CN112301001A - 金黄色葡萄球菌噬菌体lsa2311及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明公开一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311及其应用，该噬菌体为宽谱型且能够裂解金黄色葡萄球菌及其耐药菌株，经鉴定为有尾噬菌体目肌尾噬菌体科，保藏编号为CCTCC NO：M 2020562；噬菌体LSA2311在pH 6‑11，温度40‑50℃之间效价稳定。根据该噬菌体全基因测序结果可知，噬菌体无毒力和抗生素抗性，转导相关基因，从遗传背景上证实了该噬菌体应用于食品中病原菌及噬菌体治疗的安全性。利用本发明提供的噬菌体可以有效控制牛奶样品中的金黄色葡萄球菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

Description

金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311及其应用

技术领域

本发明涉及食品安全领域，具体涉及一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311及其应用。

背景技术

金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus,S.aureus)作为最常见的食源性致病菌之一，与食品行业及医药领域的卫生和安全休戚相关。由于其广泛存在于自然界中，空气、土壤、水及食具上均有分布，人和动物均具有较高的带菌率，报道称正常人群中金黄色葡萄球菌的带菌率可达到30％-80％。金黄色葡萄球菌作为重要的食源性疾病源之一，由该菌引起的食物中毒事件越来越多，对食品卫生领域造成了极大地影响。报道称，美国每年由金黄色葡萄球菌肠毒素所引起的食品安全事件约185060起，其中约1750人住院，已经占细菌性食物中毒的33％，每年损失约达15亿美元；近年来，我国每年由此所引发的食物中毒事件已居细菌性食物中毒的第4位。可见，抑制金黄色葡萄球菌的污染已经成为国内外食品安全领域的迫切需求。

通过对食品中毒事件污染源的监测和追踪表明：各类食品受金黄色葡萄球菌的污染程度呈现显著性差异，其中乳及乳制品、生鲜肉、速冻制品等最易受金黄色葡萄球菌污染。特别是牛奶由于其具有液态营养成分均衡的特点，使之特别容易受到金黄色葡萄球菌的污染。

对于金黄色葡萄球菌的防治，传统上主要采取抗生素治疗法，这种方法对于抑制金黄色葡萄球菌具有一定的作用。但抗生素作为治疗细菌感染的化学物质，由于使用者缺乏必要的安全知识以及生产者为了牟取更大的商业利益，不能够严格按照标准进行使用，致使在我国普遍存在着抗生素的超剂量使用和超范围使用的情况。

近年来，由于人们过度依赖抗生素治疗，导致了一些耐药性细菌的出现，其中最为典型的就是具有“超级细菌”之称的耐甲氧西林金黄色葡萄球菌，每年由该菌所引发的感染都会给人类造成巨大的损失。因此，许多科学家都纷纷开始研究以寻找一种高效的抗生素替代品，而噬菌体作为治疗性制剂由于具有以下显著的优势：噬菌体特异性强，只针对特定的病原菌，而不破坏正常的微生态平衡；噬菌体具有指数的增殖能力，通常情况下，使用噬菌体治疗只需要给药一次便可通过自身的增殖，裂解细菌达到治疗的效果；噬菌体治疗的副作用小，即使是一些存在免疫性缺损的患者服用噬菌体治疗后也很安全，正是基于以上优势使得噬菌体的应用具有了更广阔的前景。

用于治疗的候选噬菌体主要是属于肌尾噬菌体科(如噬菌体K或phiStau2A)和短尾噬菌体科(phiSAP-2)的烈性噬菌体。这些噬菌体是从不同的环境中分离到的，包括乳制品、农场(感染***炎的牛奶)和病人等。应用噬菌体治疗的局限是宿主谱窄。

发明内容

本发明的目的在于克服现有技术的不足，提供了一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311，其为宽谱型且能裂解金黄色葡萄球菌耐药菌。金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311作为一种对金黄色葡萄球菌具有强有效裂解作用的噬菌体，它能够有效抑制金黄色葡萄球菌ATCC25923，ATCC29213，196，6538等多株细菌。

噬菌体是近年来被认为杀菌效果良好且相对安全的一种抗菌剂。噬菌体(bacteriophages)是感染细菌、真菌、放线菌或螺旋体等微生物的病毒的总称，因部分能引起宿主菌的裂解，故称为噬菌体。噬菌体是专一裂解细菌的病毒，自我增殖快，安全性高，分布广泛于环境中，也是人体微生物组的重要组成部分，具有高效、高特异性、易大量制备等特点，并且无色无味，不会影响食品本身的风味。

目前国际上已有应用于食品的噬菌体产品，其中具有标志性的是：2006年，美国食品药品监督管理局(FDA)批准ListShield^TM噬菌体产品可作为食品添加剂，用于即食食品和禽肉制品中控制单核细胞增生李斯特菌污染。噬菌体治疗具有指数增殖、特异性强、易实时更新、副作用小、无残留及周期短、成本低等优点，因而具有广阔的开发前景。

本发明以金黄色葡萄球菌为宿主菌分离出一株裂解能力强、宿主范围广、效价高的烈性噬菌体，通过研究它的生理特性，对其进行分类鉴定，为该噬菌体在食品安全中的应用提供物质基础；此外，通过研究该噬菌体对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制作用。

本发明的第二个目的是在于提供了一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在预防金黄色葡萄球菌的杀菌剂中的应用，尤其再在牛奶保鲜中的应用。饮用牛奶的加工过程中所用的杀菌方式还不能完全满足市场需求。目前，国内常用的牛奶热杀菌方法为巴氏杀菌(62.8～65.6℃，30min)和超高温瞬时杀菌(135～147℃，4～0.5s)。对于前者而言，巴氏杀菌后的牛奶虽然保有了大部分的风味和营养物质，但是货架期短，只能在4℃下保存不到10天。对于后者来说，虽然货架期延长至6个月，但是牛奶的营养成分和风味物质都受到了一定的损失。由金黄色葡萄球菌等细菌引起的奶牛的***炎的控制也是乳品行业的一个重要环节。在此背景下，开发一种新型的牛奶杀菌保鲜技术十分重要。利用本发明提供的噬菌体可以有效控制牛奶样品中的金黄色葡萄球菌，与抗生素和化学防腐剂相比较，具有特异性高、无残留和安全的特点。

为了实现上述技术目的，本发明采用以下技术措施：

本发明提供了一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311，所述噬菌体具有广谱性、能够裂解金黄色葡萄球菌耐药菌株，经鉴定，该噬菌体为有尾噬菌体目肌尾噬菌体科，其命名为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311，Staphylococcus aureus bacteriophage LSA2311，保藏编号为CCTCC NO：M 2020562，于2020年9月29日将该噬菌体LSA2311保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为：CCTCC M 2020562，保藏日期为：2020年9月29日。

上述金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311为实验室分离噬菌体在pH 6-11，温度40-50℃之间效价稳定，最佳感染复数为0.01；其为可识别金黄色葡萄球菌的宽谱噬菌体。

本发明还提供了一种上述金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在制备预防金黄色葡萄球菌的杀菌剂中的应用，其中，所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌标准菌株(MSSA)ATCC25923。

本发明还提供了一种上述金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在牛奶保鲜中的应用。

上述应用的方法：向牛奶中添加金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311培养液，其中，金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的添加量为1000～10000PFU/mL。

金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在牛奶样品中抑菌效果的实验，其步骤是：

(1)将培养至对数期的金黄色葡萄球菌ATCC25923，用PBS缓冲液将其浓度调整为1×10⁴CFU/mL。将实验分为六组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL灭菌的脱脂牛奶中，将三组牛奶样品放置在25℃的培养箱中20min，将另外三组牛奶样品放置在4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。

(2)在每个温度下的三组实验组中，两组为实验组：取100μL纯化的噬菌体LSA2311(效价分别为1×10⁸PFU/mL、1×10⁷PFU/mL)加入已加菌液的牛奶中，将其充分混匀；另一组为对照组：取100μL PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)加入已加菌液的牛奶中，将其充分混匀。

(3)将步骤(2)经过两种处理的牛奶静置于4℃、25℃培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24h取出，按照GB-4789.10-2016(国标金黄色葡萄球菌检验方法)平板计数法检测牛奶中肠炎金黄色葡萄球菌的数量，进而计算噬菌体的抑菌效果。

本发明的有益效果：

(1)经固体富集后的噬菌体原液效价高，在本发明中，噬菌体LSA2311的效价≧10⁹PFU/mL。

(2)在不同的条件下，抑菌能力强。在本发明中，比较了噬菌体LSA2311在MOI＝10、MOI＝1、MOI＝0.1、MOI＝0.01、MOI＝0.001的条件下对金黄色葡萄球菌的抑菌作用，并发现在不同的MOI条件下均具有很好的抑菌效果。

(3)pH范围更广。本发明提供的噬菌体LSA2311的pH稳定性(6～11)优于专利201810715693.0中的金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC No:M 2017394的pH稳定性(6～9)、专利201710048705.4中的金黄色葡萄球菌噬菌体CCTCC No:M 2015142的pH稳定性(5～9)。

(4)宿主谱宽。本发明提供的噬菌体LSA2311对29株金黄色葡萄球菌(包括3株金黄色葡萄球菌耐药菌株)均具有较好的裂解效果。

(5)据统计，目前对耐药性金黄色葡萄球菌的应用较少，本发明旨在提供一种新型的抑菌剂能够抑制牛奶样品中金黄色葡萄球菌的生长。

附图说明

图1为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在双层琼脂平板上的噬菌斑形态；

图2为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的电镜观察图；

图3为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311基因组和酶切电泳图；

图中，M：15000bp DNA marker；1：噬菌体LSA2311基因组；2：噬菌体LSA2311基因组经Hind III酶切；3：噬菌体LSA2311基因组经EcoR Ⅰ酶切；

图4为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的BLAST颜色比例尺；

图5为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在不同MOI值条件下对金黄色葡萄球菌ATCC25923裂菌能力结果图；

图6为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的吸附曲线；

图7为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的一步生长曲线；

图8为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的pH稳定性结果图；

图9为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的热稳定性结果图；

图10为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在低温4℃及室温25℃对牛奶中金黄色葡萄球菌的抑制效果图；

图中，图10A为噬菌体LSA2311在4℃下的抑菌效果图；图10B为噬菌体LSA2311在25℃下的抑菌效果图。

具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明作进一步的详细描述，以便本领域技术人员理解。

实施例1

金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的分离筛选方法，其步骤是：

(1)样品采集

污水样品分别来自于湖北省武汉市某菜市场。

(2)金黄色葡萄球菌噬菌体的筛选

取污水样品10mL，用0.22μm微孔滤器过滤。分别放入装有20mL灭菌的LB肉汤培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB肉汤培养基25.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20min备用)的50mL灭菌离心管中，另加入对数生长期(培养6h～8h)的宿主菌菌液5mL。37℃振荡培养12h～18h，使噬菌体增殖，其中，宿主菌为金黄色葡萄球菌ATCC25923。将上述培养液于50mL离心管中，以4℃下，8000r/min离心10min，取上清液用0.22μm的滤膜过滤。按照上述方法反复富集两次，即加入灭菌的LB肉汤培养基、加入对数生长期宿主菌菌液培养6h～8h。

采用点样法初步验证：有明显空斑样品进一步采用双层平板法，经梯度稀释，观察噬菌斑形态。

(3)噬菌体的扩增培养和纯化

在培养噬菌体原液的双层平板中挑取相对独立、大而边缘光滑的噬菌斑，接种于1mL LB肉汤培养基中，37℃、200r/min振荡培养12h～18h。4℃下，8000r/min离心10min，0.22μm滤膜过滤除菌，将噬菌体原液按从稀释倍数高向稀释倍数低的方向加入混有200μL菌液的上层培养基。重复上述步骤5次反复纯化噬菌体，直至得到大小较均一的噬菌斑，即为纯化的噬菌体，将该菌株编号为LSA2311。并利用双层平板法测定所分离噬菌体的效价；经测定，该噬菌体LSA2311的效价为3×10⁹PFU/mL。

(4)菌株鉴定

经纯化后的噬菌体LSA2311头部呈正十二面体结构，头部直径长约78nm，噬菌体含伸缩性尾，尾长约85nm，尾部直径约10nm，经鉴定该噬菌体为有尾噬菌体目，肌尾噬菌体科。

(5)噬菌体的保藏

短期保存可将过滤得到的噬菌体悬液存放于4℃冰箱中；若长期保存将过滤得到的噬菌体悬液，加入灭菌甘油(终浓度为20％)，存放于-80℃冰箱。

于2020年9月29日将该噬菌体LSA2311保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏地址为湖北省武汉市武汉大学，保藏编号为CCTCC NO：M 2020562。

噬菌体LSA2311形成的噬菌斑呈圆形透明状，直径1mm左右(培养12h)，边界清楚无晕环，头部呈正二十面体结构，头部直径长约78nm，噬菌体含收缩性尾，尾长约85nm，尾部直径约10nm，属肌尾噬菌体科。

实施例2：噬菌体LSA2311宿主谱的测定

试验选择29种金黄色葡萄球菌菌株(ATCC25923、ATCC29213、6538、196、7、16、18、30、32、SA2、SA6、SA24、SA26、SA90、SA99、SA100、SA102、SA103、SA104、SA105、SA106、SA109、SA113、SA115、SA118、SA122)和9种其他菌属(鼠伤寒沙门氏菌SJTUF13277、SJTUF13350、SJTUF13336、ATCC10855、SJTUF13337、SJTUF13277、肠炎沙门氏菌10960、印第安纳沙门氏菌13500、大肠杆菌ATCC25922)来做噬菌体LSA2311的宿主谱分析，具体步骤如下：

分别培养上述菌株(29种金黄色葡萄球菌菌株和9种其他种属菌株)至对数期。取100μL对数期上述菌液，待上层琼脂(向100mL实施例1步骤(2)中的LB肉汤培养基中加入0.7g琼脂，121℃灭菌20min备用)温度降至40℃时，分别取3mL上层琼脂与上述菌液混匀，之后倒入15mL下层LB琼脂培养基(该培养基的成分为：胰蛋白胨10.0g/L、酵母提取物5.0g/L、氯化钠10.0g/L、琼脂10.0g/L、pH值7.3±0.2；该培养基的使用方法为：称取上述成分的LB琼脂培养基35.0g，加热搅拌溶解于1000mL蒸馏水中，分装于试管或其它合适的容器中，121℃高压灭菌20min备用)上；静置晾干约10min，待上层培养基凝固后，分别滴加5μL噬菌体原液(噬菌体原液的制备方法为：取金黄色葡萄球菌ATCC25923接种于3mL新鲜LB肉汤培养基中，37℃培养6h左右，取100μL上述菌液于10mL新鲜LB肉汤培养基中，再分别加入100μL，4℃保存的噬菌体LSA2311，混匀后37℃振荡培养箱中培养12h～18h使噬菌体增殖；取5mL增殖液于离心管中，8000r/min离心15min去除细菌碎片，上清液用0.22μm滤膜过滤得噬菌体原液)，隔夜观察。

结果如表1所示，噬菌体可裂解多种不同金黄色葡萄球菌，表现出广谱性。

由于广谱抗生素的大量使用，导致金黄色葡萄球菌耐药菌株逐年增多，多重耐药金黄色葡萄球菌引起的食源性疾病严重危害人类健康和生命。噬菌体LSA2311能有效地裂解这些耐药菌株，不仅拓宽了噬菌体的宿主谱，还为杀灭耐药金黄色葡萄球菌提供了一种新杀菌剂。

表1噬菌体LSA2311宿主谱的测定

Table 1The host range of phage LSA2311

注：“++”表示噬菌斑清晰、通透；“+”表示噬菌斑模糊；“－”表示无噬菌斑；“++”Clear plaque；“+”Opaque plaque；“－”No plaque.

实施例3：噬菌体LSA2311的电镜观察

采用磷钨酸负染色法(Clokie and Kropinski 2009)，噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒，沉淀用0.1mol/L乙酸铵重悬，取噬菌体重悬液20μL和体积分数2％、pH＝7的磷钨酸20μL分别滴加在封口膜上。轻取铜网，先浸没于噬菌体液中10min之后用滤纸吸去多余液体。再将铜网置于磷钨酸染料中染色10min后吸去多余液体，自然晾干至完全干燥，制备好的铜网在透射电子显微镜下观察噬菌体形态，并用软件DigitalMicrograph Demo 3.9.1测量其大小。

结果如图2所示，经纯化后的噬菌体LSA2311头部呈正二十面体结构，头部直径长78nm，噬菌体含收缩性尾，尾长85nm，尾部直径10nm，属肌尾噬菌体科。

实施例4：噬菌体基因组的提取与全基因组denovo测序

取1mL噬菌体LSA2311原液，加入脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ(1mg/mL)20μL，核糖核酸酶RNase A(10mg/mL)20μL，用小型涡旋仪涡旋2min，37℃温育40min；加入20μL 2mol/LZnCl₂，37℃温育7min，离心，10000r/min，1min；弃上清，加入500μL TES buffer，吹吸后至澄清透明的状态，无白色颗粒物，65℃，15min(打散)，加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，用枪头轻轻吹吸，上下颠倒，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下，此时溶液是澄清的。温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH₃COOK提前放4℃，用醋酸调pH至5.2)，冰上放置15min，离心12000r/min，10min，4℃，取上清，加入600μL苯酚/氯仿/异戊醇(体积比为：25：24：1)，上下轻柔反复颠倒200次，离心12000r/min，10min，常温，取上层液体，加入1倍体积(约600μL)的异丙醇在-20℃沉淀DNA，上下颠倒后，有絮状物即是DNA，放置过夜。之后冷冻离心，4℃，12000r/min，10min，弃上清，加入1mL 70％(体积比)乙醇洗一次，吹吸，在12000r/min，10min离心，弃上清，再离心1min，管子要按同一个方向，用白枪头小心吸取剩余乙醇，放在37℃培养箱至少风干40min，再加20μL TE在常温下溶解DNA，静置30min。测序工作交于测序公司完成。

噬菌体LSA2311的全基因测序结果，由结果来看，噬菌体基因组为双链DNA，全长为144592bp。通过毒力因子数据库筛选推定的毒力因子，通过综合抗生素抗性数据库筛选抗生素抗性基因，可以看出噬菌体LSA2311无毒力和抗生素抗性，转导相关基因。

在NCBI中通过BLAST进行全数据库比对不能发现完全相似的序列，如图4所示，说明该噬菌体是一种新型噬菌体。

实施例5：金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311核酸的提取及鉴定

(1)噬菌体悬液于4℃、40000r/min超速离心1h沉淀噬菌体颗粒。

(2)加入脱氧核糖核酸酶DNaseⅠ(1mg/mL)20μL，核糖核酸酶RNase A(10mg/mL)20μL，用小型涡旋仪涡旋2min，37℃温育40min。

(3)加入20μL 2mol/L ZnCl₂，37℃温育7min。离心，4℃，10000r/min，1min；弃上清。

(4)加入500μL TES缓冲液，65℃吹吸15min至澄清透明，无白色颗粒物。

(5)加入10μL蛋白酶k(20mg/mL)，50℃温育1h，每隔10min上下颠倒一下。

(6)温育后冷却，加入60μL预冷的3mol/L CH₃COOK(pH＝5.2)，冰浴15min。

(7)离心12000r/min，10min，4℃。取上清。等量苯酚:氯仿:异戊醇(25:24:1)抽提1次。

(8)离心12000r/min，10min，常温。取上层液体，1倍体积的异丙醇在-20℃沉淀DNA，放置过夜。

(9)离心，4℃，12000r/min，10min，弃上清。加入1mL 70％乙醇洗涤1次。12000r/min，10min离心，弃上清，37℃风干40min。

(10)用TES缓冲液溶解核酸沉淀，-20℃保存备用。

(11)核酸用HindⅢ和EcoRⅠ核酸内切酶进行常规消化，消化产物于0.8％琼脂糖凝胶电泳进行鉴定。

结果如图3所示，噬菌体LSA2311核酸能被HindⅢ核酸内切酶酶切，根据酶切片段大小估算噬菌体LSA2311的基因组大小约为144592bp。

实施例6：噬菌体LSA2311的最佳感染复数

感染复数(Multiplicity of Infection，MOI)是指初始感染时噬菌体的数量与宿主菌数量的比值。按一定的MOI值(0.001、0.01、0.1、1、10、100、1000)将噬菌体悬液与宿主菌液各500μL混合，37℃培养3.5h，8000r/min离心10min，用双层平板法测定不同MOI值上清液的噬菌体效价。试验重复3次，每次设2个平行。

噬菌体LSA2311的最佳感染复数结果如表2所示。由表2可知，噬菌体LSA2311在MOI＝0.01时，噬菌体效价达到最大，即噬菌体LSA2311的最佳感染复数为0.01，表明在噬菌体效价与宿主菌菌量以0.01感染时，可增殖更多的噬菌体。

表2噬菌体LSA2311的最佳感染复数测定结果

Table2 MOI results for bacteriophage

实施例7：噬菌体LSA2311裂菌能力的评价

(1)挑取金黄色葡萄球菌ATCC25923单菌落接种于10mL LB肉汤培养基中，150r/min、37℃摇床中培养8h。再按照1:100的比例转接到装有10mL LB肉汤培养基中，150r/min、37℃下振荡培养3h。培养液用梯度稀释涂平板法进行计数，备用。

细菌的数量(CFU/mL)＝单菌落个数×稀释梯度×10

(2)取噬菌体LSA2311原液(噬菌体LSA2311原液的制备方法为：以金黄色葡萄球菌ATCC25923为宿主菌，用LB肉汤培养基对噬菌体LSA2311进行增殖培养12h～18h；将培养好的噬菌体和宿主菌的混合液8000r/min离心15min，上清液用0.22μm的滤膜除去宿主菌，得到纯的噬菌体液，测效价，备用。)

噬菌体的效价(PFU/mL)＝噬菌斑个数×稀释倍数×10

(3)取对数期金黄色葡萄球菌菌液，连续十倍梯度稀释至10⁵CFU/mL，取上述噬菌体液连续十倍梯度稀释至10⁸PFU/mL、10⁷PFU/mL、10⁶PFU/mL、10⁵PFU/mL、10⁴PFU/mL、10³PFU/mL，分别按照MOI＝1000、100、10、1、0.1、0.01、0.001加入对应的实验组，并加入100μL10⁵CFU/mL的金黄色葡萄球菌菌液混匀；另设阳性对照组加入100μL 10⁵CFU/mL菌液，100μLLB肉汤培养基；阴性对照组100μL 10⁷PFU/mL噬菌体液，100μL LB肉汤培养基；酶标仪设定参数，λ＝600nm，T＝37℃，开机之后要预热30min，每隔1h测定OD₆₀₀值的变化。利用软件GraphPad Prism 6作图得到裂解曲线图。

噬菌体在以不同MOI感染金黄色葡萄球菌时，均表现出一定的裂解活性。加入噬菌体的实验组细菌吸光值维持在初始值且没有增长的趋势，完全能够抑制细菌的增长，但是在3h后吸光值有所增加，说明宿主菌没有被完全杀死，菌量有所上升，实验结果表明噬菌体LSA2311对宿主菌有较强裂解作用，但不能完全杀死宿主菌。实验组也明显低于阳性对照组，且以不同的MOI值加入噬菌体裂解能力稍有差异，当MOI值高时，对宿主菌的抑制能力也更强。裂解曲线的结果为后续噬菌体的应用实验提供了实验依据。

实施例8：吸附实验

培养金黄色葡萄球菌LSA2311至对数期。以MOI＝0.01比例混合噬菌体液和金黄色葡萄球菌菌液。分别混合于5、10、15、20、25、30min时，各取100μL加至900μL SM buffer缓冲液中，混匀。立即以4℃，13000g离心1min，吸上清液100μL加至900μL SM buffer缓冲液中，混匀待用。双层平板测定效价。

通过LSA2311对其本身宿主吸附实验研究发现，如图6中所示，横坐标表示噬菌体和宿主细菌共同孵育时间，纵坐标表示被宿主菌吸附的噬菌体百分比。当LSA2311和宿主混合孵育，10min后大部分噬菌体吸附到宿主上。

实施例9：噬菌体LSA2311一步生长曲线的测定

按最佳MOI值(MOI＝0.01)将新鲜噬菌体液与宿主菌液各500μL，混匀，37℃温育20min后于4℃下，7000r/min离心2min，尽量弃去上清，用1mL LB培养基洗涤2次，弃上清，用预热的10mL LB培养基重悬。重悬液迅速置于37℃摇床中160r/min振荡培养，同时开始计时，在0min和每隔10min取样300μL，4℃、7000r/min离心30s，立刻吸取上清液100μL于900μLLB培养基中作梯度稀释。

按上述操作每间隔10min，取样选择合适的稀释梯度，测定噬菌体效价。

结果如图7所示，噬菌体LSA2311的潜伏期约为10min；裂解期约为60min；裂解量约为60PFU/cell。

实施例10：噬菌体LSA2311的pH稳定性的测定

用HCl和NaOH调节LB肉汤培养基的pH值，在pH为2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13时，取900μL的LB肉汤培养基分装于无菌EP管中，置于37℃水浴锅中，待温度稳定后加入100μL噬菌体液(约10⁷PFU/mL)，37℃水浴2h，待作用时间结束，根据预实验结果将样品做适当稀释后采用双层平板法测定噬菌体效价。

结果如图8所示，噬菌体LSA2311在pH值6～11时都可以保持较高活性，而且噬菌体活性波动较小，在pH≥12时，噬菌体效价降为最小值并保持不变。

实施例11：噬菌体LSA2311的热稳定性的测定

各取1mL噬菌体液，稀释至10⁷PFU/mL，并分装于2个1mL无菌离心管中，每管各1mL，将EP管分别置于30℃、40℃、50℃、60℃、70℃、80℃恒温水浴锅中，分别在30min、60min时从EP管中取100μL噬菌体液，先冷却至室温，之后用双层琼脂平板法测定噬菌体效价。

结果如图9所示，噬菌体LSA2311的效价在40℃～50℃环境下效价保持稳定没有发生明显变化，50℃～60℃效价开始降低，然而70℃和80℃的高温作用下，则检测不到噬菌体的存在，表明噬菌体基本失活。由此可见该噬菌体在40℃～50℃内具有较强的稳定性。

实施例12：低温4℃及室温25℃条件下，噬菌体LSA2311以不同MOI值(MOI＝1000，MOI＝100)加入牛奶中对金黄色葡萄球菌的抑菌效果实验

将培养至对数期的金黄色葡萄球菌菌液，用PBS缓冲液(pH7.2-7.4)将其浓度调整为1×10⁴CFU/mL。将实验分为六组进行，分别取100μL菌液加入到9.8mL经过灭菌的脱脂牛奶中，将三组牛奶样品放置在25℃的培养箱中20min，将另外三组牛奶样品放置在4℃的培养箱中20min，让菌液充分适应该环境。

在每个温度下的三组实验组中，两组为实验组：取100μL纯化的噬菌体LSA2311液(效价分别为1×10⁸PFU/mL、1×10⁷PFU/mL)加入已加菌液的牛奶中，将其充分混匀；另一组为对照组：取100μL的PBS缓冲液(pH 7.2-7.4)加入已加菌液的牛奶中，将其充分混匀。

将以上经过两种处理的牛奶分别静置于4℃和25℃的培养箱中，分别于0、1、3、6、12、24、48h取出，按照GB-4789.10-2016(国标金黄色葡萄球菌检验方法)平板计数法检测牛奶中金黄色葡萄球菌的数量，进而计算噬菌体的抑菌效果。

如图10所示，25℃、MOI＝1000(噬菌体LSA2311效价为1×10⁸PFU/mL)时，在加入噬菌体的牛奶中，6h后菌数相比对照组降低了4.3log CFU/mL，杀菌效率达到了50％；25℃、MOI＝100(噬菌体LSA2311效价为1×10⁷PFU/mL)时，在加入噬菌体的牛奶中，6h后菌数相比对照组降低了3.5log CFU/mL，杀菌效率达到了40.7％。

如图10所示，4℃、MOI＝1000(噬菌体LSA2311效价为1×10⁸PFU/mL)时，在加入噬菌体的牛奶中，6h后菌数相比对照组降低了2.6log CFU/mL，此时噬菌体LSA2311在牛奶中的杀菌效率达到36.1％；4℃、MOI＝100(噬菌体LSA2311效价为1×10⁷PFU/mL)时，在加入噬菌体的牛奶中，6h后菌数相比对照组降低了2.1log CFU/mL，杀菌效率29.2％。

所述的实施例12中的杀菌效率的计算公式是：(对照组金黄色葡萄球菌数量-实验组金黄色葡萄球菌数量)÷对照组金黄色葡萄球菌数量×100％。

其它未详细说明的部分均为现有技术。尽管上述实施例对本发明做出了详尽的描述，但它仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部实施例，人们还可以根据本实施例在不经创造性前提下获得其他实施例，这些实施例都属于本发明保护范围。

Claims (5)

1.一种金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311，其特征在于：所述噬菌体具有广谱性、能够裂解金黄色葡萄球菌耐药菌株，其命名为金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311，Staphylococcusaureus bacteriophage LSA2311，保藏编号为CCTCC NO：M 2020562。

2.一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在预防金黄色葡萄球菌的杀菌剂中的应用。

3.根据权利2所述的应用，其特征在于：所述金黄色葡萄球菌为金黄色葡萄球菌标准菌株(MSSA)ATCC25923。

4.一种权利要求1所述金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311在牛奶保鲜中的应用。

5.根据权利4所述的应用，其特征在于：所述应用的方法：向牛奶中添加金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311培养液，其中，金黄色葡萄球菌噬菌体LSA2311的添加量为1000～10000PFU/mL。

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