CN112166315A - 修饰粒子、修饰粒子的制造方法及检测装置 - Google Patents

修饰粒子、修饰粒子的制造方法及检测装置 Download PDF

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Abstract

本公开提供减少被固定在粒子的表面的特异性结合物质的劣化的修饰粒子。本公开涉及的修饰粒子(100)包含：粒子(10)；特异性结合物质(20)，上述特异性结合物质(20)具有能够与被检测物质特异性结合的性质，且固定在粒子(10)的表面；以及氨基糖分子(30)，上述氨基糖分子(30)通过酰胺键而固定在粒子(10)的表面。

Description

修饰粒子、修饰粒子的制造方法及检测装置
技术领域
本公开涉及用于检测试样中的被检测物质的修饰粒子、修饰粒子的制造方法以及检测装置。
背景技术
近年来，在医疗、生物化学领域中，使用了利用了抗体等生理活性物质(以下，特异性结合物质)的生物传感器。
例如在专利文献1中，公开了将用于捕捉被检测物质的特异性结合物质吸收或结合于基质，并将用于检测被捕捉的被检测物质的有无的特异性结合物质配置在基质上，并通过冷冻干燥而能够每次使用地构成的检测试剂盒。
现有技术文献
专利文献
专利文献1：日本特表平04-503404号公报
发明内容
发明所要解决的课题
另外，作为利用了特异性结合物质的其它方法，也有使用粒子状基材的方法。该方法是使预先结合了特异性结合物质的粒子状基材与被检测物质结合，根据结合于被检测物质的粒子状基材的特性而通过各种检测方法检测被检测物质的存在的有无、和存在量的方法。在上述方法中，需要检测被检测物质的存在量等的微细变化，经常要求检测的高灵敏度化。
因此本公开提供能够实现检测被检测物质时的检测的高灵敏度化的修饰粒子等。
用于解决课题的手段
本公开的一方案涉及的修饰粒子包含：粒子；特异性结合物质，上述特异性结合物质具有能够与被检测物质特异性结合的性质，且固定在上述粒子的表面；以及氨基糖分子，上述氨基糖分子通过酰胺键而固定在上述粒子的表面。
发明的效果
根据本公开，提供能够实现检测的高灵敏度化的修饰粒子等。
附图说明
图1为显示实施方案涉及的修饰粒子的一例的概略图。
图2为显示实施方案涉及的修饰粒子的制造方法的一例的流程图。
图3为显示实施方案涉及的检测装置的一例的概略构成图。
图4为对用于检测装置时的修饰粒子进行说明的图。
图5为对实施方案涉及的、从检测装置输出的2维图像的一例进行示意性说明的图。
图6为对实施例涉及的修饰粒子的吸附试验的试验方法进行说明的图。
图7为对实施例涉及的修饰粒子的吸附试验的结果进行说明的图。
具体实施方式
(成为公开的基础的认识)
特异性结合物质易于通过热、或干燥而受到破坏。例如，通过热、或干燥而特异性结合物质的结构的一部分变性，功能降低。这在将特异性结合物质固定于传感器基板、粒子的表面而使用的情况下经常成为问题。由于这样的特异性结合物质的功能降低与被检测物质的检测中的检测灵敏度的降低直接关联，因此期望尽可能抑制功能降低。
因此，在专利文献1中公开了将用于捕捉被检测物质的特异性结合物质、和用于检测被捕捉的被检测物质的有无的特异性结合物质配置在基质上，通过冷冻干燥而能够每次使用地构成的检测试剂盒。通过冷冻干燥，特异性结合物质耐受某程度长期的保存，在使用时添加溶液从而能够立即恢复到能够使用的状态。
然而，上述以往的检测试剂盒虽然使用冷冻干燥而制造，但根据特异性结合物质的种类，也有不适合于冷冻干燥的种类的物质，不能一概说可以享有上述效果。因此，不能说以往的检查试剂盒的保护特异性结合物质免受功能降低的效果是充分的。特别是，由于特异性结合物质的结构性和功能性劣化(以下，特异性结合物质的劣化)，可能发生试样中的杂质等与特异性结合物质的劣化了的部分非特异性吸附、或结合(以下，非特异性吸附)。进一步，在将上述技术应用于使用固定了特异性结合物质的粒子状基材的方法的情况下，存在由粒子状基材彼此的非特异性吸附引起的凝集、和向规定容纳粒子状基材的空间的结构体的非特异性吸附增加这样的问题。
因此，本公开提供减少固定在粒子的表面的特异性结合物质的劣化的修饰粒子、以及该修饰粒子的制造方法。此外，本公开提供可以通过使用该修饰粒子来检测被检测物质的检测装置。
(公开的概要)
本公开的一方案的概要如下所述。
本公开的一方案涉及的修饰粒子包含：粒子；特异性结合物质，上述特异性结合物质具有能够与被检测物质特异性结合的性质，且固定在上述粒子的表面；以及氨基糖分子，上述氨基糖分子通过酰胺键而固定在上述粒子的表面。
由此，氨基糖分子被稳定地固定在粒子的表面。稳定地固定在粒子的表面的氨基糖分子在液体中不从粒子的表面脱离。而且，氨基糖分子所具有的羟基(OH基)代替水分子而起作用，因此特异性结合物质的疏水部不露出而减少劣化。此外，通过这样在粒子的表面减少特异性结合物质的劣化，从而抑制修饰粒子彼此、或检测中的修饰粒子可能接触的地方与修饰粒子的相互作用，阻碍它们的非特异性吸附。因此，可以使被检测物质的检测高灵敏度化。
例如，本公开的一方案涉及的修饰粒子可以包含基材、和覆盖上述基材的表面的至少一部分的有机膜，上述氨基糖分子通过上述酰胺键而固定于上述有机膜。
由此，通过选择能够容易地与氨基糖分子形成酰胺键的有机膜，从而能够容易地构成在表面配置了氨基糖分子的修饰粒子。
例如，本公开的一方案涉及的修饰粒子可以包含覆盖上述有机膜的至少一部分，且阻碍与上述有机膜中的规定分子的相互作用的阻断剂。
由此，在检测被检测物质时，可以减少粒子彼此、和粒子的表面中的杂质等的非特异性吸附。因此，可以减少由非特异性吸附而产生的噪声(即，非特异性吸附噪声)，精度良好地检测被检测物质。
例如，对于本公开的一方案涉及的修饰粒子，上述有机膜可以为自组装化单分子膜。
由此，特异性结合物质和氨基糖分子可以与自组装化了的有机膜容易地结合。因此，特异性结合物质和氨基糖分子容易并且稳定地固定在粒子的表面。
例如，对于本公开的一方案涉及的修饰粒子，上述基材可以包含荧光体。
由此，可以通过使用了荧光的光学方法来检测与被检测物质形成了特异性结合的修饰粒子。
例如，对于本公开的一方案涉及的修饰粒子，上述基材可以包含顺磁体或电介质。
由此，可以通过利用磁场或电场进行移动等方法来检测与被检测物质形成了特异性结合的修饰粒子。
此外，本公开的一方案涉及的修饰粒子的制造方法包含下述工序：准备工序，准备粒子；固定工序，将能够与被检测物质特异性结合的特异性结合物质固定在上述粒子的表面；以及糖固定工序，将氨基糖分子通过酰胺键固定在上述粒子的表面。
由此，可以获得粒子在保存液中也可以减少特异性结合物质劣化，并可以减少在用于检测等时粒子彼此、或检测中的粒子可能接触的地方与粒子的吸附的修饰粒子。
例如，对于本公开的一方案涉及的修饰粒子的制造方法，可以通过将包含上述特异性结合物质和上述氨基糖分子的溶液、与上述粒子进行混合，来实施上述固定工序、和上述糖固定工序。
由此，可以通过一步(合在一起)实施固定工序、和糖固定工序，可以减少制造工序中的工时。
此外，本公开的一方案涉及的检测装置具备：容纳部，上述容纳部容纳上述中任一项所述的修饰粒子；导入部，上述导入部将可能包含上述修饰粒子能够特异性结合的被检测物质的试样导入到上述容纳部；以及检测器，上述检测器输出基于上述修饰粒子所结合的上述被检测物质的量的检测信号。
由此，检测装置可以实现使用修饰粒子能够从试样中检测被检测物质的存在、或存在量的检测装置。
另外，它们的包括的、或具体的方案可以通过***、方法、集成电路、计算机程序、或能够通过计算机读取的CD-ROM等记录介质来实现，可以通过***、方法、集成电路、计算机程序和记录介质的任意组合来实现。
以下，参照附图对本公开的实施方案进行说明。
另外，以下说明的实施方案都显示包括的或具体的例子。以下实施方案中显示的数值、形状、材料、构成要素、构成要素的配置位置、和连接形态、步骤、步骤的顺序等为一例，不是限定权利要求的意图。此外，关于以下实施方案中的构成要素之中，表示最上位概念的独立权利要求中未记载的构成要素，作为任选的构成要素进行说明。
另外，各图不一定是严格地图示。在各图中，对实质上相同的构成附上相同的符号，重复的说明省略或简化。
此外，在本说明书中，平行等表示要素间的关系性的用语、和矩形等表示要素的形状的用语、以及数值、和数值范围不是仅表示严格意思的表达，是意味着实质上同等的范围、例如也包含数％程度的误差等差异的表达。
(实施方案)
[修饰粒子的构成]
图1为显示本实施方案涉及的修饰粒子100的一例的概略图。在图1中显示修饰粒子100的截面，修饰粒子100之中的纸面下侧的一部分省略图示。
如图1所示那样，修饰粒子100包含粒子10、特异性结合物质20、和氨基糖分子30。特异性结合物质20具有能够与被检测物质特异性结合的性质，且固定在粒子10的表面。此外，氨基糖分子30通过酰胺键而固定在粒子10的表面。
粒子10只要是在其表面能够结合特异性结合物质20、和氨基糖分子30的粒子，则其大小就没有特别限定。
粒子10的大小为例如直径为1nm以上且10μm以下。在粒子中，使用公知的表面处理技术而在其表面导入羧基。由此，粒子10可以使氨基糖分子30结合于其表面。导入了羧基的粒子与导入了氨基的粒子相比，也有与抗体等特异性结合物质20的结合性高这样的优点。
此外，粒子10包含基材11、和覆盖基材11的表面的至少一部分的有机膜。更详细而言，从特异性结合物质20的固定容易性的观点、和特异性结合物质20与被检测物质的反应性的观点考虑，粒子10的表面可以通过能够适当确保特异性结合物质20与基材11的距离的分子(连接体)而构成。该连接体通过有机膜而构成，但可以不为有机膜。能够成为这样的连接体的分子通常根据连接体被结合的表面的荷电特性等来选择。
本实施方案中的能够成为连接体的分子例如通过链烷硫醇等形成自组装化单分子膜(SAM12)那样的分子而构成，但不限于此。例如，根据基材11的特性，可举出硅烷偶联剂、包含聚乙二醇链(PEG链)的亲水性聚合物、和作为具有磷脂极性基的MPC(2-甲基丙烯酰氧基乙基磷酸胆碱)的聚合物的MPC聚合物等。此外，这些连接体分子在与基材11表面结合时，可以经由在基材11表面形成的金属等而结合。
作为金属的材料，可以使用例如，金、银、铝、铜、铂等金属之中的至少一种金属、或它们的合金。另外，金属的材料不限定于此。
基材11的材质可举出例如，石英、玻璃、二氧化硅、和陶瓷等无机材料、以及聚苯乙烯、聚碳酸酯和环烯烃聚合物等树脂、以及水凝胶、琼脂糖、纤维素、和包含异戊二烯等橡胶材料的天然材料、以及铁、金、氧化铝、和银等金属材料等。
此外，基材11可以包含荧光体而构成。所谓荧光体，是通过照射激发光而放射具有与激发光不同波长的荧光的物质，可以使用例如，以荧光素及其衍生物为代表的有机色素、以及绿色荧光蛋白质等生物学荧光分子。此外作为荧光体，可以使用能够设计放射荧光的发光特性的量子点。
此外，基材11可以包含顺磁体或电介质而构成。作为顺磁体，可以使用例如，氧化铁等，作为电介质，可以使用聚苯乙烯等，但不限定于此。
如上述那样，在本实施方案中，有机膜由能够成为连接体的SAM12构成。此时，特异性结合物质20通过与SAM12结合，从而被固定在粒子10的表面。此外，氨基糖分子30通过酰胺键而被固定于SAM12。这样，通过粒子10在基材11上包含SAM12，从而特异性结合物质20和氨基糖分子30被稳定地固定在粒子10的表面。被稳定地固定在粒子10的表面的氨基糖分子30即使经过修饰粒子100的洗涤等工序也不从表面脱离。而且，氨基糖分子30所具有的羟基(OH基)代替水分子而起作用，因此即使在包含修饰粒子100的溶液被干燥了的情况下，也减少由特异性结合物质的干燥引起的劣化，在实际使用修饰粒子100的被检测物质的检测中，可以实现检测的高灵敏度化。此外由于这样特异性结合物质20的稳定性增加，因此修饰粒子100的操作的容易性提高。
此外，在本实施方案中，如上述那样有机膜通过形成SAM12的连接体分子而构成。作为形成SAM12的单分子，可以使用例如，碳原子数4以上并且20以下左右的羧基链烷硫醇，特别是10-羧基-1-癸烷硫醇。使用碳原子数4以上并且20以下左右的羧基链烷硫醇而形成的SAM12具有透明性高，折射率低，膜厚(即从基材11表面到粒子10的表面的距离)薄等性质。因此，在使用了修饰粒子100的检测中，光学影响少。SAM12的一端只要是能够与基材11的表面结合的官能团即可，例如在为硫醇基的情况下，通过对存在于基材11的表面的金进行结合来形成粒子10。此外，SAM12的另一端只要具有能够与特异性结合物质20和氨基糖分子30结合的羧基即可。由于这样SAM12在末端具有羧基，因此特异性结合物质20和氨基糖分子30可以与SAM12容易地形成结合。进一步，氨基糖分子30通过酰胺键被固定。由此，特异性结合物质20和氨基糖分子30被稳定地固定在粒子10的表面。
特异性结合物质20为能够与被检测物质特异性结合的物质。被检测物质例如为蛋白质、脂质、糖、核酸等，为想要检测的对象的病毒粒子、微生物、细菌等产生的、或构成它们的分子种类。特异性结合物质20可举出例如，针对抗原的抗体、基质、或针对辅酶的酶、针对激素的受体、针对抗体的蛋白A或蛋白G、针对生物素的抗生物素蛋白类、针对钙的钙调蛋白、针对糖的凝集素等。此外，在被检测物质为核酸的情况下，具有与该核酸特异性结合的序列的(互补链的)核酸可以作为特异性结合物质20使用。
例如，在特异性结合物质20为抗体等蛋白质的情况下，在构成该蛋白质的多个氨基酸中，有在其侧链具有羧基、氨基、硫醇基的氨基酸。可以使这些官能团与粒子10进行化学结合，或在将这些官能团进行抗生物素蛋白修饰，进一步将粒子10进行了生物素修饰后，通过抗生物素蛋白-生物素结合而使特异性结合物质20与粒子10结合。另外，在特异性结合物质20为蛋白质的情况下，可以利用存在于N末端的氨基、和存在于C末端的羧基。
此外，为了使特异性结合物质20与粒子10效率更好地结合，可以使用能够促进特异性结合物质20与粒子10的结合反应的物质而进行官能团的活化处理。作为该活化处理的方法，可以使用例如，1-乙基-3-(-3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺盐酸盐(EDC)、和N-羟基琥珀酸酰亚胺(NHS)。这是使SAM12和特异性结合物质20中的一者所具有的羧基进行活性酯化，使该被活性酯化了的羧基、与特异性结合物质20和SAM12中的另一者所具有的氨基结合的方法。此外，该活化处理的方法可以为例如，使用戊二醛等具有多个醛基的物质，使SAM12的氨基、与特异性结合物质20的氨基结合的方法。
另外，将特异性结合物质20固定于粒子10的方法只要是特异性结合物质20不失活(不丧失特异性结合能力)的固定方法，就可以使用其它公知的方法。
氨基糖分子30为具有氨基的糖。氨基糖分子30通过在其分子中具有氨基，从而通过酰胺键固定在粒子10的表面。在本实施方案中，粒子10在表面具有SAM12(有机膜)，具有羧基。因此，通过氨基糖分子30所具有的氨基、与SAM12所具有的羧基，从而通过羧基与氨基的反应而形成酰胺键。由此，氨基糖分子30与SAM12通过作为酰胺键的共价键而固定。共价键在化学键中结合力强。因此，氨基糖分子30被更稳定地固定在粒子10的表面。通过这样被稳定地固定的氨基糖分子30的保水性，保护修饰粒子100的表面免受干燥，减少特异性结合物质20的结构性和功能性劣化，因此可以提高修饰粒子100的保存稳定性。
此外，氨基糖分子30不仅可以为单糖，而且可以为二糖类、或由3个以上单糖构成的少糖类(所谓寡糖)、或多糖类(所谓聚糖)。此外，氨基糖分子30可以如唾液酸那样在1个分子中具有除氨基以外的官能团。此外，氨基糖分子30可以为例示的氨基糖分子的盐。氨基糖分子30优选为单糖或二糖类。
具体而言，氨基糖分子30可以为例如葡糖胺、甘露糖胺、半乳糖胺、唾液酸、氨基糖醛酸、或胞壁酸等具有氨基的氨基糖、或脱乙酰壳多糖等具有氨基的多糖类等，也可以为它们的盐。另外，在上述氨基糖分子30存在D型、或L型的镜像异构体的情况下，可以使用任一者。氨基糖分子30优选为葡糖胺。
将这些氨基糖分子30固定在粒子10的表面的方法可以使用与特异性结合物质20同样的方法。另外，氨基糖分子30只要是能够通过酰胺键而固定在粒子10的表面的氨基糖分子，就没有特别限定，可以使用除上述糖以外的公知的糖。
氨基糖分子30通过酰胺键被固定在粒子10的表面可以通过在使胰蛋白酶等蛋白酶作用于修饰粒子100而获得的分解物中存在来源于氨基糖分子30的红外吸收峰来确认。
此外，本实施方案涉及的修饰粒子100可以进一步包含覆盖粒子10的表面的至少一部分，且阻碍与修饰粒子100的SAM12中的其它分子的相互作用的阻断剂。阻断剂为阻碍可能包含被检测物质的试样中的杂质等与粒子10的表面非特异性吸附、或结合的相互作用(即，非特异性吸附)的物质。杂质例如为除构成修饰粒子的分子以外的蛋白质、脂质、糖、肽、核酸等规定分子。
阻断剂在本实施方案中作为乙醇胺40进行说明，但不限于此。可以为例如，脱脂奶、鱼明胶、牛血清白蛋白(BSA)、表面活性剂、酪蛋白、精蛋白、聚乙二醇(PEG)等。阻断剂只要是至少覆盖粒子10的表面未固定特异性结合物质20和氨基糖分子30的区域(即，间隙区域)的物质即可。
通过这样的阻断剂，从而在检测被检测物质时，可以阻碍粒子10的表面中的非特异性吸附。因此，可以减少由非特异性吸附产生的噪声(即，非特异性吸附噪声)，在检测被检测物质时使检测高灵敏度化。
另外，在本公开中所谓阻断处理，是指如上述那样用于阻碍非特异性吸附的处理。通过阻断处理，可以减少非特异性吸附引起的对被检测物质的检测的影响。对于阻断处理，在将特异性结合物质20和氨基糖分子30固定在粒子10的表面后，将乙醇胺40固定在粒子10的表面为好。
更具体而言，在将特异性结合物质20、和氨基糖分子30固定在粒子10后，添加包含乙醇胺40的溶液，从而使溶液中的乙醇胺40固定在粒子10的表面。包含乙醇胺40的溶液供于反应规定时间(例如用于充分覆盖间隙区域的反应时间)后，包含剩余的(未被固定的)乙醇胺40，因此通过外液交换等将其除去。另外，在阻断剂在反应中被充分固定的情况下，也可以与特异性结合物质20、和氨基糖分子30的固定同时进行阻断处理。
[修饰粒子的制造方法]
图2为显示本实施方案涉及的修饰粒子100的制造方法的一例的流程图。
如图2(a)所示那样，在修饰粒子100的制造方法中，实施[1]准备粒子10的准备工序(S101)、和[2]使反应性官能团活化的活化工序(S102)。另外，活化工序是为了使该活化工序之后的固定工序、和糖固定工序的反应效率上升而实施的。因此，在通过反应性官能团的选择等而导入了具有充分反应性的反应性官能团的情况下等，也有时不需要活化工序。
此外，修饰粒子100的制造方法包含下述工序：[3]将能够与被检测物质特异性结合的特异性结合物质20固定在粒子10的表面的固定工序(S103)；以及[4]将氨基糖分子30通过酰胺键而固定在粒子10的表面的糖固定工序(S104)。
进一步，[5]关于未反应的反应性官能团，认为有助于非特异性吸附，因此在修饰粒子100的制造方法中，可以实施进行阻断处理的阻断工序(S105)。另外，在能够设定不形成(不残存)未反应的反应性官能团的固定工序、和糖固定工序的条件的情况下，可以不实施该阻断工序。
以下，更具体地说明修饰粒子100的制造方法。
[1]修饰粒子100的制造方法中的准备工序(S101)例如包含以下3个子步骤。第1子步骤为准备基材11的工序。第2子步骤为在该基材11上形成SAM12的工序。
以下，更具体地对各个子步骤进行说明。
在第1子步骤中，例如，在基材11的材料为树脂材料的情况下，使用聚合等公知的合成技术而形成基材11。此外，基材11的材料即使为金属、顺磁体，也使用公知的合成技术而形成基材11。
接着，在第2子步骤中，在基材11的表面(例如，形成了金属的表面)形成SAM12。SAM的形成方法没有特别限定，使用通常进行的方法为好。可举出例如，将在其表面形成了金属的基材11在包含碳原子数4以上并且20以下左右的羧基链烷硫醇(例如，10-羧基-1-癸烷硫醇等)的乙醇溶液中浸渍的方法等。
在该方法中，通过羧基链烷硫醇(以下，单分子)的硫醇基与金属结合，从而单分子被固定在金属基材的表面，这些被固定了的单分子在金属的表面上通过相互作用而自组装化，进行膜形成。通过以上，可获得在基材11的表面配置了SAM12的粒子10。
[2]活化工序(S102)为将SAM12所具有的导入到粒子10表面侧的反应性官能团(例如，羧基)以易于与特异性结合物质20所具有的反应性官能团(例如，氨基)反应的形式活化的工序。在本活化工序中，例如，在构成SAM12的单分子具有羧基的情况下，通过1-乙基-3-(3-二甲基氨基丙基)碳二亚胺(EDC)、和N-羟基琥珀酸酰亚胺(NHS)而被活性酯化。在本活化工序中，使用以上那样的修饰、或虽然未例示但脱离等反应而使反应性官能团变化为反应性更高的状态。
[3]固定工序(S103)例如包含以下3个子步骤。第4子步骤为将特异性结合物质20与粒子10混合的工序。第5子步骤为使特异性结合物质20固定在SAM12(即粒子10)的工序。第6子步骤为将未被固定在SAM12的游离状态的特异性结合物质20除去的工序。
以下，更具体地对各个子步骤进行说明。
在第4子步骤中，将在步骤S102中具有反应性官能团被活化了的SAM12的粒子10与包含特异性结合物质20的溶液混合。
进而，在第5子步骤中，使SAM12所具有的被活化了的反应性官能团、与特异性结合物质20所具有的反应性官能团反应，使特异性结合物质20固定在SAM12上。特异性结合物质20通过酰胺键而被固定在SAM12上。
接着，在第6子步骤中，将未被固定在SAM12上的游离状态的特异性结合物质20除去。更具体而言，例如，使用磷酸缓冲生理食盐液(PBS)等缓冲液，维持被固定了的反应性官能团彼此不被分解的环境，通过外液交换等方法将游离状态的分子除去。由此，可以获得特异性结合物质20被固定在粒子10的表面的修饰粒子100。
[4]糖固定工序(S104)例如包含按照上述固定工序的子步骤。即，包含代替特异性结合物质20而固定氨基糖分子30的、与第4子步骤～第6子步骤对应的子步骤。
这里，如图2(b)所示那样，固定工序与糖固定工序可以同时进行。更具体而言，在活化工序中，在使反应性官能团活化后，将被活化了的粒子10、和包含特异性结合物质20和氨基糖分子30的溶液混合。由此将第5子步骤、和糖固定工序中的与第5子步骤对应的子步骤合在一起作为1个工序(S106)而实施。
即在本制造方法中，也可以将包含特异性结合物质20和氨基糖分子30的溶液、与反应性官能团被活化了的粒子10进行混合，而同时实施将特异性结合物质20固定在形成在粒子10的表面的SAM12的固定工序(S103)、和将氨基糖分子30固定的糖固定工序(S104)。
另外，修饰粒子100的制造方法可以进一步包含[5]阻断工序(S105)。在阻断工序中，如上述那样进行通过能够阻碍可能包含被检测物质的试样中的杂质等与粒子10的表面非特异性吸附的乙醇胺40(阻断剂)而被覆粒子10的表面的处理。
具体而言，在阻断工序中，将乙醇胺40、与固定了特异性结合物质20、和氨基糖分子30的粒子10进行混合。由此，可获得可以减少试样中的杂质等与粒子10的表面非特异性吸附的、包含乙醇胺40的修饰粒子100。
进一步，可以调制在包含特异性结合物质20和氨基糖分子30的溶液中添加了阻断剂的溶液，在该溶液中加入反应性官能团被活化了的粒子10并混合。由此，也可以将固定工序、糖固定工序、和阻断工序作为1个工序而一起进行。因此，也可以进一步将制造工序合在一起进行而减少修饰粒子100的制造中的工时。
[检测装置的构成]
图3为显示本实施方案涉及的检测装置50的一例的概略构成图。
如图3所示那样，检测装置50具备：容纳部，上述容纳部容纳修饰粒子100；导入部，上述导入部将可能包含修饰粒子100能够特异性结合的被检测物质的试样导入到容纳部；以及检测器，上述检测器输出基于修饰粒子100所结合的被检测物质的量的检测信号。
更详细而言，具备：容纳修饰粒子100的小室51(容纳部的一例)；光源54；吸拉磁场施加部56；扫描磁场施加部57；以及2维图像检测部58(检测器的一例)。小室51具有由检测板52和盖53而划分成的空间，在与该空间对置的检测板52的表面相反侧的表面接合有棱镜55。这里，小室51的空间例如通过盖53开闭等而与外部可连接地构成。即在这样的例子中，盖53作为导入部起作用。
另外，可以为在小室51具有能够导入可能包含被检测物质的试样的连通孔(未图示)的构成，在这样的例子中，该连通孔作为导入部起作用。因此，只要可以导入可能包含被检测物质的试样，就可以在检测装置50的任一构成要素具备导入部。
以下，进一步对构成检测装置50的各构成要素进行详细地说明。在本实施方案中说明的检测装置50显示通过被称为外力辅助型近场照明(EFA-NI)的检测方法而进行被检测物质的检测的装置作为一例。
这里，在使用了检测装置50的被检测物质的检测中，使用至少2种修饰粒子100。使用图4对这样的粒子进行说明。图4为对用于检测装置50时的修饰粒子进行说明的图。图4的修饰粒子100与图1同样地由一部分省略了图示的截面图表示。
如图4所示那样，检测装置50在检测被检测物质59时，使用基材11a包含荧光体F的修饰粒子(即第1粒子100a)、和基材11b包含顺磁体M的修饰粒子(即第2粒子100b)。第1粒子100a经由特异性结合物质20a而与被检测物质59结合。此外，第2粒子100b同样地，经由特异性结合物质20b而与被检测物质59结合。这里，特异性结合物质20a和特异性结合物质20b与被检测物质59的不同位置结合。
例如，在被检测物质59为病毒的外壳蛋白质等具有重复结构的分子的情况下，特异性结合物质20a和特异性结合物质20b可以与分子内的同一位置结合。更详细而言，即使在重复结构之中的一个结合位置结合特异性结合物质20a，也由于同一结合位置在重复结构中存在多个，因此能够同时结合特异性结合物质20b。
另一方面，在被检测物质59为单一蛋白质等不具有同一结合位置的单一分子的情况下，需要特异性结合物质20a和特异性结合物质20b在被检测物质59的分子内与不同位置结合。因此，需要以特异性结合物质20a和特异性结合物质20b根据作为对象的被检测物质59的种类而特别地对被检测物质59的结合位置具有同一结构、或不同结构的方式设计修饰粒子。
注意以上而设计的2种修饰粒子(第1粒子100a、和第2粒子100b)通过与被检测物质59结合从而形成粒子复合体100c。
回到图3，显示出第1粒子100a、第2粒子100b、和被检测物质59被导入到小室51的空间内，其中的一部分形成粒子复合体100c的状况。
小室51如上述那样通过作为板状构件的检测板52被划分成。因此检测板52的一个主面52a面向小室51的空间。此外检测板52的另一个主面52b面向棱镜55，彼此被接合。这里，从另一个主面52b侧向检测板52照射激发光54L。激发光54L从透光性的棱镜55内透过，进一步入射到检测板52的另一个主面52b。入射到检测板52的另一个主面52b的激发光54L从检测板52内透过，在检测板52的一个主面52a被反射。这样，检测板52、棱镜55、和照射激发光54L的光源54以在检测板52的一个主面52a全反射激发光54L那样的条件进行配置、折射率、和界面形状等的设计。
激发光54L如上述那样在检测板52的一个主面52a被全反射，但此时在小室51的空间中的检测板52的一个主面52a附近，形成隐失场、增强电场等近场。由于近场仅在一个主面52a附近形成，具有随着远离检测板52的一个主面52a而急剧衰减的性质，因此仅照射检测板52的一个主面52a附近的小室51的空间。另外，作为检测板52的构成，没有特别限制，可以根据目的来适当选择，可以由单层构成，也可以由以电场增强作为目的的叠层体构成。
光源54如上述那样为出射规定波长的光，使近场形成，照射到小室51的空间的光照射部的一例。作为光源54，可以没有特别限定地利用公知的技术。例如，可以利用半导体激光、气体激光等激光作为光源54。另外，光源54优选照射与被检测物质59所包含的物质相互作用小的波长的激发光(例如，400nm～2000nm)。进一步，激发光的波长优选为半导体激光可以利用的波长400nm～850nm。
盖53为与检测板52的一个主面52a对置地设置的透光性的板状构件，使用树脂等任意材料而构成。盖53与检测板52仅分开规定距离而设置，可以根据该距离而使小室51的空间的容积变化。因此，根据应用检测装置50的用途来适当设定检测板52与盖53的分开距离。
2维图像检测部58与盖53分开地配置于面向小室51的空间的盖53的一个主面背向的面侧，使通过激发光54L的照射而在小室51的空间中产生的光成像而作为2维图像检测。
吸拉磁场施加部56使小室51的空间产生在图中由双点划线表示的箭头的第1磁场梯度56M。吸拉磁场施加部56通过能够进行ON/OFF切换的电磁石而构成，但也可以为使永磁石远近的构成。通过吸拉磁场施加部56，向小室51的空间施加第1磁场梯度56M，在小室51的空间内存在的顺磁体朝向检测板52的垂直方向中的棱镜55侧被吸拉。
扫描磁场施加部57使小室51的空间产生在图中由双点划线表示的箭头的第2磁场梯度57M。扫描磁场施加部57与吸拉磁场施加部56同样地通过电磁石而构成，但也可以为使永磁石远近的构成。通过扫描磁场施加部57而向小室51的空间施加第2磁场梯度57M，在小室51的空间内存在的顺磁体朝向与检测板52平行方向中的光源54侧被吸拉。另外，扫描磁场施加部57可以配置在与检测板52平行方向的任一位置，以下，作为一例，使用上述配置进行说明。
以上的吸拉磁场施加部56、和扫描磁场施加部57即为向小室51的空间施加磁场的磁场施加部的一例。
[被检测物质的检测方法]
接着，使用图5对使用如以上那样构成的本实施方案涉及的检测装置50检测被检测物质59的方法进行说明。图5为示意性说明从本实施方案的检测装置50输出的2维图像的图。
小室51的空间预先容纳第1粒子100a、和第2粒子100b。
在其中导入可能包含被检测物质59的试样。试样所包含的被检测物质59在小室51的空间内，与第1粒子100a、和第2粒子100b结合，形成粒子复合体100c。
这里，第1粒子100a、和第2粒子100b为氨基糖分子30被固定在各自的表面的粒子。通过这样的构成，抑制第1粒子100a、和第2粒子100b吸附于检测板52、以及第1粒子100a与第2粒子100b相互吸附。例如，在第1粒子100a吸附于检测板52时，如后述，通过近场被照射而背景光上升，因此检测灵敏度降低。此外例如，在第1粒子100a与第2粒子100b相互吸附时，尽管未与被检测物质59结合，但与粒子复合体100c同样地动作，因此成为被检测物质59的计数中的误差因素。
因此，通过在第1粒子100a、和第2粒子100b固定有氨基糖分子30，可以减少这样的检测灵敏度的降低、和误差因素。
粒子复合体100c由于包含第2粒子100b，因此基材11b所包含的顺磁体M通过被施加的磁场而被吸拉。因此，在通过吸拉磁场施加部56而第1磁场梯度56M被施加到小室51的空间时，粒子复合体100c被吸拉成与检测板52大致相接的状态。此外，在小室51的空间内存在的未形成粒子复合体100c的第2粒子100b也同样地被吸拉成与检测板52大致相接的状态。另一方面，由于未形成粒子复合体100c的第1粒子100a不具有顺磁体M，因此不从原来的状态被吸拉。
这里，如果从光源54出射激发光54L，则如上述那样在检测板52的一个主面52a附近形成近场。由于粒子复合体100c与第1粒子100a结合，因此在被照射激发基材11a所包含的荧光体F的波长的光时发出荧光。即，如果近场为具有荧光体F的激发波长的光，则粒子复合体100c发出荧光。另外，未形成粒子复合体100c的第1粒子100a也同样地在通过近场被照射时发出荧光。
然而，近场仅在检测板52的一个主面52a的附近形成。即，第1粒子100a之中，处于与检测板52大致相接的状态的第1粒子100a可以发出荧光。由于第1粒子100a不具有顺磁体M，因此这样通过近场被照射的第1粒子100a仅为整体之中的极少的一部分。
通过以上，在小室51的空间内，粒子复合体100c、和第1粒子100a的一部分发出荧光。
这里，图5是显示在上述状况下通过2维图像检测部58被输出的2维图像58R的图。在被输出的2维图像58R中，显示出来源于粒子复合体100c发出的荧光的光点P100c、和来源于第1粒子100a发出的荧光的光点P100a。
这里不能区别光点P100c与光点P100a。因此，通过扫描磁场施加部57将第2磁场梯度57M施加于小室51的空间。此时，如果使上述那样的2维图像58R连续输出，则通过第2磁场梯度57M而产生的变化作为2维运动图像而获得。
如上述那样，由于粒子复合体100c具有顺磁体M，因此通过第2磁场梯度57M被吸拉，但由于第1粒子100a不具有顺磁体M，因此停留在原地。因此在所得的2维运动图像中可观察到在图5中由箭头表示那样的光点P100c的移动。另一方面这样的移动在光点P100a中观察不到，可以通过该差将粒子复合体100c与第1粒子100a区别计数。
因此2维图像检测部58在使结合有第1粒子100a和第2粒子100b的被检测物质59(即粒子复合体100c)通过第1磁场梯度56M、和第2磁场梯度57M而移动时，基于通过规定波长的近场而从荧光体F发出的荧光，输出能够计数被检测物质59的2维图像58R。即这里，2维图像58R为基于被检测物质59的量的检测信号的一例。
另外，可以为通过将从2维图像检测部58输出的2维图像58R进行图像识别而自动进行这样的光点的计数的构成。
(实施例)
以下，在实施例中具体地说明本公开的修饰粒子，但本公开不仅仅受以下实施例任何限定。
[实施例]
在实施例中，作为特异性结合物质，使用了以A型流行性感冒病毒的核蛋白(NP：Nucleoprotein)作为抗原的抗体。此外，氨基糖使用了葡糖胺。另外，在本实施例中，作为修饰粒子的制造方法，使用图2(b)所示的方法，采用使特异性结合物质、和糖在一工序中结合的方法。
首先，(i)将形成了SAM的粒子通过离心分离而在25mM的MES(2-吗啉乙磺酸，2-morpholinoethanesulfonicacid)缓冲生理盐水中以成为粒子终浓度1mg/mL的方式进行了外液交换后，再次通过离心分离而将外液流分废弃。
(ii)添加包含各50mg/mL的NHS(N-羟基琥珀酰亚胺，N-Hydroxysuccinimide)和EDC(1-(3-二甲基氨基丙基)-3-乙基碳二亚胺盐酸盐，1-(3-Dimethylaminopropyl)-3-ethylcarbodiimidehydrochloride)的MES缓冲生理盐水60μL并静置。然后，通过离心分离而将外液流分废弃。
(iii)在其中添加包含0.5mg/mL的抗体、和1％葡糖胺的25mM乙酸缓冲液100μL，使其反应。由此，在SAM上固定了抗体和葡糖胺。然后，通过离心分离而将外液流分废弃。
(iv)添加包含0.1％的NP-40(Nonidet P-40)的、1M乙醇胺溶液240μL，使其反应。
(v)进一步，通过离心分离而将外液流分废弃，添加包含50mM的氯化钾、1mM的EDTA(乙二胺四乙酸，Ethylenediaminetetraacetic acid)、和10％甘油的10mM的HEPES(4-(2-羟基乙基)-1-哌嗪乙磺酸，4-(2-hydroxyethyl)-1-piperazineethanesulfonic acid)溶液200μL。在进行了将其通过离心分离而将外液流分废弃的操作后，添加上述溶液100μL。
通过以上工序而获得了实施例涉及的修饰粒子。实施例涉及的修饰粒子具有粒子、抗体、葡糖胺、和乙醇胺。
此外，以下显示制造3个比较例涉及的修饰粒子的方法。
[比较例1]
上述实施例涉及的修饰粒子的制造方法的各工序之中，不实施(iii)和(iv)的工序，除此以外，与实施例同样地进行。由此，获得了比较例1涉及的修饰粒子。比较例1涉及的修饰粒子具有粒子、和抗体，与实施例涉及的修饰粒子相比在不具有葡糖胺和乙醇胺方面不同。
[比较例2]
上述实施例涉及的修饰粒子的制造方法的各工序之中，在(iii)的工序中，不添加1％葡糖胺，除此以外，与实施例同样地进行。由此，获得了比较例2涉及的修饰粒子。比较例2涉及的修饰粒子具有粒子、抗体、和乙醇胺，与实施例涉及的修饰粒子相比在不具有葡糖胺的方面不同。
[比较例3]
上述实施例涉及的修饰粒子的制造方法的各工序之中，在(iii)的工序中，代替1％葡糖胺而添加了1％海藻糖，除此以外，与实施例1同样地进行。由此，获得了比较例3涉及的修饰粒子。比较例3涉及的修饰粒子具有粒子、抗体、和乙醇胺，进一步未形成结合的海藻糖存在于修饰粒子的周围。因此，与实施例涉及的修饰粒子相比在不具有葡糖胺，海藻糖存在于周围方面不同。
[非特异性吸附的评价]
接下来使用图6对使用了实施例中的修饰粒子的、非特异性吸附的评价进行说明。图6为对实施例涉及的修饰粒子的吸附试验的试验方法进行说明的图。
图6(a)为显示用于评价非特异性吸附的试验方法的示意图。在本试验方法中，预先将人血清白蛋白(HSA61)固定化在96孔板的底面60，检测修饰粒子对固定化了的HSA61吸附的量，从而将非特异性吸附的程度与比较例涉及的修饰粒子进行比较。
另外，关于试验方法的详细内容，如下所述实施。首先，对96孔板的底面60，将包含3.2μM的HSA61和0.5％Tween(注册商标)20的磷酸缓冲生理食盐液每孔都添加50μL，在4℃下使其过夜反应，使HSA61固定化。然后，将包含HSA61和0.5％Tween(注册商标)20的磷酸缓冲生理食盐液废弃。这里基材使用包含荧光体的修饰粒子，每孔都添加粒子终浓度为7×109个/mL的修饰粒子液50μL。然后，在室温下使其反应60分钟，将该修饰粒子液废弃。
进一步，每孔都添加包含0.05％Tween(注册商标)20的磷酸缓冲生理食盐液200μL并进行3次废弃的处理，将各孔进行了洗涤。与HSA61结合而残留的修饰粒子通过荧光(在激发波长：532nm、和荧光波长：568nm的条件下)进行测定，将实施例、和比较例1～3的荧光强度进行了比较。另外，实施例、和比较例1～3对各4孔进行了试验(n＝4)。
因此，由于向HSA61的吸附(非特异性吸附)越被减少则荧光强度越低，因此在本吸附试验中，荧光强度越低则显示出对被检测物质的检测灵敏度越高。
另外，图6(a)中的由符号100m表示的修饰粒子表示实施例涉及的修饰粒子、和比较例1～3涉及的修饰粒子之中的任1种。
这里，在修饰粒子100m之中的由虚线的矩形表示的修饰位置m中，如图6(b)所示那样，根据为实施例涉及的修饰粒子、和比较例1～3涉及的修饰粒子的哪个而包含不同分子。比较例1涉及的修饰粒子在修饰位置m中，任何分子都不进入，如上述那样仅具有抗体。
比较例2涉及的修饰粒子在修饰位置m中，如图6(b)的1所示那样包含乙醇胺。该乙醇胺在图6中虽然省略地显示，但被固定在SAM。
此外，比较例3涉及的修饰粒子在修饰位置m中，如图6(b)的2所示那样包含海藻糖、和乙醇胺。这里，乙醇胺与比较例1同样地被固定在SAM，但海藻糖未被固定，存在于修饰粒子的周围。
此外，实施例涉及的修饰粒子在修饰位置m中，如图6(b)的3所示那样包含葡糖胺、和乙醇胺。这里，葡糖胺和乙醇胺都被固定在SAM。
接下来，使用图7显示本吸附试验的试验结果。图7为对实施例涉及的修饰粒子的吸附试验的结果进行说明的图。
在图7中，纵轴列出相对荧光强度，横轴列出各修饰粒子(比较例1、比较例2、比较例3、和实施例)而显示。各棒图表示n＝4的平均值，通过误差棒一并显示各测定中的误差。
如图7所示那样，显示出仅具有抗体的比较例1涉及的修饰粒子的荧光强度最高，与比较例1涉及的修饰粒子相比，比较例2涉及的修饰粒子的荧光强度低。即确认到导入乙醇胺引起的非特异性吸附的抑制效果。进一步如果将比较例2与实施例进行比较，则实施例涉及的修饰粒子的荧光强度大幅低，确认到由固定葡糖胺引起的非特异性吸附的抑制效果。
另一方面，比较例3涉及的修饰粒子显示与比较例2同等的荧光强度，可知仅获得由导入乙醇胺引起的非特异性吸附的抑制效果。认为这是因为，海藻糖处于未结合的状态，通过洗涤而海藻糖被除去了。另外，作为比较例3中的误差大的原因，认为这是因为，由于海藻糖的粘度高，从而存在即使通过洗涤也不能被除去而残留的海藻糖分子。
通过以上，获得了通过酰胺键而使氨基糖分子结合，从而非特异性吸附的抑制效果提高的结果。因此，显示出通过酰胺糖分子的酰胺键而被检测物质的检测可以高灵敏度化。
以上，基于实施方案和实施例对本公开涉及的修饰粒子、修饰粒子的制造方法、和检测装置进行了说明，但本公开不限定于这些实施方案和实施例。只要不超出本公开的主旨，在实施方案和实施例中实施了本领域技术人员想到的各种变形的方案、将实施方案和实施例中的一部分构成要素组合而构建的其它方案也包含于本公开的范围。
另外，本公开涉及的修饰粒子、修饰粒子的制造方法、和检测装置例如可以利用于检测在空气中悬浮的病毒的检测***。
以下，进一步对其它实施方案进行说明。
(其它实施方案)
在实施方案中，对修饰粒子100具有SAM12作为有机膜的构成进行了说明，但只要是特异性结合物质20、和氨基糖分子30能够结合的基材11，则不需要具备SAM12。这有例如基材11使用具备反应性官能团的树脂、或使用表面形成了金属的基材11等方法。
此外，对通过以乙醇胺40例示的阻断剂而覆盖粒子10的表面的有机膜的至少一部分的构成进行了说明，但也可以不具备阻断剂，也可以使用不是乙醇胺40的阻断剂。
此外，对使用SAM12作为有机膜的构成进行了说明，但也可以使用不是SAM12的有机膜。
此外，基材11可以包含荧光体F、和顺磁体M，也可以不包含。可以使用任意含有具有适于检测方法的性质的物质的基材11而构成修饰粒子100。此外，修饰粒子100可以包含色素，在该情况下，也作为免疫色谱中的标记粒子使用。
此外，修饰粒子100能够应用于实施方案所示那样的检测装置50，但使用了修饰粒子100的被检测物质59的检测装置不限于此。可以为例如，使用聚苯乙烯等电介质作为修饰粒子100的基材，使用介电电泳法仅将与被检测物质59结合了的修饰粒子分离，进行检测的检测装置。
例如，也可以应用于使用层流而使修饰粒子100一个一个流通于检测流路的流式细胞器。此外例如，将通过将绿色荧光蛋白质进行分割而在被分割了的部分各自会合时表现荧光性的物质，与2个修饰粒子分别结合，构建仅在这些修饰粒子2个都与被检测物质59结合时表现荧光性的***。也可以通过将这样的***与分光光度计组合而构成检测装置。此外，也可以将上述光学***制成能够进行高吞吐量处理的检测阵列而实现检测装置。
此外，在上述实施方案、和实施例中，虽然粒子10不是细胞，但不限定于此。如果通过技术的进步或派生的别的技术而出现新的粒子，当然，也可以使用该粒子而构成修饰粒子100。生物技术的应用等作为可能性而可能有，在该情况下，粒子10可以为细胞等。
产业可利用性
本公开具有液体中的高的保存稳定性，在可以应用于研究用、医疗用和环境测定用的生物传感器等方面是有用的。此外，本公开涉及的修饰粒子和使用了该修饰粒子的检测装置不仅能够应用于非竞争法(夹层免疫测定法)，而且也能够应用于竞争法、采用杂交的基因检测法。
符号的说明
10 粒子
11、11a、11b 基材
12 SAM
20、20a、20b 特异性结合物质
30 氨基糖分子
40 乙醇胺
50 检测装置
51 小室
52 检测板
52a 一个主面
52b 另一个主面
53 盖
54 光源
54L 激发光
55 棱镜
56 吸拉磁场施加部
56M 第1磁场梯度
57 扫描磁场施加部
57M 第2磁场梯度
58 2维图像检测部
58R 2维图像
59 被检测物质
60 96孔板的底面
61 HSA
100、100m 修饰粒子
100a 第1粒子
100b 第2粒子
100c 粒子复合体
F 荧光体
M 顺磁体
m 修饰位置
P100a、P100c 光点。

Claims (9)

1.一种修饰粒子，其包含：
粒子；
特异性结合物质，所述特异性结合物质具有能够与被检测物质特异性结合的性质，且固定在所述粒子的表面；以及
氨基糖分子，所述氨基糖分子通过酰胺键而固定在所述粒子的表面。
2.根据权利要求1所述的修饰粒子，所述粒子包含基材、和覆盖所述基材的表面的至少一部分的有机膜，
所述氨基糖分子通过所述酰胺键而固定于所述有机膜。
3.根据权利要求2所述的修饰粒子，其进一步包含覆盖所述有机膜的至少一部分，且阻碍与所述有机膜中的规定分子的相互作用的阻断剂。
4.根据权利要求2或3所述的修饰粒子，所述有机膜为自组装化单分子膜。
5.根据权利要求2～4中任一项所述的修饰粒子，所述基材包含荧光体。
6.根据权利要求2～4中任一项所述的修饰粒子，所述基材包含顺磁体或电介质。
7.一种修饰粒子的制造方法，其包含下述工序：
准备工序，准备粒子；
固定工序，将能够与被检测物质特异性结合的特异性结合物质固定在所述粒子的表面；以及
糖固定工序，将氨基糖分子通过酰胺键固定在所述粒子的表面。
8.根据权利要求7所述的修饰粒子的制造方法，通过将包含所述特异性结合物质和所述氨基糖分子的溶液、与所述粒子进行混合，来实施所述固定工序和所述糖固定工序。
9.一种检测装置，其具有：
容纳部，所述容纳部容纳权利要求1～6中任一项所述的修饰粒子；
导入部，所述导入部将可能包含所述修饰粒子能够特异性结合的被检测物质的试样导入到所述容纳部；以及
检测器，所述检测器输出基于所述修饰粒子所结合的所述被检测物质的量的检测信号。
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