CN1690194A - 一株治疗金黄色葡萄球菌感染的噬菌体 - Google Patents

Abstract

本发明涉及筛选出的金黄色葡萄球菌噬菌体，用作活性治疗物质杀灭细菌或抑制细菌生长，尤其是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(methicillin－resistant Staphylococcus aureus，MRSA)。

Description

一株治疗金黄色葡萄球菌感染的噬菌体

技术领域

本发明涉及用于治疗细菌感染，特别是如金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)感染的噬菌体，及其治疗方法和组合物。

背景技术

细菌的多重抗生素耐药性已成为细菌感染性疾病的治疗难题。尤其是近年来医院内和社区获得性耐药菌感染大幅升高(National Nosocomial InfectionsSurveillance(NNIS)report，data summary from October 1986-April 1996，issued May 1996.Am J Infect Control.1996；24：380-8.)。其中金黄色葡萄球菌，特别是耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistantStaphylococcus aureus，MRSA)已成为这类感染的主要原因之一。因此需要寻求抗生素之外的替代方法来克服细菌耐药性。

噬菌体是细菌的病毒，能特异性地感染细菌，多数噬菌体能烈解宿主菌，或者以其它机制来抑制或破坏特定的菌株。正是利用噬菌体的特异性烈解感染细菌，而不影响患者组织或正常菌群这一特性，噬菌体治疗提供了克服抗生素耐药性细菌感染的治疗前景(Smith，H.W.，a.H.，M.B.J.of Gen.Microbiol.，1982，128((Pt 2))：p.307-318；Merril，C.R.，et al，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，1996，93(8)：p.3188-3192)。

噬菌体治疗的有效性在大肠杆菌(Smith，同上)，伤寒沙门氏菌(Merril，同上)和金黄色葡萄球菌(Shigenobu Matsuzaki，et al，J.of Infec.Dis.2003，187：p.613-624)感染的相应动物模型研究中得到证实。

本发明以新分离出的金黄色葡萄球菌噬菌体，并对临床分离的金黄色葡萄球菌，包括多重耐药性菌株进行离体和动物在体模型研究，实现本发明。

发明内容

本发明已经研究噬菌体治疗抗生素耐药菌的潜在性。特别是，本发明已经确定能烈解金黄色葡萄球菌，尤其是烈解MRSA的特异性烈性噬菌体。本发明尤其证明该噬菌体可用于广谱烈解临床分离出的多重抗生素耐药性金黄色葡萄球菌。

本发明涉及筛选出的金黄色葡萄球菌噬菌体，用作活性治疗物质显著地治疗细菌性感染疾病，更适宜治疗抗生素耐药性细菌感染疾病。

本发明也涉及分离和纯化该金黄色葡萄球菌噬菌体。

进而，本发明提供一种治疗细菌感染性疾病的方法，尤其是治疗抗生素耐药性细菌感染的方法，以一种动物组合给药给予动物需要的筛选出的金黄色葡萄球菌噬菌体。本发明也提供一种减少细菌毒力，尤其是减少抗生素耐药性细菌毒力的方法，以一种从属于组合给药给予筛选出的有效剂量的金黄色葡萄球菌噬菌体。

本发明也提供组合给药方式杀灭或抑制细菌生长。使用该方法的媒介可以是食品，制造食品的物质，动物饲料，医学设备，皮肤，外科灌输，或金属，塑料，搪瓷器，瓷器，或玻璃表面。该媒介可以是惰性载体，也可以常规杀菌的方式加以使用。

本发明也提供一种新的由一种或多种分离并纯化的金黄色葡萄球菌噬菌体制备的杀菌剂，用于消毒或杀灭致病性细菌，以保护任何需要，包括但不限于食品，制造食品的物质，食物制备区域，动物饲料，外科灌输，金属，塑料，搪瓷器，瓷器，或玻璃表面，医学设备和仪器，皮肤。

本发明所涉及金黄色葡萄球菌噬菌体，phi006，能融合性烈解临床分离出的58.70％金黄色葡萄球菌，并能抑制29.35％金黄色葡萄球菌生长，尤其包括MRSA。

本发明所涉及的陈述，组合物，杀菌剂，和方法对抵抗致病菌有用，尤其是多重耐药菌。例如，适合抵抗像金黄色葡萄球菌。本陈述和方法对于抵抗对如万古霉素糖肽敏感性降低的葡萄球菌尤其有用。本发明中具体的葡萄球菌也是甲氧西林耐药性的。

在本说明书和具体实施方法中，使用常规分子生物学和微生物学技术和操作。如Sambrook，Fritsch，和Maniatis，(1989)分子克隆：实验室手册(第2版，冷泉港实验室，冷泉港，纽约)；Parker，M.T.(1972)微生物学方法：7B卷(纽约和伦敦学术出版社)中所述。

本发明方法中所使用的噬菌体是能直接或间接破坏细菌的噬菌体株。相适应的噬菌体可以包括烈性噬菌体，溶源性而后变为烈性的噬菌体(即，噬菌体遗传改造为烈性噬菌体)，和能产生对细菌有害物质的非烈性噬菌体。本发明中首选烈性噬菌体。

本发明中陈述和方法中所使用的噬菌体属于金黄色葡萄球菌噬菌体，特别是本发明所使用噬菌体，phi006，能烈解大约58.70％的金黄色葡萄球菌，和抑制29.35％的金黄色葡萄球菌。

噬菌体可以籍修饰使该噬菌体能延迟被宿主防御***灭活，宿主防御***灭活表现为使噬菌体数量减少，或/和使噬菌体杀灭感染的细菌能力降低。修饰噬菌体可以籍连续通过噬菌体，或噬菌体遗传工程选择性修饰噬菌体株，使修饰噬菌体在体内保留比野生型噬菌体更长的时间(U.S.Pat.Nos.5,811,0935,766,892，5,688,501.)。

该噬菌体能与其它抗菌剂联合使用。能与噬菌体联合使用的适当抗菌剂包括，但不限于抗生素和化学疗法制剂。此类制剂包括青霉素，头孢菌素，糖肽类(如万古霉素，替考拉宁)，

该噬菌体能在适当培养基的适当细菌中生长(此处为SA006)。烈解物经处理制成无活菌和无像细胞壁类的毒性物质的制剂。例如，烈解物可用如过滤的常规方法除菌，使用超滤纯化除去细菌细胞壁。如陈述中描述该噬菌体可以密封包装于安瓿或其它包装形式用于给药。并以检测噬菌体稀释液与特异性的标准菌株共同接种产生的烈解斑数量确定制剂的近似滴度，同时每批均检测残存细菌。具体的为噬菌体制剂的最低浓度介于10⁸至10⁹pfu。此噬菌体制剂可用于注射，也可对其进行浓缩(如冻干)，随后再重新悬浮于诸如生理盐水的缓冲液中。该噬菌体制剂还应用诸如豚鼠的实验动物测定毒性，以确保不含残存的细菌表面碎片。

据此，该噬菌体制剂可以确立其组成或原则，以一种适合活体给药的生物学相容形式给药于动物体或人体。“适合活体给药的生物学相容形式”是指活性物质的给药形式，其治疗效应超过其毒性效应。该活性物质可以给药于动物，包括人，宠物动物，家畜，渔业，动物园动物，和水上公园动物。本发明确立的治疗性活性给药剂量定义为一种在用量和必要时间间期取得预期效果的有效剂量。例如，一种物质的治疗性活性剂量可以依据诸如个体疾病状态，年龄，性别，体重因素而变化。用量范围可调节到给出最佳治疗反应。例如，每天可给几个分开的用量，或该用量可按治疗情况的需要指征适当地减少。

该用量可以在10⁶至10⁸pfu/千克/天，最好是10⁸至10¹¹pfu/千克/天。噬菌体给药可以直至完全消灭致病性细菌。

该活性物质可以用便利的方式给药，诸如注射(皮下注射，静脉注射，等)，口服，肺部气雾剂，鼻腔喷雾，肌肉注射，腹腔注射，***灌注，直肠灌注，局部注射，腰椎穿刺，和直接敷用。依据给药途径，此活性物质可被以保护层(如肠衣片或丸剂)避免酶，酸和其它天然条件下的灭活作用。该噬菌体亦可组合成一种气雾剂形式，特别适合于气雾吸入给药至肺。

在此所描述的药用形式可配制成药物学允许的可用于人或动物的制剂形式，诸如有效量的活性物质与药物学许可的载体混合组成。

技术成熟的赋形剂可用作传输载体。

噬菌体可冻干，于静脉注射给药前再溶解。噬菌体可溶解于适当的媒介，如水溶液，或缓冲液，或悬浮于任何适当的液体，胶体，或多聚混合物制成抗菌剂。抗菌剂可组合成药膏，或敷料作为药用，诸如治疗创伤感染的敷料，或外科插管，或制成广谱消毒剂用于皮肤和口腔清洁液，消毒擦洗剂，洗剂。该杀菌剂也可用于清洁医疗器械，外科手术前擦洗，等等。

本发明的形式和方法适合于抵抗葡萄球菌，如金黄色葡萄球菌。在预防和治疗对如万古霉素糖肽敏感性降低的葡萄球菌造成的感染，该形式和方法尤其有用。具体在本发明中，葡萄球菌也是耐甲氧西林的。本发明中具体首选的组合物和方法用于预防和治疗MRSA感染。

具体实施方法

以下用非限制性实例说明本发明：

用于治疗耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(MRSA)的噬菌体疗法由能烈解于活体中分离的典型MRSA株的噬菌体而建立。该噬菌体经鉴定，能杀灭多数临床分离的金黄色葡萄球菌。

方法和材料：

噬菌体制备：

噬菌体按以下方式分离并命名为phi006。自市政污水厂收集未经处理的污水，加入1mol/L NaCl，搅拌使其溶解，冰浴1小时。于4℃以8000g离心20分钟，将上清液倾入一干净烧瓶内。加入固体聚乙二醇(PEG6000)至终浓度为10％w/v。于室温用磁力搅拌器轻轻搅拌使其溶解。冰浴过夜。于4℃以8000g离心20分钟。弃上清液，将离心管倾斜放置5分钟，用吸管吸去残存液体。用一装有橡皮球的吸管轻轻将噬菌体沉淀重悬于SM溶液中(NaCl 5.8g，MgSO₄·7H₂O 2g，1mol/L Tris·Cl(pH7.5)50ml，2％明胶溶液5ml，加水至1L)。加入等体积氯仿，振荡30秒钟。于4℃以3000g离心15秒钟分离有机相和水相。回收含噬菌体颗粒的水相。将该抽提液300μl与200μl过夜培养的SY006混合，于35℃孵育20分钟，再混合2.5ml于50℃保温的融化顶层的LB琼脂(0.5％)，立即倒入1.5％LB琼脂(LB琼脂含0.3％葡萄糖，0.075mmol/L CaCl₂，0.004mmol/L FeCl₃，2mmol/L MgSO₂，简称LBGCFM)90mm平板上，于35℃培养过夜。收获该平板噬斑，用该法单斑纯化三次。

噬菌体phi006，于SY006宿主菌高滴度增殖，挑取平板上SY006单菌落于1ml LBGCFM液体培养基内，35℃，培养8小时。取该菌0.1ml和0.1ml phi006(2×10⁵PFU/ml)混合于2.8ml 50℃保温的0.5％LBGCFM琼脂内，立即倒入1.5％LBGCFM琼脂平板上，于35℃培养过夜。每平板内加入5ml噬菌体稀释液(SM)，收取该噬菌体洗脱液，并加入1％氯仿，于35℃，1小时。并于4000g，4℃，离心10分钟。于上清液中加入聚乙二醇(平均分子量6000)和氯化钠成终浓度分别为10％和0.5mmol/L，于4℃过夜。8000g，4℃离心20分钟，将含噬菌体颗粒沉淀物悬浮于10mmol/L Tris-HCl(pH7.2)，5mmol/L MgCl₂，5mmol/L CaCl₂缓冲液内。并加入20μg/ml DNase I和10μg/ml RNase A，37℃，30分钟。噬菌体悬液置于氯化铯密度梯度(ρ＝1.3，1.5，和1.7)内，10,000g，4℃，离心1小时。收集噬菌体带，并以10mmol/L NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.2)，20mmol/L MgCl₂，20mmol/l CaCl₂透析该噬菌体两次，每次1小时。使用前以0.22-μm滤器过滤该高滴度噬菌体制备物，过滤后的噬菌体4℃保存。

金黄色葡萄球菌分离和鉴定：

本研究所用金黄色葡萄球菌自中山大学第三附属医院外科门诊局部感染患者创面处收集并分离鉴定。血琼脂平板上，周围呈透明的β-溶血环之菌落，其血浆凝固酶阳性和甘露醇发酵阳性之菌株进而测定其抗生素敏感性。接种1.5×10⁸CFU/ml的待测菌于Mueller-Hinton琼脂平板(每升培养基牛肉浸汁粉2g，水解酪蛋白17.5g，淀粉1.5g，琼脂13g，氯化钠40g，加H₂O至1L，pH7.4，于115℃灭菌10分钟，冷却至45-50℃时倾倒平板，20ml/90mm板)，于35℃培养24小时。同时接种苯唑西林敏感的SAATCC 29213株，和苯唑西林耐药的SAATCC 43300株为对照。采用美国临床微生物标准化委员会(NCCLS)推荐分组和判断标准。药敏纸片购自北京天坛药物生物技术开发公司，包括：苯唑西林，青霉素G，红霉素，万古霉素，甲氧苄啶/磺胺甲噁唑，环丙沙星，氯霉素，呋喃妥因。相关金黄色葡萄球菌菌株冻干保藏于广州虎克噬菌体有限公司噬菌体实验室。见表1。

                    表1.92株金黄色葡萄球菌抗生素敏感试验模式

敏感性抗生素	OXA	PEN	E	VA	SXT	CIP	C	FT
									敏感中介耐药	55-37	27-65	71-21	92-0	75-17	92--	92--	92--

注：OXA：苯唑西林，PEN：青霉素G，E：红霉素，VA：万古霉素，SXT：甲氧苄啶/磺胺甲噁唑，CIP：环丙沙星，C：氯霉素，FT：呋喃妥因

噬菌体phi006对金黄色葡萄球菌敏感试验：

分别挑取上述92株金黄色葡萄球菌单菌落于1ml LBGCFM液体培养基内，35℃，培养8小时。以接种环挑取一满环菌液，于平板涂布直径约1cm。待接种菌液干躁后滴加噬菌体phi006一滴(约0.01ml)于接种处，置35℃培养8-12小时观察结果。见表2。

表2.92株金黄色葡萄球菌噬菌体phi006烈解试验

烈解模式噬菌体	3×108PFU/ml
		融合性烈解(CL)部分烈解(OL)不烈解(-)	54(58.70％)27(29.35％)11(11.95％)

噬菌体phi006实验治疗小鼠腹腔感染金黄色葡萄球菌：

一个月龄NIH雌性小鼠(每组5只，2002A022，广东省科学技术委员会；26-2003A001，广东省医学实验动物管委会)用于感染实验。按以下方式建立感染，金黄色葡萄球菌SY050株(耐药模式为OXA^RP^RE^RSXT^R)35℃生长于LBGCFM液体培养基内，培养18小时，收集菌苔于灭菌磷酸盐缓冲液(PBS)中，1,000rpm/分，10分钟，除去上清，连续三次PBS洗涤。该PBS菌液连续稀释用于测定最小致死剂量(minimum lethal dose，MLD)，注射300μl该稀释菌液于NIH小鼠一侧腹腔，准确记录小鼠死亡时间，观察100小时以上。本试验测得4×10⁹CFU(SY050)为NIH小鼠的MLD，所有接受注射MLD剂量的小鼠于300余分钟内死亡。见表3。

表3.金黄色葡萄球菌致死性MLD剂量感染NIH小鼠存活时间(分钟)

鼠号细菌剂量(109CFU/ml)	8×	6×	4×	2×
					12345	285276268302287	294265298310287	268302295323317	48004800480048004800
均数标准差	283.612.9	290.816.7	301.021.6

腹腔注射MLD剂量细菌后，立即对侧腹腔单剂量注射噬菌体phi006。连续24小时观察记录感染动物存活时间的剂量效应。噬菌体高感染复数0.2和2.0组，100％动物存活。当噬菌体剂量降低，结果低感染复数0.02组的动物存活时间为600余分钟。见表4。

噬菌体phi006实验治疗新西兰兔皮肤感染金黄色葡萄球菌：

新西兰家兔(雌性，2kg，每组3只。2002A025，广东省科学技术委员会；26-2003A004，广东省医学实验动物管委会)，按以下方式制备皮肤感染模型。于兔背部前1/3处两侧脱被毛约直径4cm，以碘伏消毒，皮下接种金黄色葡萄球菌SY050株(100μl，4×10⁹CFU/ml)。接种后7天形成直径约1-1.5cm溃疡，并于30天自愈。于不同时间不同剂量给予噬菌体phi006治疗，于双侧感染局部皮下或溃疡部位多点给药，500μl/次，2次/天，连续给药4天。而对照组于接种后7天以10mmol/L NaCl，10mM Tris-HCl(pH7.2)，20mmol/L MgCl₂，20mmol/l CaCl₂代替噬菌体phi006。观察并记录红肿消退，溃疡形成时间，及治愈时间。见表5。

表4.噬菌体phi006挽救小鼠致死性金黄色葡萄球菌菌血症剂量效应(分钟)

鼠号噬菌体剂量(1010PFU/ml)	2×	0.2×	0.02×	0
					12345	48004800480048004800	48004800480048004800	480674653552480	286295312307320
均数标准差			567.892.5	304.013.5

表5.噬菌体phi006治疗新西兰兔皮肤感染金黄色葡萄球菌(愈合时间：天^a)

治疗组兔号	1	2	3	均数	标准差
						接种 2×109pfu/ml后1d 2×107pfu/ml	-/5.5-/8.5	-/6.0-/9.0	-/6.0-/9.5	5.839.00	0.29b0.50
接种 2×109pfu/ml后7d 2×107pfu/ml	15.519.5	16.519.0	15.020.5	15.6719.67	0.76c0.76
						对照 0	29.5	31.5	28.5	29.83	1.53

注：a：自接种细菌后计算；b：自接种后无溃疡形成，红肿消退的时间；c：自接种后溃疡形成，溃疡愈合的时间。

生物材料的保藏：

噬菌体phi006株，已于2004年4月26日按照布达佩斯条约在中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(CGMCC)进行了保藏。编号为CGMCC 1139。

Claims (11)

1.一种分离并纯化的金黄色葡萄球菌噬菌体用于治疗或预防细菌感染。

2.一种含有金黄色葡萄球菌噬菌体的药剂。

3.一种如权利要求2所要求的药剂，其中的噬菌体是phi006，或phi006的修饰株。

4.一种治疗细菌感染性疾病的方法，以一种动物组合给药给予动物噬菌体进行治疗，该噬菌体如权利要求1所要求的。

5.一种如权利要求4中所要求的方法，所指细菌感染性疾病是由金黄色葡萄球菌引起。

6.一种降低细菌毒力的方法，以一种受试动物组合给药给予动物有效剂量的如权利要求1所要求的噬菌体。

7.一种如权利要求6所要求的方法，所指细菌是金黄色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

8.一种如权利要求1所要求的噬菌体，以有效噬菌体剂量杀灭或抑制细菌生长的方法。

9.一种如权利要求8所要求的方法，所指细菌是金黄色葡萄球菌，包括耐甲氧西林金黄色葡萄球菌。

10.一种如权利要求8所要求的方法，所指方法用于处理食品，制造食品的原料，动物饲料，医疗器械，皮肤，外科导管，或金属器，塑料器，搪瓷器，瓷器和玻璃表面。

11.一种如权利要求8所要求的杀菌剂，含有分离并纯化的噬菌体phi006。