＭＥＲＳと区別することは難しい。したがって、１つのストリップで同時にＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、Ａ型・Ｂ型インフルエンザを検査できる、本明細書の例示的な実施形態に記載するキットを開発することは有益である。
キットの例示的な実施形態は、図３に示すように、１つの検査キットに二重のストリップを含む１つまたは複数のストリップを含み得る。ストリップで、ＣＯＶＩＤ－１９、ＭＥＲＳ、Ａ型インフルエンザ、およびＢ型インフルエンザ、ならびにこれらの組み合わせを含むがこれに限定されない、本明細書に示す１つまたは複数のウイルスの検査をし得る。
新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キット法が着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を含み得ることを特徴とし、いくつかの実施形態では、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質の調製方法は以下のステップを含み得る：
１）ヒトＡＣＥ２遺伝子のＣ末端を、ＡＶＩタグ配列および６×Ｈｉｓタグに順に接続させ、人工的に設計された配列を形成し得る。人工的に設計された配列は、宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングし得る。ＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し得、これをＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。
２）ステップ１）で構築したＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立し得る。安定トランスフェクト細胞の培養および増殖、ＡＣＥ２融合タンパク質を含有する上清の回収をさらに行い得る。
３）ステップ２）で調製した培養上清からタンパク質精製カラムによってＡＣＥ２融合タンパク質を得ることができ、またＡＣＥ２タンパク質を得ることができる。いくつかの実施形態では、タンパク質精製カラムは、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋カラムなどのＨｉｓタグ親和性カラムであり得る。
４）ステップ３）で得たＡＣＥ２タンパク質は、ビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＣ末端で部位特異的ビオチン化し、ＡＣＥ２－ビオチンを得ることができる。
５）ストレプトアビジンＳＡはカルボキシル基で着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＳＡを得ることができる；ステップ４）で得たＡＣＥ２－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、それによりＬ－ＳＢ－ＡＣＥ２を得ることができる。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キット法が着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質を含み得ることを特徴とし、いくつかの実施形態では、着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質の調製方法は以下のステップを含み得る：
１）ヒトＤＰＰ４遺伝子のＮ末端を、ラット成長ホルモンシグナルペプチド、６×Ｈｉｓタグ、およびＡＶＩタグ配列に順に接続させ、人工的に設計された配列を形成し得る。人工的に設計された配列は、宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングし得る。６×Ｈｉｓタグ－ＡＶＩタグ－ＤＰＰ４融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し得、これをＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。
２）ステップ１）で構築したＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立し得る。方法は、安定トランスフェクト細胞を培養し、増殖させるステップ、およびＤＰＰ４融合タンパク質を含有し得る上清を回収するステップをさらに含み得る。
３）ステップ２）で調製した培養上清からタンパク質精製カラムによってＤＰＰ４融合タンパク質を得ることができ、またＤＰＰ４タンパク質を得ることができる。実施形態は、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋カラムなどのＨｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムを含み得る。
４）ステップ３）で得たＤＰＰ４タンパク質は、ビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＮ末端で部位特異的ビオチン化し得る。また、ＤＰＰ４－ビオチンを得ることができる。
５）ストレプトアビジンＳＡはカルボキシル基で着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＳＡを得ることができ；ステップ４）で得たＤＰＰ４－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４を得ることができる。
さらにいくつかの実施形態では、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、ヒトＡＣＥ２遺伝子がヒトＡＣＥ２の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０４６５６９．１のパート１－７３９ａａのコード化遺伝子配列であり；ヒトＤＰＰ４遺伝子がヒトＤＰＰ４の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ８９６７２２．１のパート２９－７６６ａａであり；ＡＶＩタグ配列がＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥであり；コドンがヒト宿主に最適化され得；ベクターがレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰであり得；構築したＡＣＥ２融合タンパク質のプラスミドが本明細書においてｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰと命名され得；構築したＤＰＰ４融合タンパク質のプラスミドが本明細書においてｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰと命名されることを特徴とし得る。
ＡＣＥ２融合タンパク質の人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されており、その翻訳されたタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されている。添付の配列表を参照のこと。
ＤＰＰ４融合タンパク質の人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されており、その翻訳されたタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されている。添付の配列表を参照のこと。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、トランスフェクションのための細胞株がＨＥＫ２９３またはＣＨＯである可能性があり；ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株が本明細書においてＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３またはＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯと命名され；ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株が本明細書においてＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３またはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯと命名されることを特徴とし得る。
安定トランスフェクト細胞株の確立プロセスは以下であり得る：ｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰプラスミド、ｐＨ１プラスミド、およびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージング細胞２９３Ｖに共トランスフェクトして、ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製し、またＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスでＨＥＫ２９３またはＣＨＯをトランスフェクトする。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、部位特異的ビオチン化が、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）で；ＤＰＰ４タンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮ末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）で行われ得ることを特徴とし得る。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、カルボキシル着色ラテックスをＥＤＣ／ＮＨＳ架橋剤で活性化させた後、ストレプトアビジン（ＳＡ）をペプチド結合によりラテックスに結合させて、Ｌ－ＳＡを得ることができ；ＡＣＥ２－ビオチンタンパク質をストレプトアビジン－ビオチン反応によってＬ－ＳＡに結合させ、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を得ることができ、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２と命名することを特徴とし得る。同じプロセスに従ってＬ－ＳＢ－ＤＰＰ４を得ることができる。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋剤活性化カルボキシル着色ラテックス、抗Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶＡ）抗体（捕獲）、抗Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶＢ）抗体（捕獲）、およびウサギＩｇＧを使用するステップも含み得るキットにおいて説明される特徴を有し得、これらはそれぞれペプチド結合により着色ラテックスに結合させて、Ｌ－ＩＦＶＡ、Ｌ－ＩＦＶＢ、およびＬ－ウサギＩｇＧを得ることができる。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キットが２つのクロマトグラフィーストリップも含み得ることを特徴とし得る。ストリップは、底部ライニング、ニトロセルロース（ＮＣ）膜、試料パッド、剥離パッド、および吸収紙を含み得る。試料パッド、剥離パッド、ＮＣ膜、および吸収紙は底部ライニングの上に組み合わせ得、その中で剥離パッドおよび吸収紙はＮＣ膜のいずれかの端部上に積み重ね得、また試料パッドは剥離パッドの上に積み重ね得る。
ストリップのうちの１つで、Ｌ－ＩＦＶＡ、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２、およびＬ－ウサギＩｇＧを混合し、ストリップの剥離パッド上に噴霧し得；その剥離パッドから吸収紙まで、検査線領域Ｔ１（Ａ型インフルエンザウイルス）、Ｔ２（新型コロナウイルス）、および対照線領域Ｃ１を連続的にＮＣ膜上に設置し得る。また、それぞれ抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（検出型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）で被覆し得る。このストリップはストリップＡと命名し得る。
もう１つのストリップで、Ｌ－ＩＦＶＢ、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４、およびＬ－ウサギＩｇＧを混合し、ストリップの剥離パッド上に噴霧し得；その剥離パッドから吸収紙まで、検査線領域Ｔ３（Ｂ型インフルエンザウイルス）、Ｔ４（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および対照線領域Ｃ２を順にＮＣ膜上に設置し得る。また、それぞれ抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（検出型）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）で被覆し得る。このストリップはストリップＢと命名し得る。
いくつかの実施形態では、検査ストリップＡおよびＢは、二重ストリップカード上に組み合わせ得る。新型コロナウイルス、ＭＥＲＳ、およびＡ型・Ｂ型インフルエンザウイルスの４－ｉｎ－１迅速検出キットを構築し得る。このうち、新型コロナウイルスおよびＡ型インフルエンザウイルスはストリップＡ上で検出でき、ＭＥＲＳおよびＢ型インフルエンザウイルスはストリップＢ上で検出できる。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、検査の際に、試薬プレートの２つの試料孔それぞれに試料を投入すると、約３～１５分以内に、Ａ型インフルエンザウイルスのＴ１、新型コロナウイルスのＴ２、Ｂ型インフルエンザウイルスのＴ３、またはＭＥＲＳウイルスのＴ４を目視で観察し得、対応するＴ線が現れたものが陽性であり、現れなければ陰性であることを特徴とする。
さらに、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キットが、便、尿、呼吸器分泌物、口腔粘液、涙、および環境試料の検出に好適であり得ることを特徴とし得る。新型コロナウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型インフルエンザ、およびＢ型インフルエンザウイルスに適用して迅速に検出し、４つのウイルス性伝染病を同時に約３～１５分以内に特定することができる。これは、病院検査、在宅検査、疫学調査、大規模スクリーニングおよび診断に、ならびにコロナウイルスやインフルエンザウイルスアウトブレイクの世界的監視に使用できる。
いくつかの例示的な実施形態では、キットは、キットのストリップのバイオセイフティが改善されていること、すなわち、リボヌクレアーゼを１つまたは複数の試料パッド前処理溶液に添加し、１つまたは複数の試料でウイルスを抑制または不活性化したことを特徴とし得る。試料パッド前処理溶液中のリボヌクレアーゼの濃度は、約０．１～１Ｕ／ｍＬであり得る。
図４に示すように、例示的な実施形態は、検査ストリップ４００、試料パッド４０２、吸収紙４０４、底部ライニング４０６、ニトロセルロース膜４０８、剥離パッド４１０を含み得る。試料パッド４０２、剥離パッド４１０、ニトロセルロース膜４０８、および吸収紙４０４は、図４に示すように、底部ライニング４０６上に配置し得る。剥離パッド４１０および吸収紙４０４はニトロセルロース膜４０８の両端部上に、それぞれをニトロセルロース膜４０８の各端部に重ねてさらに配置し得、また試料パッド４０２は、剥離パッド４１０の端部上に、剥離パッド４１０の前記端部に重ねて配置し得、このとき剥離パッド４１０の前記端部はニトロセルロース膜４０８の端部上にない。いくつかの例示的な実施形態では、試料は試料投入口４１２を通じてキットに入れ得る。試料は、矢印４２２に示すように横の流れ方向に流動し得る。
いくつかの例示的な実施形態では、検査ストリップ４００は、ニトロセルロース膜４０８上に第１の対照線領域４１４、ニトロセルロース膜４０８上に第１の検査線領域４１６、ニトロセルロース膜４０８上に第２の検査線領域４１８、およびニトロセルロース膜４０８上に第３の検査線領域４２０をさらに有し得る。図３など他の実施形態では、キット内に１つよりも多い検査ストリップを有し得、図３および４に示すよりも多いまたは少ない、１つまたは２つの検査線領域を含む検査線領域を有し得る。キット中の各検査ストリップは対照線領域を有し得る。いくつかの例示的な実施形態では、第１の検査線領域４１６は、第１の対照線領域４１４とともに連続的に配置し得、このとき第１の対照線領域４１４は、第１の検査線領域４１６と比べて吸収紙４０４の近くに配置されている。第２の検査線領域４１８は、第１の対照線領域４１４と比べて吸収紙４０４から遠くに配置し得る。ウイルス検査の結果が陽性であれば、本明細書に教示するように、それが第１の対照線領域４１４の着色線と一致すれば、各検査領域に着色線で示される。
明細書の追加支持
実施形態１：新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キット。キット法が、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を含み、また着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質の調製方法が、以下のステップを含むことを特徴とする：
１．１ ヒトＡＣＥ２遺伝子のＣ末端を、ＡＶＩタグ配列および６×Ｈｉｓタグに順に接続させ、人工的に設計された配列を形成した。人工的に設計された配列は宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングした。ＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、これをＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。
１．２ ステップ１．１で構築したＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立した。安定トランスフェクト細胞を培養、増殖させ、ＡＣＥ２融合タンパク質を含む上清を回収した。
１．３ Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋カラムなどのＨｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムによって、ステップ１．２で調製した培養上清からＡＣＥ２融合タンパク質を得て、ＡＣＥ２タンパク質を得た。
１．４ ステップ１．３で得たＡＣＥ２タンパク質は、ビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＣ末端で部位特異的ビオチン化した。また、ＡＣＥ２－ビオチンを得た。
１．５ ストレプトアビジンＳＡは、カルボキシル基を有する着色ラテックスと結合させ、Ｌ－ＳＡを得た。ステップ１．４で得たＡＣＥ２－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２を得た。
実施形態２：新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キット。キット法が、着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質を含み、また着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質の調製方法が、以下のステップを含むことを特徴とする：
２．１ ヒトＤＰＰ４遺伝子のＮ末端を、ラット成長ホルモンシグナルペプチド、６×Ｈｉｓタグ、およびＡＶＩタグ配列に順に接続させ、人工的に設計された配列を形成した。人工的に設計された配列は、宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングした。６×Ｈｉｓタグ－ＡＶＩタグ－ＤＰＰ４融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、これをＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。
２．２ ステップ２．１で構築したＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立した。安定トランスフェクト細胞を培養、増殖させ、ＤＰＰ４融合タンパク質を含む上清を回収した。
２．３ ステップ２．２で調製した培養上清から、Ｎｉ２＋またはＣｏ２＋カラムなどのＨｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムによってＤＰＰ４融合タンパク質を得て、ＤＰＰ４融合タンパク質を得た。
２．４ ステップ２．３で得たＤＰＰ４タンパク質は、ビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＮ末端で部位特異的ビオチン化した。また、ＤＰＰ４－ビオチンを得た。
２．５ ストレプトアビジンＳＡはカルボキシル基で着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＳＡを得て；ステップ２．４で得たＤＰＰ４－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４を得た。
実施形態３：実施形態１および２に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、ヒトＡＣＥ２遺伝子がヒトＡＣＥ２の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０４６５６９．１のパート１－７３９ａａのコード化遺伝子配列であり；ヒトＤＰＰ４遺伝子がヒトＤＰＰ４の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ８９６７２２．１のパート２９－７６６ａａのコード化遺伝子配列であり；ＡＶＩタグ配列がＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥであり；コドンがヒト宿主に最適化され；ベクターがレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ｃｏｐＧＦＰであり；構築したＡＣＥ２融合タンパク質のプラスミドがｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰと命名され；構築したＤＰＰ４融合タンパク質のプラスミドがｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰと命名されたことを特徴とする。
ＡＣＥ２融合タンパク質の人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されており、その翻訳されたタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されている。
ＤＰＰ４融合タンパク質の人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されており、その翻訳されたタンパク質配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されている。
実施形態４：実施形態１および２に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、トランスフェクションのための細胞株がＨＥＫ２９３またはＣＨＯであり；ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株がＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３またはＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯと命名され；ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株がＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３またはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯと命名されたことを特徴とする。
安定トランスフェクト細胞株の確立プロセスは以下であった：ｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰプラスミド、ｐＨ１プラスミド、およびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージング細胞２９３Ｖに共トランスフェクトして、ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製し、またＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰまたはＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスでＨＥＫ２９３またはＣＨＯをトランスフェクトした。
実施形態５：実施形態１および２に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、部位特異的ビオチン化が、ＡＣＥ２タンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）で；ＤＰＰ４タンパク質のアミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮ末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）で行われたことを特徴とする。
実施形態６：実施形態１および２に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、カルボキシル着色ラテックスをＥＤＣ／ＮＨＳ架橋剤で活性化させた後、ストレプトアビジン（ＳＡ）をペプチド結合によりラテックスに結合させて、Ｌ－ＳＡを得；ＡＣＥ２－ビオチンタンパク質をストレプトアビジン－ビオチン反応によってＬ－ＳＡに結合させ、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を得て、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２と命名し；Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４についても同様であったことを特徴とする。
実施形態７：実施形態１に記載するように、キットにおいて説明する特徴を有する新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、ＥＤＣ／ＮＨＳ架橋剤活性化カルボキシル着色ラテックス、抗Ａ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶＡ）抗体（捕獲）、抗Ｂ型インフルエンザウイルス（ＩＦＶＢ）抗体（捕獲）、およびウサギＩｇＧを使用し、これらをそれぞれペプチド結合により着色ラテックスに結合させて、Ｌ－ＩＦＶＡ、Ｌ－ＩＦＶＢ、およびＬ－ウサギＩｇＧを得るステップも含む。
実施形態８：実施形態１に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キットが２つのクロマトグラフィーストリップも含むことを特徴とする。ストリップは、底部ライニング、ニトロセルロース（ＮＣ）膜、試料パッド、剥離パッド、および吸収紙を含む。試料パッド、剥離パッド、ＮＣ膜、および吸収紙は底部ライニングの上に組み合わせ、その中で剥離パッドおよび吸収紙はＮＣ膜のいずれかの端部上に積み重ね、試料パッドは剥離パッドの上に積み重ねる。
例示するストリップのうちの１つで、Ｌ－ＩＦＶＡ、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２、およびＬ－ウサギＩｇＧを混合し、ストリップの剥離パッド上に噴霧した。その剥離パッドから吸収紙まで、検査線領域Ｔ１（Ａ型インフルエンザウイルス）、Ｔ２（新型コロナウイルス）、および対照線領域Ｃ１を連続的にＮＣ膜上に設置する。また、それぞれ抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（検出型）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）で被覆した。このストリップはストリップＡと命名する。
もう１つの例示するストリップで、Ｌ－ＩＦＶＢ、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４、およびＬ－ウサギＩｇＧを混合し、ストリップの剥離パッド上に噴霧した。その剥離パッドから吸収紙まで、検査線領域Ｔ３（Ｂ型インフルエンザウイルス）、Ｔ４（ＭＥＲＳ－ＣｏＶ）、および対照線領域Ｃ２を連続的にＮＣ膜上に設置する。また、それぞれ抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体（検出型）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）で被覆した。このストリップはストリップＢと命名する。
検査ストリップＡおよびＢを、二重ストリップカード上に組み合わせる。新型コロナウイルス、ＭＥＲＳ、およびＡ型・Ｂ型インフルエンザウイルスの４－ｉｎ－１迅速検出キットを構築した。このうち、新型コロナウイルスおよびＡ型インフルエンザウイルスはストリップＡ上で検出でき、ＭＥＲＳおよびＢ型インフルエンザウイルスはストリップＢ上で検出できる。
実施形態９：実施形態８に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、検査の際に、試薬プレートの２つの試料孔それぞれに試料を投入すると、約３～１５分以内に、Ａ型インフルエンザウイルスのＴ１、新型コロナウイルスのＴ２、Ｂ型インフルエンザウイルスのＴ３、またはＭＥＲＳウイルスのＴ４を目視で観察し、対応するＴ線が現れたものが陽性であり、現れなければ陰性であることを特徴とする。
実施形態１０：実施形態８に記載するように、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、キットが、便、尿、呼吸器分泌物、口腔粘液、涙、および環境試料の検出に好適であることを特徴とする。新型コロナウイルス、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型インフルエンザ、およびＢ型インフルエンザウイルスに適用して迅速に検出し、４つのウイルス性伝染病を同時に約３～１５分以内に特定することができる。これは、病院検査、在宅検査、疫学調査、大規模スクリーニングおよび診断に、ならびにコロナウイルスおよびインフルエンザウイルスアウトブレイクの世界的監視に使用できる。
以下に、特定の実施例を参照する。これらは例示的な実施形態であり、それらの特定の要素に限定されることを意図するものではないが、本開示の実施形態は、本明細書に教示するより多くまたは少なく含み得る。
以下に、例示的な実施形態を、特定の例示的な実施形態と組み合わせてさらに説明する。ただし、例示的な実施形態の保護範囲はこれに限定されない。
プラスミドｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰの構築
ヒトＡＣＥ２遺伝子のＣ末端（ＧｅｎＢａｎｋ：ＡＢ０４６５６９．１のパート１－７３９ａａのコード化遺伝子配列）を、ビオチン化タグ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫｌＥＷＨＥ）および６×Ｈｉｓタグに順に接続させ、人工的に設計された配列を形成した。人工的に設計された配列は宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングした。ＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、これをＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されており、その発現されたアミノ酸配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されている。遺伝子を合成した後、リガーゼ制限部位ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを介してｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＣｏｐＧＦＰベクターにクローニングした。構築したプラスミドはｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰと命名する（図１に示す）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１の特定の配列を配列表に示す。その末端のそれぞれにおいて、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）／ＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を遺伝子サブクローニングに用いる。７－２２２３ｂｐ配列のパートはヒトＡＣＥ２タンパク質の細胞外領域（１－７３９ａａ）をコードする。２２２４－２２９５ｂｐ配列のパートはＢｉｒＡ酵素の識別部位をコードする。２２９６－２３１４ｂｐは精製タグ６×Ｈｉｓの遺伝子配列である。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の特定の配列を配列表に示す。１－７３９ａａのパートはヒトＡＣＥ２タンパク質の細胞外領域であり；７４０－７６３ａａのパートはＢｉｒＡ酵素の認識部位であり；７６４－７７０ａａは精製タグ６×Ｈｉｓである。
プラスミドｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰの構築
ヒトＤＰＰ４遺伝子のＮ末端（ＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ８９６７２２．１のパート２９－７６６ａａのコード化遺伝子配列）を、ラット成長ホルモンシグナルペプチド（ＭＡＡＤＳＱＴＰＷＬＬＴＦＳＬＬＣＬＬＷＰＱＥＡＧＡ）、６×Ｈｉｓタグ、およびＡＶＩタグ配列（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）に順に接続し、人工的に設計された配列を形成した。人工的に設計された配列は宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングした。６×Ｈｉｓ－ＡＶＩタグ－ＤＰＰ４融合タンパク質を発現するプラスミドを構築し、これをＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドと呼ぶ。人工的に設計されたＤＮＡ配列はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されており、その発現されたアミノ酸配列（ラット成長ホルモンシグナルペプチド除去）はＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されている。遺伝子を合成した後、リガーゼ制限部位ＥｃｏＲＩおよびＮｏｔＩを介してｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦ１－ＣｏｐＧＦＰベクターにクローニングした。構築したプラスミドはｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰと命名する（図２に示す）。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３の特定の配列を添付の配列表に示す。その末端のそれぞれにおいて、ＥｃｏＲＩ（ＧＡＡＴＴＣ）／ＮｏｔＩ（ＧＣＧＧＣＣＧＣ）を遺伝子サブクローニングに用いる。７－８４ｂｐ配列のパートはラット成長ホルモンシグナルペプチドをコードする。８５－１０２ｂｐ配列は６×Ｈｉｓタグをコードする。１０３－１４７ｂｐ配列はＡＶＩタグをコードする。１５４－２３６７ｂｐ配列はヒトＤＰＰ４タンパク質の細胞外領域（２９－７６６ａａ）をコードする。
ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４の特定の配列は添付の配列表に示す。
ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３細胞株の構築
ｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰプラスミド、ｐＨ１プラスミド、およびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージングライン細胞２９３Ｖに共トランスフェクトしてＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３安定細胞株を確立し、蛍光顕微鏡下でピックアップによりクローニングした。例示的な具体的なステップは以下のとおりである：
１）実験の前日に２９３Ｖ細胞を１５ｃｍの皿５つに播種し、細胞のコンフルエンスが７０～８０％に達したのを確認してからトランスフェクションを行った。
２）トランスフェクションの１～２時間前に、皿の培地を血清フリー培地および抗生物質フリーＤＭＥＭ培地に交換した。
３）１５ｍＬ管を用意し、５ｍＬの１×ＨＢＳを添加し、次いで１００μｇのｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰプラスミドおよび１００μｇのｐＨ１／ｐＨ２プラスミド（ｐＨ１：ｐＨ２＝３：１）を添加したのち、穏やかに混合した。
４）４ｍＬのＰＥＩ溶液（１０μＭ）を添加し、穏やかに混合したのち、３７℃で２０分間インキュベートした。
５）トランスフェクション化合物溶液を５等分して１５ｃｍの皿５つに均等に加え、トランスフェクトした。化合物を穏やかに振とうして均等に分布させた。
６）６時間トランスフェクトした後、培地をＤＭＥＭ完全培地（＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）に交換した。
７）４８～７２時間トランスフェクトした後、上清を回収し、８０００ｇで１５分間遠心分離した。上清を０．４５μｍの膜でろ過してから、８５０００ｇで２時間遠心分離した。
８）上清を捨て、沈殿物を０．５ｍＬの完全培地（＋１０％ＦＢＳ＋１％ペニシリン／ストレプトマイシン）で再懸濁し、ＨＥＫ２９３細胞（１２ウェルプレートの１ウェルで細胞の６０～７０％コンフルエンス）を感染させた。
９）感染させたＨＥＫ２９３細胞を２日間培養し、６ウェルプレートの６ウェルに細分した。分散させる個々の細胞がクローン細胞集団を形成し（約１週間）、緑色蛍光タンパク質が高発現したモノクローナル細胞集団を蛍光顕微鏡下でピックアップして増幅させ、培養してＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３安定細胞株を確立した。
ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３細胞株の確立
ｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰプラスミド、ｐＨ１プラスミド、およびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージングライン細胞２９３Ｖに共トランスフェクトしてＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製し、ＨＥＫ２９３細胞にトランスフェクトした。ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３安定細胞株を確立し、蛍光顕微鏡下でピックアップによりクローニングした。具体的なステップは実施例３と同様である。
ＡＣＥ２－ビオチンタンパク質の調製
タンパク質フリー２９３細胞培養培地を用いてＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３安定細胞を培養し、上清を回収した。ＡＣＥ２融合タンパク質はＮｉ２＋アガロースで精製した。ビオチンタンパク質リガーゼでビオチンをＡＣＥ２の部位（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）に結合させてＡＣＥ２－ビオチンを得た。具体的な例示ステップは以下のとおりである：
１）ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３細胞を増殖させ、ＨｅｋｔｏｒＨＥＫ２９３タンパク質またはポリペプチドフリーの細胞培地が入った５層細胞プラントで培養した。
２）培養培地を回収し、１２０００ｇで３０分間、４℃で遠心分離した。上清をＮｉ２＋アガロースカラムに流し、標的タンパク質を吸収させ；洗浄緩衝液（２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）で洗浄後、溶出緩衝液（２００ｍＭイミダゾール、２０ｍＭ Ｔｒｉｓ－ＨＣｌ、１５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ８．０）を添加し、溶出液を回収する。
３）ＡＣＥ２タンパク質を、タンパク質の分画分子量が１０ｋＤの限外ろ過管で濃縮し、酵素の連結緩衝液（１０ｍＭ ＡＴＰ、１０ｍＭ ＭｇＯＡｃ、５０μＭビオチン）をＢｉｒＡと交換した。製品の使用説明書に従って、ＢｉｒＡ酵素を用いてＡＣＥ２タンパク質の部位－点（ｐｏｉｎｔ）のビオチン化を行い、これをＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ配列でリジン（Ｋ）に結合させてＡＣＥ２－ビオチンを得た。
ＤＰＰ４－ビオチンタンパク質の調製
タンパク質フリー２９３細胞培養培地を用いてＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３安定細胞を培養し、上清を回収した。ＤＰＰ４融合タンパク質はＮｉ２＋アガロースで精製した。ビオチンタンパク質リガーゼでビオチンをＤＰＰ４の部位（ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥ）に結合させてＤＰＰ４－ビオチンを得た。具体的な例示ステップは実施例５と同様である。
Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４、Ｌ－ＩＦＶＡ、Ｌ－ＩＦＶＢ、およびＬ－ラビットＩｇＧの調製
ストレプトアビジン（ＳＡ）－ビオチンシステムを用いて、ＳＡをカルボキシル着色ラテックスに結合させることにより、ＡＣＥ２－ビオチンを着色ラテックスでしっかり標識できる。この方法では、－ＮＨ４および－ＣＯＯＨの縮合反応を直接介することで、ＡＣＥ２またはＤＰＰ４によるＡＣＥ２またはＤＰＰ４タンパク質機能不活性化が回避できるだけでなく、検出信号の多段増幅も形成される。具体的な例示ステップは以下のとおりである：
１）製品取扱説明書に記載の方法に従ってストレプトアビジン（ＳＡ）をカルボキシル着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＳＡを得る。
２）ラビットＩｇＧもカルボキシル着色ラテックスに結合させ、ストリップの対照システムで用いるＬ－ラビットＩｇＧを得た。
３）抗ＩＦＶＡモノクローナル抗体（捕獲）をカルボキシル着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＩＦＶＡを得た。
４）抗ＩＦＶＢモノクローナル抗体（捕獲）をカルボキシル着色ラテックスに結合させ、Ｌ－ＩＦＶＢを得た。
５）Ｌ－ＳＡおよびＡＣＥ２－ビオチンをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で１：４のモル比で混合し（Ｌ－ＳＡは標識ＳＡとして計算した）、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間インキュベートしてＬ－ＳＢ－ＡＣＥ２を得た。
６）Ｌ－ＳＡおよびＤＰＰ４－ビオチンをｐＨ７．４のＰＢＳ緩衝液で１：４のモル比で混合し（Ｌ－ＳＡは標識ＳＡとして計算した）、３７℃、１５０ｒｐｍで１時間インキュベートしてＬ－ＳＢ－ＤＰＰ４を得た。
７）１５０００ｇ、４℃で３０分間遠心分離し、上清を除去して、沈殿物をＰＢ緩衝液（ｐＨ７．０、１％ＢＳＡ、８％スクロース、０．０５％ＮａＮ３）で再懸濁した。
新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットの作成
ここでは、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キット（ラテックス法）を作成し、ウイルス不活性化のためのバイオセイフティーシステムを確立した。
１）０．２Ｕ／ｍＬのヌクレアーゼを試料パッド前処理溶液に添加した。コロナウイルスはＲＮＡウイルスであるため、リボヌクレアーゼはその核酸を分解することによってウイルスを阻害または不活性化する。試料パッド前処理溶液は０．５％ｔｗｅｅｎ２０を含有するＴｒｉｓ緩衝液（ｐＨ７．４）であった。
２）前述の実施例７で調製したＬ－ＳＢ－ＡＣＥ２、Ｌ－ＩＦＶＡ、およびＬ－ラビットＩｇＧを混合し、キットの剥離パッドに噴霧して、３７℃で１２時間乾燥させて使用できるようにし、剥離パッドＡと命名した。
３）前述の実施例７で調製したＬ－ＳＢ－ＤＰＰ４、Ｌ－ＩＦＶＢ、およびＬ－ラビットＩｇＧを混合し、キットの剥離パッドに噴霧して、３７℃で１２時間乾燥させて使用できるようにし、剥離パッドＢと命名した。
４）抗ＩＦＶＡモノクローナル抗体（検出）、新型ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体のウサギ抗Ｓ１タンパク質、ヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）を被覆希釈剤（ｃｏａｔｅｄ ｄｉｌｕｅｎｔ）（１５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．４）で約０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ニトロセルロース膜の検査線Ｔ１、Ｔ２、対照線（Ｃ１）にそれぞれ均等に噴霧した。３７℃で１２時間乾燥させ、後で使用するために袋を密封し、ＮＣ膜Ａと命名した。
５）抗ＩＦＶＢモノクローナル抗体（検出）、ＭＥＲＳ－ＣｏＶポリクローナル抗体のウサギ抗Ｓ１タンパク質、およびヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体（ＧＡＲ）を被覆希釈剤（１５０ｍＭ ＰＢ、ｐＨ７．４）で約０．５ｍｇ／ｍＬに希釈し、ニトロセルロース膜の検査線Ｔ３、Ｔ４、および対照線（Ｃ２）にそれぞれ均等に噴霧した。３７℃で１２時間乾燥させ、後で使用するために袋を密封し、ＮＣ膜Ｂと命名した。
６）試料パッド、剥離パッド、ニトロセルロース薄膜、および吸収紙を底部ライニング上に重ねて組み合わせた。剥離パッドおよび吸収紙は、ニトロセルロース膜のいずれかの端部上にそれぞれ積み重ねた。試料パッドは剥離パッドの上に積み重ね、組み合わせて検査板を形成する。以下の２種類の検査板を作成した。検査板Ａ：剥離パッドＡとＮＣ膜Ａの組み合わせ。検査板Ｂ：剥離パッドＢとＮＣ膜Ｂの組み合わせ。検査板は約３．７８ｍｍのストリップに切り、ストリップＡおよびストリップＢの２種類の検査ストリップを作成した。ストリップＡおよびストリップＢを二重ストリップカードに組み合わせ、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットに仕上げた。
新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットの適用
新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットは、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（その変異体を含む）、Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルスの迅速な検出に適用できる。これは、便、尿、痰、涙、口腔粘液、呼吸器分泌物、全血、血漿、血清を含むさまざまな生物および環境試料の検出に好適である。
１）新型コロナウイルス感度試験の実験：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入したＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組み換えＳ１タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．００ｎｇ／ｍＬ、０．０２ｎｇ／ｍＬ、０．１０ｎｇ／ｍＬ、０．５０ｎｇ／ｍＬ、２．５０ｎｇ／ｍＬ、および１２．５０ｎｇ／ｍＬに調合し、さらにブランク群としてＰＢＳ（ｐＨ７．４）を用意し、各濃度群を５つ複製して、このキットを測定に使用する。各ウェルに加えた約１００μＬの試料でクロマトグラフィーを行った約１０～１５分後にＴ２線を肉眼で観察した。結果から、ブランク、Ｓ１タンパク質試料の濃度０．００ｎｇ／ｍＬおよび０．０２ｎｇ／ｍＬではＴ２線に発色がなく陰性であることが示され；一方、Ｓ１タンパク質試料の濃度０．１０ｎｇ／ｍＬ、０．５０ｎｇ／ｍＬ、２．５０ｎｇ／ｍＬ、および１２．５０ｎｇ／ｍＬでは、Ｔ２線は淡色から濃色の着色線を示し、これらはすべて陽性であった。ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＳ１タンパク質に対する検査ストリップの感度は、最大０．１ｎｇ／ｍＬ、約０．１２ｐＭと説明される。
２）新型コロナウイルス交差反応試験の実験：本製品を用いて、他の一般的な感染症の病原体について交差反応試験を実施する。３群の並行対照実験を、それぞれヒト伝染性コロナウイルス（ＨＫＵ１、ＯＣ４３、ＮＬ６３、および２２９Ｅ）、インフルエンザ、一般的なウイルス、および肺炎マイコプラズマの試料で実施した。データ解析の結果、製品はこれらと交差反応していなかった。
理論上、これは他の受容体（ＭＥＲＳのＤＰＰ４など）に感染したコロナウイルスとは交差反応しない。ＳＡＲＳもＡＣＥ２受容体を用いるが、親和性はＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の１０～２０分の１であるため、弱い交差反応が生じ得る。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組み換えＳ１タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ヒトＲＳＶ（Ｂ１）のＧタンパク質、Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１のＨＡタンパク質、Ｂ型インフルエンザを採取してＰＢＳで調製し、それぞれ０．０００μｇ／ｍＬ、０．００１μｇ／ｍＬ、０．０１０μｇ／ｍＬ、０．１００μｇ／ｍＬ、１．０００μｇ／ｍＬ、および１０．０００μｇ／ｍＬを作成した。それぞれ１００μＬを取り、ストリップに添加した。１５分後、Ｔ２の結果から、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２が強い陽性、その他はすべて陰性であったことが示された（表１参照）。
Figure 2022027498000002
ＡＣＥ２受容体タンパク質を用いて新型コロナウイルスを検出したことから、感染機構としてＡＣＥ２受容体を持つウイルス以外の他のウイルスに対する交差反応はないはずである。しかしながら、例示的には、新型コロナウイルスのＳ１は、ＡＣＥ２受容体タンパク質に結合することが知られている最強のリガンドタンパク質である。実験の結果は、理論的予想と一致している。
１）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ感度試験の実験：Ｓｉｎｏ Ｂｉｏｌｏｇｉｃａｌ Ｉｎｃ．から購入したＭＥＲＳ－ＣｏＶの組み換えＳ１タンパク質をＰＢＳ（ｐＨ７．４）で０．００μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬに調合し、各濃度群を５つ複製して、このキットを測定に使用する。各ウェルに加えた１００μＬの試料でクロマトグラフィーを行った１０～１５分後にＴ４線を肉眼で観察した。結果から、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳ１タンパク質試料の濃度０．００μｇ／ｍＬおよび０．０１μｇ／ｍＬではＴ４線に発色がなく陰性であることが示され；一方、ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳ１タンパク質試料の濃度約０．１０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬでは、Ｔ４線は淡色から濃色の着色線を示し、これらはすべて陽性であった。ＭＥＲＳ－ＣｏＶのＳ１タンパク質に対する検査ストリップの感度は、最大約１００ｎｇ／ｍＬと説明される。
２）ＭＥＲＳ－ＣｏＶ交差反応試験の実験：本製品を用いて、他の一般的な感染症の病原体で交差反応試験を実施する。３群の並行対照実験を、それぞれヒト伝染性コロナウイルス（ＨＫＵ１、ＯＣ４３、ＮＬ６３、および２２９Ｅ）、インフルエンザ、一般的なウイルス、および肺炎マイコプラズマの試料で実施した。データ解析の結果、製品はこれらと交差反応していなかった。
理論上、これは他の受容体（ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２のＡＣＥ２など）に感染したコロナウイルスとは交差反応しない。
ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２の組み換えＳ１タンパク質、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２（Ｄ６１４Ｇ）、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－ＮＬ６３、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、ＨＣｏＶ－２２９Ｅ、ＨＣｏＶ－ＨＫＵ１、ＨＣｏＶ－ＯＣ４３、ヒトＲＳＶ（Ｂ１）のＧタンパク質、Ａ型インフルエンザＨ１Ｎ１のＨＡタンパク質、Ｂ型インフルエンザを採取してＰＢＳで調製し、それぞれ０．００μｇ／ｍＬ、０．０１μｇ／ｍＬ、０．１０μｇ／ｍＬ、１．００μｇ／ｍＬ、１０μｇ／ｍＬ、１００μｇ／ｍＬを作成した。それぞれ１００μＬを取り、ストリップに添加した。１５分後、Ｔ４の結果から、ＭＥＲＳ－ＣｏＶが陽性、その他はすべて陰性であったことが示された（表２参照）。
Figure 2022027498000003
１）Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス抗原検出試薬の品質評価および対照試験：国家標準Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス抗原検出キット（表３）を用いて、Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス抗原検出キットの品質評価および対照試験を行った。
（１）陽性対照の一致率：ＰＣ０１－ＰＣ０４ Ｂ型インフルエンザウイルスは陽性で、Ａ型インフルエンザウイルスは陰性であった。ＰＣ０５－ＰＣ１０ Ａ型インフルエンザウイルスは陽性で、Ｂ型インフルエンザウイルスは陰性であった。
（２）陰性対照の一致率：ＮＣ０１－ＮＣ０６ Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルスはともに陰性であった。
（３）再現性：ＣＶ１およびＣＶ２をそれぞれ１０回くり返した。ＣＶ１はＡ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して陰性であり、一方ＣＶ２はＢ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ａ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった；反応の結果は一致し、色の濃度は一様であった。
Figure 2022027498000004
（４）検出限界：
Ｓ１：力価は１．２２×１０４ＴＣＩＤ５０／Ｌ（１：８０希釈）以下で、結果はＡ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった。
Ｓ２：力価は３．２５×１０４ＴＣＩＤ５０／Ｌ（１：４０希釈）以下で、結果はＡ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった。
Ｓ３：力価は５．２５×１０５ＴＣＩＤ５０／Ｌ（１：４０希釈）以下で、結果はＢ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ａ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった。
Ｓ４：力価は１．００×１０４ＴＣＩＤ５０／Ｌ（１：１０希釈）以下で、結果はＢ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ａ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった。
Ｓ５：力価は１．２５×１０３ＴＣＩＤ５０／Ｌ（１：８０希釈）以下で、結果はＡ型インフルエンザウイルスに対して陽性、Ｂ型インフルエンザウイルスに対して陰性であった。
前述の例示的な実施形態で、コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルスを検査するキットを詳述しているが、本明細書の教示は、本明細書に教示する原理を用いた、これらのウイルスの１つ、２つ、または３つを用いるキットについても検討し得る。検査キットは、１つまたは２つの検査ストリップを備え得、前記検査ストリップについて１つまたは複数の対照線を有し得る。本明細書に記載する実施形態は、例えば、列記した４つのウイルスのうち３つについて教示する検査キットを含み得る。本開示の利点により、ウイルスのうち２つまたは１つを検出する検査キットも構想し得る。
前述の詳細な説明において、本開示のさまざまな特徴は、開示を合理化する目的で、単一の実施形態にまとめられている。この開示方法は、請求された開示が、各請求項に明示的に記載されているよりも多くの特徴を必要とするという意図を反映していると解釈されるものではない。むしろ、以下の請求項に反映されるように、発明の態様は、先に開示した任意の単一の実施形態のすべての特徴よりも少ない。したがって、以下の請求項は、参照により詳細な説明に組み込まれ、各請求項は、本開示の別個の実施形態として独立している。
前述の構成は、本開示の原理の適用の例示に過ぎないことを理解されたい。多数の改変および代替的な構成が、本開示の精神および範囲から逸脱することなく、当業者によって考案され得、添付の特許請求の範囲は、そのような改変および構成を含むことを意図している。したがって、本開示は、図面に示し、特殊性および詳細について上記で説明しているが、本明細書に記載する原理および概念から逸脱することなく、量、割合、材料、ならびに製造および使用の方法のバリエーションを含むがこれらに限定されない多数の改変が、当業者には明らかとなろう。

Claims (30)

  1. 着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を含む、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットであって、
    前記着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質が、以下のステップ：
    ヒトＡＣＥ２遺伝子のＣ末端を、ＡＶＩタグ配列および６×Ｈｉｓタグに順に接続させ、人工的に設計された配列を形成するステップ；
    前記人工的に設計された配列を宿主細胞コドンによって最適化し、次いでそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングし、それにより、ＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドと呼ばれる、ＡＣＥ２－ＡＶＩタグ－６×Ｈｉｓタグ融合タンパク質を発現するプラスミドを構築するステップ；
    前記ＡＣＥ２融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立するステップ；
    前記安定トランスフェクト細胞を培養し、増殖させるステップ；
    ＡＣＥ２融合タンパク質を含む培養上清を回収するステップ；
    Ｈｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムによって、前記培養上清からＡＣＥ２融合タンパク質を得るステップ；
    前記ＡＣＥ２融合タンパク質をビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＣ末端で部位特異的ビオチン化して、ＡＣＥ２－ビオチンを得るステップ；
    ストレプトアビジンＳＡを、カルボキシル基を有する着色ラテックスと結合させ、Ｌ－ＳＡを得るステップ；ならびに
    ＡＣＥ２－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２を得るステップ
    を用いて調製されるキット。
  2. 前記Ｈｉｓタグ親和性カラムが、Ｎｉ２＋およびＣｏ２＋カラムのうち少なくとも１つを含む、請求項１に記載の迅速検出キット。
  3. 前記ヒトＡＣＥ２遺伝子が、ヒトＡＣＥ２の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ；ＡＢ０４６５６９．１のパート１－７３９ａａのコード化遺伝子配列を含む、請求項１に記載のキット。
  4. 前記ＡＶＩタグ配列がＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥを含む、請求項１に記載のキット。
  5. 前記ベクターがレンチウイルス発現ベクターｐＣＤＨ－ＣＭＶ－ＭＣＳ－ＥＦｌ－ｃｏｐＧＦＰであり；前記構築したＡＣＥ２融合タンパク質のプラスミドがｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰであり；ＡＣＥ２融合タンパク質の前記人工的に設計されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：１に記載されており、かつその翻訳されたタンパク質配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２に記載されている、請求項１に記載のキット。
  6. トランスフェクションのための前記細胞株が、ＨＥＫ２９３およびＣＨＯのうち少なくとも１つを含み、ＡＣＥ２融合タンパク質を発現する前記安定トランスフェクト細胞株が、ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／２９３およびＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯのうち少なくとも１つを含み；前記安定トランスフェクト細胞株の前記確立プロセスがｐＣＤＨ－ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰプラスミドを含み；トランスフェクションの前記ステップが、ｐＨ１プラスミドおよびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージング細胞２９３Ｖに共トランスフェクトして、ＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製するステップ、ならびにＡＣＥ２．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスでＨＥＫ２９３またはＣＨＯをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１に記載のキット。
  7. ビオチン化の前記ステップが、ＡＣＥ２タンパク質の前記アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：２の末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）での部位特異的ビオチン化ステップをさらに含む、請求項１に記載のキット。
  8. 前記方法が、前記カルボキシル着色ラテックスをＥＤＣ／ＮＨＳ架橋剤で活性化させるステップ、およびストレプトアビジン（ＳＡ）をペプチド結合により前記カルボキシル着色ラテックスに結合させて、Ｌ－ＳＡを得るステップ；前記ＡＣＥ２－ビオチンタンパク質をストレプトアビジン－ビオチン反応によってＬ－ＳＡに結合させ、着色ラテックスで標識したＡＣＥ２タンパク質を得て、Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２と命名するステップをさらに含み；Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４も同様である、請求項１に記載のキット。
  9. 着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質を含む、新型コロナウイルス／ＭＥＲＳ－ＣｏＶ／Ａ型・Ｂ型インフルエンザウイルス多重迅速検出キットであって、
    前記着色ラテックスで標識したＤＰＰ４タンパク質が、以下のステップ：
    ヒトＤＰＰ４のＮ末端を、ラット成長ホルモンシグナルペプチド、６×Ｈｉｓタグ、およびＡＶＩタグ配列に順に接続させ、人工的に設計された配列を形成するステップ；
    前記人工的に設計された配列を、宿主細胞コドンを用いて最適化するステップ；
    前記人工的に設計された配列をそのＣＭＶプロモーター下でベクターにサブクローニングし、ＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドと呼ばれる、６×Ｈｉｓタグ－ＡＶＩタグ－ＤＰＰ４融合タンパク質を発現するプラスミドを構築するステップ；
    前記ＤＰＰ４融合タンパク質プラスミドを細胞株にトランスフェクトし、ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する安定トランスフェクト細胞株を確立するステップ；
    安定トランスフェクト細胞を前記安定トランスフェクト細胞株で培養し、増殖させ、かつＤＰＰ４融合タンパク質を含む培養上清を回収するステップ；
    Ｈｉｓタグ親和性カラムであるタンパク質精製カラムによって、前記培養上清からＤＰＰ４融合タンパク質を得るステップ；
    前記ＤＰＰ４融合タンパク質をビオチン－タンパク質リガーゼＢｉｒＡによってそのＮ末端で部位特異的ビオチン化して、ＤＰＰ４-ビオチンを得るステップ；
    ストレプトアビジンＳＡを、カルボキシル基を有する着色ラテックスと結合させ、Ｌ－ＳＡを得るステップ；ならびに
    ＤＰＰ４－ビオチンをＬ－ＳＡと共インキュベートし、Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４を得るステップ
    を用いて調製されるキット。
  10. 前記ヒトＤＰＰ４遺伝子が、ヒトＤＰＰ４の細胞外部分、すなわちＧｅｎＢａｎｋ：ＫＪ８９６７２２．１のパート２９－７６６ａａのコード化遺伝子配列を含む、請求項９に記載のキット。
  11. 前記構築したＤＰＰ４融合タンパク質のプラスミドがｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰである、請求項９に記載のキット。
  12. ＤＰＰ４融合タンパク質の前記人工的に設計されたＤＮＡ配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：３に記載されており、かつその翻訳されたタンパク質配列がＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４に記載されている、請求項９に記載のキット。
  13. ＤＰＰ４融合タンパク質を発現する前記安定トランスフェクト細胞株が、ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／２９３およびＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰ／ＣＨＯのうち少なくとも１つを含み；前記安定トランスフェクト細胞株の前記確立プロセスがｐＣＤＨ－ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰプラスミドを含み；トランスフェクションの前記ステップが、ｐＨ１プラスミドおよびｐＨ２プラスミドをレンチウイルスパッケージング細胞２９３Ｖに共トランスフェクトして、ＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスを調製するステップ、ならびにＤＰＰ４．ｃｏｐＧＦＰレンチウイルスでＨＥＫ２９３またはＣＨＯをトランスフェクトするステップをさらに含む、請求項１に記載のキット。
  14. ビオチン化の前記ステップが、ＤＰＰ４タンパク質の前記アミノ酸配列ＳＥＱ ＩＤ ＮＯ：４のＮ末端、ビオチンタンパク質リガーゼの認識部位ＧＬＮＤＩＦＥＡＱＫＩＥＷＨＥのリジン（Ｋ）での部位特異的ビオチン化ステップをさらに含む、請求項１に記載のキット。
  15. ＡＣＥ２タンパク質および少なくとも１つのクロマトグラフィーストリップを含む、ＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するためのキットであって、
    前記クロマトグラフィーストリップが前記ＡＣＥ２タンパク質を収容し、
    前記少なくとも１つのクロマトグラフィーストリップが、底部ライニング、ニトロセルロース膜、試料パッド、剥離パッド、および吸収紙を含み、
    前記試料パッド、前記剥離パッド、前記ニトロセルロース膜、および前記吸収紙が、前記底部ライニングの上に配置されており、
    前記剥離パッドおよび前記吸収紙が、前記ニトロセルロース膜の両端部上に、それぞれを前記ニトロセルロース膜の各端部に重ねてさらに配置されており、ならびに
    前記試料パッドが、前記剥離パッドの端部上に、前記剥離パッドの前記端部に重ねて配置されており、このとき前記剥離パッドの前記端部が前記ニトロセルロース膜の端部上にない
    キット。
  16. 前記クロマトグラフィーストリップが、抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
  17. 前記クロマトグラフィーストリップが、抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体をさらに含む、請求項１６に記載のキット。
  18. ＡＣＥ２タンパク質が第１の着色ラテックスで標識され、前記抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体が第２の着色ラテックスで標識され、前記抗Ｂ型インフルエンザモノクローナル抗体が第３の着色ラテックスで標識され、このとき３つすべてが、前記剥離パッドに埋め込まれ、試料の新型コロナウイルスまたはインフルエンザウイルスを捕獲するよう構成されている、請求項１７に記載のキット。
  19. 前記クロマトグラフィーストリップが、前記ニトロセルロース膜に配置されたＬ－ウサギＩｇＧおよび対照線領域をさらに含む、請求項１５に記載のキット。
  20. 前記試料パッドに適用された試料が検査で陽性であるかどうかを観察する時間枠が約３～約１５分間を含む、請求項１５に記載のキット。
  21. ウイルスの陽性検査結果が、前記ニトロセルロース膜上の当該ウイルスに指定された検査線領域に着色線が現れ、かつ前記ニトロセルロース膜上に配置された検査対照線領域に着色線が現れることによって示され、ならびに陰性結果が、前記検査領域に着色線が現れず、かつ前記検査対照線領域に着色線が現れることによって示される、請求項１５に記載のキット。
  22. 前記キットが、便、尿、呼吸器分泌物、口腔粘液、涙、および環境試料のうち少なくとも１つを含む試料からＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２を検出するよう構成される、請求項１５に記載のキット。
  23. ＡＣＥ２タンパク質および第１のクロマトグラフィーストリップを含む、ＳＡＲＳ－ＣＯＶ－２、ＭＥＲＳ－ＣｏＶ、Ａ型インフルエンザ、およびＢ型インフルエンザを検出するためのキットであって、
    前記第１のクロマトグラフィーストリップが前記ＡＣＥ２タンパク質を収容し、
    前記第１のクロマトグラフィーストリップが、底部ライニング、ニトロセルロース膜、試料パッド、剥離パッド、および吸収紙を含み、
    このとき前記試料パッド、前記剥離パッド、前記ニトロセルロース膜、および前記吸収紙が、前記底部ライニングの上に配置されており、
    前記剥離パッドおよび前記吸収紙が、前記ニトロセルロース膜の両端部上に、それぞれを前記ニトロセルロース膜の各端部に重ねてさらに配置されており、ならびに
    前記試料パッドが、前記剥離パッドの端部上に、前記剥離パッドの前記端部に重ねて配置されており、このとき前記剥離パッドの前記端部が前記ニトロセルロース膜の端部上にない
    キット。
  24. 前記キットが第２のクロマトグラフィーストリップをさらに含み、
    前記第２のクロマトグラフィーストリップが、第２の底部ライニング、第２のニトロセルロース膜、第２の試料パッド、第２の剥離パッド、および第２の吸収紙を含み、
    前記第２の試料パッド、前記第２の剥離パッド、前記第２のニトロセルロース膜、および前記第２の吸収紙が、前記第２の底部ライニングの上に配置されており、
    前記第２の剥離パッドおよび前記第２の吸収紙が、前記第２のニトロセルロース膜の両端部上に、それぞれを前記第２のニトロセルロース膜の各端部に重ねてさらに配置されており、ならびに
    前記第２の試料パッドが、前記第２の剥離パッドの端部上に、前記第２の剥離パッドの前記端部に重ねて配置されており、このとき前記第２の剥離パッドの前記端部が前記第２のニトロセルロース膜の端部上にない、
    請求項２３に記載のキット。
  25. 前記剥離パッドが、
    Ｌ－ＩＦＶＡ、
    Ｌ－ＳＢ－ＡＣＥ２、および
    Ｌ－ウサギＩｇＧをさらに含み；ならびに
    前記キットが、前記ニトロセルロース膜上に第１の対照線領域、
    前記ニトロセルロース膜上に第１の検査線領域、および
    前記ニトロセルロース膜上に第２の検査線領域をさらに含み、
    このとき前記第１の検査線領域が前記第１の対照線領域とともに連続的に配置されており、
    前記第１の対照線領域が、前記第１の対照線領域と比べて前記吸収紙の近くに配置されており、
    前記第２の検査線領域が、前記第１の対照線領域と比べて前記吸収紙から遠くに配置されており、
    前記第１の検査線が抗Ａ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の被覆を含み、前記第２の検査線領域がＳＡＲＳ－ＣｏＶ－２ポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質の被覆を含み、ならびに
    前記第１の対照線領域がヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を含む、
    請求項２４に記載のキット。
  26. 前記第２の剥離パッドが、
    Ｌ－ＩＦＶＢ、
    Ｌ－ＳＢ－ＤＰＰ４、および
    Ｌ－ウサギＩｇＧをさらに含み、ならびに
    前記キットが、前記第２のニトロセルロース膜上に第２の対照線領域、
    前記ニトロセルロース膜上に第３の検査線領域、および
    前記ニトロセルロース膜上に第４の検査線領域をさらに含み、
    このとき前記第３の検査線領域が前記第２の対照線領域とともに連続的に配置されており、
    前記第２の対照線領域が、前記第３の対照線領域と比べて前記吸収紙の近くに配置されており、
    前記第４の検査線領域が、前記第２の対照線領域と比べて前記吸収紙から遠くに配置されており、
    前記第３の検査線が抗Ｂ型インフルエンザウイルスモノクローナル抗体の被覆を含み、前記第４の検査線領域がＭＥＲＳ－ＣｏＶポリクローナル抗体の抗Ｓ１タンパク質の被覆を含み、ならびに
    前記第２の対照線領域がヤギ抗ウサギＩｇＧポリクローナル抗体を含む、
    請求項２４に記載のキット。
  27. 前記キットが二重ストリップカードをさらに含み、前記二重ストリップカードの第１のストリップが、新型コロナウイルスおよびＡ型インフルエンザウイルスを検出するよう構成されており、ならびに前記二重ストリップカードの第２のストリップが、ＭＥＲＳおよびＢ型インフルエンザウイルスを検出するよう構成されている、請求項２３に記載のキット。
  28. 前記試料プレートに適用された試料が検査で陽性であるかどうかを観察する前記時間枠が約３～約１５分間を含む、請求項２３に記載のキット。
  29. ウイルスの陽性検査結果が、前記第１の検査領域に着色線が現れ、かつ前記検査対照領域に着色線が現れることによって示され、ならびに陰性結果が、前記第１の検査領域に着色線が現れず、かつ前記対照線領域に着色線が現れることによって示される、請求項２３に記載のキット。
  30. １つまたは複数のウイルスの存在を検出するのに使用される前記試料が、便、尿、呼吸器分泌物、口腔粘液、涙、および環境試料のうち少なくとも１つを含む、請求項２３に記載のキット。



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