KR101504824B1 - 고당화된 지속형 인간 성장호르몬 단백질 및 이의 제조방법 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 체내 지속성이 증대된 고당화 인간성장호르몬 NexP-hGH 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것이다. 구체적으로, 본 발명은 체내 지속성을 증가시키는 고당화 알파-1 안티트립신 변이체와 인간 성장호르몬이 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 특정 이소폼(isoform) 및 이의 제조 방법에 관한 것으로서, 상기 이소폼은 등전점 5.2 이하인, 인간 성장호르몬(hGH) 및 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)가 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 이소폼으로서, 야생형 인간성장호르몬에 비하여 당화가 현저히 증대되어 체내 지속성이 현저히 뛰어날 뿐만 아니라 그 약효 역시 우수한 이점을 지닌다.
Description
본 발명은, 고당화되어 체내 지속성이 높은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질 및 이의 제조방법에 관한 것으로, 구체적으로 체내 지속성을 증가시키는 고당화 알파-1 안티트립신 변이체와 인간 성장호르몬이 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 특정 이소폼(isoform) 및 이의 제조 방법에 관한 것이다.
일반적으로 천연형 인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH)은 191개의 아미노산으로 구성되어 있으며, 약 21,500 달톤의 분자량을 가지는 호르몬이다. 인간 성장호르몬은 뇌하수체 전엽에서 분비되며, 체내에서 뼈, 연골 등의 성장을 촉진시킨다. 이러한 성장호르몬이 결핍되면 저신장증, 심혈관 질환의 위험도 증가, 근육 및 골밀도 감소 등을 유발할 수 있다.
성장호르몬 결핍증을 치료하기 위하여 1950년대 후반부터 인간의 뇌하수체에서 유래되거나 또는 유전공학기술로 생산된 성장호르몬이 사용되었으며, 2009년 인간 성장호르몬은 세계적으로 약 3조원의 시장규모를 가지게 되었다. 다만, 성장호르몬의 경우, 매일 피하주사로 투여해야하는 불편함이 있어 환자 편의성의 개선, 증대가 요구되어 왔다. 이러한 요구에 부합하여 지속형 인간 성장호르몬이 개발되고 있으며, 지속성을 높이기 위한 방법으로 서방형 제형, 단백질 또는 당 융합, 당쇄 공학 등이 이용되고 있다. 그 예로, 서방형 제품으로서 제넨텍 사에서 뉴트로핀 디팟(nutropin depot)을 최초로 출시하였으며, 국내에서는 LG 생명과학에서 디클라제를 2007년 출시하였다(대한민국 등록번호 제 10-0236771호 및 제 10-0329336호). 그러나 서방형 치료제는 인체에 원치 않는 면역반응을 야기하고, 굵은 주사기를 사용하여 통증을 유발하며, 낮은 생산수율로 인한 경제성에 문제가 있다. 특히, 뉴트로핀 디팟은 1세대 제품에 비해 유효성이 낮아 시장에서 철수하였다.
서방형 제형 외에 단백질의 지속성을 높이기 위한 방법으로서, 고분자 당인 폴리에틸렌글리콜과의 융합(Polyethylene glycol, Sada et al., J.Ferment Bioeng 71, 137-139, 1991), 당쇄 공학(Glycoengineering, 미국등록특허 제 7,217,689호), 다른 단백질과의 융합(국제공개특허 제WO93/15199호)등의 방법을 이용하여 체내의 흡수, 대사, 배설을 시키기도 한다. 다만, 상기 방법들은 낮은 제조 수율로 경제성이 결여되며, 장기간 사용시 면역반응을 야기하고, 결합 과정에서 사용되는 화학 물질이 독성을 야기하는 등 다양한 이유에서 범용적인 반감기 증가방법으로 사용되지 못하고 있다. 따라서, 상기와 같은 단점을 최소화하면서 지속성을 증대시키는 방법을 이용한 지속형 인간 성장호르몬의 개발이 요구되어 왔으며, 대한민국 등록특허 제10-1183262호에서는 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체와 인간 성장호르몬 결합체 형태의 지속형 인간 성장호르몬 단백질을 개발하여, 단백질의 크기 증가를 통한 반감기의 증대를 꾀한 내용이 개시되어 있다. 이와 더불어, 알파-1 안티트립신에 한 개 이상의 유전자 변이를 통하여 N-당쇄를 추가하여 체내 반감기의 증가를 추가적으로 꾀하였다(대한민국 공개특허 제10-2013-0029713호).
체내에 존재하는 단백질은 단백질의 종류에 따라 당화 정도가 반감기 및 유효성에 영향을 미치는 정도가 다르다. 그 예로, 범용적으로 많이 사용되는 단백질 의약품인 에리스로포이에틴과 GCSF(Granulocyte colony-stimulation factor)가 있다. 체내에 존재하는 단백질인 에리스로포이에틴(Erythropoietin, JC Egrie and JK Browne, British J. of Cancer, 84, 3-10, 2001)은 시알산(sialic acid)의 함량에 따라 체내 유효성이 달라진다. 구체적으로, 에리스로포이에틴은 시알산 함량과 체내 유효성 간의 연관성(correlation)이 높으며, 적절한 유효성을 나타내기 위해서는 특정 비율 이상의 시알산이 포함된 고당화 당쇄가 필수적으로 필요하다. 반면, GCSF는 당쇄의 유무에 따라 in vitro 시험에서의 유효성은 25%까지 차이가 나지만, in vivo 유효성에서는 차이가 없는 것으로 알려져 있다(H Bonig et al. Bone marrow transplantation, 28, 259-264, 2001).
이에 본 발명자들은 면역원성의 가능성이 낮으면서도 in vitro 및 in vivo 모두에서 높은 지속성 및 약리활성을 보이는 인간 성장 호르몬을 개발하기 위해 예의 노력한 결과, 하나 이상의 아미노산을 변이시켜 특정 부위에 돌연변이가 유발된 알파-1 안티트립신 단백질과 인간 성장호르몬이 융합된 신규한 인간 성장호르몬을 개발하였고, 동물세포에서 제조된 상기 단백질은 in vitro 및 in vivo 모두에서 높은 지속성 및 약리활성을 가짐을 확인하였다. 특히, 본 발명자들은 특정 pI를 가진 NexP-hGH 단백질의 이소폼이 우수한 체내 지속성 및 성장 효과를 지님을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 하나의 목적은 동물세포에서 제조된, 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 단백질로서, 5.2 이하의 등전점(isoelectric point, pI)을 갖는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 (a) 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 생물학적 유액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (b) 등전점(isoelectric point, pI) 차이에 따라 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 제조 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 상기 방법으로 제조된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 제공하는 것이다.
상기의 목적을 달성하기 위한 하나의 양태로서, 본 발명은 동물세포에서 제조된, 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 단백질로서, 5.2 이하의 등전점(isoelectric point, pI)을 갖는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 제공한다.
본 발명에서 용어, "인간 성장호르몬(human growth hormone, hGH)"은 펩타이드 호르몬으로서, 인간의 성장, 세포 생산(cell reproduction) 또는 재생(regeneration)을 가져올 수 있는 호르몬을 의미한다. 상기 인간 성장호르몬은 체내에서 연골 성장판의 세포 분화를 자극하여 성장을 촉진시킬 수 있는 단백질이라면 본 발명에 제한 없이 포함된다. 상기 인간 성장호르몬은 자연적으로 생산된 성장호르몬 및 유전공학기술을 이용하여 생산된 성장호르몬 모두 포함하며, 바람직하게는 유전공학기술을 이용하여 생산된 성장호르몬이나, 이에 제한되지 않는다. 또한, 상기 인간 성장호르몬에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 AAA98618인 인간 성장호르몬 등이 있으나, 이에 제한되지 않는다.
인간 성장호르몬은 체내에서 연골 성장판의 세포 분화를 자극함으로써 성장을 촉진시킬 수 있으므로, 체내 합성 또는 분비에 있어 문제가 있는 개체에 있어 치료용 단백질로서 중요하게 여겨지고 있다. 다만, 환자의 투여 편의성 및 치료 효과 측면에서 기존 성장호르몬에 비해 반감기가 증대된 지속형 인간 성장호르몬의 개발이 요구되어 왔으며, 이에 본 발명자들은 알파-1 안티트립신 변이체를 개발하고, 이를 인간 성장호르몬에 융합시킨 다음, 동물세포에서 발현시켜 고당화된 인간 성장호르몬 NexP-hGH을 개발하였다. 상기 고당화된 인간성장호르몬 NexP-hGH는 동물세포에서 생산되고 등전점(pI) 5.2 이하인 단백질로서, 등전점 5.2를 초과하는 경우에 비하여 당화 정도가 높아 높은 체내 지속성 및 약효를 나타낸다.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장호르몬"은 인간 성장호르몬(hGH) 및 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)가 융합된 형태의 단백질로서, 본 발명에서 "NexP-hGH"와 혼용되어 사용될 수 있다. 상기 NexP는 본 발명자들에 의해 개발된 체내 지속성을 유지함으로 체내 반감기가 증가된 체내 단백질인 알파-1 안티 트립신(alpha 1-Antitrypsin, A1AT)의 변이체로, 본 발명자들에 의해 명명된 용어이다. 단백질 분해 효소 억제제의 활성을 없앤 알파-1 안티 트립신 변이체 단백질의 서열, 제작 방법 등은 대한민국 등록특허 제10-1183262호 또는 대한민국 공개특허 제10-2013-0029713호에 개시되어 있으며, 대한민국 등록특허 제10-1183262호 명세서 전체 또는 대한민국 공개특허 제10-2013-0029713호 명세서 전체는 본 발명의 참고자료로 포함되나, 이에 제한되지 않는다.
상기 알파-1 안티트립신은 약 50,000Da의 분자량을 가진, 포유류의 혈액 내에 존재하는 단백질 중의 하나로서, 알파-1 프로테아제 억제제(alpha-1 protease inhibitor)로도 명명된다. 혈액 내에서 추출한 알파-1 안티트립신은 FDA의 허가를 거쳐서 프로라스틴(Prolastin)이라는 상품명으로 폐기종(emphysema) 치료제로 판매되고 있으며, 프로라스틴은 통상적으로 60㎎/㎏의 용량으로 1주 간격으로 정맥 주사로 인체에 투여되며, 인체에서의 안전성이 입증이 된 단백질이다. 또한, 알파-1 안티 트립신의 프로테아제 억제제로의 역할 및 구조 등은 이미 잘 알려져 있다(Elliott, P. et al., JMB 275, 419-425, 1998). 또한, 상기 알파-1 안티트립신은 자연계에 100여 종 이상의 대립유전자(allele)가 존재하고, 표현형은 IEF(isoelectric focusing) 유형에 따라 A에서 Z로 구분한다(Stoller et al., The Lancet, 365, 2225-2236, 2005). 이중 가장 많은 M 대립 유전자는 정상형으로 아미노산 서열 변이에 의해 다시 M1(Val213), M2, M3와 같이 여러 가지 아형(subtype)으로 구분된다. 따라서, 본 발명에 사용된 알파-1 안티트립신은 자연계에 존재하는 특정 아형이며, 다른 아형에 대하여도 동일한 효과를 얻을 수 있다. 상기 알파-1 안티트립신 단백질에 대한 정보는 미국 국립보건원(NCBI) GenBank와 같은 공지의 데이터베이스로부터 얻을 수 있으며, 그 예로 Accession Number가 AAH11991인 야생형 알파-1 안티트립신 단백질일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 야생형 알파-1 안티트립신 단백질의 서열을 서열번호 1에 나타내었다.
이러한 알파-1 안티트립신은 특정부위 돌연변이 유발(site-directed mutagenesis) 방법을 이용하여 하나 이상의 아미노산 잔기를 변형시켜 고유한 체내 활성을 없애고 반감기를 증가시킬 수 있다. 상기 아미노산 잔기의 변형을 통하여 N-당화 부위를 생성하여 알파-1 안티트립신의 프로테아제 억제제의 활성을 중화시키는 동시에 체내 주입시에 아미노산 치환에 의한 면역원성 가능성을 최소화할 수 있으며, 유리 시스테인기에 의한 이중체 형성 등을 제거할 수 있다. 이때 하나 이상의 아미노산의 변이는 P2 위치인 서열번호 1의 알파-1 안티트립신 단백질의 357번째 아미노산인 프롤린(Proline, P)을 변이시킨 것을 특징으로 할 수 있으며, 보다 구체적으로 이를 아스파라진(Asparagine, N)으로 변이시킨 것을 특징으로 할 수 있다. 또한, 알파-1 안티트립신 변이체는 서열번호 1의 알파-1 안티트립신 단백질에서 9번째 아미노산인 글루타민(Glutamine, Q)의 아스파라진으로의 변이, 232번째 아미노산인 시스테인(Cysteine, C)의 세린(Serine, S)으로의 변이 또는 359번째 세린(Serine, S)의 트레오닌(Threonine, T)으로의 변이를 포함할 수 있으며, 이때 P2 위치인 357번째 아미노산인 프롤린이 아스파라진으로 변이되고, 상기 변이 중 하나 이상을 추가로 포함할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 이러한 알파-1 안티 트립신(A1AT)의 변이체를 인간 성장호르몬의 N-말단 또는 C-말단에 유전자 재조합 방식으로 융합한 단백질이다. 특히, 상기 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH은 인간 성장호르몬의 N-말단에, 9번째 아미노산인 글루타민 및 357번째 아미노산인 프롤린이 모두 아스파라진으로 변이된 알파-1 안티트립신 단백질이 융합된 단백질(hGH-A1AT(Q9N, P357N))일 수 있으나, 이에 제한되지는 않는다.
본 발명에서 용어, "고당화된 지속형 인간 성장호르몬"은 알파-1 안티트립신 변이체와 인간 성장호르몬을 포함하는 형태의 단백질로서, 그 당화 정도가 자연상태에서 발견되는 야생형 단백질보다 당화 정도가 높고 등전점 값이 5.2 이하로 당화된 지속형 인간 성장호르몬을 의미한다.
본 발명에서는, 상기 지속형 인간성장호르몬의 당화 정도가 높아질수록 높은 체내 지속성을 가질 수 있음을 확인하였으며, 그 중에서도 지속형 인간 성장호르몬의 등전점이 5.2 이하일 때 in vitro 및 in vivo 모두에서 현저하게 높은 체내 지속성 및 약물 활성을 나타냄을 규명하였다.
상기 고당화된 지속형 인간 성장호르몬은 등전점이 5.2 이하, 바람직하게는3.5 내지 5.2이나, 이에 제한되지 않는다.
여기서, 상기 당화 부위는 탄수화물 구조(carbohydrate structure)의 부착과 같은 글리코실화가 일어날 수 있는 폴리펩타이드 내의 아미노산 잔기 또는 부위로서, 이러한 부위로는 N-글리코실화 부위 또는 O-글리코실화 부위 등이 대표적이다. 보존적인 N-글리코실화 부위로는 Asn-X-Ser 또는 Asn-X-Thr이 있으며, 여기서 X는 임의의 아미노산이나, 이에 제한되지 않는다.
상기 고당화된 지속형 인간 성장호르몬은 상기 지속형 인간 성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 동물세포를 배양하여 생산할 수 있다.
본 발명에서 용어, "동물세포"는 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬을 발현시킬 수 있는 세포로서, 당화를 가져오는 세포라면 그 종류가 특별히 제한되지 않으나, 그 예로 CHO 세포, BHK 세포, Vero 세포, HeLa 세포, MDCK 세포, 293 세포 및 3T3 세포가 있으나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명의 일 실시예에서는 9번 및 357번째 아미노산이 모두 아스파라진으로 치환된 알파-1 안티트립신이 융합된 인간 성장호르몬 단백질을 제조하였으며, 상기 단백질을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 벡터를 CHO 세포에 도입하여, Stable 세포주를 제작하였다(실시예 1). 또한, 음이온 교환 수지 크로마토그래피, 소수성 크로마토그래피 및 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피를 순차적으로 수행하고 등전점 차이에 따라 NexP-hGH 단백질을 수득한 결과, 이소폼 1 내지 3 중 낮은 pI를 가지는 이소폼 1이 이소폼 2 및 3에 비하여 높은 당화를 가지며, 이소폼 3에 비하여 낮은 pI를 가지는 이소폼 2가 이소폼 3에 비하여 높은 당화를 나타냄을 확인하였다(도 1 및 2). 또한, 인간 성장호르몬 약역학을 확인한 결과, 당화 정도가 높아질수록 본 발명의 지속형 인간 성장호르몬의 약역학이 뛰어났으며, 특히 양성대조군과 대등하거나 우수한 결과를 보였다(도 3). 또한 이소폼 1 및 이소폼 2는 양성대조군 대비 시험동물의 몸길이를 현저히 늘려주는 것을 확인하였다(도 4). 즉, 본 발명의 고당화된 지속형 인간 성장호르몬은 양성대조군에 비하여 현저히 높은 유효성을 보이는 결과를 나타내었다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 (a) 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 생물학적 유액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및 (b) 등전점(isoelectric point, pI) 차이에 따라 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 제조 방법을 제공한다.
상기 알파-1 안티트립신 변이체, 인간 성장호르몬 및 지속형 인간 성장호르몬에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
상기 제조 방법의 각 단계를 구체적으로 설명하면 다음과 같다.
상기 (a) 단계는 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계이다.
상기 단계는 NexP와 항체 단편 간의 친화도를 통하여 NexP-hGH를 컬럼에 부착시키기 위한 단계이다.
본 발명에서 용어, "지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH를 포함하는 생물학적 유액"은 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 생산하는 세포의 배양 상등액(cell culture supernant), 상기 세포의 파쇄물(cell extract), 또는 이의 부분 정제된 형태일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 특히, 상기 생물학적 유액은 바람직하게는 상기 지속형 인간 성장호르몬을 코딩하는 폴리뉴클레오티드를 포함하는 발현 벡터가 도입된 동물세포를 배양하여 수득한 배양 상등액 또는 상기 세포의 파쇄물이나, 이에 제한되지 않는다.
본 발명에서 용어, "부분 정제(partially purified)"는 크로마토그래피와 같은 분류 과정(fractionation procedure)을 하나 이상 수행하였으나 목적하는 pI값을 가지는 NexP-hGH 단백질 외에도 다른 단백질이 존재하는 상태를 의미한다. 상기 부분 정제 과정은 특별히 그 종류가 제한되지 않으며, 그 예로 소수성 크로마토그래피 또는 음이온 교환 수지 크로마토그래피일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다. 상기 부분 정제는 소수성 크로마토그래피 및 음이온 교환 수지 크로마토그래피로 이루어진 군으로부터 선택되는 하나 이상의 방법을 이용하여 정제할 수 있으며, 바람직하게는 음이온 교환 수지 크로마토그래피 또는 소수성 수지 크로마토그래피에 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 생산하는 세포의 배양 상등액 또는/및 상기 세포의 파쇄물을 적용하여 용출액을 생성시키거나, 보다 바람직하게는 음이온 교환 수지 크로마토그래피 및 소수성 수지 크로마토그래피를 순차적으로 적용하여 용출액을 생성시키는 것일 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
상기 (b) 단계는 pI 차이에 따라 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬을 분리하는 단계이다.
상기 항체 단편이 부착된 수지로부터 분리하는 단계에서, 지속형 인간 성장호르몬인 NexP-hGH의 당사슬 패턴 및 등전점이 다른 구조적 아형(isoform)은 MgCl2 농도에 따라 분리용출이 가능하다.
따라서, 상기 (b) 단계는 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬을 분리용출하기 위하여, 0 내지 1000mM MgCl2가 포함된 트리스 완충용액, 바람직하게는 0 내지 300mM MgCl2, 더욱 바람직하게는 0 내지 200mM MgCl2 , 더욱더 바람직하게는 200mM MgCl2가 포함된 트리스 완충용액을 적용하여 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬을 분리용출할 수 있으나, 이에 제한되지 않는다.
분리용출을 위한 트리스 완충용액에 있어서, MgCl2은 선택적으로 첨가하거나 첨가하지 않을 수 있다.
또 다른 양태로서, 본 발명은 상기 방법으로 제조된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 제공한다.
상기 방법 및 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질에 대해서는 상기에서 설명한 바와 같다.
본 발명의 고당화 지속형 인간성장호르몬 및 이의 제조방법은 기존의 인간성장호르몬에 비하여 당화가 현저히 증대되어, 시판되는 디클라제와 같은 인간성장호르몬에 비하여 지속성이 현저히 뛰어날 뿐만 아니라 그 약효 역시 우수하므로, 인간 성장호르몬이 필요한 분야에 유용하게 사용될 수 있다.
도 1 및 2는, pI의 차이에 따른 지속형 인간 성장호르몬의 분획을 나타낸 것이다.
도 3은, 본 발명의 고당화 지속형 인간 성장호르몬 이소폼 1 내지 3의 몸무게에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 4는, 본 발명의 고당화 지속형 인간 성장호르몬 이소폼 1 내지 3의 몸길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
도 3은, 본 발명의 고당화 지속형 인간 성장호르몬 이소폼 1 내지 3의 몸무게에 미치는 영향을 확인한 도이다.
도 4는, 본 발명의 고당화 지속형 인간 성장호르몬 이소폼 1 내지 3의 몸길이를 측정한 결과를 나타낸 도이다.
이하, 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다. 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주어진 상황에 따라 통상적으로 사용되는 벡터 및 배양조건 등을 적절히 선택할 수 있다.
실시예
: 인간성장호르몬/알파-1
안티트립신
융합체의
제조 및
융합체
발현 세포주의 제조
pSGHV0(GenBank Accession No. AF285183)에서 shGH, His tag, TEV site를 제거한 개량벡터 pAV1을 이용하여 인간성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체를 클로닝하였으며, 단백질 고유의 신호 서열(signal sequence)을 이용하여 세포 외로 분비되도록 하였다.
또한 상기 융합체를 지속적으로 발현하는 세포주(stable cell line) 구축을 위한 선별마커로 DHFR 시스템을 도입하였으며, 이를 위하여 IRES-DHFR 유전자를 pAV1 벡터에 삽입하였다. 발현량 증대를 위해 신호 서열에 Kozac 서열을 추가로 삽입하였다. 표적 단백질인 hGH-A1AT(Q9N, P357N)은 A1AT의 N 말단에 hGH를 융합하는 방식으로 도입하였다.
그 다음, 이렇게 제조된 클론을 CHO DG44 세포주에 유전자 도입을 하여, MTX(methotrexate) 50nM에서 시작하여 2배수로 늘려주며 4μM까지 선별을 진행하여, Stable 세포주를 확보하였다.
다만, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주어진 상황에 따라 통상적으로 사용되는 벡터 및 세포주를 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
실험예
1: 지속형 인간 성장호르몬/알파-1
안티트립신
융합체
발현 세포주의 배양 및
융합체
생산
상기에서 얻어진 세포주에서 고당화된 성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체를 고수율로 얻기 위하여, 본 발명의 지속형 성장호르몬인 성장호르몬/알파-1 안티트립신 융합체을 통상적인 세포배양 조건에서 발현시켰다. 다만, 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 주어진 상황에 따라 통상적으로 사용되는 배양조건 등을 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
실험예
2: 인간 성장호르몬/알파-1
안티트립신
융합체의
pI
별 분획
상기 실시예에서 얻어진 발현 세포주를 현탁배양하여 얻어진 세포배양액으로 분비된 본 발명의 신규한 지속형 성장호르몬을 정제하였다.
구체적으로, 배양액을 여과하여 세포를 제거한 후 상등액만 취하고, 평형 완충용액(20mM 소듐 포스페이트, pH 8.0)을 이용하여 한외 여과 시스템(분자량 컷 오프 30,000)을 이용하여 정용여과하였다. 그 다음, 이를 Q-세파로즈(Q-sepharose, GE Healthcare, 미국) 컬럼에 주입하고, 평형 완충용액과 50mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 8.0)으로 불순 단백질들을 제거한 다음, 190mM NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충용액(pH 8.0)을 흘려, 지속형 성장호르몬이 포함된 용액을 회수하였다.
Q-세파로즈 컬럼 용출액에 4M NaCl/20mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.5)을 첨가하여 약 2.5M NaCl/20mM 소듐 포스페이트(pH 7.5)가 되도록 하여 페닐-세파로즈(GE Healthcare, 미국) 로딩액을 준비하였다. 그 다음, 이를 페닐-세파로즈 컬럼에 로딩하고, 2.5M NaCl이 포함된 20mM 소듐 포스페이트 완충액으로 컬럼을 세척하였다. 그 다음, 20mM 소듐 포스페이트 완충액(pH 7.5)을 이용하여 지속형 인간 성장호르몬이 포함된 용액을 회수하였다.
페닐 세파로즈 컬럼 용출액을 150mM NaCl이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 이용하여 한외 여과 시스템(분자량 컷 오프 30,000)을 이용하여 정용여과하였다. 그 다음, 이를 안티 알파1-안티트립신(A1AT) 항체 단편이 부착된 수지(GE Healthcare, 이하 'A1AT'로 명명)에 로딩하여 컬럼에 결합시킨 후, 50mM MgCl2가 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)으로 세척하였다. 이후, 100mM MgCl2이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4), 200mM MgCl2이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4), 300mM MgCl2이 포함된 트리스(Tris) 완충용액(pH 7.4)을 순차적으로 흘려 pI 차이에 따른 본 발명의 지속형 성장호르몬을 분획하여 용출하였다.
이때, 100mM MgCl2/트리스 완충용액(pH 7.4)으로 용출된 본 발명의 지속형 성장호르몬을 이소폼(isoform) 1로, 200mM MgCl2/트리스 완충용액(pH 7.4)으로 용출된 본 발명의 지속형 성장호르몬을 이소폼(isoform) 2로, 300mM MgCl2/트리스 완충용액(pH 7.4)으로 용출된 본 발명의 지속형 성장호르몬을 이소폼(isoform) 3으로, 각각 명명하였다(도 1 및 2).
상기 방법 외에도 이 분야에서 통상의 지식을 가진 자는 등전점에 따라 단백질을 분리하기 위한 통상의 방법을 적절히 선택하여 적용할 수 있다.
실험예
3: 인간 성장호르몬/알파-1
안티트립신
융합체의
약역학
실험
본 발명에 따른 지속형 성장호르몬 분획의 약역학을 확인하기 위하여 하기와 같은 실험을 수행하였다.
뇌하수체 제거 랫트에 상기 이소폼 1 내지 3을 0.6mg/kg의 농도로 피하(S.C.) 투여하여 14일 차까지 몸무게의 변화 및 몸길이를 측정하였고, 그 결과를 각각 도 3 및 4에 나타내었다.
그 결과, 도 3에 나타난 바와 같이, 음성대조군인 PBS 투여군에서는 무게변화가 없었으나. 이소폼 1 내지 3 및 양성대조군인 유트로핀(Eutropin) 및 디클라제(Declage) 투여 군에서는 현저한 무게 증가가 나타났다. 특히, 이소폼 1 및 2는 양성대조군보다 무게 증가율이 10일 차에 더 컸으며, 이소폼 3은 양성대조군보다 다소 저조한 증가율을 보였다.
또한, 몸길이 측정 결과의 경우, 이소폼 1 및 2는 양성대조군인 디클라제보다 몸길이 증가율이 컸으나, 이소폼 3은 다소 적은 결과를 나타내었다(도 4).
상기와 같은 결과는 같은 종류의 지속형 성장 호르몬이라 하더라도, 당쇄의 정도에 따라 효능의 정도에 차이가 있음을 나타내는 것으로, 특히 본 발명의 방법으로 제조된, 5.2 이하의 pI를 가진 NexP-hGH 단백질이 고당화 단백질로서, 체내 지속성 및 높은 성장효과를 지님을 시사하는 것이다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.
<110> CJ CheilJedang Corporation
Alteogen, Inc
<120> Hyperglycosylated long-acting human growth hormone and method for
preparing the same
<130> PA120923KR
<160> 1
<170> KopatentIn 2.0
<210> 1
<211> 394
<212> PRT
<213> Homo sapiens
<400> 1
Glu Asp Pro Gln Gly Asp Ala Ala Gln Lys Thr Asp Thr Ser His His
1 5 10 15
Asp Gln Asp His Pro Thr Phe Asn Lys Ile Thr Pro Asn Leu Ala Glu
20 25 30
Phe Ala Phe Ser Leu Tyr Arg Gln Leu Ala His Gln Ser Asn Ser Thr
35 40 45
Asn Ile Phe Phe Ser Pro Val Ser Ile Ala Thr Ala Phe Ala Met Leu
50 55 60
Ser Leu Gly Thr Lys Ala Asp Thr His Asp Glu Ile Leu Glu Gly Leu
65 70 75 80
Asn Phe Asn Leu Thr Glu Ile Pro Glu Ala Gln Ile His Glu Gly Phe
85 90 95
Gln Glu Leu Leu Arg Thr Leu Asn Gln Pro Asp Ser Gln Leu Gln Leu
100 105 110
Thr Thr Gly Asn Gly Leu Phe Leu Ser Glu Gly Leu Lys Leu Val Asp
115 120 125
Lys Phe Leu Glu Asp Val Lys Lys Leu Tyr His Ser Glu Ala Phe Thr
130 135 140
Val Asn Phe Gly Asp Thr Glu Glu Ala Lys Lys Gln Ile Asn Asp Tyr
145 150 155 160
Val Glu Lys Gly Thr Gln Gly Lys Ile Val Asp Leu Val Lys Glu Leu
165 170 175
Asp Arg Asp Thr Val Phe Ala Leu Val Asn Tyr Ile Phe Phe Lys Gly
180 185 190
Lys Trp Glu Arg Pro Phe Glu Val Lys Asp Thr Glu Glu Glu Asp Phe
195 200 205
His Val Asp Gln Val Thr Thr Val Lys Val Pro Met Met Lys Arg Leu
210 215 220
Gly Met Phe Asn Ile Gln His Cys Lys Lys Leu Ser Ser Trp Val Leu
225 230 235 240
Leu Met Lys Tyr Leu Gly Asn Ala Thr Ala Ile Phe Phe Leu Pro Asp
245 250 255
Glu Gly Lys Leu Gln His Leu Glu Asn Glu Leu Thr His Asp Ile Ile
260 265 270
Thr Lys Phe Leu Glu Asn Glu Asp Arg Arg Ser Ala Ser Leu His Leu
275 280 285
Pro Lys Leu Ser Ile Thr Gly Thr Tyr Asp Leu Lys Ser Val Leu Gly
290 295 300
Gln Leu Gly Ile Thr Lys Val Phe Ser Asn Gly Ala Asp Leu Ser Gly
305 310 315 320
Val Thr Glu Glu Ala Pro Leu Lys Leu Ser Lys Ala Val His Lys Ala
325 330 335
Val Leu Thr Ile Asp Glu Lys Gly Thr Glu Ala Ala Gly Ala Met Phe
340 345 350
Leu Glu Ala Ile Pro Met Ser Ile Pro Pro Glu Val Lys Phe Asn Lys
355 360 365
Pro Phe Val Phe Leu Met Ile Asp Gln Asn Thr Lys Ser Pro Leu Phe
370 375 380
Met Gly Lys Val Val Asn Pro Thr Gln Lys
385 390
Claims (8)
- 삭제
- 동물세포에서 제조된, 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 단백질로, 5.2 이하의 등전점(isoelectric point, pI)을 갖는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질로서, 상기 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)는 야생형 알파-1 안티트립신 단백질의 9번째 글루타민(glutamine)의 아스파라진(asparagine)으로의 변이, 232번째 아미노산인 시스테인(cysteine)의 세린(serine)으로의 변이, 357번째 아미노산인 프롤린(proline)의 아스파라진(asparagine)으로의 변이, 및 359번째 아미노산인 세린(serine)의 트레오닌(threonine)으로의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 것인, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질.
- (a) 알파-1 안티트립신 변이체(NexP) 및 인간 성장호르몬(hGH)이 융합된 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 생물학적 유액을 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계; 및
(b) 등전점(isoelectric point, pI) 차이에 따라 등전점(pI) 5.2 이하인 지속형 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 분리하는 단계를 포함하는, 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질의 제조 방법으로서, 상기 알파-1 안티트립신 변이체(NexP)는 야생형 알파-1 안티트립신 단백질의 9번째 글루타민(glutamine)의 아스파라진(asparagine)으로의 변이, 232번째 아미노산인 시스테인(cysteine)의 세린(serine)으로의 변이, 357번째 아미노산인 프롤린(proline)의 아스파라진(asparagine)으로의 변이, 및 359번째 아미노산인 세린(serine)의 트레오닌(threonine)으로의 변이로 구성된 군에서 선택된 1종 이상의 변이를 포함하는 것인, 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (b) 단계는 0 내지 1000mM MgCl2가 포함된, 트리스(Tris) 완충용액으로 용출시키는 단계를 포함하는, 제조 방법.
- 제4항에 있어서, 상기 트리스 완충용액은 0 내지 200mM MgCl2가 포함된 트리스 완충용액인 것인, 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (a)단계는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 시료를 음이온 교환 수지 크로마토그래피 또는 소수성 수지 크로마토그래피에 적용하여 생성된 용출액을, 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계인 것인, 제조 방법.
- 제3항에 있어서, 상기 (a) 단계는 지속형 인간 성장호르몬 NexP-hGH 단백질을 포함하는 시료를 음이온 교환 수지 크로마토그래피 및 소수성 수지 크로마토그래피에 순차적으로 적용하여 생성된 용출액을, 안티 알파-1 안티트립신 항체 단편이 부착된 수지로 충진된 친화성 크로마토그래피에 적용하는 단계인 것인, 제조 방법.
- 삭제
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-
2013
- 2013-05-31 KR KR1020130063053A patent/KR101504824B1/ko not_active IP Right Cessation
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