JP6260541B2 - 夾雑物の影響を低減する免疫測定法 - Google Patents
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Description
標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法(リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む)を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合(交差)する糖鎖化合物を添加する、下記の要件を満たす測定方法。
添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をx、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をaとした場合、xがx>aの範囲である。
また、本発明の別の側面では、本発明の測定方法は、次の通りである。
標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法(リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む)を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合(交差)する糖鎖化合物を添加する方法であり、測定対象化合物、標識レクチン及び添加する糖鎖化合物の組合せが次の(1)〜(4)のいずれかである測定方法。
(1)測定対象化合物が前立腺特異抗原(PSA)であり、標識レクチンがキカラスウリレクチン(TJA−II)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体又はガラクトース誘導体である。
(2)測定対象化合物が前立腺特異抗原(PSA)であり、標識レクチンがノダフジレクチン(WFA)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。
(3)測定対象化合物がα−フェトプロテイン(AFP)であり、標識レクチンがレンズマメレクチン(LCA)であり、添加する糖鎖化合物がマンノース誘導体である。
(4)測定対象化合物がα−フェトプロテイン(AFP)であり、標識レクチンがヒイロチャワンダケレクチン(SSA)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。
1.測定対象化合物
(1)生体試料
本発明は、生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法である。測定する生体試料は特に制限はなく、例えば、ヒトや動物の血液、血清、血漿、尿、髄液、唾液、細胞、組織及び器官及びこれらの調整物(例えば、生検標本)が挙げられる。特に、癌抗原、腫瘍マーカーを含む可能性のある血液、血清及び血漿は測定する生体試料として好適である。
本発明では、サンドイッチ法の標識物質として標識レクチンを用いる。標識レクチンは特定の糖鎖を認識して結合する。従って、本発明における測定対象化合物は糖鎖を有する必要がある。
本発明では、サンドイッチ法による免疫測定法を使用するが、その方法は通常用いられている方法で良く、特に制限はされない。
(1)リガンド(サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質)
本発明で使用するリガンド(サンドイッチ法の測定対象化合物捕捉物質)は、測定対象化合物を特異的に認識して結合し、かつ、サンドイッチ法の標識物質としての標識レクチンによる測定対象化合物の糖鎖の認識を妨げない物質である。測定対象化合物を捕捉する物質として適切な物質であればリガンドは特に制限されないが、例えば、抗体、アプタマー、合成ペプチド等を用いることができる。特に、測定対象化合物に対するモノクローナル抗体が好適である。癌抗原、腫瘍マーカー等を測定対象化合物とする場合は、その抗原に特異的に結合する抗体(モノクローナル抗体等)をリガンドとして用いることが適切である。例えば、ヒトPSA(前立腺特異抗原)を測定対象化合物とする場合は、抗ヒトPSA抗体を用いればよい。
サンドイッチ法においては、通常、リガンドは支持体(固相)に固相化(固定化)して用いられる。すなわち、測定対象化合物は固相化されたリガンドを通して、支持体上に捕捉される。
リガンドと支持体との結合は、化学結合や物理的な吸着などの通常用いられる方法により行うことができる。これらの支持体はすべて市販のものが好適に使用できる。
支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面に固相化層を設けて行うこともできる。
このような固相化層は、グルコース,カルボキシメチル化グルコース,ならびにビニルエステル類,アクリル酸エステル類,メタクリル酸エステル類,オレフィン類,スチレン類,クロトン酸エステル類,イタコン酸ジエステル類,マレイン酸ジエステル類,フマル酸ジエステル類,アリル化合物類,ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される単量体からなる群より選択される少なくとも1種の単量体から構成される高分子を含むことが好ましく、デキストランおよびデキストラン誘導体などの親水性高分子ならびにビニルエステル類,アクリル酸エステル類,メタクリル酸エステル類,オレフィン類,スチレン類,クロトン酸エステル類,イタコン酸ジエステル類,マレイン酸ジエステル類,フマル酸ジエステル類,アリル化合物類,ビニルエーテル類およびビニルケトン類それぞれに包含される疎水性単量体から構成される疎水性高分子を含むことがより好ましく、カルボキシメチルデキストラン(CMD)などのデキストランが生体親和性、非特異的な吸着反応の抑制性、高い親水性の観点から特に好適である。
SPFSを用いた測定法の場合、固相化層(例えば、デキストランまたはデキストラン誘導体からなるもの)は、その密度として2ng/mm2未満を有することが好ましい。固相化層の密度は、用いる高分子の種類に応じて適宜調整することができる。上記高分子が後述するSAMに、このような密度の範囲内で固相化されていると、プラズモンセンサをアッセイ法に用いた場合に、アッセイのシグナルが安定化し、かつ増加するため好適である。なお、Biacoreライフサイエンス社製「Sensor Chip CM5」の密度は2ng/mm2であった。この密度は、このCM5基板および金膜のみの基板を用いて、Biacoreライフサイエンス社製のSPR測定機器により得られた測定シグナルにおいて、平均2000RUを測定した結果、2ng/mm2と見積もられたものである。
支持体へのリガンドの固相化は、支持体のリガンドを固相化する面にSAM(Self−Assembled Monolayer:自己組織化単分子膜)を設けて行うこともできる。
以下に、SPFSを用いた測定法の場合を例に説明する。
このような「誘電体からなるスペーサ層」の形成に用いられる誘電体としては、光学的に透明な各種無機物、天然または合成ポリマーを用いることもできる。その中で、化学的安定性、製造安定性および光学的透明性に優れていることから、二酸化ケイ素(SiO2),二酸化チタン(TiO2)または酸化アルミニウム(Al2O3)を含むことが好ましい。
SAMを形成した場合は、リガンドは、SAM上に固相化層を設けて、又はSAM上に直接、固定化することができる。
本発明では、上記2.(2)でリガンドを通して支持体(固相)上に捕捉された測定対象化合物を標識するために、標識レクチンが用いられる。
(a)動植物,真菌,細菌,ウイルスなどから得られる様々な分子家系に属するレクチン、すなわち、細菌を含むすべての生物界で見出されるリシンB鎖関連の「R型レクチン」、
(b)真核生物全般に存在し糖タンパク質のフォールディングに関与する「カルネキシン・カルレティキュリン」、
(c)多細胞動物に広く存在する「セレクチン」,「コレクチン」等代表的なレクチンを多く含むカルシウム要求性の「C型レクチン」、
(d)動物界に広く分布しガラクトースに特異性を示す「ガレクチン」、
(e)植物豆科で大きな家系を形成する「豆科レクチン」、
(f)これと構造類似性を有し動物細胞内輸送に関わる「L型レクチン」、
(g)リソソーム酵素の細胞内輸送に関わるマンノース6−リン酸結合性の「P型レクチン」、
(h)グリコサミノグリカンをはじめとする酸性糖鎖に結合する「アネキシン」、及び
(i)免疫グロブリン超家系に属し「シグレック」を含む「I型レクチン」等
が挙げられる。
標識体としては、蛍光色素、酵素・補酵素、化学発光物質、放射性物質等の当業者に公知の標識体を用いることができる。
放射性物質としては、ラジオアイソトープ(32P、14C、125I、3H、131Iなど)が挙げられる。
一般に、レクチンと糖鎖との結合は平衡反応であり、抗体と抗原の結合に比べて結合力は弱いとされている。また、レクチンと糖鎖との結合における糖鎖の特異性は、抗体と抗原との結合における抗原の特異性に比べて低い。従って、標識レクチンを用いたサンドイッチ法では、標識レクチンの添加後に別の糖鎖化合物を添加して、平衡反応で標識レクチンと結合している夾雑物に糖鎖化合物を競合(交差)させることが可能である。
更に好ましくは、本発明で添加する糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をx、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をaとした場合、xがx>aの範囲である。
前記のように、本発明で添加する糖鎖化合物は、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合(交差)する糖鎖化合物である。本発明で「競合(交差)」とは、一般的な競合阻害等における競合と同義であり、レクチンを受容体とした場合に、その同じ結合部位で、ある物質と他の物質が可逆的に競合して結合する関係をいう。つまり、結合部位を分子レベルで正確に認識して結合している競合に限らず、レクチンの同じ結合領域に結合する糖鎖間で起こる競合も含んでいる。
(i)標識レクチンを用いたサンドイッチ法の測定系で、生体試料に糖鎖化合物を添加して標識レクチンと結合している夾雑物と競合させ、遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去したシグナル強度を測定する(すなわち、競合後の「夾雑物由来のノイズ(N)」と「測定対象化合物由来のシグナル(s)」の合計(以下、単にノイズ(N)という)の強度を測定する)、及び
(ii)測定対象化合物の標準品を生体試料に添加した上で糖鎖化合物を添加し、上記(i)と同様にしてシグナル強度を測定する(すなわち、競合後の「標準品由来のシグナル(S)」、「夾雑物由来のノイズ(N)」及び「測定対象化合物由来のシグナル(s)」の合計(以下、単にシグナル(S)という)の強度を測定する)を測定する。そして、「S」/「N」の比が、その測定の目的に応じた程度に大きいものを添加する糖鎖化合物として選べばよい。例えば、後述の実施例の生体試料、測定対象化合物及び標識レクチンの場合には、添加する糖鎖化合物としては、S/Nの比が3以上が好ましく4以上が更に好ましい。
前記のように、本発明で添加する好ましい糖鎖化合物は、添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をx、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をaとした場合、xがx>aの範囲である糖鎖化合物である。
糖鎖化合物(A)とレクチン(B)との結合は可逆反応であり、平衡状態では次の式が成り立つ([A]は糖鎖化合物の濃度(mol/L)、[B]はレクチンの濃度(mol/L)、[A−B]は糖鎖化合物とレクチンの結合体の濃度(mol/L))。
本発明で添加する糖鎖化合物の好ましい例は、測定対象化合物及び標識レクチンに応じて、表1の通りである。
糖鎖化合物の添加は、標識レクチンを添加し、未反応の標識レクチンを洗浄した後に行うことができ、また、標識レクチンの添加と同時に行うこともできる。
本発明の測定法では、リガンド及び測定対象化合物を通して支持体(固相)に捕捉された標識レクチンの発するシグナルの強度を測定する。
本発明の測定方法を用いた生体試料中の測定対象化合物は、例えば次の(1)〜(6)の工程を順に実施すればよい。
(1)測定対象化合物との結合能を有するリガンドが固相化された測定容器(ウエル、流路等)に生体試料を導入し、測定対象化合物をリガンドに結合させる工程、
(2)工程(1)の測定容器内に標識レクチンを添加し、標識レクチンを測定対象化合物の糖鎖と結合させる工程、
(3)工程(2)の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、未結合の標識レクチンを除去する工程、
(4)工程(3)の測定容器内に本発明の糖鎖化合物を添加し、既に標識レクチンと結合している夾雑物の糖鎖と添加した糖鎖化合物とを競合させる工程、
(5)工程(4)の測定容器内を、例えばリン酸バッファー等を用いて洗浄し、支持体(固相)から遊離した標識レクチンと添加した糖鎖化合物との結合体を除去する工程、及び
(6)工程(5)の測定容器内の標識レクチンが発するシグナルを測定する工程。
(1-1)TJA−IIレクチンの蛍光標識化
TJA−IIレクチン〔Trichosanthes japonica Lectin〕(生化学工業(株))を、Alexa Fluor(商標名)647 タンパク質ラベリングキット(インビトロゲン社)を用いて蛍光標識化した。手順は該キットに添付のプロトコールに従った。未反応レクチンや未反応蛍光等を除去するため、限外濾過膜(日本ミリポア(株)製)を用いて反応物を精製し、Alexa Fluor 647標識TJA−II溶液を得た。得られた蛍光標識化TJA−IIレクチンの溶液はタンパク定量後、4℃で保存した。
β−N−アセチルガラクトサミン残基が発現したPSAを産生するLNCaP(Human prostate adenocarcinoma cell line)を培養し、上清を回収し、遠心分離後にPSA濃度をELISAにて測定し、−80℃で保存した。
厚さ1mmのガラス製の透明平面基板「S−LAL10」((株)オハラ製、屈折率〔nd〕=1.72)を、プラズマドライクリーナー「PDC200」(ヤマト科学(株)製)でプラズマ洗浄した。プラズマ洗浄された該基板の片面に、まずクロム薄膜をスパッタリング法により形成し、さらにその表面に金薄膜をスパッタリング法により形成した。このクロム薄膜の厚さは1〜3nm、金薄膜の厚さは44〜52nmであった。
抗原添加工程:作成した1枚のセンサーチップには、送液をPBSに代え、LNCaP培養上清を市販血清(コージンバイオ社)で希釈し、PSA濃度が1.0ng/mLとなる溶液を0.5mL添加し、25分間循環させた。作成したもう1枚のセンサーチップには、NCaP培養上清を添加していない市販血清(コージンバイオ社)を添加し25分間循環させた。
(a) 生体試料として市販血清(コージンバイオ社)、測定対象化合物としてPSA、リガンドとして抗PSAモノクローナル抗体、標識レクチンとしてノダフジレクチン(WFA)(Vector社製)等を使用した場合、及び
(b) 生体試料として市販血清(コージンバイオ社)、測定対象化合物としてα−フェトプロテイン(AFP)(AFP;2.0mg/mL溶液;Acris Antibodies GmbH社製)、リガンドとして抗AFPモノクローナル抗体(クローン1D5;1.8mg/mL;ミクリ免疫研究所(株)製)、標識レクチンとしてレンズマメレクチン(LCA)(Vector社製)、ヒイロチャワンダケレクチン(SSA)(J−OIL MILLS社製)等を使用した場合についても、上記と同様に実験を行い、S/Nを求めた。上記(b)の場合、上記(1-3)のセンサーチップの作製におけるSAM上の一次抗体の固相化では、流路に、抗AFPモノクローナル抗体溶液2.5mL(抗AFPモノクローナル抗体濃度を50μ/mLに調整)を30分間循環送液した。また、上記(1-4)の抗原添加工程では、1枚のセンサーチップには、AFP濃度が3.0ng/mLとなる溶液(AFPを市販血清で希釈)を0.5mL添加し、25分間循環させた。
これらの結果は、表2に示す。
上記1の検出工程で、蛍光標識化レクチンを含むPBSを添加し、Tween20を含むTBS溶液を送液して洗浄した後に、糖鎖化合物として、ガラクトシルセラミド(α-Galactosylceramide)(フナコシ社製)、2′-フコシル-D-ラクトース(2′-Fucosyl-D-lactose)(シグマ社製)、ガラクトシルジグリセリド(Galactosyl diglyceride)(シグマ社製)、Fuc-2-Chol(国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照)又はMan-2-Chol(国際公開WO2008/081686号公報の記載に従って合成、下記構造式参照)を濃度0.1重量%で含むPBS溶液を10分送液し、標識レクチンと結合している市販血清中の夾雑物と添加した糖鎖化合物を競合させた。次いでTween20を含むTBS溶液を送液して洗浄した。これ以外は上記1と同様に実験し、S/Nを算出した。結果は表2に示す。
2 糖鎖を有する測定対象化合物
3 生体試料中の糖鎖を有する夾雑物
4 標識レクチンが認識する糖鎖
5 標識レクチンが認識しない糖鎖
6 固相化層(リガンドを支持体に固相化するためのCMD等)
7 支持体(マイクロプレートのウエル、SPFSの透明支持体・金属薄膜、等)
7a 金属薄膜
7b 透明支持体(プリズム)
8 標識レクチン
9 本発明で添加する糖鎖化合物
10 固相化層(カルボキシメチルデキストラン(CMD))
11 SAM
Claims (5)
- 標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法(リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む)を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合(交差)する糖鎖化合物を添加する、下記の要件を満たす測定方法。
添加する糖鎖化合物と標識レクチンの解離定数をx、測定対象化合物と標識レクチンの解離定数をaとした場合、xがx>aの範囲である。 - 標識レクチンを用いたサンドイッチ法による免疫測定法(リガンドとして、抗体以外の測定対象化合物捕捉物質を用いる場合を含む)を用いて生体試料中の糖鎖を有する測定対象化合物の量を測定する方法であって、標識レクチンとの結合において生体試料中の夾雑物と競合(交差)する糖鎖化合物を添加する方法であり、測定対象化合物、標識レクチン及び添加する糖鎖化合物の組合せが次の(1)〜(4)のいずれかである測定方法。
(1)測定対象化合物が前立腺特異抗原(PSA)であり、標識レクチンがキカラスウリレクチン(TJA−II)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体又はガラクトース誘導体である。
(2)測定対象化合物が前立腺特異抗原(PSA)であり、標識レクチンがノダフジレクチン(WFA)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。
(3)測定対象化合物がα−フェトプロテイン(AFP)であり、標識レクチンがレンズマメレクチン(LCA)であり、添加する糖鎖化合物がマンノース誘導体である。
(4)測定対象化合物がα−フェトプロテイン(AFP)であり、標識レクチンがヒイロチャワンダケレクチン(SSA)であり、添加する糖鎖化合物がフコース誘導体である。 - 測定する生体試料中の糖鎖を有する化合物が、腫瘍マーカーである請求項1又は2に記載の測定方法。
- リガンド(測定対象化合物捕捉物質)を支持体に固相化するための固相化層が糖鎖化合物を含むものであり、当該糖鎖化合物と異なる糖鎖化合物を添加する請求項1〜3のいずれか一つに記載の測定方法。
- 標識レクチンが発する蛍光を表面プラズモン励起増強蛍光分光法(SPFS)で測定する請求項1〜4のいずれか一つに記載の測定方法。
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