ES2271634T3 - Metodo para ensayos basados en celulas de alto rendimiento que usan micromatrices vivas versatiles. - Google Patents

Abstract

Un método para la búsqueda de respuestas celulares de componentes celulares que comprende: (a) proporcionar componentes celulares que se seleccionan del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, sobre la superficie de un sustrato de óxido metálico poroso sólido, en el que (i) dicho sustrato poroso sólido tiene canales de paso a través orientados; (ii) dicho sustrato poroso sólido retiene dichos componentes celulares sobre su superficie, y en el que, (iii) dicho sustrato poroso sólido tiene inmovilizada en el mismo, dentro de los poros, una matriz de moléculas de detección; (b) administrar compuestos de prueba a posiciones sobre el sustrato quecorresponden a las moléculas de detección en matriz sobre la superficie de dicho sustrato poroso sólido; (c) incubar dichos compuestos de prueba con dichos componentes celulares sobre la superficie del sustrato poroso sólido, en condiciones que permiten la inducción de respuestas celulares; (d) someter a ensayo dichas respuestas celulares; e identificar y caracterizar las respuestas celulares inducidas por dichos compuestos de prueba.

Description

Método para ensayos basados en células de alto rendimiento que usan micromatrices vivas versátiles.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a ensayos basados en células. La presente invención se refiere a un método para ensayos de búsqueda funcional sobre chips de respuestas celulares. La presente invención se refiere a un método para la búsqueda y caracterización farmacológica de compuestos que modulan una respuesta fisiológica celular.

Antecedentes de la invención

Dentro de la industria farmacéutica, hay un número significativo de compuestos, disponibles en depósitos de compuestos, mediante el uso de química combinatoria. Los éxitos de estas bibliotecas de compuestos se identifican mediante el uso de búsqueda de alto rendimiento (HTS - High Throughput Screening). La función principal de la HTS es probar diversos compuestos químicos de un depósito de compuestos frente a múltiples dianas de enfermedad en muchos ensayos biológicos diferentes. La HTS tradicional utiliza comúnmente placas de microvaloración de 96 pocillos. Hay una gran incentiva en la industria farmacéutica para miniaturizar estos ensayos en microplacas para reducir el coste, reducir los residuos, y acelerar las fechas límite. Ha habido un cambio desde el formato de 96 pocillos hasta las densidades de pocillos superiores tales como formatos de 384 y 1536 pocillos, sin embargo esto puede representar retos con respecto al manejo de líquidos, instrumentación para detección de señales, y tecnología de ensayo. Además, las dificultades típicas encontradas cuando se usan ensayos de búsqueda basados en placas de microvaloración incluyen por ejemplo (i) crecimiento diferencial y/o expresión génica de clones idénticos en pocillos separados de la placa de microvaloración y (ii) exposición a estrés diferencial (por ejemplo, tratamiento térmico, humedad) a lo largo de la placa.

Se han realizado esfuerzos hacia resolver las dificultades mencionadas anteriormente. Por ejemplo, el documento WO 99/35496 proporciona un método y aparato para la búsqueda en formato de alta densidad para moléculas bioactivas con una técnica muy simplificada para probar la administración del compuesto a una capa de células, es decir sin necesidad de manejo de fluidos complicado. En dicho método, pueden examinarse simultáneamente hasta 6144 compuestos de prueba para determinar su bioactividad.

No obstante, hay necesidad de ensayos biológicos funcionales basados en células de densidad incluso superior que siguen siendo uno de los tipos de ensayos más difíciles de miniaturizar debido a las limitaciones para administrar cantidades de microlitros de células sistemáticamente sin cortar las células ni activar respuestas de estrés de las propias células, interfiriendo así con el ensayo biológico.

Con la llegada de los enfoques de la química combinatoria para identificar compuestos farmacológicamente útiles, es cada vez más evidente que hay una necesidad de métodos y aparatos a niveles de micromatriz, que puedan realizar una caracterización de alto rendimiento de perfiles farmacológicos y potencias correspondientes de los compuestos en bibliotecas combinatorias sintetizadas.

Las micromatrices de células vivas pueden proporcionar un atajo hacia el desarrollo de fármacos más seguros y personalizados y un mejor entendimiento de las rutas moleculares encontradas en el funcionamiento de organismos celulares. Como un ejemplo, el Whitehead Institute for Biomedical Research en Cambridge desarrolló micromatrices de células vivas para análisis de alto rendimiento de la función genética en células de mamíferos (Nature, Vol. 411, 3 de mayo de 2001). Sin embargo, aunque dicha tecnología es sumamente eficaz, hay varias limitaciones a su uso incluyendo, las cantidades de reactivos relativamente elevadas necesarias de las cuales una cantidad sustancial nunca está en contacto con la matriz y por tanto se desperdicia, y el requisito de manejos incómodos y que requieren mucho tiempo.

La patente de los EE.UU. número 6.103.479 describe un ejemplo adicional de una micromatriz de células vivas. Las matrices de células miniaturizadas descritas caracterizadas por un tamaño de matriz y pocillo reducido permiten una búsqueda de alto contenido. Sin embargo, el carácter no poroso no permite a las células que crecen en/sobre los pocillos o sitios de unión a células en la matriz superar la propagación en condiciones de crecimiento habituales lo que obviamente interfiere con la discriminación de muestra celular apropiada.

Tal como se apreciará en la técnica, hay una necesidad continuada de métodos mejorados que superen las desventajas mencionadas anteriormente.

Por tanto, es un objeto de la presente invención proporcionar un método sumamente eficaz y rentable para ensayos integrados basados en células usando micromatrices.

Es un objeto adicional de la presente invención proporcionar un método para ensayos de alto rendimiento basados en células que requieren cantidades mínimas de muestra y reactivos.

También es un objeto de la presente invención proporcionar micromatrices o kits para realizar tales métodos.

Sumario de la invención

La presente invención se refiere a un método para la búsqueda de respuestas celulares de componentes celulares que comprende:

(a) proporcionar componentes celulares que se seleccionan del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, sobre la superficie de un sustrato de óxido metálico poroso sólido, en el que

(i)

dicho sustrato poroso sólido tiene canales de paso a través orientados;

(ii)

dicho sustrato poroso sólido retiene dichos componentes celulares sobre su superficie, y en el que

(iii)

dicho sustrato poroso sólido tiene inmovilizada en el mismo, dentro de los poros, una matriz de moléculas de detección;

(b) administrar compuestos de prueba a posiciones sobre el sustrato que corresponden con las moléculas de detección de la matriz sobre la superficie de dicho sustrato poroso sólido;

(c) incubar dichos compuestos de prueba con dichos componentes celulares sobre la superficie del sustrato poroso sólido, en condiciones que permiten la inducción de respuestas celulares;

(d) someter a ensayo dichas respuestas celulares; e

identificar y caracterizar las respuestas celulares inducidas por dichos compuestos de prueba.

La presente invención describe adicionalmente usos del método anterior según la invención.

La presente invención proporciona la miniaturización hasta formato de micromatriz de ensayos basados en células, aumentando así el rendimiento, mientras se disminuyen los volúmenes de reactivos y compuestos de prueba.

Debido a las características de flujo a través del dispositivo usado en dicho método, el presente método proporciona además una alta velocidad y análisis eficaz.

El método según la invención permite un cultivo no invasivo sobre chip de células o componentes celulares, creciendo dicha capa en condiciones iguales a lo largo de la superficie del sustrato sólido, y estando dichas células o componentes celulares en contacto con el medio de cultivo solo durante el tiempo necesario para obtener una densidad deseada.

Se expondrán características y ventajas adicionales de la invención en la descripción detallada que sigue, y en parte resultarán evidentes a partir de la descripción, o pueden aprenderse mediante la puesta en práctica de la invención. Los objetivos y otras ventajas de la invención se realizarán y alcanzarán mediante el procedimiento destacado en particular en la descripción por escrito y las reivindicaciones adjuntas.

Descripción detallada de la invención

Antes de describir el presente método y soluciones usadas en el método, debe entenderse que esta invención no está limitada a métodos, componentes o soluciones particulares descritas, ya que tales métodos, componentes, y soluciones pueden, desde luego, variar. También debe entenderse que no se pretende que la terminología en el presente documento sea limitativa, ya que el alcance de la presente invención se determinará solo por las reivindicaciones adjuntas.

A menos que se defina lo contrario, todos los términos técnicos y científicos usados en el presente documento tienen el mismo significado que se entiende normalmente por un experto en la técnica a la que pertenece esta invención. Aunque puede usarse cualquier método y material similar o equivalente a los descritos en el presente documento en la práctica o prueba de la presente invención, ahora se describen los métodos y materiales preferidos.

En esta memoria descriptiva y reivindicaciones adjuntas, las formas singulares "un", "uno", y "el" incluyen las referencias en plural a menos que el contexto indique claramente lo contrario.

Realizar una búsqueda en muchos miles de compuestos requiere un tratamiento y manejo paralelo de muchos compuestos y reactivos componentes. Las selecciones de alto rendimiento habituales utilizan mezclas de compuestos y reactivos biológicos junto con algún compuesto indicador cargado en matrices de pocillos en placas de microvaloración habituales.

La presente invención se refiere a una miniaturización a gran escala que comprende el uso de un sustrato sólido al que se unen una multitud de moléculas en regiones predefinidas para formar una micromatriz.

Hay principalmente tres componentes diferentes implicados en las matrices celulares según la presente invención: componentes celulares, compuestos de prueba y moléculas de detección. Además, pueden implicarse moléculas de captura de células como cuarto componente; éstas pueden ser por ejemplo anticuerpos para capturar una bacteria específica cada uno. Dependiendo de la naturaleza de las moléculas de captura, pueden capturarse células específicas (bacterias, hongos, virus, micoplasmas). Una variedad de moléculas de captura distintas en una matriz pueden proporcionar una matriz celular que comprende una variedad de componentes celulares distintos. La presente invención proporciona un ensayo basado en células integradas versátiles en el que se prevén varios formatos de prueba.

En una matriz de componentes celulares, se hacen crecer o depositan islas de células diferentes sobre el sustrato en un formato de matriz. Posteriormente se expone toda la matriz a un (o un numero limitad de) compuesto(s) de prueba y finalmente se expone a una (o un número limitado de) molécula (s) receptora(s) (posiblemente presente en el sustrato) si es necesario tras lisis. Como tal, este formato de prueba permite la exploración de una matriz de componentes celulares diferentes para determinar respuestas inducidas por un compuesto de prueba particular, detectado con una molécula de detección particular. Dicha molécula de detección puede proporcionarse posteriormente a la incubación del compuesto de prueba con los compuestos celulares o puede haberse introducido dentro del sustrato antes del contacto del sustrato con los componentes celulares. Además, puede haberse introducido una molécula de detección dentro de los componentes celulares antes de la exposición a los compuestos de prueba; por ejemplo, puede expresarse GFP como una respuesta celular.

Pueden capturarse componentes celulares sobre el sustrato sólido capturando moléculas que se depositaron previamente sobre dicho sustrato.

Los términos "molécula de detección", "molécula receptora" y "moléculas de discriminación" pueden usarse de manera intercambiable y se refieren, en el contexto de la presente invención, a moléculas que permiten la detección de una respuesta celular. Una molécula de detección también puede generarse mediante la conversión de un compuesto de prueba.

En una matriz de sustancia de prueba se trata localmente una capa homogénea de un componente celular, en regiones predefinidas, mediante pinchado con diversas sustancias de prueba. Además, la sustancia de prueba o compuesto de prueba puede estar presente en el sustrato antes de aplicar los componentes celulares o la sustancia de prueba o compuesto de prueba puede estar presente en las células. Tras el tratamiento, pueden detectarse respuestas celulares con una molécula de detección particular. Dicha molécula de detección puede proporcionarse posteriormente a la incubación del compuesto de prueba con los compuestos celulares o puede introducirse dentro del sustrato antes del contacto del sustrato con los componentes celulares. Además, la molécula de detección puede haberse introducido en las células tal como por ejemplo para obtener células que expresan GFP.

En una matriz de detección, se ponen en contacto una matriz de moléculas de detección o receptoras diferentes con una capa homogénea de componentes celulares que se tratan con un compuesto de prueba particular (o unos pocos unos después de otros). Se monitorizan las respuestas celulares detectando los productos de excreción por la molécula receptora o detectando los productos intracelulares mediante la unión a las moléculas receptoras tras la lisis de los componentes celulares. También pueden detectarse la muerte celular y cambios morfológicos.

La naturaleza y geometría del sustrato dependerán de una variedad de factores, incluyendo, entre otros, el tipo de matriz y modo de unión. Generalmente, el sustrato puede estar compuesto por cualquier material que permita el cultivo celular y la inmovilización de las moléculas deseadas y que no se fundirá ni degradará sustancialmente de otro modo en las condiciones usadas para realizar los ensayos basados en células. Además, cuando se prevé la inmovilización covalente, el sustrato debe poder activarse con grupos reactivos que pueden formar un enlace, que puede ser covalente, con la molécula que va a inmovilizarse.

Se han descrito en la técnica varios materiales adecuados para su uso en sustratos tal como se usan en la presente invención. Sustratos adecuados a modo de ejemplo en la presente invención comprenden materiales que incluyen acrílico, acrilamida, metilen-bis-acrilamida, dimetilaminpropilmetacrilamida, copolímeros de metacrilato de estirenmetilo, etileno/ácido acrílico, acrilonitrilo-butadienestireno (ABS), ABS/policarbonato, ABS/polisulfona, ABS/poli(cloruro de vinilo), etilenpropileno, etileno-acetato de vinilo (EVA), nitrocelulosa, poliacrilonitrilo (PAN), poliacrilato, policarbonato, polibutilentereftalato (PBT), polietilentereftalato (PET), polietileno (incluyendo calidades de baja densidad, lineal de baja densidad, alta densidad, entrecruzado y de peso molecular ultra-alto), homopolímero de polipropileno, copolímeros de polipropileno, poliestireno (incluyendo calidades para fines generales y de alto impacto), politetrafluoroetileno (PTFE), etileno-propileno fluorado (FEP), etileno-tetrafluoroetileno (ETFE), perfluoroalcoxietileno (PFA), poli(fluoruro de vinilo) (PVF), poli(fluoruro de vinilideno) (PVDF), policlorotrifluoroetileno (PCTFE), polietileno-clorotrifluoroetileno (ECTFE), poli(alcohol vinílico) (PVA), estireno de silicio-acrilonitrilo (SAN), estireno-anhídrido maléico (SMA), y vidrio. Sustratos adecuados a modo de ejemplo adicionales comprenden mezclas de dos o más de los materiales mencionados anteriormente.

Otros materiales adecuados a modo de ejemplo para la fabricación de sustratos en la presente invención incluyen óxidos metálicos. Los óxidos metálicos proporcionan un soporte que tiene tanto una alta densidad de canal como una alta porosidad, permitiendo matrices de alta densidad que comprenden primeras sustancias de unión diferentes por unidad de superficie para la aplicación de muestras. Además, los óxidos metálicos son sumamente transparentes para la luz visible. Los óxidos metálicos son sustratos relativamente baratos que no requieren el uso de ninguna tecnología de microfabricación típica y, que ofrecen un control mejorado sobre la distribución del líquido sobre la superficie del sustrato, tal como membrana de óxido metálico fabricada electroquímicamente. Las membranas de óxido metálico que tienen canales orientados, de paso a través, pueden fabricarse mediante ataque químico de una lámina metálica. Los óxidos metálicos considerados son, entre otros, oxides de tantalio, titanio, y aluminio, así como aleaciones de dos o más óxidos metálicos y óxidos metálicos dopados y aleaciones que contienen óxidos metálicos. Las membranas de óxido metálico son transparentes, especialmente si están húmedas, lo que permite ensayos que utilizan diversas técnicas ópticas. Tales membranas tienen canales de paso a través orientados con propiedades de de superficie químicas útiles y diámetro bien controlado. El documento WO 99/02266, que describe el uso de Anopore™, es un ejemplo a este respecto, y se incorpora específicamente en la presente invención.

En consecuencia, en una realización de la presente invención, el sustrato sólido es un soporte sólido poroso.

En una realización adicional, el sustrato sólido tal como se comprende en las etapas del método de la presente invención es un soporte sólido de flujo a través.

En una realización adicional, el sustrato sólido tal como se comprende en las etapas del método de la presente invención es un sustrato de óxido metálico.

En una realización adicional, el sustrato sólido tal como se comprende en las etapas del método de la presente invención es un sustrato de óxido de aluminio.

El término "componentes celulares" tal como se usa a lo largo de la presente memoria descriptiva se refiere a células viables intactas completas incluyendo, por ejemplo células procariotas; así como componentes celulares tales como vesículas, orgánulos y vectores; así como material seccionado tal como secciones de tejido; así como células fijadas; así como organismos multicelulares microscópicos tales como, por ejemplo, nematodos, pez cebra. Los componentes celulares también pueden ser virus, bacterias y micoplasmas.

Según la presente invención, la superficie de dicho sustrato sólido puede ponerse en contacto, mediante depósito directo sobre la misma, con un inóculo de componentes celulares. Dicho inóculo puede ser una formulación líquida que comprende dichos componentes y un medio de crecimiento apropiado.

Sin embargo, también puede eliminarse el medio de crecimiento del inóculo final y comprender conservantes en su lugar tales como glicerol (por ejemplo, cultivos bacterianos). En consecuencia, pueden conservarse componentes celulares sobre el sustrato para su análisis posterior; es decir, los componentes celulares pueden estar sobre el sustrato en condiciones de conservación tales como en glicerol u otro medio adecuado o liofilizados. El término "condición de conservación" se refiere a una condición para mantener los componentes celulares vivos y/o intactos y libres de degradación.

Alternativamente, puede incubarse un cultivo de componentes celulares para el crecimiento hasta que se alcanza la fase exponencial con respecto a su curva de crecimiento, seguido de la deposición de una alícuota de dicho cultivo directamente sobre el sustrato.

En consecuencia, en una realización de la presente invención se proporciona un método en el que dicho proporcionamiento de componentes celulares sobre la superficie de un sustrato se realiza mediante el depósito directamente sobre dicho sustrato de un inóculo o un cultivo.

Tal como apreciará un experto en la técnica, hay protocolos establecidos disponibles para el cultivo de diversos tipos de células. Tales protocolos pueden requerir el uso de recubrimientos especializados y medios selectivos para permitir el crecimiento celular y la expresión de funciones celulares especializadas. No se excluye ninguno de tales protocolos a partir del uso con el método de la presente invención.

En la presente invención, pueden proporcionarse nutrientes a la superficie del sustrato sólido desde abajo o desde arriba y a través de los poros de dicho sustrato sólido.

Dichos nutrientes y/o efectores pueden proporcionarse mediante difusión a la superficie del sustrato sólido desde abajo o desde arriba y a través de los poros de dicho sustrato sólido.

Dichos nutrientes pueden proporcionarse con un medio de crecimiento para cultivar las células. Dicho medio de crecimiento puede ser cualquier medio convencional adecuado para el crecimiento de las células huésped, tal como un medio mínimo o complejo que contiene complementos apropiados. Los medios adecuados están disponibles de proveedores comerciales o pueden prepararse según recetas publicadas (por ejemplo en catálogos de la Colección Americana de Cultivos Tipo). Los medios se preparan usando procedimientos conocidos en la técnica.

El suministro de los nutrientes al sustrato para el crecimiento de los componentes celulares se realiza en condiciones asépticas bien conocidas en la técnica. Dichas condiciones asépticas pueden conseguirse trabajando en una mesa de laboratorio de flujo laminar o colocando una cubierta sobre el sustrato; es decir, sobre el lado del depósito o crecimiento de los componentes celulares.

El método según la presente invención también puede ser aplicable al material seccionado que puede colocarse directamente en contacto con el sustrato.

Si se requieren para ensayos posteriores, por ejemplo detección inmunofluorescente, pueden fijarse las células sobre la superficie del sustrato sólido, por ejemplo mediante fijación química. Normalmente, el fijador preferido dependerá de si se manifiesta la respuesta celular o la molécula de interés se sitúa en la superficie de la célula o dentro de la célula. Por ejemplo, algunos métodos de fijación (tales como fijación con metanol o acetona) no se utilizan normalmente sobre células que se necesitará permeabilizar (por ejemplo, la exploración de antígenos intracelulares).

En la técnica se conocen diversos protocolos de fijación para diversos tipos de células para diversos ensayos; por ejemplo, pueden ponerse en contacto células de mamífero con un fijador tal como solución salina tamponada con fosfato (PBS) con el 3,7% de paraformaldehído y el 4,0% de sacarosa.

El término "componente celular" tal como se usa en la presente invención abarca cualquier tipo de célula que puede cultivarse en artículos de cultivo de tejido habituales. Pueden usarse tipos de células tanto adherentes como no adherentes. Un "componente celular" tal como se usa en la presente invención se refiere a cualquier célula que permite la detección de una respuesta al exponerla a tratamiento frente a/con un compuesto de prueba. Un componente celular según la presente memoria descriptiva puede ser una célula de tipo natural, mutante o transformada o transfectada (célula bacteriana, célula viral, etc.) y por tanto puede proporcionar la subsistencia o alojamiento de una sustancia no de huésped; dicha sustancia no de huésped puede ser viable tal como por ejemplo un parásito o no viable tal como por ejemplo un vector y puede estar presente de manera estable o transitoria en dicha célula huésped. Se ha transfectado una célula mediante material genético exógeno o heterólogo cuando tal material se ha introducido dentro de la célula. Se ha transformado una célula mediante material genético exógeno o heterólogo cuando el material genético realiza un cambio celular, por ejemplo, un cambio fenotípico. Normalmente, el material genético transformante debe integrarse dentro del ADN cromosómico de la célula que compone su genoma. La integración del material genético transformante incluyendo ADN vector dentro del cromosoma del huésped puede producirse mediante recombinación homóloga o no homóloga. Además, un "componente celular" tal como se usan en la presente memoria descriptiva abarca cualquier progenie de una célula original que no es idéntica a la célula original debido a mutaciones que se producen durante la replicación.

Las células útiles incluyen procariotas y eucariotas tales como células de mamífero incluyendo células de hibridoma, células de insectos, células de plantas, células de levadura, y células de protistas que comprenden protozoos, algas y células fúngicas. Las células de mamífero pueden derivarse de cualquier fuente reconocida con respecto a la especie (por ejemplo, ser humano, roedor, simio), fuente tisular (cerebro, hígado, pulmón, corazón, riñón, piel, músculo) y tipo de células (por ejemplo, epitelial, endotelial). Además, las células que se han transfectado con genes recombinantes también puede cultivarse usando la presente invención.

Las líneas celulares adecuadas pueden estar comprendidas dentro de, por ejemplo, la Colección Americana de Cultivos Tipo y la Colección Alemana de Microorganismos y Cultivos Celulares.

En una realización de la presente invención, los componentes celulares se seleccionan del grupo que comprende células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células de plantas, y células microbianas incluyendo células bacterianas y fúngicas, vesículas celulares, orgánulos celulares, secciones de tejido, y organismos microscópicos completos incluyendo nematodos.

Ejemplos no limitativos de líneas celulares de mamíferos útiles incluyen líneas celulares de animales y seres humanos tales como células de ovario de hámster chino (CHO), células de pulmón de hámster chino (CL), células de riñón de hámster recién nacido (BHK), células COS, células HeLa, líneas celulares THP, células TAg Jurkat, células de hibridoma, líneas celulares de carcinoma, hepatocitos y similares.

Líneas celulares de insectos adecuadas incluyen, pero no se limita a, líneas celulares de Lepidoptera tales como células de Spodoptera frugiperola (por ejemplo Sf9, Sf21) y células de Trichoplusia ni (por ejemplo High Five™, BTI-Tn-5B1-4).

Ejemplos no limitativos de células fúngicas útiles en la presente invención incluyen el filum Ascomycota, Basidiomycota, Chytridiomycota, y Zygomycota así como el Oomycota y todos los hongos mitospóricos. Grupos representativos de Ascomycota incluyen, por ejemplo, Neurospora, Eupenicillium (o Penicillium), Emericella (o Aspergillus), Eurotium (o Aspergillus), y las auténticas levaduras enumeradas anteriormente. Ejemplos de Basidiomycota incluyen hongos, roya, y tizó. Grupos representativos de Chytridiomycota incluyen, por ejemplo, Allomyces, Blastociadiella, Coelomomyces, y hongos acuáticos. Grupo representativos de Oomycota incluyen, por ejemplo, hongos acuáticos saprolegniomicetos (humus acuáticos) tales como Achlya. Ejemplos de hongos mitospóricos incluyen Aspergillus, Penicillium, Candiaa, y Alternaria. Grupos representativos de Zygomycota incluyen, por ejemplo, Rhizopus y Mucor.

Células fúngicas pueden ser células de levadura. Ejemplos no limitativos de células de levadura útiles incluyen levaduras ascosporógenas (Endomycetales), levaduras basidiosporógenas, y levaduras que pertenecen a Fungi Imperfecti o Deuteromycota (Blastomycetes). Las levaduras ascosporogenous se dividen en las familias Spermophthoraceae y Saccharomycetaceae. Ésta última está comprendida por cuatro sub-familias, Schizosaccharomycoideae (por ejemplo, género Schizosaccharomyces incluyendo S. pombe), Nadsonioideae, Lipomycoideae, y Saccharomycoideae (por ejemplo, géneros Pichia incluyendo P. pastoris, P. guillermondii y P. methanolio), Kluyveromyces incluyendo K. lactis, K. fragilis y Saccharomyces incluyendo S. carlsbergensis, S. cerevisiae, S. diastaticus, S. douglasii, S. kluyveri, S. norbensis o S. oviformis). Las levaduras basidiosporogenous incluyen los géneros Leucosporidim, Rhodosporidium, Sporidiobolus, Filobasidium, y Filobasidiella. Las levaduras que pertenecen a los Fungi Imperfecti se dividen en dos familias, Sporobolomycetaceae (por ejemplo, géneros Sporobolomyces y Bullera) y Cryptococcaceae (por ejemplo, género Candida incluyendo C. maltose). Otras células huésped de levadura útiles son Hansehula polimorpha, Yarrowia lipolytica, Ustilgo maylis.

Las células fúngicas pueden ser células fúngicas filamentosas incluyendo todas las formas filamentosas de la subdivisión Eumycota y Oomycota. Los hongos filamentosos se caracterizan por un micelio vegetativo compuesto por quitina, celulosa, glucano, quitosano, manano, y otros polisacáridos complejos. El crecimiento vegetativo se realiza mediante elongación hifal y el catabolismo del carbono es obligatoriamente aerobio. En cambio, el crecimiento vegetativo por levaduras tales como Saccharomyces cerevisiae se realiza mediante brote de un tallo unicelular y el catabolismo del carbono puede ser fermentativo. En una realización más preferida, la célula huésped fúngica filamentosa es una célula de una especie de, pero sin limitarse a, Acremonium, Aspergillus, Fusarium, Humicola, Mucor, Myceliophthora, Neurospora, Penicillium, Thielavia, Tolypocladium, y Trichoderma o un teleomorfo o sinónimo de los mismos.

Las células de microorganismos útiles pueden ser unicelulares, por ejemplo una procariota, o no unicelulares, por ejemplo eucariotas. Las células unicelulares útiles son Archaebacteria. Células unicelulares útiles adicionales son células bacterianas aeróbicas tales como bacterias gram positivas incluyendo, pero sin limitarse a, los géneros Bacillus, Sporolactobacillus, Sporocarcina, Filibacter, Caryophanum, Arthrobacter, Staphylococcus, Planococcus, Micrococcus, Mycobacterium, Nocardia, Rhodococcus; o bacterias gram negativas incluyendo, pero sin limitarse a, los géneros Acetobacter, Gluconobacter, Frateuria, Akaligenes, Achromobacter, Deleya, Amoebobacter, Chromatium, Lamprobacter, Lamprocystis, Thiocapsa, Thiocystis, Thiodictyon, Thiopedia, Thiospirillum, Escherichia, Salmonella, Shigella, Erwinia, Enterobacter, Serratia, Legionella, Neisseria, Kingella, Eikenella, Simonsiella, Alysiella, Nitrobacter, Nitrospina, Nitrococcus, Nitrospira, Pseudomonas, Xanthomonas, Zoogloea, Fraturia, Rhizobium, Bradyrhizobium, Azorhizobium, Sinorhizobium, Rickettsia, Rochalimaea, Ehrlichia, Cowdria, Neorickettsia, Treponema, Borrelia, Vibrio, Aeromonas, Plesiomonas, Photobacterium, Bruccella, Bordetella, Flavobacterium, Francisella, Chromobacterium, Janthinobacterium, y lodobacter.

Células de plantas adecuadas para su uso en la presente invención incluyen células de plantas dicotiledóneas, ejemplos de las cuales son Arabidopsis Thaliana, tabaco, patata, tomate y células leguminosas (por ejemplo judía, guisante, soja, alfalfa). Sin embargo, se contempla que las células de plantas monocotiledóneas, por ejemplo células de plantas de cereales monocotiledóneas tales como por ejemplo arroz, centeno, cebada y trigo pueden ser igualmente adecuadas.

La administración de los compuestos de prueba, componentes celulares o moléculas de detección a regiones predefinidas sobre el sustrato puede conseguirse usando un dispositivo de manejo de líquidos pero también puede conseguirse igualmente mediante manejo manual.

En consecuencia, puede colocarse un dispositivo de manejo de líquidos sobre el sustrato, en el que dicho dispositivo de manejo de líquidos puede tener un pipeteador x-y-z de alta precisión o una impresora de chorro de tinta que contiene 1 o más canales a través de los cuales puede dispensarse líquido, secuencialmente o en paralelo, a posiciones que corresponden a moléculas en matrices sobre la superficie del sustrato sólido. Alternativamente, puede superponerse una máscara de superposición que comprende orificios transversales sobre el sustrato, en la que dicha superposición es tal que cada orificio transversal en dicha máscara corresponde a una molécula en matriz sobre la superficie de dicho sustrato sólido.

Las máscaras de superposición pueden ser útiles en la generación de matrices celulares; es decir, tras hacer crecer una capa confluente de células, estas células pueden transformarse posteriormente mediante un juego de vectores o constructos de genes para obtener una matriz de diferentes células transformadas. El uso de una máscara durante la etapa de transformación permite la transformación de células que crecen en una zona predefinida sobre la matriz que se transforman con un vector o constructo de genes conocido. Como tal, mediante el uso de una máscara, se crea un patrón XV de células transformadas, del cual la posición XY sobre la matriz define las células transformadas.

La administración de compuestos de prueba, componentes celulares o moléculas de detección puede realizarse mediante medios de pinchado de contacto o sin contacto. El término "pinchado de contacto" o "fuerza de contacto" tal como se usa en esta memoria descriptiva se refiere a un contacto de superficie directo entre un sustrato de impresión y un mecanismo de administración que puede contener una o una pluralidad de una matriz de pinzas, puntas o capilares que sirven para transferir o administrar cualquier contenido dentro del mecanismo de administración a la superficie golpeando físicamente dicha(s) punza(s), punta(s) o capilar(es) sobre la superficie. Además, puede colocarse una máscara de superposición sobre el soporte sólido (que contiene células) mediante lo cual se administra pasivamente el contenido de los pocillos formados por los orificios llenos en la máscara sobre dichas células mediante acciones capilares cuando se presiona la máscara sobre el chip. Tal como se usa en la presente memoria descriptiva, una máscara actúa como barrera al paso de un reactivo. Normalmente, un patrón de orificios en la máscara permite el paso selectivo de reactivos y da como resultado un patrón correspondiente de deposición de reactivos sobre una superficie colocada tras/debajo de la máscara.

Alternativamente, los compuestos de prueba también pueden administrarse o pincharse mediante tecnología de impresión por chorro de tinta, una tecnología sin contacto en la que los reactivos se pulverizan sobre la superficie usando una tecnología adaptada a partir de las impresoras de chorro de tinta de ordenadores. El método de chorro de tinta se denomina algunas veces indirecto, dado que los reactivos se pulverizan sobra la superficie en vez de colocarse directamente. Los métodos de chorro de tinta pueden ser capaces de producir pinchados más pequeños, y dado que evitan el contacto físico con la superficie, puede probarse que son más fiables.

Metodologías de impresión de chorro de tinta útiles pueden incluir métodos de chorro de tinta continuos y de goteo por dimanada. Los métodos de impresión de chorro de tinta más adecuados son los métodos de chorro de tinta de goteo por demanda, ejemplos de los cuales incluyen sistemas de chorro de tinta piezoeléctricos y electrostáticos.

Además, los robots de pinchado o dispositivos de manejo de líquidos son útiles en la presente invención. La mayoría de los robots de pinchado o dispositivos de manejo de líquidos usan un brazo robótico X-Y-Z (uno que pueden moverse en tres dimensiones) montado sobre una mesa antivibraciones. Dicho brazo puede sujetar boquillas en caso de pinchado sin contacto. En el pinchado de contacto, dicho brazo puede sujetar puntas. Se sumergen las boquillas o puntas en una primera placa de microvaloración para recoger el fluido (por ejemplo, disolución de compuesto de prueba) que va a administrarse. Los conos o puntas se mueven entonces hacia la superficie del soporte sólido y se les deja tocar la superficie sólo mínimamente; entonces se transfiere la disolución de compuesto de prueba. Entonces se lavan las puntas y se mueven hacia el siguiente juego de pocillos y compuestos de prueba. Este procedimiento se repite hasta que se depositan cientos o miles de compuestos de prueba. Las configuraciones de puntas sólidas, vainas, y puntas y anillos pueden ser útiles.

En consecuencia, en una realización de la presente invención, la administración de compuestos de prueba se realiza mediante un medio seleccionado del grupo que comprende una máscara de administración, un pipeteador x-y-z de alta precisión, una impresora de chorro de tinta, y manejo manual.

En una realización adicional de la presente invención, la administración de compuestos de prueba se realiza mediante un medio de pipeteador x-y-z de alta precisión o impresora de chorro de tinta.

En una realización de la presente invención, la administración de compuestos de prueba al soporte que contiene células se realiza por medio de una fuerza de contacto.

En una realización adicional de la presente invención, la administración de compuestos de prueba al soporte que contiene células se realiza por medio de una fuerza de contacto que puede ser una fuerza capilar o una fuerza piezoeléctrica.

La presente invención proporciona un método para la búsqueda y la caracterización farmacológica de compuestos de prueba que modulan una respuesta celular, por ejemplo, una respuesta fisiológica y/o las actividades de las células. Puede detectarse y caracterizarse cuantitativamente una variedad de defectos provocados por los compuestos que van a examinarse según la presente invención. Estos efectos incluyen, pero no se limitan a, cambios en la concentración intracelular de calcio ionizado, diferencias de AMPc (por ejemplo, debido a la activación o inactivación metabólica), pH, temperatura, NO, y potencial transmembrana, flujos de Ca, K o Na intracelulares dentro o fuera de la célula y otras características fisiológicas y bioquímicas de la célula viva que pueden medirse mediante una variedad de medios convencionales, por ejemplo, usando colorantes de revelación del color, luminiscentes o fluorescentes específicos.

La presente invención también incluye métodos de búsqueda para la actividad agonista o antagonista de fármacos, métodos de caracterización de sus perfiles de potencia, métodos de identificación del patrón de expresión receptora de la membrana celular ("huella dactilar receptora"), métodos de determinación de perfiles de toxicidad para los compuestos (por ejemplo, respuestas toxicológicas, CYP-450, HERC), lisis bacteriana, apoptosis, necrosis celular, procesos de mutación de células tales como por ejemplo carcinogénesis, interacciones proteína-proteína inducidas por fármacos detectables usando transferencia de energía de resonancia por fluorescencia (FRET) o transferencia de energía de resonancia por bioluminiscencia (BRET), ADME (adsorción, distribución, metabolismo y eliminación) o cualquier otra respuesta celular. La pluralidad de respuestas celulares incluye una respuesta celular seleccionada del grupo que consiste en transducción de señal, interacciones proteína-proteína generales, cambios en la actividad enzimática, tráfico de vesícula, movimiento de proteínas, movimiento de vesícula, activación o inhibición de una respuesta mediada por receptor, activación o inhibición de un canal de iones, activación o inhibición de un poro no selectivo, activación o inhibición de una ruta de mensajero secundario en un punto posterior de un receptor o canal, activación o inhibición de apoptosis, y activación o inhibición de necrosis celular, toxicidad celular, diferenciación de células y proliferación de células. Algunas respuestas celulares tales como lisis bacteriana, apoptosis, necrosis, proliferación no necesitan necesariamente moléculas de detección para detectarlos, en su lugar pueden detectarse mediante inspección visual.

El método de la presente invención también puede usarse para realizar análisis bioquímicos, tales como análisis de tipo Western, análisis de tipo Northern, detección de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP), detección de actividades enzimáticas, o ensayos de reunión molecular.

Según el método de la presente invención, pueden detectarse, evaluarse y caracterizarse la capacidad y potencia de las sustancias para actuar como agonistas o antagonistas frente a receptores, canales de iones, bombas de iones, y transportadores de iones ubicados en una membrana de superficie celular. Estas reuniones moleculares funcionan coordinadamente para mantener la homeostasis iónica intracelular. Cualquier cambio en la actividad de estos sistemas provocaría una desviación en las concentraciones intracelulares de iones y, en consecuencia, en la respuesta metabólica de la célula.

Las bombas de iones actúan para mantener los gradientes de iónicos transmembrana utilizando ATP como una fuente de energía. Ejemplos de bombas de iones son: Na^{+}/K^{+}-ATPasa que mantiene el gradiente transmembrana de iones de sodio y potasio, Ca^{2+}-ATPasa que mantiene el gradiente transmembrana de iones de calcio y H^{+}-ATPasa que mantiene el gradiente transmembrana de protones.

Los transportadores de iones usan la energía electroquímica de los gradientes transmembrana de una especie iónica para mantener gradientes de otra contrapartida iónica. Por ejemplo, el intercambiador Na^{+}/Ca^{2+} utiliza el potencial químico del gradiente de sodio dirigido hacia dentro para bombear iones de calcio hacia fuera contra su potencial químico.

Los canales de iones, con su activación, permiten que los iones se muevan a través de la membrana celular según su potencial electroquímico.

En consecuencia, en una realización de la presente invención, se proporciona un método tal como se describe en el presente documento, en el que se seleccionan respuestas celulares del grupo que comprende inducidas químicamente o acontecimientos fisiológicos en la célula, incluyendo lisis, apoptosis, inhibición del crecimiento, y promoción del crecimiento; producción, secreción, y exposición de la superficie de una proteína u otra molécula de interés por la célula; activación de molécula de superficie de la membrana incluyendo activación de receptor; transportes de iones transmembrana; y regulaciones de la transcripción.

Las moléculas de interés que pueden monitorizarse pueden ser cualquier molécula de origen biológico, ejemplos no limitativos de las cuales son péptidos, polipéptidos, proteínas, enzimas, polipéptidos modificados tras la traducción tales como lipopéptidos o péptidos glucosilados, péptidos o moléculas antimicrobianos, metabolitos primarios o se-
cundarios tales como alginatos, moléculas orgánicas pequeñas, moléculas que tienen propiedades farmacéuticas, etc.

En una realización adicional de la presente invención, se proporciona un método en el que dicha molécula de interés se selecciona del grupo que comprende péptidos incluyendo lipopéptidos, péptidos glucosilados y péptidos antimicrobianos, polipéptidos, proteínas, enzimas, moléculas antimicrobianas, metabolitos primarios y secundarios, y pequeñas moléculas orgánicas incluyendo moléculas farmacéuticas.

En una realización de la presente invención, se proporciona un método, en el que compuesto de prueba es un fármaco o cualquier compuesto que puede convertirse en fármaco. Dicho compuesto de prueba puede ser útil en el proceso de selección/validación de un candidato a fármaco.

En consecuencia, en una realización adicional, se proporciona un método, en el que dicho compuesto de prueba es un fármaco o cualquier compuesto que es útil en el proceso de selección de un candidato a fármaco.

El número de compuestos de prueba posibles asciende a millones. Pueden obtenerse bibliotecas de compuestos comercialmente disponibles incluyendo péptidos, proteínas, azúcares, etc. de, por ejemplo, ArQule, Pharmacopeia, Graffinity, Panvera, y Oxford.

En una realización particular de la presente invención, dicho compuesto de prueba es un fármaco seleccionado de una biblioteca de candidatos de fármaco químicos o naturales.

La evaluación de respuestas celulares puede realizarse de varias maneras. La detección puede ser simplemente inspección visual; por ejemplo crecimiento celular o no, morfología celular, etc. o puede realizarse mediante el uso de moléculas de detección. Las moléculas de detección pueden estar ya presentes en el sistema de matriz; por ejemplo cuando se observa la expresión de un gen con un notificador de GFP. Además, las moléculas de detección pueden difundirse a partir de agar bajo el sustrato tal como se muestra como ejemplo en el ejemplo 2.

Cuando las moléculas de detección aún no están presentes en la matriz celular, pueden someterse las respuestas celulares a ensayo mediante la adición de las moléculas de detección a la matriz celular tras la incubación de los compuestos de prueba con componentes celulares.

En una realización de la presente invención, se proporciona un método tal como se describe en el que el ensayo de las respuestas celulares se realiza:

(a) proporcionando un agente de detección a los componentes celulares;

(b) eliminando mediante lavado el exceso de agente de detección no incorporado; y,

(c) detectando la presencia o ausencia de un cambio en una señal detectable, indicando la presencia de un cambio en una señal detectable una respuesta celular.

Alternativamente, puede considerarse la detección libre de marcador de respuestas celulares mediante, por ejemplo, mediciones calorimétricas. Esto permite la medición de, por ejemplo, actividades metabólicas en una célula mediante detección con, por ejemplo, una cámara IR sensible.

En una realización de la presente invención, se someten a ensayo las respuestas celulares en todo el caldo o medio de cultivo celular, en células aisladas tales como células sedimentadas, en sobrenadantes de los componentes celulares, o en lisado de componentes celulares.

En una realización de la presente invención, se seleccionan las moléculas de detección del grupo que comprende ácidos nucleicos incluyendo análogos modificados de los mismos, péptidos, proteínas, y anticuerpos incluyendo fragmentos de anticuerpos, sustratos de enzimas y colorantes específicos. Ejemplos adecuados no limitativos de colorantes específicos se conocen bien en la técnica e incluyen colorantes de Fluo-3, Fluo-4, y Ca tales como por ejemplo Calcium Green-1 (véase por ejemplo el catálogo de Molecular Probes).

La presente invención contempla la monitorización de más de una respuesta celular, por ejemplo observando la fluorescencia a diferentes longitudes de onda usando por ejemplo colorantes CY3 y CY5, o empleando simultáneamente métodos diferentes de detección.

Las células o componentes celulares pueden modificarse con indicadores luminiscentes para las propiedades celulares químicas o moleculares y pueden analizarse en un estado vivo. Dichos indicadores pueden introducirse dentro de las células antes o después de exponerlas con compuestos de prueba y mediante uno cualquiera o una combinación de una variedad de métodos físicos, tales como, pero sin limitarse a, la difusión a través de la membrana celular, la perturbación mecánica de la membrana celular, o ingeniería genética de modo que se expresan en células en las condiciones prescritas. Los estudios en vivo permiten el análisis del estado fisiológico de la célula tal como se notifica por el indicador durante su ciclo de vida o cuando se pone en contacto con un compuesto de prueba tal como un fármaco y otro principio activo.

En consecuencia, en una realización de la presente invención, se proporciona un agente de detección a los componentes celulares antes de administrar el compuesto de prueba proporcionando así componentes celulares premarcados.

En una realización de la presente invención, la identificación de las respuestas celulares se realiza mediante luminiscencia.

En una realización adicional de la presente invención, dicha luminiscencia es fluorescencia.

Moléculas fluorescentes particularmente útiles incluyen, a modo de ejemplo y no de limitación, isotiocianato de fluoresceína (FITC), rodamina, malaquita verde, Oregon green, Texas Red, Congo red, SybrGreen, ficoeritrina, aloficocianina, 6-carboxifluoresceína (6-FAM), 2',7'-dimetoxi-4',5'-dicloro-6-carboxifluoresceína (JOE), 6-carboxi-X-rodamina (ROX), 6-carboxi-2',4',7',4,7-hexaclorofluoresceína (HEX), 5-carboxifluoresceína (5-FAM), N,N,N',N'-tetrametil-6-carboxirodamina (TAMRA), colorantes de cianina (por ejemplo Cy5, Cy3), colorantes BODIPY (por ejemplo BODIPY 630/650, Alexa542, etc), proteína fluorescente verde (GFP), proteína fluorescente azul (BFP), proteína fluorescente amarilla (YFP), proteína fluorescente roja (RFP), y similares, (véase, por ejemplo, Molecular Probes, Eugene, Oregon, EE.UU.).

Métodos para detectar señales en general se conocen bien por aquellos expertos en la técnica. Por tanto, por ejemplo, pueden detectarse radiomarcadores usando una película fotográfica o recuentos de centelleo, pueden detectarse marcadores fluorescentes usando un detector para detectar la iluminación emitida. Los marcadores enzimáticos se detectan normalmente proporcionando a la enzima un sustrato de enzima y detectando el producto de reacción producido por la acción de la enzima sobre el sustrato, y los marcadores colorimétricos se detectan visualizando sencillamente el marcador coloreado. Medios de detección adicionales son, por ejemplo, (micro) calorimetría y microscopía (de luz).

La detección de respuestas celulares también puede conseguirse mediante prácticas de detección de múltiples etapas. Dichas prácticas pueden ser, a modo de ejemplo y no de limitación, ensayos de tipo sandwich tal como se conocen bien en la técnica y conversiones enzimáticas en un producto detectable.

En una realización de la presente invención, el ensayo se realiza en tiempo real.

En otra realización de la presente invención, el ensayo es un ensayo de punto final.

Los métodos según la presente invención pueden usarse particularmente para monitorizar respuestas celulares inducidas de células huésped. Las respuestas celulares inducidas incluyen, pero no se limitan a, recombinación, transformación e inducción vírica tal como por ejemplo mediante desviaciones de temperatura.

En consecuencia, el método según la presente invención puede usarse particularmente para recombinación, transformación o inducción vírica de componentes celulares sobre el chip.

Adicionalmente, los métodos según la presente invención pueden usarse particularmente para la selección funcional de respuestas celulares al someter a ensayo componentes celulares con compuestos de prueba.

El método y micromatrices según la presente invención pueden encontrarse de manera adicional particularmente adecuados para la búsqueda de matrices de, por ejemplo, antibióticos con micoplasmas.

Tal como se apreciará en la técnica, los métodos y micromatrices según la presente invención también son particularmente adecuados para selecciones combinatorias.

Las matrices de compuesto de prueba pueden tener compuestos de prueba inmovilizados sobre la superficie de un sustrato sólido.

Puede desearse proporcionar compuestos de prueba en disolución en regiones predefinidas dentro de un sustrato para seleccionar en un punto de tiempo posterior. Las micromatrices tal como se usa en el método de la presente invención son particularmente adecuadas para la conservación de compuestos de prueba. Si se proporcionan en disolución, dichos compuestos de prueba pueden moverse libremente durante los procedimientos de búsqueda. Esto puede ser ventajoso comparado con un compuesto fijo que puede provocar un efecto de estorbo estérico.

En consecuencia, es otro objeto de la presente invención proporcionar una micromatriz para realizar un método según la presente invención en el que se proporciona una matriz de compuestos de prueba dentro de regiones predefinidas, dichos compuestos de prueba están en disolución líquida y no están inmovilizados en el sustrato.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar una micromatriz para realizar un método según la presente invención en el que se proporciona una matriz de componentes celulares en regiones predefinidas sobre un sustrato, estando dichos componentes celulares condicionados para la conservación sobre dicho sustrato.

Es aún otro objeto de la presente invención proporcionar una micromatriz para realizar un método según la presente invención en el que se proporciona un componente celular sobre un sustrato, estando dicho componente celular condicionado para la conservación sobre dicho sustrato.

Aún en una realización adicional de la presente invención, se proporciona una micromatriz según la presente invención en la que dicha condición se selecciona del grupo que comprende, liofilización y disolución en glicerol.

Las matrices de células conservadas tal como se describe anteriormente están bien adecuadas para el almacenamiento a largo plazo. Se apreciará que tales matrices de células condicionadas pueden usarse como plantillas; es decir como matrices madre para generar matrices idénticas secundarias posteriores mediante, por ejemplo, impresión continua ("back-to-back") de componentes celulares a partir de matriz madre sobre una matriz secundaria. Este manejo puede repetirse varias veces con la misma matriz madre para crear un juego de matrices secundarias.

En una realización de la invención, se proporciona una micromatriz tal como se describe en el presente documento en la que se inmoviliza una matriz de moléculas de detección dentro del sustrato.

En una realización adicional de la presente invención, se proporciona una micromatriz según la presente invención en la que dicha matriz de moléculas de detección comprende una pluralizad de moléculas de detección iguales o una pluralidad de moléculas de detección diferentes.

La presente invención también abarca el uso de una micromatriz o sustrato poroso sólido tal como se describe dentro de la presente memoria descriptiva para obtener una baja propagación de crecimiento de componentes celulares sobre la superficie del sustrato. Se encontró sorprendentemente que la inoculación de componentes celulares sobre la superficie del sustrato sólido en los métodos según la presente invención conduce a una propagación limitada entre colonias colocadas estrechamente sobre el sustrato.

Es aún otro objeto de la invención proporcionar un kit para realizar un método según la presente invención que comprende una micromatriz tal como se describe en el presente documento.

Breve descripción de las figuras

La figura 1 ilustra la presencia de colonias transformadas sobre un sustrato sólido de flujo a través, centrándose en el borde del sustrato. El panel (B) del fondo muestra colonias de E. coli XL2 MRF' dejadas crecer sobre el sustrato, con nutrientes que se difunden a través del sustrato desde el agar inferior. El panel (A) superior muestra colonias dejadas crecer directamente sobre agar.

La figura 2 ilustra la detección de actividad de \beta-galactosidasa expresada por E. coli usando el sustrato fluorogénico MUG. Las imágenes muestran una zona de 4 mm por 3 mm y estaban a escala idéntica.

(A) Principio del ensayo. Las bacterias atrapadas sobre la superficie del sustrato sólido de flujo a través expresan una enzima que forma un producto fluorescente, mediante la difusión del sustrato de la enzima (MUG en este caso) hacia arriba hacia las bacterias y/o la difusión de la enzima (\beta-galactosidasa) liberada de las células hacia abajo hacia el agar. a, agar; b, sustrato de flujo a través; c, colonia (\beta-galactosidasa)

(B) Bacterias colocadas sobre placas directamente con agar nutriente, o

(C) sobre un sustrato sólido de flujo a través depositado sobre agar.

La figura 3 ilustra un sustrato sólido con máscara para compartimentar el crecimiento microbiano o reacciones enzimáticas. La difusión es posible desde un medio de crecimiento por debajo mientras se evita el movimiento de propagación lateral de los microorganismos u otros materiales.

(A) Diagrama esquemático (vista desde arriba);

(B) Fotografía de sustrato con máscara lavado con metanol en canal fluorescente desde arriba. Los compartimientos varían desde 0,5 mm hasta 1 mm de anchura, de 0,25 a 1 mm^{2} de área. Sin embargo, con tecnología de impresión apropiada son posibles compartimientos mucho más pequeños.

(C) Compartimiento; dm, máscara de división sobre la superficie o que penetra a través del chip

La figura 4 ilustra un sustrato con máscara (similar a la figura 3):

(A) Sustrato inoculado con E. coli que expresa GFP propagando un cultivo bacteriano sobre toda la superficie. La captura de imagen se realizó mediante un microscopio BX41, 30 ms de exposición usando un filtro de fluoresceína. Los compartimientos en este caso son de aproximadamente 0,5 a 1 mm de ancho. Las zonas claras son compartimientos llenos de bacterias;

(B) La iluminación visual de un sustrato inoculado con E. coli que expresa GFP tocando una punta de pipeta dentro de un compartimiento de 0,5 mm por 0,5 mm;

(C) Visualización de GFP con iluminación UV de un sustrato inoculado con E. coli que expresa GFP tocando una punta de pipeta dentro de un compartimiento de 0,5 mm por 0,5 mm.

La figura 5 ilustra la acumulación de filtración de bacterias sobre un sustrato de flujo a través:

(A) Se incubó el sustrato en caldo L a temperatura ambiente conteniendo 10^{3} bacterias que expresaban GFP por ml y;

(B) Filtración de medio a través del sustrato, golpeando las bacterias sobre su superficie;

(C) Detección de crecimiento de una colonia que expresa GFP de E. coli (30 ms de exposición) sobre el sustrato de flujo a través durante 6 horas;

(D) Una mancha de hibridación de un transcripto de ARN marcado con Flu a una oligosonda también sobre matriz PamChip (98 ms de exposición), esta imagen tiene la misma escala comparada con (C), las manchas de (c) y (D) son de tamaño similar;

(E), (F) Comparación de colonias típicas de la colocación en placas de E. coli que expresa GFP sobre agar L (E); y colonias dejadas crecer durante el mismo periodo de tiempo sobre la misma placa sobre un sustrato de flujo a través colocado sobre la base de agar (F). La magnificación fue idéntica en ambas fotografías. Los bordes que definen un límite de colonia son inevitablemente más bruscos para bacterias que crecen sobre el sustrato.

La figura 6 ilustra la expresión de GFP como un indicador de la actividad de kanamicina en chips de flujo a través compartimentados. Las barras de error muestran la desviación estándar de mediciones por triplicado.

La figura 7 ilustra una transformación de

(A) pUC18 (que expresa resistencia a la ampicilina pero no GFP); y

(B) pGFPuv (que expresa proteína GFP así como resistencia a la ampicilina) sobre sustrato sólido de flujo a través compartimentado sobre placas de agar L, nt, sin transformación;

(C) Transformación de pGFPuv en E. coli mezclando células y ADN en el chip. Se visualizan las microcolonias en un compartimiento de sustrato de Pam mediante fluorescencia de GFP;

(D) Como (A) y (B) pero tras 48 horas de incubación con el sustrato usando iluminación visible. Se observa que la compartimentación todavía contiene propagación de colonia aunque los compartimientos inoculados son confluentes. Las cuatro esquinas tienen crecimiento bacteriano confluente, que no se ha propagado a los compartimientos centrales o incluso parcialmente a través del agente de máscara.

La figura 8 ilustra la captura de anticuerpos de E. coli visualizada mediante expresión de GFP:

(A) Anticuerpo M13 (control negativo);

(B) Anticuerpo de E. coli (cultivado frente a extractos de célula completa).

La figura 9 ilustra el crecimiento de un asilado de Penicillium sobre sustrato sólido de flujo a través:

(A) Cepa parenteral que crece sobre pan;

(B) Mycelium que crece inmediatamente sobre la superficie del sustrato;

(C) Mycelium aerial que crece 3 mm por encima de la superficie del sustrato del mismo experimento que en (B), la fotografía se centra en el micelio que se origina sobre el sustrato pero se proyecta significativamente por encima de éste.

La figura 10 ilustra los principios de la captura de anticuerpos y detección en el chip basándose en la sensibilidad al detergente, actividad enzimática y una inserción de transposón en un entorno de diagnóstico, clasificación de cepas para un patógeno bacteriano.

Ejemplos

Los siguientes ejemplos de la invención son a modo de ejemplo y no deben tomarse como limitativos de ninguna manera.

Los siguientes experimentos demuestran el uso de un sustrato flujo a través en métodos de análisis de matriz viva según la presente invención, pueden detectarse los compuestos de bajo peso molecular que o bien se imprimen sobre el sustrato o bien se difunden a través del sustrato mediante una respuesta celular. En los siguientes ejemplos, las respuestas celulares usadas fueron microorganismos incluyendo crecimiento (o inhibición de crecimiento), actividad enzimática o la captación de ADN que conduce a la expresión de una proteína fluorescente. Sin embargo, esto no limita la aplicación a estas áreas únicamente, son sólo ilustrativas de diferentes factores aplicables a matrices de células vivas. Se sometieron a ensayo las respuestas celulares a los efectores sobre el sustrato, lo que es adecuado para imprimir compuestos con alta densidad para múltiples análisis paralelos y miniaturizados.

Ejemplo 1 Provisión de células de E. coli transformadas sobre la superficie de sustrato sólido poroso

Según la presente invención, la superficie del sustrato sólido puede ponerse en contacto, depositando directamente sobre la misma, con un inóculo de componentes celulares.

Se colocó un sustrato sólido de flujo a través esterilizado con etanol (sustrato de óxido de aluminio; Anopore, Whatman) sobre placas de agar L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina (Sigma). Se transformaron 10 pg de plásmido pUC18 (Sigma) en células competentes XL2 MRF' (Stratagene, se usaron los protocolos de los fabricantes excepto que se usaron tan sólo 20 \mul en vez de 100 \mul células competentes por transformación) y luego se colocaron en placas sobre el sustrato con diferentes diluciones, luego se dejó crecer durante 8 horas a 37ºC se evaluó el aspecto de las colonias resistentes a la ampicilina. Tanto los nutrientes como la ampicilina alcanzaban a las bacterias desde abajo del sustrato a través de los poros del sustrato.

Tal como se muestra en la figura 1B, tras 8 horas las colonias eran ligeramente menores sobre el sustrato comparado con agar L y tuvieron una tendencia reducida a propagarse comparado con las colonias crecidas directamente sobre agar L (figura 1A). Tras 16 horas las colonias sobre el sustrato poroso tenían un diámetro de aproximadamente la mitad del de aquellas sobre placas de agar. La detección se realizó mediante microscopía de luz e inspección visual. Las eficacias de transformación fueron de 2,7 x 10^{8} ufc/\mug plásmido (agar) y 1,8 x 10^{8} ufc/\mug (sustrato).

Estos experimentos muestran que el sustrato se esteriliza fácilmente y que el crecimiento y la selección de células transformadas por plásmido puede realizarse rápidamente sobre la superficie de un sustrato poroso con una eficacia de crecimiento ligeramente inferior. Aunque el crecimiento de colonia parece estar sólo marginalmente limitado comparado con el crecimiento directo sobre agar en el plazo de las primeras 8 horas; tras ello el crecimiento parece restringirse más rápidamente que sobre agar, esto es una ventaja al limitar la propagación entre colonias colocadas estrechamente sobre el sustrato, lo que se ajusta a las aplicaciones de matriz reduciendo la posibilidad de contaminación entre muestras.

Ejemplo 2 Detección de actividad de \beta-galactosidasa de células de E. coli que crecen sobre el sustrato poroso usando MUG, un sustrato fluorogénico para esta enzima

Se colocó un sustrato de flujo a través estéril sobre placas de 2TY que contenían 100 \mug/ml de ampicilina (Sigma) y 50 \mug/ml de MUG (4-metilumbeliferil-\beta-D-galactósido, Sigma, cat: M-1633). Se colocaron sobre placas alícuotas de 50 \mul de caldo L que contenía 10^{3} ufc/ml de E. coli XL2 Blue MRF' con el plásmido pUC18 (que expresa \beta-galactosidasa) sobre el sustrato y un volumen similar directamente sobre agarosa. Se realizaron controles colocando sobre placas la cepa huésped que carece de pUC18 sobre las mismas placas (sin ampicilina). Se evaluó la conversión de MUG en su producto fluorescente (4-metilumbeliferona) tras 8 horas de crecimiento colocando las placas de agar sobre un transiluminador de UV y capturando las imágenes de colonias fluorescentes usando una cámara UVP Epi Chemi II CCD. La figura 2A ilustra el ajuste experimental y las figuras 2B y 2C muestran los resultados obtenidos sobre el sustrato (2C) o directamente sobre el agar (2B).

Las colonias que no expresaban \beta-galactosidasa no eran fluorescentes. La fluorescencia podía detectarse a partir de colonias de E. coli que contenían pUC18 (y por tanto expresaban la enzima) sobre agar o sustrato depositado sobre las mismas placas de agar. La fluorescencia era más detectable y menos difusa sobre el sustrato poroso (figura 2B).

En conclusión, los métodos según la presente invención permiten la difusión desde el agar nutriente u otra matriz desde debajo del sustrato; por ejemplo los sustratos de enzimas pueden difundir hacia arriba. Además, puede moverse un sustrato fijado adecuado con microorganismos sobre su superficie entre diferentes medios permitiendo ensayos secuenciales. En este experimento, colocando sobre placas bacterias que expresan una enzima sobre material poroso el sustrato de bajo peso molecular para la enzima en el agar por debajo, se demostró la detección de bacterias basándose en la expresión de una enzima específica, en otras palabras, un fenotipo basado en una actividad enzimática. Esto tiene muchas aplicaciones, por ejemplo en diagnósticos en los que es común la clasificación de bacterias basándose en diversos ensayos colorimétricos y fluorométricos. Además el sustrato proporciona un ruido de fondo bajo para la detección de agentes fluorescentes y la detección se mejoró ligeramente sobre el material poroso de flujo a través, que refleja en parte menos propagación de las bacterias y/o menos difusión lateral de la enzima, una propiedad útil para una matriz microbiana que puede aplicarse al crecimiento de un gran número de micro-colonias en cercana proximidad.

Ejemplo 3 Crecimiento de célula bacteriana sobre la superficie de un sustrato sólido de flujo a través-sensibilidad a los antibióticos proporcionada desde debajo del sustrato

Se pincharon puntos de 200 nl de agar al 0,5% fundido y o bien 0,500 \mug/ml o bien 5 mg/ml de kanamicina (0,100 y 1000 ng de kanamicina) sobre sustrato de flujo a través esterilizado con etanol para formar coágulos de agar de 1 mm de diámetro a través del sustrato. La naturaleza porosa del sustrato lleva el agar fundido dentro de los poros mediante acción capilar. Estos sustratos tratados se recubrieron con 10^{6} ufc/ml de células de E. coli XL2 MRF' que contenían plásmido pUC18 que se habían dejado crecer en caldo 2TY con 100 \mug/ml de ampicilina y se colocaron sobre placas de 2TY con la misma concentración de ampicilina. Entonces se incubaron las placas durante 12 horas a 37ºC. Los resultados se muestran en la tabla 1.

En conclusión, este experimento muestra que la sensibilidad a antibióticos puede probarse a microescala imprimiendo coágulos de agar que contienen un antibiótico sobre el sustrato poroso. La matriz viva según la presente invención permite la localización de efectores en puntos controlados o bien impresos directamente o incrustados en una matriz tal como agarosa de bajo punto de fusión dentro de los poros del sustrato poroso. La impresión del antibiótico directamente, o en agar, u otra matriz, puede permitir que se realice de modo simultáneo este ensayo de modo que pueden realizarse miles de ensayos por centímetro cuadrado de superficie de matriz con una precisión y carencia de contaminación cruzada imposible sobre vidrio u otras matrices planas.

Ejemplo 4 Atrapar las bacterias sobre la superficie de un sustrato sólido de flujo a través mediante filtración-detección y morfología de colonias

Se diluyeron células de E. coli XL2 blue MRF' que contenían el plásmido pGFPuv (Clontech/BD) y expresaban activamente GFP hasta 10^{3} bacterias/ml. Se colocó sustrato de flujo a través estéril en un filtro Nalgene de 0,22 \muM de poros, 10 cm de diámetro y se extendió medio sobre y a través del sustrato. Como control, se incubó sustrato con agitación en un volumen similar de medio con la misma densidad de bacterias. Entonces se incubó el sustrato sobre placas de agar L durante la noche y se usó GFP para visualizar las colonias.

Tal como se muestra en las figura 5A y 5B, se demostró la acumulación de bacterias. Además, pudieron detectarse micro-colonias que tenían menos de 100 \mum de diámetro sobre el sustrato (figura 5C y 5D); pudieron detectarse colonias bacterianas (figura 5C) con el mismo tamaño como un punto de oligonucleótido impreso (figura 5D).

En conclusión, se demostró la concentración de bacterias atrapándolas mediante filtración usando un sustrato de flujo a través apropiadamente fijado. En general, no se permite a los microorganismos penetrar en el agar u otra matriz debajo del sustrato. Esto es aplicable a aplicaciones tales como prueba de la calidad del agua, por ejemplo, una combinación de enriquecimiento de filtro y sobre un sustrato de matriz pinchado con medio de crecimiento selectivo o un agente de clasificación o captura adicional (por ejemplo, anticuerpo). Además, tal como se ha observado en otros experimentos, las colonias bacterianas se propagan menos sobre sustratos de flujo a través comparado con agar y pueden detectarse con el mismo tamaño como un punto de oligonucleótidos impreso. Estas dos últimas propiedades apoyan el uso del sustrato de flujo a través en aplicaciones de matriz viva de alta densidad.

Ejemplo 5 Uso de una máscara de superposición sobre el sustrato sólido de flujo a través-compartimentación y prueba de autofluorescencia

Tal como se demostró en los experimentos anteriores, el sustrato sólido de flujo a través tal como se usa en la presente invención, muestra una propagación relativamente baja de microorganismos sobre su superficie, sin embargo todavía puede ser deseable compartimentarlo adicionalmente para reacciones enzimáticas o microbiología distinta de aplicaciones de matriz células vivas.

Se pintó un sustrato sólido de flujo a través esterilizado con etanol con una variedad de compuestos para buscar un agente de máscara adecuado para compartimentar regiones del sustrato. Los criterios para un agente de máscara adecuado fueron (1) fácil de aplicar,(2) baja fluorescencia en los canales de Cy3, Cy5 y fluoresceína, (3) resistente a la esterilización por disolvente, (4) insoluble en agua y (5) que puede tanto bloquear los poros en el sustrato como prevenir la propagación microbiana dentro de zonas diferenciadas (véase la figura 3A). Se probó el candidato líder, una película de máscara de látex, de manera extensa para determinar su idoneidad en cuanto a esterilidad, resistencia al disolvente, autofluorescencia y facilidad de aplicación.

Se encontró que la película de máscara líquida de látex era una sustancia apropiada con baja fluorescencia tal como se vende por proveedores de la técnica. Talens Liquid Masking Film (052, Royal Talens, Apeldoorn, Holanda) era adecuada pero otros agentes de máscara pueden ser igualmente aplicables. Se aplicó el agente de máscara usando un pincel de pelo de marta número 1 esterilizado en etanol. Tras dejarlo secar durante 2 horas, se sumergieron muestras en etanol al 95%, metanol al 100%, isopropanol al 100%, SDS al 1% estéril, agua estéril o DMSO al 100% durante 10 minutos, luego se aclararon en agua estéril y se secaron. Entonces se evaluó el sustrato tratado para determinar la resistencia del fluido de máscara a disolventes, fluorescencia y esterilidad (véase la tabla 2). Un ejemplo de máscara se muestra en la figura 3B.

En conclusión, la superficie del sustrato de flujo a través puede compartimentarse para microorganismos usando un agente de máscara impreso que también vuelve al sustrato un material compuesto más robusto. Incluso tras condiciones que conducirían a un sobrecrecimiento sobre agar, la compartimentación es eficaz sobre el sustrato de flujo a través. La etapa de lavado tuvo un efecto moderado sobre la fluorescencia del agente de máscara pero no afectó a la esterilidad. El metanol y DMSO parecían ser los mejores agentes de lavado ya que dejaron el sustrato y el agente de máscara sin dañar y con baja autofluorescencia. Una vez seco, el agente de máscara fue extremadamente resistente a los disolventes probados. Se pretende que esta máscara compartimente la matriz viva, con un tipo de célula o analito diferente aplicado a cada compartimiento y es lo más aplicable al crecimiento sobre un sustrato sólido que es adecuado para aplicaciones bacterianas y fúngicas pero también puede usarse para reducir la propagación lateral de células de cultivo de tejido de mamífero o de otro tipo crecido en superficie.

Ejemplo 6 Zonas de máscara del sustrato de flujo a través-compartimentación para crecimiento bacteriano

Se esterilizó el sustrato de flujo a través, se colocó una máscara tal como anteriormente y se lavó en metanol al 100% antes de su uso. Entonces se colocó el sustrato sobre placas de agar L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina e IPTG 1 mM y o bien se cubrieron o bien se pincharon con E. coli XL2 blue MRF' que contenía plásmido pGFPuv (Clontech/BD Biosciences) que expresaban un GFP variante adecuada para bacterias. Se evaluaron el crecimiento y la fluorescencia tras incubación durante la noche a 37ºC.

Tal como se muestra en la figura 4A, se observó buen crecimiento en el caso de pinchado específico en compartimientos, se demostró buena contención de las bacterias sin propagación hacia compartimientos adyacentes (figuras 4B y 4C).

En conclusión, el crecimiento bacteriano puede compartimentarse eficazmente sin propagación entre compartimientos usando un agente de máscara. La impresión automatizada y la máscara pueden permitir una miniaturización adicional de este procedimiento.

Ejemplo 7 Uso de la expresión de GFP para monitorizar la sensibilidad a antibióticos sobre sustrato de flujo a través compartimentado

Se imprimieron compartimientos de sustrato de flujo a través en agarosa Metaphor al 1% que contenía varias concentraciones de kanamicina. Se tuvo cuidado para imprimir a una temperatura inferior a 60ºC y se imprimieron todas las muestras por triplicado. Se colocaron estos sustratos sobre placas de agar L que contenían 100 \mug/ml de ampicilina y se cubrieron con E. coli XL2 Blue que expresaba GFP. Se usó un microscopio equipado con una cámara Kappa para capturar imágenes, que se digitalizaron y cuantificaron para evaluar el efecto de kanamicina sobre el crecimiento bacteriano y la viabilidad.

Pudo detectarse claramente el efecto de la kanamicina sobre la viabilidad usando un notificador de GFP tal como se muestra en la figura 6.

En conclusión, este experimento demuestra el uso de un notificador fluorescente o sistema de lectura que se usa en matrices vivas sobre un sustrato de flujo a través.

Ejemplo 8 Transformación de plásmidos en E. coli sobre sustrato de flujo a través compartimentado

Se usaron dos métodos, el primero, (a) mezcla plásmido y E. coli inmediatamente antes de la aplicación a la matriz y el segundo, (b) mezcla los dos componentes sobre la propia matriz.

(A) se transformaron 10 ng de pGFPuv o pUC18 por separado en alícuotas de 10 \mul de células competentes (Stratageno XL2Blue MRF') mezclando simplemente los dos componentes, y estas mezclas se pincharon en alícuotas de 0,2 \mul (aprox.) en chips de flujo a través compartimentados que entonces se cultivaron sobre placas de agar L/ampicilina durante la noche.

(B) Se manchó ADN de pGFPuv (aprox. 0,2 \mul) sobre sustrato, luego se pincharon 0,5 \mul de células competentes unos segundos después. Entonces se colocó el sustrato y se incubó sobre placas de agar L/ampicilina durante la noche.

Tal como se muestra en las figuras 7A y 7B, pUC y pGFPuv pudo transformarse sobre sustrato compartimentado eficazmente tras una premezcla previa según el método A mencionado anteriormente. No se observó propagación hacia compartimientos adyacentes.

Tal como se muestra en la figura 7C, pGFPuv también pudo transformarse en E. coli mezclando los dos componentes sobre el sustrato según el método B mencionado anteriormente.

En conclusión, la compartimentación es eficaz incluso tras 48 horas (figura 7D) para contener el crecimiento de regiones inoculadas y evitar la contaminación cruzada. Estos datos sobre la transformación abren un camino para métodos de transformación que implican pinchar el ADN purificado seguido de la introducción de células directamente sobre el sustrato juntas en rápida sucesión o juntas para aplicaciones de matriz viva. Las bacterias pueden transformarse inmediatamente antes de imprimir o incluso sobre el chip con alta eficacia.

La incubación en frío de bacterias con ADN y choque térmico común en muchos protocolos de transformación también puede realizarse sobre el chip. Es potencialmente posible imprimir, por ejemplo, 96 tipos de células (por ejemplo E. coli con 96 inserciones de transposón diferentes) de un juego de placas de 96 pocillos con 96 plásmidos complementarios (u otro efector captado del sustrato) para miles de combinaciones de cepas y efectores usando esta metodología.

Ejemplo 9 Captura de anticuerpos de bacterias sobre sustrato de flujo a través

Se esterilizó con etanol sustrato de flujo a través sin tratar y luego se trató con alícuotas de fracción Ig de conejo anti-E. coli, preparadas mediante inoculación de un conejo con un extracto sonicado de la cepa C600 derivada de K12 de E. coli (de DAKOA/S Dinamarca, CATB0357, lote 090-101) o anticuerpo de control (anticuerpo M13 de Santa Cruz). Se incubaron estos portaobjetos en una cámara de humedad durante 2 horas y luego se secaron brevemente para inmovilizar los anticuerpos, se lavó y se incubó con 10 ml de caldo L con 10^{6} E. coli que expresaban GFP con agitación suave (o control de esterilidad, sin E. coli). Tras lavar los sustratos en caldo L se colocaron sobre placas de agar L y se contaron las colonias fluorescentes al día siguiente.

Como resultado, se observó una acumulación de bacterias específicas para el anticuerpo específico frente a E. coli tal como se muestra en la figura 8. Se observó una media de 214 colonias por sustrato (n = 2) con anticuerpo frente a E. coli y 71 con anticuerpo de control M13 (n = 2).

En conclusión, se demostró la captura de anticuerpo específico de células sobre el sustrato de flujo a través.

Ejemplo 10 Matrices de anticuerpos

Se pinchan anticuerpos frente a proteínas de choque térmico HSP90alfa, HSP90beta, PoliUBQ y beta-actina en un formato de matriz sobre un sustrato de óxido de aluminio (Anopore, Whatman) usando protocolos habituales. Se hacen crecer células Jurkat en condiciones habituales en una incubadora de CO_{2} hasta una densidad de 10^{6} células/ml. Se añaden 25 \mul de la suspensión de células a la matriz. Se elimina el medio de cultivo mediante succión a través de la matriz usando el equipo habitual, y se añaden 50 \mul de medio nuevo. Se incuban las células en condiciones estériles a 37ºC sobre el sustrato durante 24 h, o hasta que se alcanza una densidad de 10^{7} células/ml. Se eleva la temperatura hasta 43ºC durante 15 min. Se mantiene el control a 37ºC. Se elimina el medio de cultivo mediante succión a través de la matriz. Se lavan las células con 50 \mul de líquido de lavado. Tras la eliminación de este líquido mediante succión a través de la matriz, se añaden 25 \mul de tampón de lisis. Tras 15 min de lisis, se bombea el líquido dentro y fuera a través de la matriz durante 15 min con dos ciclos, de flujo de subida y bajada, por minuto. Se elimina el líquido mediante succión, se lava la matriz con 25 \mul de tampón de lavado, que se elimina mediante succión. Se añaden 20 \mul de una mezcla de anticuerpos anti-choque térmico (anti-HSP90alfa, anti-HSP90beta, anti-PoliUBQ y anti-beta-actina, todos marcados con fluoresceína), y se bombean a través de la matriz durante 15 minutes a dos ciclos por minuto. Se capturan imágenes cada dos minutos. En el caso de que el fondo sea demasiado alto, se elimina la disolución de anticuerpo de la matriz y se lava la matriz con tampón de lavado. Se toman imágenes. Se analizarán los datos utilizando software habitual.

Los anticuerpos pueden ser monoclonales, policlonales, anticuerpos de cadena única, parámetros mediante los cuales aquellos pinchados sobre el sustrato reconocen otro epítopo a parte de los añadidos para la detección de anticuerpos unidos.

Ejemplo 11 Inducción de isoenzima 1A de citocromo P450 (CYP1A)

Se modifica químicamente la etoxiresorufina con un agente reticulación y se pincha sobre un sustrato de óxido de aluminio usando tecnología de pinchado tal como se conoce bien en la técnica.

Se preparan Hepatocitos tal como se describió por van 't Hoen et al. (2000). P.A.Chr 't Hoen et al. Selective induction of cytochrome P450 3A1 by dexametason in cultured rat hepatocytes. Analysis with a novel reverse transcriptase polymerase chain reaction assay. Biochemical Pharmacology, Vol. 60 págs. 1509-1518 (2000). Se juzga la viabilidad mediante exclusión de azul de triptano. Se añaden 50 \mul de suspensión de células con una densidad de células de 80000 células/ml al sustrato. Se elimina el medio de cultivo mediante succión a través del sustrato usando un equipo habitual. Para permitir la adherencia, se cultivan inicialmente las células durante 3,5 h en DMEM que contiene el 10% de (v/V suero bovino fetal, 140 mU\cdotml^{-1} de insulina, L-glutamina 2 mM, 100 U\cdotml^{-1} de penicilina, y 100 microgramos\cdotml^{-1} de estreptomicina en una atmósfera humidificada con CO_{2} a 37ºC. A continuación, se extraen por lavado las células que no se adhieren extrayendo el medio por pipeteo. Se cambia el medio de incubación a DMEM libre de suero, que contiene el 0,2% (p/v) de BSA, 140 mU\cdotml^{-1} de insulina, L-glutamina 2 mM, 200 U\cdotml^{-1} de penicilina, y 200 microgramos\cdotml^{-1} de estreptomicina. Los hepatocitos formarán una capa confluente en un plazo de 1 día. Veinticuatro horas tras la aplicación de las células a la matriz, se elimina la mayoría del medio mediante succión, teniendo cuidado de no secar las células.

Se aplican benzo[a]pireno, dexametasona, fenobarbital, hexobarbital, debrisoquina, anilina, midazolam (concentración que oscila desde 1 hasta 100 \muM en DMSO) sobre ubicaciones específicas (en matriz) sobre la capa celular con piezotecnología de pinchado por chorro de tinta. Treinta minutos tras la aplicación de los inductores, se añaden 25 microlitros de medio de cultivo.

En puntos de tiempo diferentes, se elimina el medio mediante succión y se añaden 5 \mul de tampón de lisis. Se añaden dos \mul de una disolución de reacción y se lleva el lisado en la matriz. Se monitoriza el desarrollo de fluorescencia mediante liberación de resorufina en los poros usando el equipo habitual, y capturando imágenes cada 10 seg.

Estos compuestos inducen isoenzimas diferentes de citocromo c. Algunos son muy activos para convertir etoxiresorufina, otros apenas lo son y otros no lo son en absoluto. Mediante lisis, debe difundirse cyt P450 hacia fuera de la célula, pero esto puede ser difícil ya que es una enzima unida a la membrana que puede necesitar coenzimas y cofactores.

Alternativamente, puede no ser necesario acoplar etoxiresorufina al sustrato, la adición y captación por las células puede permitir la monitorización de la actividad in situ, antes de que difunda hacia fuera.

Durante esta reacción enzimática no se realiza bombeo para evitar que el producto difunda hacia fuera del sitio de reacción.

Ejemplo 12 Crecimiento de un hongo filamentoso sobre un sustrato de flujo a través

Se colocó sobre placas un hongo de la especie Penicillium aislado de un pan de añejo sobre un sustrato de flujo a través (óxido de aluminio; Anopore; Whatman) sobre agar L y se incubó en una cámara de humedad durante 3 días a temperatura ambiente.

Se obtuvo un crecimiento rápido y bueno tal como se muestra en las figuras 9A, 9B y 9C.

Este experimento demuestra que el crecimiento fúngico es posible sobre el sustrato de flujo a través, un intervalo similar de aplicaciones puede ser posible en chips vivos tales como para microorganismos procariotas.

Ejemplo 13 Principios de captura de anticuerpos y detección sobre chip basada en sensibilidad al detergente, actividad enzimática y una inserción de transposón en un entorno de diagnóstico, clasificación de cepas para un patógeno bacteriano

Se ilustran los principios de captura de anticuerpos y detección sobre chip basada en sensibilidad al detergente, actividad enzimática y una inserción de transposón en un entorno de diagnóstico, clasificación de cepas para un patógeno bacteriano. En este análisis, se obtiene una gran cantidad de información sólo a partir de una matriz de 5 manchas. El experimento asume una mezcla de nueve cepas bacterianas obtenidas de un paciente (tabla 3) y un formato de matriz de anticuerpos de cinco manchas que representa anticuerpos frente a los antígenos A, B, C, D, E respectivamente (figura 10); la mancha E es una mancha de control negativo.

Se hace pasar una muestra compleja de bacterias patogénicas de un paciente a través de dos matrices idénticas, tal como se describe en la figura 10-matriz 1A. La inclusión esperada de cada tipo de cepa a la matriz, basándose en los antígenos de superficie A a D capturado por anticuerpos específicos, se muestra en la figura 10-matriz 1B. Los números en cada mancha indican las cepas incluidas en cada posición sobre la matriz.

Entonces se coloca la primera matriz sobre un medio de agar no selectivo sobre el cual todas las cepas deben crecer. Se coloca la segunda matriz sobre placas sobre un medio selectivo que contiene un detergente que inhibe el crecimiento de cepas sensibles al detergente. Los patrones de crecimiento esperados (qué manchas se vuelven colonias a partir de nutrientes que difunden hacia arriba a través del sustrato de Pam poroso) se muestran en la figura 10-matrices 1C y 1D.

Ahora se colocan las matrices 1C y 1D sobre placas sobre otro medio que contiene un sustrato fluorogénico para la enzima de interés. Las colonias que se prevé que se vuelvan fluorescentes debido a la actividad enzimática se muestran en la figura 10-matrices 1E y 1F. Esto requiere la captura de la cepa apropiada, crecimiento sobre un medio selectivo y producción de la enzima en cuestión.

Entonces se retiran las matrices del agar selectivo, y se lisan las células sobre la matriz in situ, se reticula su ADN al sustrato. Entonces, se realiza la hibridación de ácido nucleico habitual, usando la funcionalidad de la matriz de paso a través como una matriz de hibridación rápida, con un oligonucleótido marcado que detecta el transposón X mediante hibridación específica. Los resultados esperados se muestran en la figura 10-matrices 1G y 1H. Ahora, solamente se detectan las cepas que se capturan por un anticuerpo específico, que pueden crecer en el medio usado y contienen la secuencia de transposón.

Este sistema de matriz da una gran flexibilidad y la posibilidad de combinar muchos ensayos diferentes hacia análisis complejos de múltiples parámetros simultáneamente.

TABLA 1 Sensibilidad de E. coli XL2 Blue MRF' frente al antibiótico kanamicina cuando se cultiva sobre el sustrato de Pam

Kanamicina (ng)	Zona de aclaramiento (diámetro mm)	Replicados (N)	Desviación estándar
Nada	0	12	na
10	0,4	12	0,3
100	2,1	16	0,3
1000	3,5	12	0,3

TABLA 2 Efecto del tratamiento de lavado sobre el agente de máscara aplicado al sustrato de Pam

Tratamiento				Resistencia al disolvente	Esterilidad
	Flu	Cy3	Cy5
Etanol	+	+	+/-	Buena	Sí
Metanol	+/-	+/-	-	Buena	Sí
DMSO	+/-	+/-	-	Buena	Sí

TABLA 2 (continuación)

Tratamiento				Resistencia al disolvente	Esterilidad
Agua	+	++	+/-	Buena	Sí
SDS	+	+	+/-	Buena	Sí
Isopropanol	+	+	+/-	Buena	Sí

Fluorescencia: evaluada usando un microscopio Olympus BX41 UV. ++ autofluorescencia inaceptablemente elevada (saturación por debajo de 98 ms de exposición), + satura la cámara 12-bit Kappa CCD entre 98 y 200 ms de exposición, +/- satura la cámara CCD entre 200 ms y 1 segundo. - satura la cámara CCD por encima de 1 segundo de exposición.

Resistencia al disolvente: evaluada usando un microscopio de luz usando una cámara BX41, evaluada basándose en la resistencia del agente de máscara al tratamiento de lavado.

Esterilidad: evaluada colocando el sustrato sobre placas de agar L a 37ºC durante la noche. Estéril indica sin colonias sobre la superficie del sustrato.

TABLA 3 Nueve cepas bacterianas en una muestra de paciente tal como se usan en el ejemplo 13. Sólo las cepas 4 y 5 tienen transposón X insertado en su genoma

Nº de cepa	Actividad enzimática	Antígeno de superficie	Sensibilidad al detergente
1	Positiva	A y B	Sensible
2	Positiva	A y B	Insensible
3	Positiva	A y C	Sensible
4	Positiva	A y C	Insensible
5	Negativa	A y B	Sensible
6	Negativa	A y B	Insensible
7	Negativa	A y C	Sensible
8	Negativa	A y C	Insensible
9	Positiva	D	Insensible

Claims (31)

1. Un método para la búsqueda de respuestas celulares de componentes celulares que comprende:

(a) proporcionar componentes celulares que se seleccionan del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, sobre la superficie de un sustrato de óxido metálico poroso sólido, en el que

(i)

dicho sustrato poroso sólido tiene canales de paso a través orientados;

(ii)

dicho sustrato poroso sólido retiene dichos componentes celulares sobre su superficie, y en el que,

(iii)

dicho sustrato poroso sólido tiene inmovilizada en el mismo, dentro de los poros, una matriz de moléculas de detección;

(b) administrar compuestos de prueba a posiciones sobre el sustrato que corresponden a las moléculas de detección en matriz sobre la superficie de dicho sustrato poroso sólido;

(c) incubar dichos compuestos de prueba con dichos componentes celulares sobre la superficie del sustrato poroso sólido, en condiciones que permiten la inducción de respuestas celulares;

(d) someter a ensayo dichas respuestas celulares;

e identificar y caracterizar las respuestas celulares inducidas por dichos compuestos de prueba.

2. Método según la reivindicación 1, en el que dicho sustrato sólido es un sustrato de flujo a través poroso sólido.

3. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 2, en el que dicha provisión de componentes celulares sobre la superficie de un sustrato se realiza mediante un depósito directo sobre dicho sustrato de un inóculo o un cultivo.

4. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, en el que dicha administración de compuestos de prueba se realiza mediante medios de fuerza de contacto.

5. Método según la reivindicación 4, en el que dicha fuerza de contacto es una fuerza capilar o una fuerza piezoeléctrica.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el(los) nutriente(s) se proporcionan desde debajo de los poros de la superficie sólida.

7. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicho ensayo de las respuestas celulares se realiza:

(a) proporcionando un agente de detección a los componentes celulares;

(b) eliminando mediante lavado el exceso de agente de detección no incorporado;

(c) detectando la presencia o ausencia de un cambio en una señal detectable, indicando la presencia de un cambio en una señal detectable una respuesta celular.

8. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que se somete a ensayo dicha respuesta celular en medio de cultivo celular o caldo completo, en células aisladas tales como células sedimentadas, en sobrenadante de los componentes celulares, o en lisado de los componentes celulares.

9. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicha administración de los compuestos de prueba se realiza mediante un medio seleccionado del grupo que comprende una máscara de administración, un pipeteador x-y-z de alta precisión, una impresora de chorro de tinta y un manejo manual.

10. Método según la reivindicación 9, en el que dicha administración de los compuestos de prueba se realiza por medio de un pipeteador x-y-z de alta precisión o impresora de chorro de tinta.

11. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que dicha identificación de las respuestas celulares se realiza mediante luminiscencia.

12. Método según la reivindicación 11, en el que dicha luminiscencia es fluorescencia.

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13. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que dichas moléculas de detección se seleccionan del grupo que comprende ácidos nucleicos incluyendo análogos modificados de los mismos, péptidos, proteínas, y anticuerpos incluyendo fragmentos de anticuerpos, sustratos de enzimas y colorantes específicos.

14. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que dichas respuestas celulares se seleccionan del grupo que comprende acontecimientos fisiológicos o químicamente inducidos en la célula incluyendo lisis, apoptosis, inhibición del crecimiento, y promoción del crecimiento; producción, secreción, y exposición de la superficie de una proteína u otra molécula de interés por la célula; activación de molécula de la superficie de la membrana incluyendo activación de receptor; transportes de iones trans-membrana; y regulaciones transcripcionales.

15. Método según la reivindicación 14, en el que dicha molécula de interés se selecciona del grupo que comprende péptidos incluyendo lipopéptidos, péptidos glucosilados y péptidos antimicrobianos, polipéptidos, proteínas, enzimas, moléculas antimicrobianas, metabolitos primarios y secundarios, y moléculas orgánicas pequeñas incluyendo moléculas farmacéuticas.

16. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 15, en el que dicho compuesto de prueba es un fármaco o cualquier compuesto que es útil en el procedimiento de selección de un candidato a fármaco.

17. Método según la reivindicación 16, en el que dicho compuesto de prueba es un fármaco seleccionado de una biblioteca fármacos candidatos naturales o químicos.

18. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 17, en el que dicho sustrato sólido es un sustrato de óxido de aluminio.

19. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 18, en el que dicho ensayo se realiza en tiempo real.

20. Método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en el que dicho ensayo es un ensayo de punto final.

21. Método según la reivindicación 7, en el que dicha provisión de un agente de detección a los componentes celulares se produce antes de administrar el compuesto de prueba proporcionando así componentes celulares marcados previamente.

22. Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para monitorizar respuestas celulares inducidas de células huésped.

23. Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para recombinación, transformación, o introducción vírica sobre chip de componentes celulares.

24. Uso de un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, para la búsqueda funcional de respuestas celulares al someter a ensayo células huésped con compuestos de prueba.

25. Una micromatriz, que comprende un sustrato de óxido metálico poroso sólido con canales de paso a través orientados y una matriz de moléculas de detección dentro de los poros de dicho sustrato, para realizar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que se proporciona una matriz de compuestos de prueba dentro de regiones predefinidas, dichos compuestos de prueba están en disolución líquida y no inmovilizada en el sustrato.

26. Una micromatriz, que comprende un sustrato de óxido metálico poroso sólido con canales de paso a través orientados y una matriz de moléculas de detección dentro de los poros de dicho sustrato, para realizar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que se proporciona una matriz de componentes celulares que se seleccionan del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, en regiones predefinidas sobre un sustrato, estando dichos componentes celulares condicionados para su conservación sobre dicho sustrato.

27. Una micromatriz, que comprende un sustrato de óxido metálico poroso sólido con canales de paso orientados y una matriz de moléculas de detección dentro de los poros de dicho sustrato, para realizar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, en el que se proporciona un componente celular que se selecciona del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insecto, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, sobre un sustrato, estando dicho componente celular condicionado para su conservación sobre dicho sustrato.

28. Micromatriz según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 27, en la que dicha matriz de moléculas de detección comprende una pluralidad de moléculas de detección iguales o una pluralidad de moléculas de detección diferentes.

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29. Micromatriz según la reivindicación 26 ó 27, en la que dicha condición se selecciona del grupo que comprende liofilización y disolución en glicerol.

30. Uso de una micromatriz según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29, para proporcionar componentes celulares que se seleccionan del grupo que comprende vesículas, orgánulos, vectores, virus y células viables intactas completas, células de mamífero, células de insectos, células de levadura, células fúngicas, células de plantas y células microbianas incluyendo células procariotas, células bacterianas, micoplasmas, secciones de tejido, células fijadas y organismos multicelulares microscópicos incluyendo nematodos y pez cebra, sobre la superficie de un sustrato para su uso en un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, proporcionando así dichos componentes celulares con propiedades de baja propagación.

31. Un kit para realizar un método según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 21, que comprende una micromatriz según cualquiera de las reivindicaciones 25 a 29.