CN101748184A - 合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法。采集获得的活性污泥，经过驯化后接入到合成油和植物基润滑油降解培养基中，经过7天连续恒温摇床培养，测定降解培养基中的微生物菌液生物量和液相培养基中的润滑油有机物残留量作为评定合成油和植物基润滑油生物降解率的评定方法和标准。本发明是一种操作简便、数据再现性和重复性稳定的合成油和植物基润滑油生物降解评定方法，适用于各种规格和粘度级别的可生物降解润滑油。该方法应用到蓖麻基全合成高性能润滑油产品的生物降解测试试验中，并以文献报道中生物降解率在96％左右的蓖麻油作为参比油，测得的蓖麻油生物降解率为97％，蓖麻基全合成高性能润滑油的生物降解率达到了85％。

Description

合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法
【技术领域】
本发明涉及生物降解润滑油的评价方法，特别是一种合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法。
【背景技术】
目前，世界上许多国家都已经开始了生物降解性润滑油的研制和使用，因此同时也就会有相应的生物降解性能标准的建立，各国的润滑油生物降解能力标准必须按照各国的社会现状而定。测定润滑油产品的生物降解方法主要有：一是通过测定氧的消耗和二氧化碳的生成，来评定生物降解率；二是通过测定润滑油经过微生物培养过后的残留量，来评定其生物降解率。这两个方法是目前应用最多的试验方法原理。根据这两种方法，分别制定了应用比较广泛的OECD 301B和CEC L-33-A-93法。OECD 301B方法操作繁琐，将会导致在实验过程中的人为误差影响大，影响试验结果的重复性和再现性，但是实验结果能切实反应试验样品的生物降解要求，最终产物为二氧化碳，对环境没有二次污染，这就造成对试验样品要求的苛刻；CEC L-33-A-93方法操作简便，采用红外光谱法测定润滑油在经过培养过后的残留量，该方法的可靠性、重复性和再现性相比较其他方法要好，因而得以普遍接受和使用。该方法通常适用于液压油及低粘度润滑油的生物降解评定试验，对于其他粘度较高的润滑油来说，由于在水质液相中的影响，其培养过程中的油水分散性能下降，后续培养液处理过程中油水难于分离等，都会导致试验结果不稳定，误差较大，有时可高达60％，甚至是完全失败。
【发明内容】
本发明的目的在于提供一种合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法，可以克服现有技术的缺陷。根据合成油和植物油基润滑油配方的特定的组成部分能被微生物利用这一特性，通过采集获得的活性污泥，经过驯化后接入到合成油和植物油基润滑油降解培养基中，经过培养，测定降解培养基中的微生物菌液生物量和液相培养基中的润滑油有机物残留量作为评定合成油和植物油基润滑油生物降解率的评定方法和标准。本发明操作简便，数据再现性和重复性稳定可靠，成本低廉，适用于各种规格和粘度级别的可生物降解润滑油。具有广泛应用前景。
本发明提供的合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法包括的步骤：
1)目的菌种的驯化：采集来自污水处理厂的活性污泥，经过24～48小时曝气处理后，溶解于无菌水中，搅拌，得到菌悬液，吸取菌悬液于液体驯化培养基中，置于26～28℃恒温箱中于180～200r/min下避光振荡培养3～5天，待培养基变混浊后吸取该菌液反复接种于相同的驯化培养基中，每次接种量为5mL/100mL培养基。按照上述培养条件进行培养。驯化后的优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等好气异养型细菌。
驯化培养基：KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO4 0.7g；酵母粉0.01g；蓖麻基润滑油2g；自来水1000mL；调节pH为7.2-7.6
2)种子培养生长曲线的确定：将驯化后生长比较旺盛的菌种，采用可见分光光度计在660nm波长下测定混合菌液OD(吸光度)值，绘制生物降解混合菌液的生长曲线，选择对数生长期活跃的新生代菌液接种于降解培养基中的时间。
种子培养基：蛋白胨1.4质量％，NaCl 0.6质量％，葡萄糖0.3质量％，牛肉膏0.5质量％，KH2PO40.5质量％，K2HPO40.4质量％；培养温度为37℃，培养基pH值为7.5。
3)润滑油生物降解试验：根据种子培养生长曲线选择生长旺盛的菌液进行润滑油生物降解试验，从种子培养基中吸取混合菌液，接入到准备好的需要添加菌液的润滑油生物降解培养基中，置于37℃，转速为200r/min的恒温振荡器中，暗室内进行生物降解培养7天。
生物降解试验包括：
(中性瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液；
(测试瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g合成油和植物油基润滑油；
(参比测试瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g参比油；
(毒化瓶)100mL矿物基营养液+2g合成油植物油基润滑油；
(参比毒化瓶)100mL矿物基营养液+2g参比油。
参比油为降解率达到96％左右的蓖麻油(文献报道)。
生物降解培养基矿物营养液：KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO40.7g；酵母粉0.01g；自来水1000mL；调节pH为7.2-7.6；参比油可以选择文献中已经报道过的生物降解率较高的植物油。
4)样品预处理及检测分析：接入混合菌液的生物培养基，在经过7天培养后，用质量分数为1％盐酸水溶液和20gNaCl溶解，采用超声波细胞破碎仪将培养液进行破碎；以TOC为检测指标，对预处理后的样品分别进行TC(总碳)和IC(无机碳)的测定，依据TOC(总有机碳)计算公式(TOC＝TC-IC)求得TOC值。根据培养前后TOC值的变化情况，求得待测样品和参比样品的TOC降解率，分析样品的生物可降解性。
超声波破碎条件(采用间歇的方式)：200W，2min，工作2s，停止1s。该步骤结束后，超声波可使容器中的物质变热，此时的温度要保持在20～25℃的范围内；
5)生物降解率测定：用显微镜观察水质润滑油生物降解培养基中的微生物菌群生物量变化率，可作为评定该润滑油被微生物利用的一个定性指标。
采用总有机碳检测方法，检测水质培养基中的有机物变化率作为其生物降解的定量指标，计算公式如下：
P：毒化瓶中残余油含量，％(平均值)
T：测试瓶中残余油含量，％(平均值)
根据润滑油在液相水质中的消耗量和微生物菌群在培养过程中的增加量来共同评定润滑油的生物降解性能。该方法在技术上有以下的改进：减少了水质有机物生物降解培养中对润滑油粘度的限制要求；改良了培养基中对矿物基营养物质的苛求，采用普通营养物质既可满足生物降解培养试验；对于润滑油的生物降解率，从另外一个层面上进行了诠释，水质润滑油培养基经过微生物培养后，经超声波细胞破碎后，使微生物细胞内容物释放，然后采用总有机碳分析法检测水质溶液中的有机物残留，损耗的润滑油有机物则生成二氧化碳，以此来作为合成油和植物油基润滑油的生物降解率测定结果。
本发明是利用自然界中的微生物降解润滑油产品的一种生物学技术。该方法以合成油和植物油基润滑油产品为唯一碳源，配以足够的氮源和微生物生长必需的其他营养成分，制备成水基溶液培养基，添加一定生物活性的自然界微生物菌种，在恒定的温度和通氧条件下，经过一段时间的培养后，水基溶液培养基中的润滑油产品被微生物消耗利用，从而达到降解的目的。其中润滑油在水质中的含量测定方法，采用精确度较高的总有机碳检测方法。该方法已经应用到蓖麻基全合成高性能润滑油产品的生物降解测试试验中，并以文献报道中生物降解率在96％左右的蓖麻油作为参比油，测得的蓖麻油生物降解率为97％，蓖麻基全合成高性能润滑油的生物降解率达到了85％。
本发明是一种操作简便、数据再现性和重复性稳定的合成油和植物基润滑油生物降解评定方法，适用于各种规格和粘度级别的可生物降解润滑油。操作简便，成本低廉，具有广泛应用前景。
【附图说明】
图1混合菌液的生长曲线。
【具体实施方式】
一、培养基配制
驯化培养基：KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO4 0.7g；酵母粉0.01g；蓖麻基润滑油2g；自来水1000mL；调节pH为7.2-7.6
种子培养基：蛋白胨1.4％，NaCl 0.6％，葡萄糖0.3％，牛肉膏0.5％，KH2PO4 0.5％，K2HPO4 0.4％；培养温度为37℃，培养基pH值为7.5。
降解培养基矿物营养液：KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO4 0.7g；酵母粉0.01g；自来水1000mL；调节pH为7.2-7.6。
二、土壤采集及降解菌驯化
1)采集土壤的要求：采集来自曝气池中的活性污泥，采样深度15～30cm即可；采集的器具为经过消毒后的土壤采集器和塑料封口袋。
2)土壤与处理：土壤采集后，经过24小时曝气处理后，方可进行筛菌试验。将从活性污泥厂不同方位采集的土壤样品每份称取5.0g至45mL无菌水中(内装玻璃珠若干)，充分振荡10min(120r/min)，然后向250mL三角瓶中吸取5mL菌悬液于100mL液体驯化培养基中，置于26～28℃恒温箱中于180～200r/min下避光振荡培养3～5天，待培养基变混浊后吸取该菌液反复接种于成分、浓度都相同的驯化培养基中，每次接种量为5mL/100mL培养基。仍按照上述培养条件进行培养。驯化后的优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等好气异养型细菌，总活菌浓度为1.0×105～1.0×106个/mL。
三、种子培养
1)种子培养生长曲线的确定：将驯化后生长比较旺盛的上述菌液，采用可见分光光度计在660nm波长下测定混合菌液OD(吸光度)值，绘制生物降解混合菌液的生长曲线，选择其最佳接种时间。
2)种子扩大培养：将经过驯化后的微生物混合菌液，在一定的温度条件、通氧情况下，培养到其生长稳定的阶段，作为种子菌液接入到润滑油降解培养基中。
四、生物降解培养
1)培养瓶的准备：(中性瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液；(测试瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g合成油和植物基润滑油；(参比测试瓶)100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g参比油；(毒化瓶)100mL矿物基营养液+2g合成油植物基润滑油；(参比毒化瓶)100mL矿物基营养液+2g参比油。(注：参比油可以选择文献中已经报道过的生物降解率较高的植物油如蓖麻油，它的生物降解率为96％)。
2)培养方式：根据种子培养生长曲线选择生长旺盛的菌液进行润滑油的生物降解试验，从种子培养基中吸取1mL混合菌液，接入到上述准备好的需要添加菌液的锥形瓶中，置于37℃，转速为200r/min的恒温振荡器中，暗室培养7天。
表1生物降解行试验所需烧瓶数量及分配
  培养期(天)   每种待测油的测试瓶   每种待测油的毒化瓶   每种参比油的测试瓶   每种参比油的毒化瓶   中性瓶
  0   3   -   3   -   2
  21   3   2   3   2   -
注：“0天”烧瓶应该在试验开始后再准备，并且马上对其进行萃取
五、培养液处理及总有机碳检测方法
1)破乳和破细胞壁：培养期结束后，在各个锥形瓶中加入约1mL盐酸水溶液和20gNaCl，NaCl通过摇动而溶解，待完全溶解后，采用超声波细胞破碎仪将培养基中的微生物细胞壁破碎，从而使放出内容物，另一方面也能达到进一步破乳的目的。超声波破碎条件(采用间歇的方式)：200W，2min，工作2s，停止1s。该步骤结束后，超声波可使容器中的物质变热，此时的温度要保持在20～25℃的范围内，如果过热，可以放在冷水浴中进行。每瓶溶液超声波破碎结束后，用蒸馏水将变幅杆上残留的液体冲洗回收入锥形瓶中，方可进入下一个样品的试验。
2)总有机碳检测：本实验以TOC含量的变化来表征润滑油的变化，即以TOC为检测指标，对待测样品中的有机物含量变化分析采用TOC法。
对预处理后的样品分别进行TC(总碳)和IC(无机碳)的测定，依据TOC(总有机碳)计算公式(TOC＝TC-IC)求得TOC值。根据培养前后TOC值的变化情况，求得待测样品和参比样品的TOC降解率，分析样品的生物可降解性。
六、生物降解率测定方法
1)微生物菌群生物量：用显微镜观察水质润滑油生物降解培养基中的微生物菌群生物量变化率，可作为评定其润滑油被微生物利用的一个定性指标。
2)生物降解率：采用总有机碳分析方法，检测水质培养基中的有机物变化率作为其生物降解的定量指标。计算公式如下：
Figure G2009102452375D00051
P：毒化瓶中残余油含量，％(平均值)
T：测试瓶中残余油含量，％(平均值)。
具体应用实施例
以蓖麻基润滑油的生物降解测定为例，参比油选择文献(王昆，方建华，润滑油生物降解快速测定方法的研究[J]，石油学报，2004，20(6))报道中报道的降解率达到96％的蓖麻油，按照上述操作方法：
一、筛选出的混合菌液进行种子培养测定生长曲线，确定最佳接种期
混合菌液的生长曲线，其结果如图1所示。图1混合菌液的生长曲线。
由上图生长曲线可以看出，混合菌液的延滞期比较短，在11h开始进入稳定期。另外，混合菌液的稳定期时间长达11h，到培养23h后进入衰亡期。
二、蓖麻基润滑油生物降解培养结束后锥形瓶中残余物质的总有机碳检测值。
三、生物降解率结果计算：
蓖麻油的生物降解率：
表1蓖麻油总有机碳数据(单位：g/100ml)
Figure G2009102452375D00061
中性瓶总有机碳平均值：0.182203
修正0天培养瓶总有机碳值：0.866157、0.821157、0.862007；
修正后平均值X＝0.849774；
标准偏差s＝0.0203
变化系数Cv＝2.389％＜5％；
修正后的测试瓶和毒化瓶数据结果如下表：
表2修正后0天培养瓶、测试瓶和毒化瓶数据结果(单位：g/100ml)
Figure G2009102452375D00062
按照给方法要求变异相关系数Cv％＜5％，测定的蓖麻油的生物降解率为97.14％。
2、蓖麻基全合成润滑油生物降解率
表3润滑油总有机碳数据(单位：g/100ml)
中性瓶总有机碳平均值为：0.182203；
修正0天培养瓶总有机碳值：0.620081、0.599222、0.584017；
修正后平均值X＝0.601107；
标准偏差s＝0.0148；
变化系数Cv＝2.459％＜5％；
修正后的测试瓶和毒化瓶数据结果如下表：
表4修正后0天培养瓶、测试瓶和毒化瓶数据结果(单位：g/100ml)
Figure G2009102452375D00071
按照给方法要求变异相关系数Cv％＜5％，测定的润滑油的生物降解率为85.49％。
从上表数据中可以看出，采用该方法经过6天培养，蓖麻油和蓖麻基全合成润滑油的生物降解率分别达到了97.14％和85.49％，平行试验的变异相关系数在可信度范围之内。
效果说明
1、对驯化后的混合菌液进行扩大化种子培养，为增强菌液在降解培养基中的活性；
2、通过对降解培养基的改良，降低了对培养基营养物质的要求；
3、在模拟自然环境条件下通过对降解培养基的培养条件优化，提高了微生物降解植物基润滑油的能力，而且相比较CEC的方法，缩短了降解时间，也简化了培养前期的菌液平板计算方法，不仅能够实现操作的可重复性，也能大大提高生物降解效果；
4、采用超声波细胞破碎的方法，将微生物内容物释放，测定的微生物降解合成油和植物基润滑油的能力为有效降解能力。

Claims (6)

1.一种合成油和植物油基润滑油产品的生物降解测试方法，其特征在于它包括的步骤：
1)采集来自污水处理厂的活性污泥，经过24-48小时曝气处理后，溶解于无菌水中，搅拌，得到菌悬液，吸取该菌悬液于液体驯化培养基中，置于26～28℃恒温箱中于180～200r/min下避光振荡培养3～5天，待培养基变混浊后吸取该菌液反复接种于成分、浓度都相同的驯化培养基中，每次接种量为5mL/100mL培养基。仍按照上述培养条件进行培养。驯化后的优势菌为假单胞菌属(Pseudomonas)、梭状芽孢杆菌属(Clostridium)、分枝杆菌属(Mycobacterium)等好气异养型细菌，总活菌浓度为1.0×105～1.0×106个/mL。
2)种子培养生长曲线的确定：将驯化后生长比较旺盛的菌种于种子培养基中培养，培养温度为37℃，采用可见分光光度计在660nm波长下测定混合菌液OD值，绘制生物降解混合菌液的生长曲线，选择对数生长期活跃的新生代菌液接种于降解培养基中的时间；
3)根据种子培养生长曲线选择生长旺盛的菌液进行润滑油的生物降解试验，从种子培养基中吸取混合菌液，接入到准备好的需要添加菌液的润滑油生物降解培养基矿物营养液中，置于37℃，转速为200r/min的恒温振荡器中，暗室内进行生物降解培养7天；
生物降解试验包括：
中性瓶：100mL矿物基营养液+1mL种子菌液；
测试瓶：100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g合成油和植物基润滑油；
参比测试瓶：100mL矿物基营养液+1mL种子菌液+2g参比油；
毒化瓶：100mL矿物基营养液+2g合成油植物基润滑油；
参比毒化瓶：100mL矿物基营养液+2g参比油；
4)接入混合菌液的生物培养基，在经过7天培养后，用1％的盐酸水溶液和20gNaCl溶解，采用超声波细胞破碎仪将培养基中的微生物细胞壁破碎；对预处理后的样品分别进行TC(总碳)和IC(无机碳)的测定，依据TOC(总有机碳)计算公式(TOC＝TC-IC)求得TOC值。根据培养前后TOC值的变化情况，求得待测样品和参比样品的TOC降解率，分析样品的生物可降解性。
5)、生物降解率测定：
用显微镜观察水质润滑油生物降解培养基中的微生物菌群生物量变化率，可作为评定其润滑油被微生物利用的一个定性指标；
采用总有机碳分析方法，检测水质培养基中的有机物变化率作为其生物降解的定量指标，计算公式如下：
Figure F2009102452375C00011
P：毒化瓶中残余油含量，％(平均值)
T：测试瓶中残余油含量，％(平均值)。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的驯化培养基为：KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO4 0.7g；酵母粉0.01g；蓖麻基润滑油2g；自来水1000mL；pH为7.2-7.6。
3.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的种子培养基为：蛋白胨1.4％，NaCl 0.6％，葡萄糖0.3％，牛肉膏0.5％，KH2PO40.5％，K2HPO40.4％；pH值为7.5。
4.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的参比油为降解率达到96％的蓖麻油。
5.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的生物降解培养基矿物营养液为KH2PO4 3.4g；Na2HPO4 1.5g；(NH4)2SO4 4.0g；MgSO4 0.7g；酵母粉0.01g；自来水1000mL调节pH为7.2-7.6。
6.根据权利要求1所述的方法，其特征在于所述的超声波破碎条件采用间歇的方式：200W，2min，工作2s，停止1s，该步骤结束后，超声波可使容器中的物质变热，此时的温度要保持在20～25℃的范围内。
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