CN107417750B - 一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，属于微生物发酵产物提取技术领域。该方法将活化后的活性炭柱酸洗至pH值2.0～3.0，并将微生物发酵滤清液调节pH值1.5～2.2，上柱吸附后用碱性溶液洗脱解吸，洗脱液浓缩、调pH值，结晶、干燥即得环磷酸腺苷。该方法操作简单，成本低，安全、高效、无污染，环磷酸腺苷收率高达85％，纯度达99％以上。

Description

一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法
技术领域
本发明涉及一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，属于微生物发酵产物提取技术领域。
背景技术
环磷酸腺苷又名腺嘌呤核苷-3’,5’-环磷酸酯，简称cAMP。它是一种人体内广泛存在、具有重要生理活性的物质。在人体中环磷酸腺苷可由三磷酸腺苷经腺苷活化酶催化生成。作为参与调节细胞功能的第二信使物质，在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢的作用，对糖、脂肪代谢以及核酸、蛋白质的合成、调节等起着重要作用。
环磷酸腺苷为蛋白酶致活剂，系核苷酸的衍生物，也是重要的医药中间体，是一种效果明显、毒副作用较小的非强心苷类药物。环磷酸腺苷能改变细胞膜的功能，促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维，增强心肌的收缩，并增加呼吸链氧化酶的活性，改善心肌缺氧，缓解冠心病及改善心电图，在临床上主要用于治疗心功能不全、心绞痛和心肌梗死。与此同时，环磷酸腺苷在抗癌、抗病毒、治疗心血管疾病、糖尿病、牛皮癣及干扰诱导等方面也具有独特的效果，可用于制备药物制剂(注射用环磷酸腺苷、环磷酸腺苷注射液、环磷酸腺苷输液)、药物中间体(制备二丁酰环磷腺苷)、保健食品、化妆品，生化试剂等，市场应用前景十分广阔。
目前，已报道的环磷酸腺苷的制备方法有化学合成法、微生物发酵法和植物提取法三种。这三种方法中植物提取法最不可取，因为提取用植物红枣内cAMP的含量过低，每生产一公斤环磷酸腺苷的成本甚至高于其市场售卖价。化学合成法的研究多数是以腺苷或5’-腺苷酸作为起始原料，其中以腺苷为起始原料需要经过酯化和环合两步反应，而以5’-腺苷酸为起始原料则不需要进行酯化反应。因此如何获得高收率的酯类化合物中间体，并将其成功分离出来以进行后续的环合反应是合成工艺研究的关键。微生物发酵法生产cAMP所用的原料如次黄嘌呤的价格相对便宜，分离步骤所用的溶剂也都是常规试剂，因此从环保角度来讲发展潜力最大。并且微生物发酵法生产一公斤cAMP的原料成本约206元，相较目前普遍采用的化学合成法(原料成本约6000元/公斤)成本降低约96.7％，并实现了生产过程节能、降耗、减排等效果。微生物发酵法中后分离工艺原采用生物膜分离、离子交换层析和反应醇析结晶的集成技术，这是一套适用于环磷酸腺苷发酵液体系的分离纯化技术。相对于复杂的化学合成法，该方法无需使用毒性较大的有机溶剂，生产环节安全高效，无污染。以上三种方法的优缺点对比见下表1。
表1三种方法的优缺点对比
比较项目 微生物发酵法 化学合成法 植物提取法
原料 次黄嘌呤 5’-AMP 红枣
生产成本(元/公斤) 3600 6000 40000
分离提取工艺 简单、高效、安全 复杂、污染性大 极复杂
总收率 80％～85％ 40％～50％
近些年来，微生物发酵法中后分离工艺又得到进一步改进。如公布号CN104788522A的发明专利公开的一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，包括：1)除菌体：将发酵液加热至60～80℃，过陶瓷膜，收集超滤液；2)上柱：将获得超滤液加氨水调节pH值至7.05～7.95，过炭层析柱；3)解析：用氨水进行洗脱解析，得到洗脱液；4)浓缩：将洗脱液加氨水调节pH值至7.05～7.95，真空浓缩，收集浓缩液；5)抽滤：浓缩液真空抽滤去除次黄嘌呤，收集滤液；6)结晶，调节滤液pH值至2～3，流加1～3倍滤液体积的甲醇进行结晶，抽滤，得到环磷酸腺苷粗品；7)重结晶：环磷酸腺苷粗品用纯化水溶解后，流加1～3倍溶液体积的甲醇进行重结晶，抽滤，真空干燥即得。该方法采用炭层析法取代传统的离子交换和树脂层析工艺，声称其收率可达75％，纯度不低于97.5％，但在实际应用中并未达到该收率值。
发明内容
本发明的目的是提供一种从发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，产品收率高达85％，纯度达99％以上。
为了实现以上目的，本发明所采用的技术方案是：
一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：
1)活性炭柱经活化后酸洗至pH值2.0～3.0；
2)微生物发酵滤清液调pH值1.5～2.2，上柱吸附；
3)洗脱解吸，收集洗脱液，浓缩；
4)浓缩液调pH值后结晶、干燥，得到环磷酸腺苷。
步骤1)中活性炭柱的填料为果壳活性炭，颗粒状，大小2～6mm。此处，可按照活性炭与发酵滤清液的体积比1:10装填活性炭(即1:10倍体积装量)。
步骤1)中活化的操作为：在温度70～90℃下用的碱液(如pH值14)浸泡柱子1.5～2.5h，水洗至中性(pH值7.0左右)，即可。所述碱液如采用1.5N～2.5N的NaOH溶液，2～3倍填料体积即可。
步骤1)中酸洗采用1.5N～2.5N的HCl溶液。
步骤2)中微生物发酵滤清液为：微生物发酵液于温度50～80℃下过0.2～0.45μm滤膜后的滤液。发酵滤清液用酸调pH值1.5～2.2后上柱吸附。
步骤2)中上柱吸附要保证流出液pH值不大于2.2，在pH1.5～2.2范围为佳，以保证活性炭柱有最大吸附。
步骤3)中洗脱解吸采用由体积比2～8:15～30:40～80:13～30的NaOH溶液(浓度20％～25％)、氨水(浓度28％～30％)、水和无水乙醇组成的碱性溶液。优选的，洗脱前先用碱性溶液浸泡柱子(1～2h)，浸泡后再用碱性溶液(3～5倍柱体积)洗脱解吸。
步骤3)中浓缩的条件为：在温度50～70℃、真空压力0.09～0.1MPa下浓缩至25～30波美度。
步骤4)中浓缩液调pH值至2.0～2.5。
步骤4)中结晶采用浓度50％以上乙醇。
本发明的有益效果：
本发明将活化后的活性炭柱酸洗至pH值2.0～3.0，并将微生物发酵滤清液调节pH值1.5～2.2，上柱吸附后用碱性溶液洗脱解吸，洗脱液浓缩、调pH值，结晶、干燥即得环磷酸腺苷。该方法操作简单，成本低，安全、高效、无污染，环磷酸腺苷收率高达85％，纯度达99％以上。
具体实施方式
下述实施例仅对本发明作进一步详细说明，但不构成对本发明的任何限制。
实施例1
一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：
1)微生物发酵液于温度65℃下过0.45μm滤膜，得微生物发酵滤清液；
2)采用2～6mm颗粒状果壳活性炭(购自河南巩义市中环环保材料商贸有限公司)以1:10倍体积的装量装填活性炭柱，装柱后在温度80℃下用2N的NaOH溶液(2.5倍体积)浸泡柱子2h，水洗至中性(pH值7.0)完成活化，活化后用2N的HCl溶液酸洗至pH值2.5；
3)微生物发酵滤清液用2N的HCl溶液调pH值2.0，上柱吸附，保证流出液pH值不大于2.0；
4)洗脱前用碱性溶液浸泡柱子1.5h，浸泡后用4倍体积的碱性溶液洗脱解吸，碱性溶液的组成为体积比5:20:60:15的NaOH溶液(浓度25％)、氨水(28％)、水和无水乙醇，收集洗脱液，在温度65℃、真空压力0.09MPa下浓缩至28波美度，得浓缩液；
5)浓缩液调pH值2.2，用同等体积的95％乙醇结晶，在45℃条件下真空干燥，即得。环磷酸腺苷的收率为83％，纯度为99％。
实施例2
一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：
1)微生物发酵液于温度50℃下过0.45μm滤膜，得微生物发酵滤清液；
2)采用2～6mm颗粒状果壳活性炭以1:10倍体积的装量装填活性炭柱，装柱后在温度70℃下用2.5N的NaOH溶液(2倍体积)浸泡柱子1.5h，水洗至中性(pH值7.0)完成活化，活化后用1.5N的HCl溶液酸洗至pH值2.0；
3)微生物发酵滤清液用2N的HCl溶液调pH值1.5，上柱吸附，保证流出液pH值不大于1.5；
4)洗脱前用碱性溶液浸泡柱子1h，浸泡后用5倍体积碱性溶液洗脱解吸，碱性溶液的组成为体积比2:15:40:13的NaOH溶液(浓度20％)、氨水(28％)、水和无水乙醇，收集洗脱液，在温度50℃、真空压力0.1MPa下浓缩至25波美度，得浓缩液；
5)浓缩液调pH值2.0，用同等体积的50％乙醇结晶，在45℃条件下真空干燥，即得。环磷酸腺苷的收率为82％，纯度为99％。
实施例3
一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，包括以下步骤：
1)微生物发酵液于温度80℃下过0.2μm滤膜，得微生物发酵滤清液；
2)采用2～6mm颗粒状果壳活性炭以1:10倍体积的装量装填活性炭柱，装柱后在温度80℃下用1.5N的NaOH溶液(3倍体积)浸泡柱子2.5h，水洗至中性(pH值7.0)完成活化，活化后用2.5N的HCl溶液酸洗至pH值3.0；
3)微生物发酵滤清液用2N的HCl溶液调pH值2.2，上柱吸附，保证流出液pH值不大于2.2；
4)洗脱前用碱性溶液浸泡柱子2h，浸泡后用3倍体积碱性溶液洗脱解吸，碱性溶液的组成为体积比8:30:80:30的NaOH溶液(浓度25％)、氨水(30％)、水和无水乙醇，收集洗脱液，在温度80℃、真空压力0.09MPa下浓缩至30波美度，得浓缩液；
5)浓缩液调pH值2.5，用同等体积的75％乙醇结晶，在45℃条件下真空干燥，即得。环磷酸腺苷的收率为85％，纯度为99％。
试验例
环磷酸腺苷含有磷酸和碱基，是一种两性物质，它的等电点pI为3.3～4.05。在环磷酸腺苷提取中，pH影响两性物质的带电性，当pH值＞pI时，环磷酸腺苷带负电，pH值＜pI时，环磷酸腺苷带正电。
活性炭的结构特点是具有非极性的表面，为疏水性和亲有机物质的吸附剂，能够从气体或液体混合物中吸附回收有机物，是一种非极性吸附剂。活性炭在pH值2.5～4的酸性溶液中吸附作用较强，而在碱性溶液中时常出现“胶溶”或脱吸附现象，因此在吸附前最好进行酸化处理。当待吸附液呈酸性时，活性炭对阳离子物质的吸附作用较强，而当溶液呈碱性时，活性炭对阴离子物质的吸附能力较强。
根据环磷酸腺苷的性质和活性炭的吸附特性，验证不同活性炭柱活化方式及不同上样pH值对环磷酸腺苷吸附和洗脱的影响，试验设计如下，结果见下表2。
试验1：取实施例1中活性炭柱，先用2N的NaOH溶液洗至pH值7.0，再用2N的HCl溶液洗至pH值2.0；环磷酸腺苷提取液调pH值2.5，上柱吸附；4倍体积碱水(同实施例1)洗脱。
试验2：取实施例1中活性炭柱，先用2N的NaOH溶液洗至pH值7.0，再用2N的HCl溶液洗至pH值2.0；环磷酸腺苷提取液调pH值7.0，上柱吸附；4倍体积碱水(同实施例1)洗脱。
试验3：取实施例1中活性炭柱，先用2N的NaOH溶液洗至pH值9.0；环磷酸腺苷提取液调pH值7.0，上柱吸附；4倍体积碱水(同实施例1)洗脱。
试验4：取实施例1中活性炭柱，先用2N的NaOH溶液洗至pH值7.0；环磷酸腺苷提取液调pH值7.0，上柱吸附；4倍体积碱水(同实施例1)洗脱。
表2不同试验条件对环磷酸腺苷吸附和洗脱的影响
Figure BDA0001295811680000051
从表2不难看出，试验1中活性炭柱吸附率和洗脱回收率均高于试验2～4，说明活性炭柱的活化方式和不同上样pH值对环磷酸腺苷的分离纯化有较大影响，特别是活性炭柱酸化至pH值2.0～3.0、待提取液调pH值1.5～2.2时环磷酸腺苷的收率和纯度最高。

Claims (7)

1.一种从微生物发酵液中提取环磷酸腺苷的方法，其特征在于：包括以下步骤：
1）活性炭柱经活化后酸洗至pH值2.0~3.0；
2）微生物发酵滤清液调pH值1.5~2.2，上柱吸附；所述上柱吸附后保证流出液pH值不大于2.2；
3）洗脱解吸，收集洗脱液，浓缩；所述洗脱解吸采用由体积比2~8:15~30:40~80:13~30的NaOH溶液、氨水、水和无水乙醇组成的碱性溶液；所述NaOH溶液的浓度为20~25%；所述氨水的浓度为28~30%；
4）浓缩液调pH值后结晶、干燥，得到环磷酸腺苷。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤1）中活化的操作为：在温度70~90℃下用碱液浸泡柱子1.5~2.5h，水洗至中性，即可。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤2）中微生物发酵滤清液为：微生物发酵液于温度50~80℃下过0.2~0.45μm滤膜后的滤液。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：洗脱前先用碱性溶液浸泡柱子，浸泡后再用碱性溶液洗脱解吸。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤3）中浓缩的条件为：在温度50~70℃、真空压力0.09~0.1MPa下浓缩至25~30波美度。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中浓缩液调pH值至2.0~2.5。
7.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：步骤4）中结晶采用浓度50%以上乙醇。
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