TW201731523A - 包含長效紅血球生成素之組成物 - Google Patents

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Abstract

本發明係提供含有長效紅血球生成素的組成物及其製備方法。更具體地提供了具有優異的生物可持續性和高純度的EPO-Fc融合蛋白質組成物，其中EPO-Fc的唾液酸含量為17mol/mol或者更多，並且以100ng/mg或者更少的量包括宿主細胞衍生的蛋白質(HCP)雜質。

Description

包含長效紅血球生成素之組成物
本發明是關於一種包括長效紅血球生成素的醫藥組成物及其製備方法。
包括165個胺基酸的紅血球生成素(EPO)是一種糖蛋白以促進骨髓內紅血球母細胞的分化且產生紅血球。EPO最多於腎臟產生且已知亦少量於肝臟產生。例如，如於慢性腎衰竭(CRF)所示，腎臟功能的損失典型地引起EPO產生的下降以及因此造成相關紅血球的下降。業已發現EPO對於因CRF引起的貧血和因多元成因造成的其他貧血的治療具有優異功效，以及具有如外科手術輔助之不同的造血功能。
一般而言，如EPO之多肽具有低穩定度且容易被蛋白質水解酶，亦即血液中的蛋白酶，所退化及分解，由此經由腎臟或肝臟容易地排除。因此，多肽有短的生物半衰期間(半衰期)。所以，為了維持含有多肽作為藥學組成的蛋白質醫藥的血液濃度及效價，該蛋白質醫藥需要經常投藥給患者。然而，在該欲投藥的蛋白質醫藥為注 射調配物類型的情況中，經常注射以保持活性多肽的血液濃度通常可能引起患者疼痛。
為了增加EPO多肽的半衰期，目前已開發使用免疫球蛋白(Ig)所製備的融合蛋白質。Ig是血液的重要構造性組成。人類Ig(hIg)可包括多種類別如IgG、IgM、IgA、IgD和IgE。
免疫球蛋白含有四個多肽鏈，且更具體而言，兩個重鏈和兩個輕鏈，其中該等鏈是經由雙硫鍵一起組合以形成四聚體。各鏈由變異區和恆定區所組成。重鏈的恆定區(重鏈恆定區)根據其同型(isotype)可再分為三或四個區段(site)如CH1、CH2、CH3和CH4。重鏈恆定區的Fc區依Ig的同型可包括鉸鏈(hinge)、CH2、CH3和/或CH4功能域(domain)。
關於半衰期，融合於免疫球蛋白之Fc區域的嵌合蛋白質已知顯示增加安定性與延長的血清半衰期。
再者，已知黏附唾液酸至EPO蛋白質的表面可於肝臟中誘發蛋白質降解的預防。唾液酸於去唾液酸糖蛋白受體中保護第二個半乳糖基因而因此影響活體中的EPO活性(生物活性)。已知存在於紅血球生成素的糖鏈的唾液酸在紅血球生成素半衰期的延長扮演重要角色，最終地，影響其功效。再者，由於已發現紅血球生成素的生物活性藉由唾液酸酶的反應而失活，更活躍地進行唾液酸對紅血球生成素生物活性的功能的研究。在多數情況下，使用於治療劑製造中的糖在表現糖蛋白的本質功效上具有基礎及不可 少的角色。尤其是，對於人衍生的紅血球生成素，糖的角色是絕對需要的。換言之，假如不包括糖，紅血球生成素不顯示活性，根據糖的結構組成或於終端的唾液酸的含量，EPO的生物活性顯著地受到影響。
宿主細胞表現期間，EPO-Fc中的唾液酸含量可藉由添加N-乙醯基甘露糖胺至培養溶液而增加。上述過程後所得到的EPO-Fc通常是高唾液酸含量的EPO-Fc和低唾液酸含量的EPO-Fc的混合物。在此，已知高唾液酸含量的EPO-Fc較低唾液酸含量的EPO-Fc具有較長的半衰期。因此，有需要開發出選擇性地製造具有增加的唾液酸含量的EPO-Fc的技術。
EPO-Fc製造時，需要培養經轉形的宿主細胞，表現大量的EPO-Fc，崩解細胞以及純化EPO-Fc。因此，對於大量生產高品質EPO-Fc，最適化培養和純化技術為非常重要。於目前已開發的培養和純化技術仍有大的改良空間，因此，迫切需要的是經由開發上述技術以最適化EPO-Fc製備過程。韓國專利公告案號897938(2009年5月8日登錄)揭露免疫球蛋白融合蛋白質。
因此，本發明的目的是提供一種在活體中具有優異持續性(生物持續性)的EPO-Fc融合蛋白質組成物。
此外，本發明的另一個目的是提供一種具有高唾液酸含量的EPO-Fc融合蛋白質組成物。
再者，本發明的另一個目的是提供一種具有高純度的EPO-Fc融合蛋白質組成物。
進一步地，本發明的另一個目的是提供一種具有降低含量的宿主細胞衍生的雜質的EPO-Fc融合蛋白質組成物。
本發明的上述目的藉由下述特徵達成：
(1)一種EPO-Fc組成物，包括EPO-Fc，該EPO-Fc具有唾液酸的含量是17mol/mol或者更多，以及宿主細胞衍生的蛋白質雜質的量是100ng/mg或者更少。
(2)如上述(1)之EPO-Fc組成物，其中唾液酸含量範圍從20至28mol/mol。
(3)如上述(1)之EPO-Fc組成物，其中EPO-Fc具有pI6.0。
(4)如上述(1)之EPO-Fc組成物，其中EPO-F具有4.5pI5.3。
(5)如上述(1)之EPO-Fc組成物，其中宿主細胞衍生的蛋白質雜質是EPO-Fc的凝集物或片段。
(6)如上述(1)之EPO-Fc組成物，其中宿主細胞衍生的蛋白質雜質的量是60ng/mg或者更少。
(7)如上述(1)之EPO-Fc組成物，進一步包括0.5ng/mg或者更少的宿主細胞衍生的DNA雜質。
(8)一種製備EPO-Fc組成物的方法，包括：於溫度範圍35℃至39℃以及6.5pH7.5的條件下以4vvd或更低的流動速率流動EPO-Fc細胞培養溶液，以製備灌注培養溶液； 從灌注培養液得到EPO-Fc純溶液；以及EPO-Fc純溶液吸附至陰離子交換樹脂以製備Q流出物，其包括具有唾液酸含量是17mol/mol或者更多的EPO-Fc。
(9)如上述(8)的方法，其中Q流出物的製備包括：EPO-Fc吸附至陰離子交換樹脂；以及使用含有0.005到0.02M的磷酸鈉、0.05到0.2M的L-精胺酸和0.02到0.1M的氯化鈉，且具有6.7pH7.1的緩衝液，洗脫出經吸附的EPO-Fc。
(10)如上述(8)的方法，其中得到EPO-Fc純溶液的步驟包括將灌注培養溶液通過POD過濾器。
(11)如上述(8)的方法，其中宿主細胞衍生的蛋白質(HCP)雜質的量於EPO-Fc組成物中為100ng/mg或者更少。
(12)如上述(8)的方法，其中EPO-Fc細胞培養溶液，係以2.0x105細胞/mL或更多的量接種至培養器。
(13)如上述(10)的方法，進一步包括，灌注培養溶液通過POD過濾器之後，將上述溶液通過經填充有蛋白質A-結合樹脂的管柱。
(14)如上述(8)的方法，其中Q流出物中所含有的EPO-Fc具有pI是6.0或者更低的。
(15)如上述(8)的方法，進一步包括分別使用POD過濾器、超濾膜以及奈米過濾器過濾Q流出物。
根據本發明的EPO-Fc組成物的特徵是糖鏈末端的常現部份是用唾液酸封端，因此增加半衰期以及增強患者的便利性。
根據本發明的EPO-Fc組成物具有降低含量的宿主細胞衍生的蛋白質雜質和DNA雜質，因此具有高的EPO-Fc純度。
根據本發明之用於製備EPO-Fc組成物的方法可能適合用於具有上述特徵之EPO-Fc的選擇性純化。
根據本發明之用於製備EPO-Fc組成物的方法可能顯著地改良唾液酸的附著至EPO-Fc和增強宿主細胞的存活，以及增強過程效率。
由後文的詳細說明以及隨附的圖式使本發明之上述及其他的目的、特徵和其他優點更清楚地被了解。
第1圖是顯示EPO-Fc等電點聚焦(isoelectric focusing)檢查的檢測結果圖。
本案發明者已基於用於改良製造性及唾液酸含量的宿主細胞培養技術、高唾液酸含量EPO-Fc選擇技術以及用於移除宿主細胞衍生的雜質而完成本發明。
本發明揭露一種EPO-Fc組成物，其含有具17mol/mol或者更多唾液酸，以及100ng/mg或者更少的宿主細胞衍生的蛋白質(宿主細胞蛋白質，HCP)雜質的EPO-Fc，和用於其製備的方法。
以下，本發明將更詳細說明。
EPO-Fc融合蛋白質是藉由將人類免疫球蛋白重鏈恆定區的Fc區融合到紅血球生成素(EPO)而形成， 且具有較EPO為更長的半衰期。該增加的半衰期是指增加功效的生物可持續性。
唾液酸存在於EPO的糖鏈，保護去唾液酸糖蛋白受體的第二個半乳糖基團，如此大幅地影響EPO的生物活性。進一步地，唾液酸可於肝臟中誘發EPO降解的預防因而增加半衰期。
因此，除了起因於Fc融合的半衰期增加功效外，EPO-Fc融合蛋白質中所含有的唾液酸的附著可提供增加半衰期的功效。
在EPO-Fc宿主細胞的培養期間，可將N-乙醯基甘露糖胺(NAM)添加於培養溶液以增加EPO-Fc的唾液酸含量。上述過程後所得的EPO-Fc通常包括高唾液酸含量的EPO-Fc和低唾液酸含量的EPO-Fc的混合物，其中，已知高唾液酸含量的EPO-Fc較低唾液酸含量的EPO-Fc，具有較長的半衰期。
根據本發明的一具體例，附著至EPO-Fc的唾液酸數目係增加，pI值係降低。基於此面向，使用陰離子交換樹脂可選擇性地純化高唾液酸含量的EPO-Fc。較佳的是使用含有交聯瓊脂糖的陰離子交換樹脂。根據一具體例，可以使用GE醫療公司(GE Healthcare Co.)所製造的Q-Sepharose樹脂。
藉由使用陰離子交換樹脂的純化過程，可選擇性地純化具有pI6的EPO-Fc。特別地，具有唾液酸含量是17mol/mol或者更多的EPO-Fc可經由此過程獲得。 根據一具體例，在4.5pI6.0的情況，可以獲得唾液酸含量是17到28mol/mol之含有EPO-Fc的組成物。根據另一具體例，在4.5pI5.3的情況，可以獲得唾液酸含量是20到28mol/mol之含有EPO-Fc的組成物。
在EPO-Fc製造期間，可能混有宿主細胞衍生的蛋白質(HCP)雜質。HCP雜質可包括，例如，含有如可能衍生自宿主細胞及其他材料之不同凝集物及片段的不正常胜肽的蛋白質雜質、DNA雜質、固有或外來的病毒和其他的顆粒或類似物。
消除這些雜質可能是一個重要的過程而直接影響EPO-Fc融合蛋白質的品質。當這個組成物是經由根據本發明的一系列過程而製備時，HCP可調控在100ng/mg或者更少的量，以及較佳是60ng/mg或者更少。宿主細胞衍生的DNA雜質可能可以0.5ng/mg或更少的量含有。
用於製備本發明的EPO-Fc組成物的方法，可依下述完成：
用於製備本發明的EPO-Fc組成物可包括：(1)於溫度範圍35℃至39℃以及6.5pH7.5的條件下，以4vvd或更低的流動率流動EPO-Fc細胞培養溶液以製備灌注培養溶液；(2)從灌注培養溶液得到EPO-Fc純溶液；(3)EPO-Fc純溶液吸附至陰離子交換樹脂，以製備具有唾液酸含量17mol/mol或者更多之含有EPO-Fc的Q流出物。
步驟(1)的灌流培養溶液可以如下述製備。
首先，EPO-Fc主細胞庫(master cell bank,MCB)可從用於EPO-Fc研究的細胞庫(RCB)來建立，以及EPO-Fc工作細胞庫(working cell bank,WCB)可從EPO-Fc主細胞庫(MCB)來建立。
用於建立MCB和WCB的培養可包括於3至7% CO2和37℃條件下，於包括L-穀胺醯胺及甲胺蝶呤的EX-cell CHO DHFR(-)的液體培養基中，次培養細胞，然後，將產物分配在用於冷凍和儲存的低溫小瓶。
在經冷凍及儲存的WCB細胞株解凍之後，經解凍的細胞株係提供且懸浮在培養基中以於培養基中增殖細胞。例如，次培養可使用搖瓶於經設定為3到7% CO2和37℃的CO2培養箱，以1：2到1：6的比率，間隔50到90小時進行。該培養中使用數個搖瓶可使培養的細胞數達到足以接種到細胞培養箱的足量。
在這種情況下，可使用EPO-Fc培養基。EPO-Fc培養基可包括，例如，EX-cell CHO DHFR(-)的粉末培養基、L-穀胺醯胺、甲胺蝶呤和碳酸氫鈉。
當用於接種的足量宿主細胞係經由搖瓶培養確保時，該等細胞可接種到主要培養箱，以便進行灌注培養。此處使用的主要培養箱可為30公升生物培養箱。
在接種到主要培養箱後，可獲得細胞濃度為2.0x105細胞/mL或更高。
主要培養箱的培養溫度範圍可從35到39℃或從36到38℃等。
主要培養箱的酸度可維持在範圍6.5pH7.5(在pH調控後)，6.8pH7.2(在pH調控後)等。
在灌流培養期間，若有需要，培養溶液可以取樣且以顯微鏡觀察，以便監控細胞的情況，過程檢測可以藉由分析pH、細胞數、細胞活性、葡萄糖濃度、穀胺醯胺濃度、氨濃度、滲透壓等而實施。
灌流率可調控為4vvd或更低。灌流率範圍可從0到4vvd、0到2vvd、1到3vvd、1到2vvd等。
用於此處的灌流培養基可包括藉由在EPO-Fc培養基添加N-乙醯基甘露糖胺所製備的培養基(即是經添加N-乙醯基甘露糖胺的培養基)，在EPO-Fc培養基添加N-乙醯基甘露糖胺及葡萄糖所製備的培養基(製造培養基)，或這兩種培養基可依序使用。
例如，根據每天40公升灌流培養4天，可得到總共140至180公斤的用於EPO-Fc製造的細胞培養溶液。重複上述收集細胞培養溶液一次到十次或二次到五次，可提供更增量的用於EPO-Fc製造的細胞培養溶液。
如上述所得到的細胞培養溶液，可成為本發明的步驟(1)的灌流培養溶液。
根據本發明之製備灌流培養溶液的步驟，17mol/mol或更多、17至28mol/mol、或20至28mol/mol的唾液酸可黏附至EPO-Fc。進一步地，細胞的存活可經改良因而增強EPO-Fc組成物的生產性。
用於製備本發明之EPO-Fc組成物的方法可 進一步包括(2)從灌流培養溶液得到EPO-Fc純溶液。
上述的步驟具有主要目的在於移除除了步驟(1)的灌流培養溶液中所含有的EPO-Fc以外的其他成份。這種移除可包括用於細胞培養的任何傳統方法。這種移除方法可與如上所述的過濾和純化過程的至少一者組合。
在回收步驟(1)的灌注培養溶液後，這個溶液可接受用於過濾及純化的多個步驟，因而移除宿主細胞衍生的雜質。該等宿主細胞衍生的雜質可包括，例如，含有如不同的凝集物和片段的異常胜肽的蛋白質雜質、DNA雜質、固有的病毒、外來的病毒和其他顆粒。
宿主細胞是指步驟(1)中用於EPO-Fc表現的所有細胞。
根據一具體例，為了移除用於EPO-Fc製造的宿主細胞培養溶液中所含有的宿主細胞衍生的蛋白質(HCP)雜質或DNA雜質，可以使用POD深度濾器。POD深度濾器通常用於移除細胞，然而，本發明用於移除蛋白質。
使用POD深度濾器以及過濾器，可移除如蛋白質凝集物、片段和其他的顆粒的宿主細胞衍生的蛋白質(HCP)雜質。
例如，如POD濾器，可以使用Merck Millipore製造的Millistak+(MA1HC10FS1)。進一步地，此處使用的過濾器可為Sartorius Co.製造的Sartobran P無菌等級膠囊。
根據另一具體例，蛋白質A純化，低pH病毒失活和/或羥基磷灰石純化等，可適用於EPO-Fc純化。
根據另一具體例，超濾裝置，亦即切向流過濾(tangential flow filtration,TFF)膜系統，可用於濃縮和緩衝液更換。若導電率和酸度經由緩衝液更換而在參考範圍內，則完成濃縮和緩衝液更換的過程(參考：導電率9.0±1.0mS/cm，酸度pH 6.9±0.1)。
步驟(2)中的EPO-Fc純溶液可如上所述製備。
用於製備本發明之EPO-Fc組成物的方法可包括(3)EPO-Fc純溶液吸附到陰離子交換樹脂，以製備Q流出物，該Q流出物包括具有唾液酸含量17mol/mol或者更多的EPO-Fc。
上述步驟具有主要的目的在於選出組成物中所含有之EPO-Fc具有唾液酸含量17mol/mol或者更高的特異者。
這一個步驟可以藉由將步驟(2)中的EPO-Fc純溶液，通過經填充含有交聯瓊脂糖的陰離子交換樹脂的管柱進行。
根據一具體例，可使用GE醫療公司的Q Sepharose樹脂，例如，可使用下表1所示的Q Sepharose Fast Flow樹脂。
製備Q流出物的過程可以包括：藉由使用含有0.005至0.02M磷酸鈉的平衡緩衝液平衡Q-Sepharose樹脂；使EPO-Fc純溶液通過Q-Sepharose樹脂以吸附EPO-Fc；藉由使用上述平衡緩衝液重新平衡Q-Sepharose樹脂；和將含有0.005至0.02M磷酸鈉、0.05至0.2M L-精胺酸和0.02至0.1M氯化鈉且具有酸度為6.7pH7.1的流出液通過該管柱以收集EPO-Fc的Q流出物。
可以適當地重複洗脫。例如，當洗脫重複進行4次時，在第一至第三次純化中獲得的Q流出物No.1至3被儲存在超低溫冷凍冰箱中，並且在完成第四次洗脫後，所有的Q流出物No.1至4可以進行匯集。
視需要地，在洗脫後，可以使用POD濾器進行過濾。此處使用的POD濾器可以包括，例如，由Merck Millipore Co.製造的Millistak+(MA1HC10FS1)。
除了上述過程之外，視需要地，可以進一步包括在管柱安裝過濾器的過程和藉由使樹脂與CIP接觸來殺菌和洗滌Q-Sepharose樹脂的過程。根據一具體例，此處使用的過濾器可包括，例如，由Sartorius Co.製造的Sartobran P無菌等級膠囊。
步驟(3)中得到的Q流出液中所含的EPO-Fc可以具有pI6.0且唾液酸含量為17mol/mol或者更多。例如，EPO-Fc可以為4.5pI6.0且唾液酸含量可為範圍17至28mol/mol，或EPO-Fc可以為4.5pI5.3且唾液酸含量可為範圍20至28mol/mol。
用於製備本發明的EPO-Fc組成物的方法還可以包括(4)分別經由POD濾器、超濾膜和/或奈米濾器過濾Q流出物。
根據上述步驟，EPO-Fc可以具有增加的濃度，可以更換緩衝液，並且可以消除病毒。
此處使用的POD濾器可以是由Merck Milipore Co.製造的Millistak+(MA1HC 10FS1)。
此處使用的超濾膜可以包括，例如，切向流過濾(TFF)膜系統。例如，在使用注射緩衝液洗滌膜(截留：30K)後，可以使用製劑緩衝液使膜平衡。製劑緩衝液可以含有0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸和0.1M氯化鈉，並且具有pH 6.2±0.2的酸度。
完成平衡後，可將目的蛋白質濃縮至約1.5±0.3mg/mL。如果回收的溶液具有約1.5±0.3mg/mL的蛋白 質濃度，則可以藉由以相同體積連續加入用於製備粗製溶液的緩衝液來進行緩衝液交換。如果最終回收的溶液的導電率和酸度在其參考範圍內，則完成濃度和緩衝液交換過程(參考：導電率12.0±2.0mS/cm，酸度pH6.2±0.2)。
當最終回收的溶液的濃縮和緩衝液交換過程完成時，可以使用奈米濾器(PALL(NT6DV20P1G))進行過濾，以消除可能源自宿主細胞或在該過程中使用的額外的材料的病毒。
根據一具體例，在洗滌用於病毒過濾的濾器之後，進行濾器的完整性測試，並且可藉由將用於粗製製造的緩衝液通過病毒過濾器來達成平衡。完成平衡後，濃縮和緩衝液更換的過程完成後的最終回收的溶液可以在30±3psi的壓力下通過濾器。因此，可以回收無病毒的病毒濾液。過濾完成後，可以使用注射緩衝液洗滌病毒過濾器，然後進行完整性測試。
對病毒濾液加入濃度為0.12g/Kg的聚山梨醇酯20和製劑緩衝液可以使蛋白質濃度調節至1.1±0.3mg/mL，然後使用滅菌過濾器可以製造EPO-Fc粗製溶液。
根據一具體例，製劑緩衝液可以包括0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸和0.1M氯化鈉，並且具有pH 6.2±0.2的酸度。根據一具體例，此處使用的滅菌過濾器可以是由Sartorius Co.製造的Sartobran P300。所製備的EPO-Fc粗製溶液可以分配並儲存在超低溫冷凍冰箱中。
藉由對EPO-Fc粗製溶液加入製劑緩衝液，然後通過滅菌過濾器過濾，將蛋白質濃度調節至0.5±0.1mg/mL，得到最終的EPO-Fc粗製溶液。此處使用的該滅菌過濾器可以包括例如由Sartorius Co.製造的Sartobran P midicap。
在下文中，將參考實施例更詳細地描述本發明。然而，提出這些實施例僅用於說明本發明的較佳具體例，並且本發明的範圍不特別限於此。
實施例1：EPO-Fc組成物的製備
<過程1：EPO-Fc主細胞庫(MCB)的製備>
對EX-細胞CHO DHFR(-)液體培養基中加入L-穀胺醯胺和甲胺蝶呤以形成培養基並將用於EPO-Fc研究的細胞庫(RCB)接種到培養基後，經由次培養增加總細胞數和總培養體積，從而構建MCB。培養在5.0±2.0%CO2培養箱中進行，直至培養溶液達到37℃的溫度。
<過程2：EPO-Fc工作細胞庫(WCB)的製備>
對EX-細胞CHO DHFR(-)液體培養基中加入L-穀胺醯胺和甲胺蝶呤以形成培養基並將過程1所製備的MCB接種到培養基後，經由次培養增加總細胞數和總培養體積，從而構建WCB。培養在5.0±2.0%CO2培養箱中進行，直至培養溶液達到37℃的溫度。
<過程3：WCB融合>
在將過程2中經冷凍及儲存的WCB解凍後，經解凍的WCB懸浮在EPO-Fc培養基(包括EX-細胞CHO DHFR(-)粉 末培養基、L-穀胺醯胺、甲胺蝶呤和碳酸氫鈉)中，然後將其培養在設置有5%CO2的37℃的CO2培養箱中。
<過程4：搖瓶細胞的培養>
將過程3的培養溶液以64至80小時的間隔進行次培養，以確保足以將其接種到細胞培養箱所需的細胞數。使用EPO-Fc培養基在設置有5%CO2和37℃的CO2培養箱中以1：3至1：4的比率進行次培養。
<過程5：在主培養箱(30L生物培養箱)中的製造和培養>
在獲得足量的過程4的培養溶液後，收集細胞並接種到主培養箱中以達到2.0×105細胞/mL。然後，使用其中進一步添加有N-乙醯基甘露糖胺的EPO-Fc培養基培養上述溶液。在培養中保持培養溫度為37±1℃和pH 7.0±0.2(pH調控後)，進行灌注培養。如果需要，藉由取樣培養溶液進行過程檢測。根據過程檢測的結果，將灌注率調控在0至2vvd的範圍。為了製備培養溶液，藉由新的EPO-Fc製造培養基(於EPO-Fc培養基中加入N-乙醯基甘露糖胺和碳酸氫鈉所製備)更換所用的培養基，然後進一步進行灌注培養。以約每天40L持續4天收集140至180kg培養溶液，以獲得一個子批次。藉由重複上述過程總共4次，持續16天，進行培養直到收集總共四(4)個子批次。結果，獲得用於EPO-Fc製造的宿主細胞的培養溶液(灌注培養溶液)。
<過程6：培養溶液的回收和過濾>
使用POD濾器(MA1HC10FS1)和過濾器(Sartobran P-無 菌等級膠囊)過濾過程5的用於EPO-Fc製造的宿主細胞培養溶液，然後獲得灌注培養溶液的濾液並儲存。
<過程7：蛋白質A的純化>
在做成使用平衡緩衝液(0.01M磷酸鈉)以平衡狀態填充蛋白A鍵合樹脂的管柱並將過程6的濾液吸附到管柱之後，使用洗滌緩衝液(0.7M L-精胺酸，pH 5.7±0.05，導電率37.0±1.0mS/cm)清洗管柱，然後使用洗脫緩衝液(0.02M乙酸鈉無水物、0.2M L-精胺酸、7.94%(v/v)甘油，pH 3.7±0.05)洗脫目標蛋白質(EPO-Fc)，然後儲存。
<過程8：低pH病毒失活>
如果過程7的純溶液測量其pH的結果為不適合作為參考，則對其加入pH調節緩衝液(1M氫氧化鈉(NaOH)，10%乙酸)以調節pH(3.7±0.05)，接著進行此過程同時攪拌溶液持續2小時。在完成該過程之後，使用pH調節緩衝液(1M氫氧化鈉，10%乙酸)將pH調節至約pH 6.9±0.1。
<過程9：羥基磷灰石的純化>
在填充有固定相(羥基磷灰石)並且用平衡緩衝液(0.01M磷酸鈉)將其平衡的管柱安裝過濾器(Sartobran P-無菌等級膠囊)之後，將過程8的純溶液吸附到管柱，然後，移除過濾器(Sartobran P-無菌等級膠囊)，隨後使用洗脫緩衝液(0.1M磷酸鈉和0.1M L-精胺酸，pH 6.9±0.1)洗脫目標蛋白質，然後儲存。
<過程10：超濾濃縮和緩衝液更換1>
在使用超濾裝置(膜：截斷30K，包括0.5m2)濃縮過程 9的純溶液後，藉由連續加入平衡緩衝液(0.01M磷酸鈉)進行緩衝液更換。當導電率和pH在其參考範圍內時，該過程完成且收集濃縮和緩衝液更換1的滯留溶液，得到EPO-Fc純溶液。
<過程11：Q Sepharose的純化>
在填充有固定相(Q Sepharose)的管柱安裝過濾器(Sartobran P-無菌等級膠囊)並以包含0.01M磷酸鈉的平衡緩衝液平衡Q Sepharose樹脂後，將過程10的EPO-Fc純溶液吸附到管柱，然後，除去過濾器，即Sartobran P無菌等級膠囊，並將Q Sepharose樹脂重新平衡，隨後使用洗脫緩衝液(0.01M磷酸鈉及0.1ML-精胺酸、0.05M氯化鈉，pH 6.9±0.1)洗脫目標蛋白質，以獲得並儲存EPO-Fc的Q流出物。
<過程12：流出物的解凍和過濾>
將過程11的經儲存的Q流出物解凍並進行匯集。使用製劑緩衝液(0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸、0.1M氯化鈉，pH 6.2±0.2)平衡POD濾器(MA1HC054H1)，隨後藉由使Q流出液通過濾器以獲得濾液。
<過程13：超濾濃縮和緩衝液更換2>
在使用超濾裝置(膜：截留30K，包括0.1M2)濃縮過程12的Q匯集濾液以達到目的蛋白質濃度後，藉由連續添加製劑緩衝液(0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸、0.1M氯化鈉，pH 6.2±0.2)進行緩衝液更換。當導電率和pH在其參考範圍內時，該過程完成，並收集濃縮和緩衝液更換2的滯留溶液。
<過程14：奈米濾器過濾>
將製劑緩衝液(0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸、0.1M氯化鈉，pH 6.2±0.2)流入奈米濾器(Pall(NT6DV20P1G))以使其平衡後，過程13的濃縮和緩衝液更換2的滯留溶液流入其中，從而消除可能存在於濃縮和緩衝液更換2滯留溶液中的病毒。
<過程15：EPO-Fc粗製溶液的製備>
過程14中獲得的病毒濾液中加入0.12g/kg聚山梨醇酯20，並使用製劑緩衝液調節蛋白質濃度。然後，使用滅菌及過濾器(Sartobran P300)進行滅菌和過濾以製備EPO-Fc粗製溶液，同時符合粗製蛋白質濃度(參考：1.1±0.3mg/mL)，隨後將其分注至儲存容器並將該容器儲存在超低溫冷凍冰箱中。
<過程16：EPO-Fc最終粗製溶液的製備>
在水浴中解凍過程15的EPO-Fc粗製溶液後，對其加入製劑緩衝液(0.01M檸檬酸鈉、0.1M甘胺酸、0.1M氯化鈉，pH 6.2±0.2，聚山梨醇酯20 0.12g/Kg)以達到0.5±0.1mg/mL的蛋白質濃度，使用滅菌及過濾器(Sartobran P midicap)進行滅菌和過濾，從而製備最終的EPO-Fc粗製溶液。
實施例2：EPO-Fc組成物的純度檢測
<檢測1：宿主細胞衍生的蛋白質(肽)(HCP)雜質含量的測試
為了檢測最終粗製溶液中的HCP雜質含量，使用CHO宿主細胞蛋白質試劑盒進行以下測試：1)稀釋並使用試劑 盒中提供的標準溶液；2)測試溶液係使用稀釋緩衝液製備為稀釋狀態；3)藉由將標準溶液加入到上述測試溶液中製備添加測試(spiked test)溶液；4)在使標準溶液、測試溶液和添加測試溶液與抗-CHO(磷酸酶連接物)反應之後，使該混合物在抗-CHO包被的微量滴定板中反應；和5)在洗滌板後，對其加入PNPP受質，並使用ELISA讀板器測量吸光度。此處使用的樣品是批號747R0001和747R0002。檢測結果總結在下表2。從測試結果可以看出，宿主細胞衍生的蛋白質雜質的含量為60ng/mg。
<檢測2：宿主細胞衍生的DNA雜質含量的測試>
為了檢測EPO-Fc最終粗製溶液中宿主細胞衍生的DNA雜質的含量，進行以下測試：1)將試劑盒中提供的高校標準劑稀釋並使用作為標準溶液；2)將試劑盒中提供的零校標準劑稀釋並用作測試溶液；3)藉由將標準溶液添加到測試樣品中製備添加測試溶液；4)此處使用的零校標準劑是試劑盒中提供的零校標準劑；5)藉由將標準溶液加入 零校標準劑以製備此處使用的添加零校標準劑；6)所製備的標準溶液、測試溶液、添加測試溶液、零校標準劑和添加零校標準劑進行DNA標記；和7)使用閾值系統濾器單元進行測試桿(stick)結合，然後讀取測試桿以確認結果。此處使用的樣品是批號Nos.GC1113-PUR-0901-PR、GC1113-PUR-0902-PR、747R0001和747R0002。檢測結果總結在下表3。從測試結果可以看出，宿主細胞衍生的DNA雜質的含量為0.5ng/mg或更低，最大為0.215ng/mg，平均為0.143ng/mg。
實施例3：EPO-Fc組成物中的EPO-Fc的糖分布檢測
<檢測3：EPO-Fc糖基化位置的分析>
EPO-Fc是指同型二聚體形式的融合蛋白，其中包括由IgD鉸鏈組合的EPO和Fc區域的兩種單體已經藉由鉸鏈區 中的雙硫鍵組合。EPO序列中有三個N-糖基化位置(N24、N38和N83)和一個O-糖基化位置(S126)。另外，在Fc序列的IgD CH2結構域中存在另外的N-糖基化位置(N261)。推測EPO-Fc可具有總共八個N-糖基化位置和兩個O-糖基化位置。
實際的糖基化位置已經由接受請求的Protagen公司確認。
在處理DTT和碘乙醯胺以由此還原/烷基化蛋白質後，使用PNGase F處理蛋白質以除去N-糖基化位置中的糖。使用胰蛋白酶和GluC/胰蛋白酶處理不含糖的蛋白質和仍然含有糖的其它蛋白質以形成多個肽，隨後使用MALDI-MS比較這些肽的大小，從而確定N-糖基化位置。
為了確認O-糖基化位置，在標記HexNAc後，將其用PNGas F處理以除去N-糖基化位置中的所有糖。藉由使用Arg C、胰蛋白酶/Glu C和Asp N/Tripsin處理，獲得多個肽，然後使用MALDI-MS比較這些肽的大小，從而確定O-糖基化位置。
分析結果總結在下表4。鑑定了存在於EPO序列中的三個N-糖基化位置(N24、N38和N83)和一個O-糖基化位置(S126)，並且在Fc序列的IgD CH2結構域中還發現了另一個N-糖基化位置(N261)。
<檢測4：EPO-Fc單醣的構成組成的分析>
糖蛋白的糖鏈通常由單醣如岩藻糖、N-乙醯基葡糖胺(GluNAc)、N-乙醯基半乳糖胺(GalNAc)、半乳糖、甘露糖、唾液酸等組成。或者，也可包括葡萄糖、木糖、甘露糖-6-磷酸或類似物等等。
接受請求的Protagen公司分析了單醣的構成組成。用4M鹽酸(最終濃度)將EPO-Fc在100℃水解4小時後，然後經由真空離心將其乾燥，所得材料溶於第三次蒸餾水中且經由液相色譜法(高效陰離子交換色譜法採用脈衝式安培法檢測；HPAEC-PAD)。藉由在相同條件下分析具有已知濃度的標準單醣物質並比較相同和各單醣之間的面積，估計各單醣與糖蛋白莫耳的莫耳比。使用標準物質的各單醣的莫耳比總結在下表5。從測試結果可以看出，在1莫耳EPO-Fc中分別存在約2.2莫耳的岩藻糖，約42.1莫耳的GluNAc，約9.3莫耳的半乳糖，約7.0莫耳的 甘露糖。
實施例4：EPO-Fc組成物中EPO-Fc的唾液酸含量的檢測
<檢測5：EPO-Fc的等電聚焦測試>
為了確定所製備的EPO-Fc的pI值，進行如下之等電聚焦(IEF)凝膠電泳測試：1)將標準溶液和測試溶液各者與樣品緩衝液(2X)混合並製備；2)所製備的樣品使用IEF pH 3-7凝膠進行電泳；3)使用三氯乙酸溶液固定完成電泳後獲得的凝膠；和4)使用混合在一起的包括Brilliant Blue R、甲醇和乙酸的染色溶液將凝膠染色，使用混合在一起的包含甲醇和乙酸的漂白溶液脫色，並乾燥之。此處使用的是批號GC1113-PUR-0902-PR。檢測結果總結在第1圖。
如第1圖的測試結果所示，可以看出所製造的EPO-Fc的主條帶分佈在pI 4.5至6.0的範圍。
<檢測6：唾液酸含量的測試>
為了檢測所製造的EPO-Fc的唾液酸含量，進行以下測試：1)於蒸餾水中藉由稀釋N-乙醯基神經胺酸製備標準溶液；2)使用蒸餾水稀釋製備測試溶液於稀釋狀態；3)使用間苯二酚試劑處理標準溶液和測試溶液後加熱；4)使用萃取溶液(1-丁醇，乙酸丁酯)回收反應產物；和5)在580nm測量回收的反應產物的吸光度以估計測試溶液的唾液酸含量，然後計算每1莫耳EPO-Fc的唾液酸含量(mol/mol)。此處使用的樣品是批號Nos.GC1113-PUR-0901-PR、GC1113-PUR-0902-PR、747R0001和747R0002。檢測結果總結在下表6。從測試結果可以看出，所製造的EPO-Fc具有唾液酸含量為20mol/mol或更多。

Claims (15)

  1. 一種EPO-Fc組成物，其包含EPO-Fc，該EPO-Fc具有唾液酸含量為17mol/mol或者更多，以及100ng/mg或者更少的宿主細胞衍生的蛋白質雜質。
  2. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其中，該唾液酸含量範圍為20至28mol/mol。
  3. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其中，該EPO-Fc具有pI6.0。
  4. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其中，該EPO-Fc具有4.5pI5.3。
  5. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其中，該宿主細胞衍生的蛋白質雜質是EPO-Fc的凝集物或片段。
  6. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其中，該宿主細胞衍生的蛋白質雜質的量為含有60ng/mg或者更少。
  7. 如申請專利範圍第1項所述的EPO-Fc組成物，其還包含0.5ng/mg或者更少的宿主細胞衍生的DNA雜質。
  8. 一種製備EPO-Fc組成物的方法，包括：在溫度範圍35℃至39℃和6.5pH7.5的條件下，以4vvd或更低的流動率流動EPO-Fc細胞培養溶液以製備灌注培養溶液；從該灌注培養溶液獲得EPO-Fc純溶液；和將該EPO-Fc純溶液吸附到陰離子交換樹脂以製備 Q流出物，該Q流出物包括具有唾液酸含量為17mol/mol或者更多的EPO-Fc。
  9. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中該Q流出物的製備包括：將該EPO-Fc吸附到該陰離子交換樹脂；並使用含有0.005至0.02M磷酸鈉、0.05至0.2M L-精胺酸和0.02至0.1M氯化鈉，並且具有6.7pH7.1的緩衝液洗脫所吸附的EPO-Fc。
  10. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中獲得EPO-Fc純溶液的步驟包括使該灌注培養溶液通過POD濾器。
  11. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中，該EPO-Fc組成物中的宿主細胞衍生蛋白質(HCP)雜質的量為100ng/mg或者更少。
  12. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中，將該EPO-Fc細胞培養溶液以2.0×105細胞/mL或者更多的量接種到培養箱。
  13. 如申請專利範圍第10項所述的方法，還包括，使該灌注培養溶液通過該POD濾器之後，使該上述溶液通過經填充有蛋白A鍵合樹脂的管柱。
  14. 如申請專利範圍第8項所述的方法，其中，該Q流出液中所含的EPO-Fc具有pI為6.0或者更低。
  15. 如申請專利範圍第8項所述的方法，還包括分別使用POD濾器、超濾膜和奈米濾器過濾該Q流出物。
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