CN112210580A - 一种降低反应组分对酶活抑制的方法 - Google Patents
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Abstract
为了解决胆酸及其衍生物对酶活抑制的问题，本发明一种降低反应组分对酶活抑制的方法通过树脂加入反应体系中的胆酸及其衍生物的浓度来降低其对酶活的抑制，提高了生物催化转化效率。本发明还提供了树脂加入提高底物转化浓度的方法。具体地，生物催化反应体系中加入底物浓度20～200g/L，树脂的加入质量浓度为4‑40g/L，转化8～12h可完成反应。通过树脂的加入，吸附反应体系中的底物，随着反应进行，树脂可以吸附反应后的产物，从而达到底物与产物在树脂吸附的动态平衡，并且降低了反应组分在溶液中的浓度，降低对酶活的抑制。树脂的加入并不降低反应速率，相同实验条件下，有效缩短反应时间，提高反应效率。反应完毕后，树脂可以通过过滤从反应体系中分离，利用洗脱剂将树脂上的反应产物洗脱。
Description
技术领域
本发明涉及利用树脂吸附反应组分，降低底物、产物在溶液中的比例来降低其对酶活抑制的方法，以及利用树脂吸附在胆酸类化合物转化过程中的应用，属于生物工程领域。
背景技术
胆酸及其衍生物具有广泛的生物活性，是内源性的天然产物。由于其本身高度的光学纯度和两亲的分子的结构特点，生物活性研究一直是药理学和药物发现领域的研究热点之一。胆酸类药物己经在临床上有应用，如熊去氧胆酸及牛横熊去氧胆酸已用于肝脏疾病的治疗(熊去氧胆酸联合来适可治疗脂肪肝合并高脂血症患者的效果，魏鸿，2017，30,133)，。而近几年来，胆酸及其衍生物的药理活性研究取得了很大的突破，2015年，FDA批准了两个胆酸类药物上市，分别为用于治疗胆汁酸合成障碍罕见病的Cholham胶囊(主要成分为胆酸)和用于颏下脂肪的溶脂针剂Kybella(主要成分为脱氧胆酸)。
传统的胆酸及其衍生物的合成方法为化学转化，近年来，利用生物法实现胆酸及其衍生物如熊去氧胆酸制备的文献也较(NAD+-Dependent Enzymatic Route for theEpimerization of Hydroxysteroids,Fabio Tonin,Linda G.Otten,IsabelW.C.E.Arends, 2018,11,1-13；Flavin Oxidoreductase-Mediated Regeneration ofNicotinamide Adenine Dinucleotide with Dioxygen and Catalytic Amount ofFlavin Mononucleotide for One-Pot Multi-Enzymatic Preparation ofUrsodeoxycholic Acid,Xi Chen,Yunfeng Cui,Jinhui Feng, Yu Wang,Xiangtao Liu,Qiaqing Wu,Dunming Zhu,Yanhe Ma,2019,DOI: 10.1002/adsc.201900111)。在胆酸及其衍生物的生物催化过程中，由于反应底物两亲的结构特点，导致对反应过程中的酶活抑制明显，胆酸及其衍生物浓度往往仅有4-10 g/L。离子树脂往往用来进行分离纯化工艺的后处理，但是利用离子树脂降低反应体系中组分浓度，从而降低其对生物催化剂即酶的抑制之前文献中尚未报道。
发明内容
为了解决胆酸及其衍生物对酶活抑制的问题，本发明通过树脂加入反应体系中的胆酸及其衍生物的浓度来降低其对酶活的抑制，提高了生物催化转化效率。
本发明还提供了树脂加入提高底物转化浓度的方法。具体地，生物催化反应体系中加入底物浓度20～200g/L，树脂的加入质量浓度为4-40g/L，转化8～12h可完成反应。
本发明的有益效果：通过树脂的加入，吸附反应体系中的底物，随着反应进行，树脂可以吸附反应后的产物，从而达到底物与产物在树脂吸附的动态平衡，并且降低了反应组分在溶液中的浓度，降低对酶活的抑制。树脂的加入并不降低反应速率，相同实验条件下，有效缩短反应时间，提高反应效率。反应完毕后，树脂可以通过过滤从反应体系中分离，利用洗脱剂将树脂上的反应产物洗脱。
附图说明
图1为不同树脂对胆酸及其衍生物的吸附能力检测。
图2为树脂加入对鹅去氧胆酸氧化反应转化的影响。
图3为树脂加入对7-Keto石胆酸还原反应转化的影响。
图4为树脂加入对胆酸氧化反应转化的影响。
图5为树脂加入对牛磺胆酸氧化反应转化的影响。
具体实施方式
下面的实施例进一步说明本发明的内容，但不应理解为对本发明的限制。
实施例1：树脂对胆酸及其衍生物的吸附
不同树脂对胆酸及其衍生物的吸附能力检测
配制50g/L的胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸、7-Keto-石胆酸、7-Keto-胆酸、鹅去氧胆酸、熊去氧胆酸的水溶液，分别加入强酸性离子树脂(1)、弱酸性离子树脂(2)、强碱性离子树脂(3)、弱碱性离子树脂(4)、非极性吸附树脂(5)、极性吸附树脂(6)，质量浓度为5g/L。加入树脂1小时后，检测水溶液中残留的胆酸及其衍生物的浓度，考察树脂的吸附能力。
实施例2：生物催化剂的制备
按照文献(Flavin Oxidoreductase-Mediated Regeneration of NicotinamideAdenine Dinucleotide with Dioxygen and Catalytic Amount of FlavinMononucleotide for One-Pot Multi-Enzymatic Preparation of UrsodeoxycholicAcid,Xi Chen,Yunfeng Cui,Jinhui Feng, Yu Wang,Xiangtao Liu,Qiaqing Wu,DunmingZhu,Yanhe Ma,2019,DOI: 10.1002/adsc.201900111)获得生物催化剂。
实施例3：树脂加入对鹅去氧胆酸氧化反应转化的影响
按照文献获得的7α-HSDH与flavin oxidoreductase(MgFR)的共表达菌株，并按照文献方法构建反应，同时加入树脂考察实验转化情况。结果表明，同样的实验条件(0.15mMNAD+，0.44mM FMN)，加入特定树脂(10g/L)后，相同的反应时间(16小时)，加入树脂的反应体系中底物转化速率可以提高至原来的2-3倍。未加入树脂(0)，强酸性离子树脂(1)、弱酸性离子树脂(2)、强碱性离子树脂(3)、弱碱性离子树脂(4)、非极性吸附树脂(5)、极性吸附树脂(6)。
实施例4：树脂加入对7-Keto石胆酸还原反应转化的影响
按照文献获得的7β-HSDH与TbADH的共表达菌株，并按照文献方法构建反应，同时加入树脂考察实验转化情况。结果表明，同样的实验条件(0.15mM NADP+，1M异丙醇)，加入特定树脂(10g/L)后，相同的反应时间(20小时)，加入树脂的反应体系中底物转化速率最高可以提高至原来的5倍。未加入树脂(0)，强酸性离子树脂(1)、弱酸性离子树脂(2)、强碱性离子树脂(3)、弱碱性离子树脂(4)、非极性吸附树脂 (5)、极性吸附树脂(6)。
实施例5：树脂加入对胆酸氧化反应转化的影响
按照文献获得的7α-HSDH与flavin oxidoreductase(MgFR)的共表达菌株，并按照实施例3方法构建反应，同时加入树脂考察实验转化情况。结果表明，同样的实验条件(0.15mM NAD+，0.44mM FMN)，加入特定树脂(10g/L)后，相同的反应时间(16小时)，加入树脂的反应体系中底物转化速率可以提高至原来的2-3倍。未加入树脂(0)，强酸性离子树脂(1)、弱酸性离子树脂(2)、强碱性离子树脂(3)、弱碱性离子树脂(4)、非极性吸附树脂(5)、极性吸附树脂(6)。
实施例6：树脂加入对牛磺胆酸氧化反应转化的影响
按照文献获得的7α-HSDH与flavin oxidoreductase(MgFR)的共表达菌株，并按照实施例3方法构建反应，同时加入树脂考察实验转化情况。结果表明，同样的实验条件(0.15mM NAD+，0.44mM FMN)，加入特定树脂(10g/L)后，相同的反应时间(20小时)，加入树脂的反应体系中底物转化速率最高可提高至原来的6倍。未加入树脂(0)，强酸性离子树脂(1)、弱酸性离子树脂(2)、强碱性离子树脂(3)、弱碱性离子树脂(4)、非极性吸附树脂(5)、极性吸附树脂(6)。
实施例7：树脂加入对鹅去氧胆酸氧化反应
按照文献获得的7α-HSDH与flavin oxidoreductase(MgFR)的共表达菌株，并按照文献方法构建反应(100mL)，加入底物鹅去氧胆酸100g/L，同时加入弱碱性离子树脂20g/L，薄层层析及HPLC检测反应进程，20小时后，底物鹅去氧胆酸转化完全后，过滤除去树脂后，反应也调节pH至9.0，离心除去菌体，再次调节至pH6.0，得到固体沉淀，过滤收集。过滤获得的离子树脂使用0.4g/L NaOH溶液再生后，同时吸附的鹅去氧胆酸氧化产物7-Keto石胆酸被洗脱后，获得的洗脱液调节pH6.0，得到固体沉淀，合并沉淀后，烘干获得粗品9.8g。
实施例8：树脂加入对7-Keto石胆酸还原反应
按照文献获得的7β-HSDH与TbADH的共表达菌株，并按照文献方法构建反应(100mL)，加入底物7-Keto石胆酸50g/L，同时加入弱碱性离子树脂4g/L，薄层层析及HPLC检测反应进程，6小时后，底物7-Keto石胆酸转化完全后，过滤除去树脂后，反应也调节pH至9.0，离心除去菌体，再次调节至pH6.0，得到固体沉淀，过滤收集。过滤获得的离子树脂使用0.4g/L NaOH溶液再生后，同时吸附的7-Keto石胆酸还原产物熊去氧胆酸被洗脱后，获得的洗脱液调节pH6.0，得到固体沉淀，合并沉淀后，烘干获得粗品4.3g。
实施例9：树脂加入对7-Keto石胆酸还原反应
按照文献获得的7β-HSDH与TbADH的共表达菌株，并按照文献方法构建反应(100mL)，加入底物7-Keto石胆酸150g/L，同时加入弱碱性离子树脂40g/L，薄层层析及HPLC检测反应进程，30小时后，底物7-Keto石胆酸转化完全后，过滤除去树脂后，反应也调节pH至9.0，离心除去菌体，再次调节至pH6.0，得到固体沉淀，过滤收集。过滤获得的离子树脂使用0.4g/L NaOH溶液再生后，同时吸附的7-Keto 石胆酸还原产物熊去氧胆酸被洗脱后，获得的洗脱液调节pH6.0，得到固体沉淀，合并沉淀后，烘干获得粗品13.9g。
Claims (6)
1.一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，将树脂加入到胆酸及其衍生物的生物转化体系中，反应完毕后将离子树脂过滤回收，利用洗脱剂将树脂上吸附的胆酸及其衍生物转化产物洗脱，反应溶液中残留产物通过调节溶液pH<6.0后过滤获得。
2.如权利要求1所述的一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，胆酸及其胆酸衍生物包括胆酸、牛磺胆酸、甘氨胆酸、7-Keto-石胆酸、7-Keto-胆酸、鹅去氧胆酸。
3.如权利要求1所述的一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，加入的树脂为弱碱性离子树脂。
4.如权利要求1所述的一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，加入树脂的量与胆酸及其衍生物的质量比为1:5～1:20。
5.如权利要求1所述的一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，胆酸及其衍生物的生物转化体系为氧化或者还原生物转化体系。
6.如权利要求1所述的一种降低反应组分对酶活抑制的方法，其特征在于，胆酸及其衍生物的底物浓度为20-200g/L。
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