CN108913750B - 一种利用单个细胞代谢速率指标评价水质的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种利用单个细胞代谢速率指标评价水质的方法。本方法通过Biolog EcoPlateTM检测河流生态***中微生物的代谢特征，使用流式细胞仪检测水样生物量，通过以上数据拟合成单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)，使该指标反映营养水平与异生物质的共同影响，达到指示水质变化的效果。

Description

一种利用单个细胞代谢速率指标评价水质的方法
技术领域：
本发明属于污水处理技术领域，具体涉及一种利用单个细胞代谢速率指标评价水质的方法。
背景技术：
传统的水质状况评价主要以包括各污染物浓度在内的物理化学指标为基础，通过对这些指标的定性或者定量分析对河流***所处的污染状态进行评价，这类指标可以测出环境中某一些或者某一类污染物质的浓度含量，并且监测结果十分精确，但是不能够准确区分不同性质污染物的总和污染效应，也不能够直接反映出各类外源污染输入对生态***中生物的影响。
由于微生物能对外界环境压力作出迅速而灵敏的反应，因此，长期以来，研究学者们一直致力于探索利用微生物指标评价水质的可行性，将水体污染所造成的微生物群落结构组成及功能的变化进行量化，并试图建立其与外界环境变化间的相关关系，从而利用微生物有效地评价和监测水污染状况。例如：污水排放会增加微生物的***发育多样性及代谢能力；棕榈油厂废水排放会使下游受体河水中低核酸含量细菌与高核酸含量细菌的比值降低；人类活动的干扰会提高微生物群落的BGN/β值，该指标是通过拟杆菌(Bacteroidetes)、γ变形菌(Gammaproteobacteria)和硝化螺菌(Nitrospira)与β变形菌(Betaproteobacteria)这四类河流微生物中常见的菌门的丰度计算得到；还有研究使用低核酸细菌至高核酸细菌的转变反映河流污染水平。而这些指标未能准确而综合地评价水体污染水平，尤其是营养水平与异生物质的共同作用。
本发明提供一种利用单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)评价水质的方法。通过Biolog EcoPlateTM检测河流生态***中微生物的代谢特征，使用流式细胞仪检测水样生物量，通过以上数据拟合成单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)，使该指标反映营养水平与异生物质的共同影响，达到指示水质变化的效果。
发明内容:
为了实现上述目的，本发明将提供一种利用单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数，NOM，metabolic index)评价水质的方法。该方法利用水质样品中细菌代谢速率及细菌生物量计算的单个细菌代谢速率作为天然有机物代谢指数，以此来指示水体中的TP与修正后的DOC比值，进而表明水质富营养化与异生物质共同影响作用，达到指示水质变化的效果。该指数为新型水质微生物指标，与水体中微生物变化密切相关，进而能通过水体中微生物变化来综合指示水质变化。根据已有试验数据及实施例证明，该指数为水质综合指标。
所述方法包括下述步骤：
(1)对水质样品进行细菌生物量检测：
①将待检测水质样品染色：用无水二甲基亚砜将
Figure BDA0001663429400000021
Green I稀释100倍配置染料，每100μL待检测水质样品加入10μL染料，并于常温、避光条件下染色15分钟；
②染色后，将样品用无菌TE缓冲液稀释10倍，每份检测样品加入等量的荧光微球用于定量收集荧光信号；
③采用流式细胞仪检测样品中的生物量；
所述TE缓冲液稀释组成为：10mM Tris-HCl，pH 8.0；1mM EDTA，pH 8.0；(2)水体细菌代谢特征分析
采用Biolog EcoPlateTM检测样品细菌代谢速率：在96孔EcoPlate的每个培养孔内加入150μL待检测水质样品，并置于30℃培养箱内连续培养7天；培养过程中每隔24h用多功能酶标仪分别于590nm和750nm检测每个培养孔的色度和浊度，细菌群落对不同碳源代谢的总体情况及代谢活性用每孔平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)表示，具体计算过程如下：
AWCD＝∑(C590-750-R590-750)i/31
其中，C590-750表示每种碳源3个平行培养孔中590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值，R表示三个对照孔590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值；i表示1-31；与对照孔吸光值相减得负值的反应孔，在统计分析时其校正吸光值定为零；根据不同时段计算的AWCD值绘制时间成长曲线，将该曲线的最大斜率定义为代谢速率，该代谢速率表示为总细菌代谢速率；
(3)单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)
总细菌代谢速率与步骤(1)获得的样品生物量(细菌个数)比值即为单个细菌代谢速率，也即天然有机物代谢指数；
当天然有机物代谢指数≥3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较小，水质综合指标正常，水体无明显污染；当天然有机物代谢指数<3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较大，水质综合指标异常，水体出现污染。
所述Biolog EcoPlateTM为96微孔板，每块板含有3组平行，每组含有一个对照孔及31种不同碳源反应孔，孔内装有四唑紫染料，细菌代谢过程中发生氧化还原反应，电子转移引起四唑紫染料变色，通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量和分析，可以获取细菌对不同碳底物的代谢模式。
有益效果：
一般的理化水质指标只能检测环境中某类或某些污染物质的浓度含量，但是不能够准确区分不同性质污染物的总和污染效应，也不能够直接反映出各类外源污染输入对生态***中生物的影响。本发明所提出的单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)是一种微生物指标，通过检测细菌对外界环境压力作出的灵敏反应而拟合成的一种综合性指标。当天然有机物代谢指数≥3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较小，水质综合指标正常，水体无明显污染；当天然有机物代谢指数<3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较大，水质综合指标异常，水体出现污染。
附图说明：
图1实施例2高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)水质情况；
图2实施例2高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)生物量情况；
图3实施例2高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)的各样品整体代谢速率；
图4实施例2中6月潮白河采样点氮磷比；
图5实施例2单个细菌代谢速率指示营养水平与异生物质对水体共同影响的关系图；
图6实施例3高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)水质情况；
图7实施例3高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)生物量情况；
图8实施例3高山区(MA)、城市区(UA)及农田区(AA)的各样品整体代谢速率；
图9实施例3中9月潮白河采样点氮磷比；
图10实施例3单个细菌代谢速率指示营养水平与异生物质对水体共同影响的关系图。
具体实施方式：
下面参照具体的实施例进一步描述本发明，但是本领域技术人员应该理解，本发明并不限于这些具体的实施例。
下述实施例中的方法，如无特别说明，均为常规方法，其中所用的试剂，如无特别说明，均为常规市售试剂。
实施例1、本发明所用样品采集及水质测定方法
1.1样品采集
选取中国海河水系中的潮白河(北纬39°至40°，东经116°至117°)流域为研究对象。于2017年6月(夏季)在潮白河流域进行采样。参考之前对于潮白河流域的研究，一共选择了22个采样点，采样点均位于潮白河的主河道及重要支流汇入口，分别为5个高山区、6个城市区及11个农田区样点。总共有25个样品。
1.2样品物理化学分析
潮白河水质的基础理化指标的分析方法，主要参考中华人民共和国国家标准及《水和废水监测分析方法(第三版)》，方法和主要仪器设备如表1所示。
表1潮白河水质监测的方法及仪器设备
Figure BDA0001663429400000041
注：所有的化学指标检测结果取三次检测结果的平均值。
1.3细菌生物量检测
细菌生物量每次测量取4次平行实验的平均值。用无水二甲基亚砜将
Figure BDA0001663429400000042
Green I稀释100倍配置染料，每100μL待测水质样品加入10μL染料，并于在常温、避光条件下染色15分钟。所有的样品均用无菌的TE缓冲液(10mM Tris-HCl,pH 8.0；1mM EDTA,pH8.0)稀释10倍。每份待检测样品加入等量的荧光微球(BD公司)用于定量收集荧光信号。样品用流式细胞仪进行检测生物量。
1.4水体细菌代谢特征分析
Biolog EcoPlateTM被用于检测河流生态***中微生物的代谢特征。EcoPlateTM为96微孔板，每块板含有3组平行，每组含有一个对照孔A1(A5，A9)及31种不同碳源反应孔，每种碳源测试有三组平行。孔内装有四唑紫染料，微生物代谢过程中发生氧化还原反应，电子转移引起四唑紫染料变色，通过对孔中颜色变化的光吸收值的测量和分析，可以获取微生物对不同碳底物的代谢模式。本发明通过运用该体系检测每个季节每个样品微生物的代谢模式。
在EcoPlateTM的每个培养孔内加入150μL待检测水质样品，并置于30℃培养箱内连续培养7天。培养过程中每隔24h用SPARK 10-M多功能酶标仪分别于590nm和750nm检测每个培养孔的色度和浊度。微生物群落对不同碳源代谢的总体情况及代谢活性用每孔平均颜色变化率(Average well color development，AWCD)表示，具体计算过程如下：
AWCD＝∑(C590-750-R590-750)i/31
其中，其中，C590-750表示每种碳源3个平行培养孔中590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值，R表示三个对照孔590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值；i表示1-31种碳源；与对照孔吸光值相减得负值的反应孔，在统计分析时其校正吸光值定为零。根据不同时段计算的AWCD值绘制时间成长曲线，将该曲线的最大斜率定义为代谢速率，该代谢速率表示为总细菌代谢速率，总细菌代谢速率与上述各个采样点生物量(细菌个数)比值即为单个细菌代谢速率，也即天然有机物代谢指数。
1.5相关性分析方法
采用非参数检验的统计方法检验潮白河水质是否和本专利的天然有机物代谢指数成显著差异(p<0.05)。数据的统计分析通过IBM SPSS Statistics 22和PAST软件进行。对于组间显著性差异结果，*代表差异显著度p<0.05，**代表p<0.01，***代表p<0.001。
实施例2运用单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)评价水质
2.1高山区、城市区和农田区河水理化指标
如实施例1中所述，进行了夏季采样，夏季(6月)平均水温分别为28.6℃，水质情况示意图见图1。总体来看，高山区的TN、TP和DOC浓度均低于城市区和农田区。城市区DOC浓度显著高于其他两区，农田区TP浓度较高。
2.2高山区、城市区和农田区微生物生物量
从图2中生物量结果来看，生物量存在极其显著的差异(p<0.001)。由于高山区的营养水平较低，其生物量也显著低于城市区和农田区。不过，虽然农田区的营养水平与城市区相近，但因为在该区域施用的农药会对微生物造成危害，所以该区域的总生物量并没有城市区高。
其中，每个采样点生物量如表2所示。
表2各采样点生物量
Figure BDA0001663429400000061
注：M表示高山区，U表示城市区，A表示农田区
2.3高山区、城市区和农田区微生物代谢情况
细菌主要利用天然有机物进行生长，由此我们利用Biolog EcoPlatesTM中31种不同的天然有机物底物来检测样品中细菌的代谢。Biolog EcoPlatesTM的平均AWCD值用来表示细菌的平均代谢水平。根据样品对底物利用的AWCD曲线计算每个样品的代谢速率(图3)，结果表明三区样品的代谢速率有显著差别，城市和农田区域细菌代谢速率显著高于山区，表明人类活动会加快水体细菌对天然有机物的代谢速率。
其中，每个采样点样品总体代谢速率如表3所示。
表3采样点样品总体代谢速率
Figure BDA0001663429400000062
Figure BDA0001663429400000071
注：M表示高山区，U表示城市区，A表示农田区
2.4单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)
将表3所示的各个采样点的总细菌代谢速率除以表2所示对应采样点的生物量，即得各个采样点的单个细菌代谢速率，也即天然有机物代谢指数(见图5横坐标)。
2.5对本发明评价方法有效性的检测
营养元素的排放会增加微生物的生物量和代谢速率，而大多数异生物质则会对微生物有一定毒害作用，为了利用微生物指标评价营养元素和异生物质对生态***的共同影响，我们采用了一个新的指标：天然有机物代谢指数(NOM metabolic index)，即单个细胞对天然有机物的代谢速率。
用TP浓度与校正后的DOC(溶解性有机碳)浓度的比值来反映水体中营养元素与异生物质的共同作用。校正后的DOC浓度通过各个样品的DOC浓度减去各季度对应MA区域的DOC浓度最低值(6月DOC浓度最低值为1.60mg/L)计算，其用来反映环境中异生物质的水平。用TP浓度来反映营养水平是因为研究区域的氮磷比远远超过正常值(图4)，氮磷比较高的情况下磷才是限制微生物生长的主要因素。所以我们用TP浓度与校正后的DOC浓度的比值来表示营养水平与异生物质的共同作用。
将2.4所得天然有机物代谢指数NOM与TP浓度和校正后DOC浓度的比值进行线性拟合，线性拟合结果表明天然有机物代谢指数与营养水平和异生物质的共同影响间存在明显正相关(R2＝0.706,p<0.001)(图5所示，横坐标为本发明所得天然有机物代谢指数，纵坐标为TP浓度和DOC浓度的比值)。
由此，表明本发明所述的天然机物代谢指数能够对水质的营养水平及异生物质起到良好的指示效果，也就意味着通过天然有机物代谢指数能够对水质的进行有效的判断。
通过以上分析，初步确立天然机物代谢指数的阈值：当天然有机物代谢指数≥3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较小，水质综合指标正常，水体无明显污染；当天然有机物代谢指数<3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较大，水质综合指标异常，水体出现污染。
实施例3运用单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)评价水质
通过实例2验证提出的天然有机物代谢指数阈值的准确性和普适性，将单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)应用到实际水体的水质评价中去。3.1高山区、城市区和农田区河水理化指标
于2017年9月再次在实例2中相同的采样点采样，进行水质样品分析。其中，城市区和农田区的氮磷浓度限值均超出了V类水范围。高山区水质较好，而城市区、农田区受人类活动影响，水质较差。水质情况示意图见图6，氮磷比见图9。
3.2高山区、城市区和农田区微生物生物量
从图7中生物量结果来看，生物量存在极其显著的差异(p<0.001)。同实例2中各区生物量趋势相同。高山区生物量显著低于城市区和农田区，农田区的的总生物量没有城市区高。
其中，每个采样点生物量如表4所示。
表4各采样点生物量
Figure BDA0001663429400000081
注：M表示高山区，U表示城市区，A表示农田区
3.3高山区、城市区和农田区微生物代谢情况
利用Biolog EcoPlatesTM检测样品中细菌的代谢。根据样品对底物利用的AWCD曲线计算每个样品的代谢速率(图8)，结果表明三区样品的代谢速率有显著差别，城市和农田区域细菌代谢速率显著高于山区。
其中，每个采样点样品总体代谢速率如表5所示。
表5采样点样品总体代谢速率
Figure BDA0001663429400000091
注：M表示高山区，U表示城市区，A表示农田区
3.4单个细胞代谢速率指标(天然有机物代谢指数)
将表5所示的各个采样点的总细菌代谢速率除以表4所示对应采样点的生物量，即得各个采样点的单个细菌代谢速率，也即天然有机物代谢指数(见图10横坐标)。
3.5对本发明评价方法阈值准确性和普适性检测
将3.4所得天然有机物代谢指数与TP浓度和校正后DOC浓度的比值进行线性拟合，线性拟合结果表明天然有机物代谢指数与营养水平和异生物质的共同影响间存在明显正相关(R2＝0.638,p<0.001)(图10所示，横坐标为本发明所得天然有机物代谢指数，纵坐标为TP浓度和DOC浓度的比值)。由此，表明本发明所述的天然机物代谢指数能够对水质的营养水平及异生物质起到良好的指示效果，也就意味着通过天然有机物代谢指数能够对水质的进行有效的判断。此外，通过实例2所给出的天然有机物代谢指数阈值，我们通过天然有机物代谢指数阈值来判定水质状况，如表6所示。
从表中各项水质指标可以明显看出，由于受到人类活动影响，从而导致水体污染的采样点A1～A11、U1～U6的氮磷含量严重超标，且DOC偏高。且天然有机物代谢指数均小于3.5E-10。而潮白河远离人类活动影响的高山区样点M1～M5的水质指标明显好于其他两个区域，水体无明显污染情况，且NOM指数均大于3.5E-10。由此可以证明，本专利所提出的天然有机物代谢指数具有良好的水质指示作用，作为水质综合指标能够全面的评估水质情况。
表6
Figure BDA0001663429400000101
应该理解，尽管参考其示例性的实施方案，已经对本发明进行具体地显示和描述，但是本领域的普通技术人员应该理解，在不背离由权利要求书所定义的本发明的精神和范围的条件下，可以在其中进行各种形式和细节的变化，可以进行各种实施方案的任意组合。

Claims (1)

1.一种利用单个细胞代谢速率指标评价水质的方法，其特征在于，所述方法包括下述步骤：
（1）对水质样品进行细菌生物量检测，确定待测样品中的细菌个数；
（2）水体细菌代谢特征分析
采用Biolog EcoPlate™检测样品细菌代谢速率：在96孔EcoPlate 的每个培养孔内加入150μL待检测水质样品，孔内装有四唑紫染料，并置于30℃培养箱内连续培养7天；培养过程中每隔24h分别于590nm和750nm检测每个培养孔的色度和浊度，根据以下公式计算AWCD：
AWCD＝∑（C590-750-R590-750）i／31
其中，C590-750表示每种碳源3个培养孔中590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值，R表示三个对照孔590nm处吸光值与750nm处的吸光值差的均值；i表示1-31；与对照孔吸光值相减得负值的反应孔，在统计分析时其校正吸光值定为零；
根据不同时段计算的AWCD值绘制时间成长曲线，将该曲线的最大斜率定义为代谢速率，该代谢速率表示为总细菌代谢速率；
（3）单个细胞代谢速率指标，即天然有机物代谢指数
步骤（2）总细菌代谢速率与步骤（1）获得的样品生物量比值即为单个细菌代谢速率，也即天然有机物代谢指数；
天然有机物代谢指数≥3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较小，水质综合指标正常，水体无明显污染；天然有机物代谢指数<3.5E-10时，表示水体受到人为活动影响较大，水质综合指标异常，水体出现污染；
水体生物量检测的方法为：
①将待检测水质样品染色：用无水二甲基亚砜将SYBR® Green I稀释100倍配制染料，每100μL待检测水质样品加入10μL染料，并于常温、避光条件下染色15分钟；
②染色后，将样品用无菌TE缓冲液稀释10倍，每份检测样品加入等量的荧光微球用于定量收集荧光信号；
③采用流式细胞仪检测样品中的生物量；
所述TE缓冲液稀释组成为：10 mM Tris-HCl，pH 8.0；1 mM EDTA，pH 8.0；
所述Biolog EcoPlate™为96微孔板，每块板含有3组平行，每组含有一个对照孔及31种不同碳源反应孔，孔内装有四唑紫染料。
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CN104316572A (zh) * 2014-11-12 2015-01-28 中国科学院城市环境研究所 一种快速简便评价水源水和饮用水微生物污染风险的方法

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