CN112076292A - 一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的粉剂及其制备方法 - Google Patents
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Abstract
本发明属于药物领域,具体涉及一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的粉剂及其制备方法。本发明提供了一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的粉剂及其制备方法。本发明通过黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣两次水提取,枸杞子、桑椹、龙眼肉两次水提取,将上述提取液混合后浓缩、过滤,再与玉竹提取物混合,经真空带式干燥,制得粉剂。本发明提供的粉剂能在一定程度上调节肾阴虚证的相关物质基础***、环磷酸腺苷水平,从而改善甲状腺功能亢进,平衡性激素及环核苷酸***。本实验提示本发明提供的粉剂可能通过调整内分泌***中激素水平紊乱、平衡调节能量代谢,发挥滋阴补肾功效。
Description
技术领域
本发明属于药物领域,具体涉及一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的粉剂及其制备方法。
背景技术
免疫力是人体自身的防御机制,是人体识别和消灭外来侵入的任何异物(病毒、细菌等)。处理衰老、损伤、死亡、变性的自身细胞以及识别和处理体内突变细胞和病毒感染细胞的能力。随着现代生活节奏的加快、工作压力的不断加大、饮食不均衡、睡眠不足、运动不够……都容易让人免疫力低下。免疫力低下的身体易于被感染或患癌症,各种原因使免疫***不能正常发挥保护作用,在此情况下,极易招致细菌、病毒、真菌等感染,因此免疫力低下最直接的表现就是容易生病,因经常患病,加重了机体的消耗,所以一般有体质虚弱、营养不良、精神萎靡、疲乏无力、食欲降低、睡眠障碍等表现。生病、***、吃药、便成了家常便饭,每次生病都要很长时间才能恢复,而且常常反复发作,如感冒反复发作、扁桃体炎反复发作、哮喘反复发作、支气管炎反复发作、肺炎反复发作、腹泻反复发作,长此以往会导致身体和智力发育不良,还易诱发重大疾病。
近年来人民生活水平明显提高人们的消费观念、健康观念发生了较大变化。为规避不健康带来的各种不利影响,使人们越来越重视营养保健品的使用。目前提高免疫力类保健食品主要以补充维生素和矿物质为主,大多以口服液的形态存在。口服液剂携带不便,稳定性差,存放时间短。片剂在压片时大都需要加入淀粉、羟甲基纤维素等大剂量辅料,崩解时间长。同时对吞咽有困难的人群服用不方便,如老人和儿童。
粉剂是指以糖、乳和乳制品、蛋或蛋制品、果汁或食用植物提取物等为主要原料,添加适量的辅料或食品添加剂制成的每100克成品水分不高于5克的固体制品,呈粉末状、颗粒状或块状,如豆晶粉、麦乳精,速溶咖啡、菊花晶等,分蛋白型粉剂、普通型粉剂和焙烤型粉剂(速溶咖啡)3类。
产品抽查中发现的主要质量问题是水分、霉菌超标。强制性国家标准GB7101~2015《食品安全国家标准饮料》规定,水分含量应≤5.0g/100g,抽查中有个别产品水分含量为7.7g/100g,是标准规定的1.5倍。水分含量过高的粉剂容易在保质期内结块、潮解甚至引发产品发霉变质。粉剂已进入快速发展的关键期,但行业发展中还存在竞争无序、质量不合格等问题,行业亟待规范和产业升级。从目前市场来看,为适应消费者对粉剂口味、营养保健等多方面的需要,粉剂行业开发动植物蛋白、果蔬汁、速溶咖啡、速溶茶等功能性粉剂,同时开始遵循天然、营养、回归自然的思想,使粉剂朝着组分营养化、品种多样化、功能保健化、成分绿色化、包装优雅化的良性方向发展具有重要的现实意义。
发明内容
有鉴于此,本发明提供了粉剂及其制备方法。本发明提供的粉剂具有增强免疫力、改善肾阴虚的功效。
本发明提供了一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的组合物,按质量份计,所述组合物由从黑木耳、茯苓、枸杞子、桑椹、龙眼肉、莲子、薏苡仁、大枣中提取的中药提取液和玉竹提取物组成;
其中,按质量份计,各原料与组分的量为:黑木耳30~50份、茯苓30~40份、枸杞子30~50份、桑椹30~40份、龙眼肉20~30份、莲子0.5~2份、薏苡仁0.5~2份、大枣0.5~2份、玉竹提取物1~2份。
黑木耳属担子菌纲,木耳目的食用真菌,腐生在枯死的树木枝干上,其状扁平,形如人耳,故名木耳,也称黑木耳。新鲜的木耳为胶质,半透明、深褐色,有弹性,干燥后的木耳,其背面凸起,腹面下凹,耳体缩小,呈角质。黑木耳色泽黑褐,质地呈胶质状透明,薄而有弹性,味道鲜美,营养丰富,可素可荤,其营养价值高。黑木耳被现代营养学家盛赞为“素中之荤”。
茯苓,又称玉灵、茯灵、万灵桂、茯菟,为多孔菌科真菌茯苓Poria cocos(Schw.)Wolf的干燥菌核,常寄生在松树根上,形如甘薯,球状,外皮淡棕色或黑褐色,内部粉色或白色,精制后称为白茯苓或者云苓。宁心安神,败毒抗癌。药性平和,利湿而不伤正气。适量服食茯苓可作为春夏潮湿季节的调养佳品可治小便不利、水肿胀满、痰饮咳逆、呕逆、恶阻、泄泻、遗精、淋浊、惊悸、健忘等症。所含茯苓酸具有增强免疫力、抗肿瘤以及镇静、降血糖等的作用。可松弛消化道平滑肌,抑制胃酸分泌,防止肝细胞坏死,抗菌等功效。
薏苡仁,为禾本科植物薏苡Coix lacryma-jobi L.var.mayuen(Roman.)Stapf的干燥成熟种仁。秋季果实成熟时采割植株,晒干,打下果实,再晒干,除去外壳、黄褐色种皮和杂质,收集种仁。性味甘淡微寒,有利水消肿、健脾去湿、舒筋除痹、清热排脓等功效,为常用的利水渗湿药。薏仁又是一种美容食品,常食可以保持人体皮肤光泽细腻,消除粉刺、雀斑、老年斑、妊娠斑、蝴蝶斑,对脱屑、痤疮、皲裂、皮肤粗糙等都有良好疗效。
莲子,为睡莲科植物莲Nelumbo nucifera Gaertn.的干燥成熟种子。善于补五脏不足,通利十二经脉气血,使气血畅而不腐,莲子所含氧化黄心树宁碱对鼻咽癌有抑制作用,这构成了莲子的防癌抗癌的营养保健功能;莲子所含非结晶形生物碱N-9有降血压作用;莲子芯所含生物碱具有显著的强心作用,莲芯碱则有较强抗钙及抗心律不齐的作用;莲子中所含的棉子糖,是老少皆宜的滋补品,对于久病、产后或老年体虚者,更是常用营养佳品;莲子碱有平抑***的作用,对于青年人梦多,遗精频繁或滑精者,服食莲子有良好的止遗涩精作用;带心莲子能清心火,祛除雀斑,然不可久煎。
大枣,属于被子植物门、双子叶植物纲、鼠李目,为鼠李科植物枣Ziziphus jujubeMill.的干燥成熟果实。其维生素含量非常高,有"天然维生素丸"的美誉,具有滋阴补阳,补血之功效。
枸杞子,为燕科植物宁夏枸杞Lycium barbarum L.的干燥成熟果实。夏、秋果实成熟时采摘,除去果柄,置阴凉处晾至果皮起皱纹后,再暴晒至外皮干硬、果肉柔软即得。遇阴雨可用微火烘干。枸杞子具有多种保健功效,是***批准的药食两用食物。适量食用有益健康,配合菊杞茶有清肝明目的效果。枸杞子中含有多种氨基酸,并含有甜菜碱、玉蜀黍黄素、酸浆果红素等特殊营养成分,使其具有非常好的保健功效。功效一、免疫调节,枸杞子富含枸杞多糖,枸杞多糖是一种水溶性多糖,由***糖、葡萄糖、半乳糖、甘露糖、木糖、鼠李糖这6种单糖成分组成,具有生理活性,能够增强非特异性免疫功能,提高抗病能力,抑制肿瘤生长和细胞突变。功效二、抗衰老,免疫衰老与细胞凋亡密切相关。枸杞多糖(LBP),能明显提高吞噬细胞的吞噬功能,提高淋巴细胞的增殖能力。功效三、抗肿瘤,枸杞多糖不仅是一种调节免疫反应的生物反应调节剂,而且可通过神经--内分泌--免疫调节网络发挥抗癌作用。功效四、抗疲劳,枸杞多糖能显著增加小鼠肌糖原、肝糖原储备量,提高运动前后血液乳酸脱氢酶总活力;降低小鼠剧烈运动后血尿素氮增加量,加快运动后血尿素氮的清除速率。这表明枸杞多糖对消除疲劳具有十分明显的作用。功效五、抗辐射损伤,枸杞子有抗Y射线辐射、保护机体的作用,可作为辅助药物来配合放疗等抗肿瘤治疗,减轻放疗的毒副作用,提高疗效,保护机体的免疫功能。功效六、调节血脂,枸杞子能有效降低患高脂血症的大鼠血清中甘油三酯和胆固醇的含量,具有明显的降血脂、调节脂类代谢功能,对预防心血管疾病具有积极作用。功效七、降血糖,枸杞多糖能明显增强受损胰岛细胞内超氧化物歧化酶(SOD)的活性,提高胰岛细胞的抗氧化能力,减轻过氧化物对细胞的损伤,降低内二醛生成量,这表明枸杞多糖对胰岛细胞有一定的保护作用。功效八、降血压,枸杞多糖可降低大鼠血压(收缩压和舒张压均见效果);降低血浆及血管中丙二醛、内皮素含量,增加降钙素基因相关肽的释放,防止高血压形成。功效九、保护生殖***,枸杞多糖可使睾丸受损伤的大鼠的血清性激素水平升高;增加睾丸、附睾的脏器系数,提高大鼠睾丸组织SOD活性,降低丙二醛含量,使受损的睾丸组织恢复到接近正常水平。功效十、提高视力,人体的视网膜光感受器是由视黄醇和视蛋白所构成,枸杞中所含丰富的β-胡萝卜素可在人体内转化成维生素A,而维生素A可生成视黄醇,从而提高视力,防止黄斑症。功效十一、提高呼吸道抗病能力,枸杞富含胡萝卜素,在人体内能转化成维生素A,具有维持上皮组织正常生长与分化的功能,量充足时可预防鼻、咽、喉和其他呼吸道感染,提高呼吸道抗病能力。功效十二、美容养颜,滋润肌肤,皮肤衰老主要是由于自由基氧化所造成,而枸杞中所含的枸杞多糖、β-胡萝卜素都是强力的抗氧化剂;另外,维生素A可维持上皮组织的生长与分化,防止皮肤干燥和毛囊角化,从而起到美容养颜、滋润肌肤的作用。功效十三、保护肝脏,抗脂肪肝枸杞中所含的甜菜碱有抑制脂肪在肝细胞内沉积、促进肝细胞新生的作用。同时可防止四氯化碳引起的肝功能紊乱,故而构杞具有明确的保护肝脏、抗脂肪肝的功效。功效十四、增强造血功能,枸杞所含枸杞多糖可保护白细胞,促进机体造血功能恢复。此外.宁夏枸杞还具有调节神经内分泌、修复缺血性脑损伤、减轻脑水肿、改善大脑功能等作用。
桑椹,(拉丁名:Morus albaL.)是桑科桑属多年生木本植物桑树的果实,为聚花果,由多数小瘦果集合而成,呈长圆形,长1~2cm,直径0.5~0.8cm。黄棕色、棕红色或暗紫色,有短果序梗。小瘦果卵圆形,稍扁,长约2mm,宽约1mm,外具肉质花被片4枚。气微,味微酸而甜。《本草新编》有“紫者为第一,红者次之,青则不可用”的记载。桑椹中含有多种功能性成分,如芦丁、花青素、白黎芦醇等,具有良好的防癌、抗衰老、抗溃疡、抗病毒等作用。
龙眼肉,是指鲜龙眼烘成干果后即成为中药里的桂圆,为无患子科植物龙眼DimocarpuslonganLour.的假种皮。生药龙眼肉为由顶端纵向裂开有不规则块片,气香,味浓甜而特殊。表面黄棕色,半透明;靠近果皮的一面皱缩不平,粗糙,靠近种皮的一面,光亮而有纵皱纹。能够补益心脾,养血安神。用于气血不足、心悸怔忡、健忘失眠、血虚萎黄。
玉竹提取物,为百合科植物玉竹Polygonatum odoratum(MilL.)Druce的干燥根茎经过水提取工艺精制而得到,具有养阴润燥、生津止渴的功效,用于主治肺胃阴伤、燥热咳嗽、咽干口渴、内热消渴等症状。
麦芽糊精,麦芽糊精也称水溶性糊精或酶法糊精。它是以各类淀粉作原料,经酶法工艺低程度控制水解转化,提纯,干燥而成。其原料是含淀粉质的玉米,大米等。也可以是精制淀粉,如玉米淀粉,小麦淀粉,木薯淀粉等。具有甜度低,溶解性好,不易吸潮,稳定性好,难以变质的特性。本产品具有增稠性强,载体性好,发酵性小,填充效果好,不吸潮、无异味、易消化、低热、低甜度等特点。麦芽糊精含有大量的多糖类,另外还含有钙、铁等对人体有益的微量元素及矿物质,并能促进人体正常的物质代谢。被广泛应用于饮料、冷冻食品、糖果、麦片、乳制品、保健品等行业,还可应用于纺织、日化、医药生产中。
在本发明的一些具体实施方案中,按质量份计,各原料与组分的量为:黑木耳40~50份、茯苓36~40份、枸杞子30~40份、桑椹30~40份、龙眼肉24~30份、莲子1.2~2份、薏苡仁1.2~2份、大枣1.2~2份、玉竹提取物1.6份。
本发明还提供了一种包含所述组合物的粉剂,按质量份计,还包含糊精30~40份,所述糊精选自麦芽糊精、α-环状糊精、β-环状糊精或其组合。
在本发明的一些具体实施方案中,所述粉剂由包括以下步骤的方法制得:
步骤1):按比例称取黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣,加入所述五种原料总质量15~25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~3h,过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量15~25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~2.5h,过滤,收集第二滤液;
步骤2):按比例称取枸杞子、桑椹、龙眼肉,加入所述三种原料总质量8~15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~3h,过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量8~15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~2.5h,过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至50~80℃,搅拌条件下分别按比例加入玉竹提取物、麦芽糊精,搅拌至完全溶解后,干燥,将干燥物料粉碎即得粉剂。
在本发明的一些具体实施方案中,在步骤1)、步骤2)、步骤3)中,所述过滤孔径为50~100目。
在本发明的一些具体实施方案中,在步骤3)中,所述浓缩温度为80~95℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩。
在本发明的一些具体实施方案中,在步骤4)中,所述干燥为真空带式干燥:前四段热水温度分别设定为80~130℃、80~130℃、80~130℃、80~130℃,第五段冷却水温度20~50℃,布料摆杆的速度为160~280r/min,角度为6~26°,履带速度为10~30cm/min,布料速度为8~20L/h,真空度上下限值分别设定为500Pa、3500Pa。
在本发明的一些具体实施方案中,所述粉剂由包括以下步骤的方法制得:
步骤1):按比例称取黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):按比例称取枸杞子、桑椹、龙眼肉,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至80℃,搅拌条件下分别按比例加入玉竹提取物、麦芽糊精,搅拌至完全溶解后,真空带式干燥,所述真空带式干燥前四段热水温度分别设定为80~130℃、80~130℃、80~130℃、80~130℃,第五段冷却水温度20~50℃,布料摆杆的速度为160~280r/min,角度为6~26°,履带速度为10~30cm/min,布料速度为8~20L/h,真空度上下限值分别设定为500Pa、3500Pa;将干燥物料粉碎即得粉剂。
基于上述研究,本发明还提供了所述粉剂在制备增强免疫力、改善肾阴虚的药物中的应用,及所述粉剂在制备增强免疫力的保健食品中的应用。
本发明提供了粉剂及其制备方法。本发明通过黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣两次水提取,枸杞子、桑椹、龙眼肉两次水提取,将上述提取液混合后浓缩、过滤,再与玉竹提取物混合,经真空带式干燥,制得粉剂。本发明提供的粉剂具有增强免疫力、改善肾阴虚的功效。
本发明提供的粉剂能在一定程度上调节肾阴虚证的相关物质基础***(E2)、环磷酸腺苷(cAMP)水平,从而改善甲状腺功能亢进,平衡性激素及环核苷酸***。本实验提示本发明提供的粉剂可能通过调整内分泌***中激素水平紊乱、平衡调节能量代谢,发挥滋阴补肾功效。
具体实施方式
本发明公开了一种粉剂及其制备方法,本领域技术人员可以借鉴本文内容,适当改进工艺参数实现。特别需要指出的是,所有类似的替换和改动对本领域技术人员来说是显而易见的,它们都被视为包括在本发明。本发明的方法及应用已经通过较佳实施例进行了描述,相关人员明显能在不脱离本发明内容、精神和范围内对本文所述的方法和应用进行改动或适当变更与组合,来实现和应用本发明技术。
本发明提供的粉剂及其制备方法所用的原料及试剂均可由市场购得。
下面结合实施例,进一步阐述本发明:
实施例1:组合物1的制备
步骤1):称取黑木耳40份、茯苓40份、莲子1.2份、薏苡仁1.2份、大枣1.2份,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子40份、桑椹35份、龙眼肉24份,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至80℃,搅拌条件下加入玉竹提取物1.6份,搅拌至完全溶解后,即得组合物1。
实施例2:组合物2的制备
步骤1):称取黑木耳50份、茯苓36份、莲子2份、薏苡仁2份、大枣2份,加入所述五种原料总质量25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1h,经100目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取2.5h,经100目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子30份、桑椹30份、龙眼肉30份,加入所述三种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1h,经100目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经100目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为95℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经100目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至70℃,搅拌条件下分别加入玉竹提取物1.6份,搅拌至完全溶解后,即得组合物2。
实施例3:组合物3的制备
步骤1):称取黑木耳30份、茯苓30份、莲子2份、薏苡仁0.5份、大枣0.5份,加入所述五种原料总质量25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1h,经50目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1h,经50目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子50份、桑椹40份、龙眼肉20份,加入所述三种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经50目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1h,经50目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为80℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经50目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至60℃,搅拌条件下分别加入玉竹提取物1份,搅拌至完全溶解后,即得组合物3。
实施例4:组合物4的制备
步骤1):称取黑木耳50份、茯苓40份、莲子0.5份、薏苡仁2份、大枣2份,加入所述五种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取3,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量15倍水提取,加热沸腾后保沸提取2.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子40份、桑椹40份、龙眼肉30份,加入所述三种原料总质量8倍水提取,加热沸腾后保沸提取3h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量8倍水提取,加热沸腾后保沸提取2.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为90℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至50℃,搅拌条件下分别加入玉竹提取物2份,搅拌至完全溶解后,即得组合物4。
对比例1:
步骤1):称取黑木耳40份、茯苓40份、莲子1.2份、薏苡仁1.2份、大枣1.2份,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子40份、桑椹35份、龙眼肉24份,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至80℃,搅拌条件下分别加入玉竹提取物0.4份,搅拌至完全溶解后,即得对比物1。
对比例2:
步骤1):称取黑木耳30份、茯苓40份,加入所述两种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述两种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子30份、桑椹35份,加入所述两种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述两种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液,即得对比物2。
试验例1:增强免疫功能的功效试验
受试品
实施例1制得的组合物1;
实施例2制得的组合物2。
对照品
对比例1制得的对比物1;
对比例2制得的对比物2。
实验动物
SPF级成年健康ICR小鼠,购自浙江省医学科学院,动物合格证号SCXK(浙2014-0001)。所有各组小鼠均于SPF级环境中分笼适应性饲养一周,在实验期间小鼠自由摄食、饮水,饲养小鼠每天给予标准颗粒饲料。实验观察室为开放式,室温控制在22-25℃,照明、噪音、换气等条件控制在规定范围内,每日定时清洁。试验共进行4个免疫试验,每个免疫试验设7个试验组,即空白组,对比物1组,对比物2组,组合物1组高剂量,组合物1组中剂量,组合物1组低剂量,组合物2组中剂量。免疫试验一:DTH试验;免疫试验二:溶血素测定;免疫试验三:小鼠碳廓清试验;免疫试验四:脏器指数、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验。按照《保健食品功能学评价程序和检验方法》项下3.1条增强免疫力功能试验的试验剂量设计原则,即剂量分组:试验设三个剂量组和一个空白对照组,以人体推荐量的10倍为其中一个剂量组,另设两个剂量组。对照配方组按人日推荐量的10倍设置1个剂量组。
主要实验仪器与试剂
高速低温离心机 (HERMLE,德国)
全波长酶标仪, (Biotek公司,美国)
微量移液器 (GILSON,法国)
漩涡混匀器 (VORTEXGENIE,美国)
低温冰箱 (SANYO,日本)
电子天平 (OHAUS,美国)
C02培养箱 (三洋,日本)
电热恒温水浴 (北京长安科学仪器厂)
115型自动体重计量仪 (大连星海电子衡器有限公司)
石蜡切片机 (德国莱卡)
尼康BX-51显微镜 (NIKAN日本)
剂量设计与分组
实验动物随机分成7组,具体分组为:
空白组,使用生理盐水灌胃。
对比物1组,灌胃1.5g/kg。
对比物2组,灌胃1.3g/kg。
组合物1组高剂量,灌胃4.5g/kg。
组合物1组中剂量,灌胃1.5g/kg。
组合物1组低剂量,灌胃0.75g/kg。
组合物2组中剂量,灌胃1.57g/kg。
每天上午10点灌胃给药,连续30d。
实验方法
每周称量动物体重,观察动物的一般状况及二便。
迟发型***反应(DTH)检测
将灌胃后的小鼠腹部皮肤用电动剃毛刀进行脱毛处理,范围约3cm×3cm,后用DNFB溶液50μl均匀涂抹致敏;5天后,再用DNFB溶液10μl均匀涂抹于小鼠右耳两面。次日处死小鼠,剪下左右两耳,用打孔器取下直径8mm的耳片,称重,计算左右耳重量差值。耳肿胀度=(右耳片重-左耳片重)/左耳片重。
半数溶血值(HC50)的测定
免疫动物:将压积SRBC用生理盐水配成2%(V/V)细胞悬液,每只小鼠腹部注射0.2mL进行免疫。
血清分离:5天后,将免疫动物摘眼球取血于离心管内,放置1h,使血清充分析出,2000r/min离心10min,收集血清。
溶血反应:取血清用SA缓冲液稀释250倍。取稀释后的血清1mL置于试管内,依次加入10%(V/V,生理盐水配制)SRBC 0.5mL,补体1mL(用SA缓冲液1︰8稀释)。另设不加血清的对照管(以SA缓冲液代替),置于37℃恒温水浴中25min后,冰浴终止反应。2000r/min离心10min。取上清液1mL,加都氏试剂3mL。同时取10%(V/V,生理盐水配制)SRBC 0.25mL,加都氏试剂4mL,充分混匀,放置10min后,于540nm处以对照品作空白,分别测各管的光密度值。溶血素的量以半数溶血值(HC50)表示,按下式计算:
碳廓清试验测定
将喂养好的小鼠称重,然后从小鼠尾部静脉注入稀释后的印度墨汁(10ml/kg),注入墨汁后在2min和10min时,分别从内眦静脉丛取血20μl,并立即将其加到盛有2ml0.1%Na2CO3溶液的试管中。在600nm处分光测定光密度值(OD),以0.1%Na2CO3溶液作空白对照。然后将小鼠处死,解剖取出肝脏、脾脏,用滤纸吸干血迹后称重,按下列公式计算吞噬指数:吞噬指数α=K1/3×体重/(肝重+脾重),K=(lgOD2min-lgOD10min)/(10min-2min)。以吞噬指数α来表示小鼠碳廓清能力。
小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和脏器/体重比值
向小鼠腹腔注入20%鸡红细胞悬液1ml,30min后,处死小鼠,将其仰位固定于鼠板上,正中剪开腹壁皮肤,经腹腔注入生理盐水2ml,转动鼠板1min。然后吸出腹腔洗液1mL,平均分滴于2片载玻片上,放入垫有湿纱布的搪瓷盒内,37℃培养30min。取出用生理盐水漂洗,以除去未贴片细胞,晾干,以1:1丙酮甲醇溶液固定,4%(v/v)Giemsa-磷酸缓冲液染色3min,再用蒸馏水漂洗晾干。在油镜下阅片计数,结果判定:每片数200个巨噬细胞按下式计算吞噬百分率和吞噬指数。计算吞噬率和吞噬指数。并解剖小鼠取出脾脏及胸腺,用滤纸吸干血迹后称重,并计算胸腺指数和脾指数。巨噬细胞吞噬率=(吞噬鸡红细胞巨噬细胞数/巨噬细胞200个)×100%,吞噬指数=(被吞噬的鸡红细胞数/巨噬细胞数200个)÷2。脏器指数(mg/g)=脏器湿重(mg)/小鼠体重(g)。
小鼠NK细胞活性测定
试验前24小时将靶细胞传代培养,使用前以Hank's液洗3次,用RPMI1640完全培养液调整细胞浓度为4×105个/mL。然后用Hanks液洗涤脾细胞悬液2次,每次离心10min(1000r/min)。弃上清液将细胞浆弹起,加入0.5ml灭菌水20秒,裂解红细胞后再加入0.5mL2倍Hank's液,8mLHank's液,离心10min(1000r/min),弃去上清液,用1ml完全培养液重悬,用1%冰醋酸稀释后计数,台酚兰染色计数活细胞数(应在95%以上),调整细胞浓度为2×107个/mL。取靶细胞和效应细胞各100μl(效靶比为50:1),加入96孔培养板中;靶细胞自然释放孔加靶细胞和培养液各100μL、靶细胞最大释放孔加靶细胞和1%NP40各100μL,每个孔皆平行操作3孔。CO2培养箱中培养4h,然后将培养板离心5min(1500r/min),每孔吸取上清液100μl置于96孔培养板中,同时加入LDH基质液100μL,反应3min,每孔加入1mol/L的HCl溶液30μL,在酶标仪490nm处测定光密度值(OD),计算NK细胞活性。
统计分析
结果与讨论
各组小鼠动物体重差异
在连续给药的30天中,各组动物均表现出稳定的体重增长,各给药组体重与空白组比较,均无统计学差异(P>0.05)。说明各实施例以及对比例对动物体重无影响,结果如表1所示。
注:与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01
各实验组对小鼠迟发型***反应(DTH)的影响
实验结果显示,经DTH诱导后小鼠耳廓明显肿胀;给予不同配方的各组合组以及对比物组后显著抑制DTH致敏小鼠耳廓肿胀,与空白不给药致敏的空白组比,高、中、低剂量的组合物1组的小鼠耳肿胀率明显下降(P=0.001,P<0.05),其抑制强度与组合物1组剂量呈一定的依赖关系。此外结果显示,抑制小鼠耳肿胀率整体趋势是,组合物1组优于组合物2组,组合物2组与对比物1组相近,对比物1组优于对比物2组。如表2所示。
注:与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01,***P=0.001
对小鼠半数溶血值(HC50)的影响
组合物组、对比物组与空白组比较,小鼠半数溶血值均有增高的趋势,但除了组合物1组高剂量、中剂量与空白组比较有显著差异以外(P<0.01,P<0.05),其他各组只有升高趋势,无统计学差异(P>0.05)。此外结果显示,HC50整体趋势是,组合物1组中剂量优于组合物2组中剂量,组合物2组优于对比物1组,对比物2组优于对比物1组。结果见表3。
注:与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01
各实验组对小鼠碳廓清试验的影响
经口给予不同配方的受试物30天后,组合物1组高剂量剂量、中剂量及组合物2组与空白组比较有显著性差异(P<0.01,P<0.05),即这三组配方可以提高小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力。其他各组有提高单核-巨噬细胞吞噬的趋势,但与空白组比较无统计学差异(P>0.05)。此外结果显示,提高小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力整体趋势是,组合物1组中剂量优于组合物2组中剂量,组合物2组优于对比物1组,对比物1组优于对比物2组。结果见表4。
注:与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01
对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和脏器/体重比值
与空白组相比,组合物1组高剂量、中、低剂量及组合物2组的小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞的吞噬率及吞噬指数均显著升高,具有统计学意义(P<0.01,P<0.05),与空白组比较,对比物1组、对比物2组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞吞噬指数有统计学差异(P<0.05),对比物1组、对比物2组小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞百分率与空白组比,没有统计学差异(P>0.05)。结果见表5。
在脏器指数实验中,与空白组比较,组合物1组高剂量、中剂量胸腺指数明显升高,差异有统计学意义(P<0.01,P<0.05);组合物1组高剂量、中、低剂量脾脏指数高于空白组(P<0.01,P<0.05);说明组合物1组可激活机体吞噬细胞的吞噬能力,结果见表5。
此外结果显示,小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和脏器/体重比值的影响整体趋势是,组合物1组优于组合物2组,组合物2组优于对比物1组,对比物1组优于对比物2组。
注:与空白组比较:*P<0.05,**P<0.01
结论:
本发明中采用的试验方法包括细胞免疫和体液免疫功能试验。在本实验条件下,给小鼠喂饲组合物1组和组合物2组后,动物的体液免疫功能和单核-巨噬细胞吞噬功能改善效果明显,提示该受试样品具有潜在的增加免疫功能的作用。从抑制小鼠耳肿胀率、小鼠半数溶血值、提高小鼠单核-巨噬细胞碳廓清能力、小鼠腹腔巨噬细胞吞噬鸡红细胞试验和脏器/体重比值的影响各试验指标都显示整体趋势是,组合物1组优于组合物2组,组合物2组优于对比物1组,对比物1组优于对比物2组。
试验例2:对肾阴虚模型小鼠的调节作用
不同配方产品
产品四个配方:对比物1组、对比物2组、组合物1组、组合物2组,无限极提供。
其它药物:
六味地黄丸(简称阳性药),黑色丸剂,国药准字Z41022128,仲景宛西制药股份有限公司生产,批号:190514。
试验动物
ICR小鼠,SPF级,体重18~25g,实验动物生产许可证号:SCXK(粤)2016-0029。
设施及饲料许可证
中山大学SPF屏障设施,使用许可证:SYXK(粤)2016-0112;
大小鼠配合维持饲料,广东省医学实验动物中心,粤饲证(2019)05073。
试剂及药品
左甲状腺素钠,Berlin-Chemie AG公司生产,进口许可证:H20160235,批号:91015A;
氯化钠,AR级,福晨(天津)化学试剂有限公司,批号:20190617;
促肾上腺激素释放激素CRH试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12334;
皮质醇CORT试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12206;
促肾上腺皮质激素ACTH试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12248;
甲状腺素T4试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12187;
三碘甲状原氨酸T3试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12190;
促甲状腺激素TSH试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F05234;
睾酮T试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12199;
***E2试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12205;
环磷酸腺苷cAMP试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F03708;
环磷酸鸟苷GAMP试剂盒(ELISA),上海研谨生物科技有限公司,批号:F12272。
实验装置
BS110S电子天平,北京塞多利斯天平有限公司;
ACS-1A1型电子天平,深圳爱华衡器有限公司;
GS-15R型台式高速冷冻离心机,德国BECNIHAN生产;
MK3型酶标仪,雷勒分析仪器有限公司。
剂量设置
表6按体表面积等效系数换算给药剂量
产品名称 | 小鼠剂量 | 相当于成人倍数 | 小鼠灌胃体积 |
对比物1组 | 1.525g/kg | 10 | 10ml/kg |
对比物2组 | 1.292g/kg | 10 | 10ml/kg |
组合物1组高剂量 | 4.605g/kg | 30 | 10ml/kg |
组合物1组中剂量 | 1.535g/kg | 10 | 10ml/kg |
组合物1组低剂量 | 0.7675g/kg | 5 | 10ml/kg |
组合物2组中剂量 | 1.53g/kg | 10 | 10ml/kg |
阳性组 | 0.72g/kg | 10 | 10ml/kg |
剂量设计依据:小鼠与60kg成人的体重等效换算系数按10倍计算,组合物1组的低中高剂量组按体重换算相当于60kg成人日服用10ml的5倍、10倍、30倍;对比物D1组、对比物D2组、组合物2组按体重换算相当于60kg成人日服用10ml的10倍;阳性药六味地黄丸给药剂量为0.72g/kg;按体重换算相当于60kg成人日服用4.32g的10倍。
不同配方产品的治疗肾阴虚的实验方法
选取健康ICR小鼠,雌雄各半,体重18-22g,检疫结束后,随机分成9个组,分别为正常组、模型组、阳性组、对比物1组、对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量;每组小鼠雌雄各半。除正常组外,各组小鼠给予左甲状腺素钠50μg/kg灌胃,0.1ml/10g,每天1次,连续14天,造成肾阴虚证候小鼠模型。每日给予左甲状腺素钠后间隔2小时给予相应药物灌胃0.1ml/10g,连续10天,正常组和模型组在同等条件下给予蒸馏水。第11天称重后眼眶取血,离心分离血清,-20℃保存待测,采用ELISA方法检测促肾上腺激素释放激素(CRH)、皮质醇(CORT)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、甲状腺素(T4)、三碘甲状原氨酸(T3)、促甲状腺激素(TSH)、睾酮(T)、***(E2)、环磷酸腺苷(cAMP)、环磷酸鸟苷(cGMP)的表达,结果采用组间比较t检验进行统计学处理;解剖,称脾重、胸腺重、肾上腺重,计算脾指数、胸腺指数和肾上腺指数。
表7
不同配方产品治疗肾阴虚的实验结果
实验分组
组别 | 给药剂量 | 给药前 |
正常组 | 等体积蒸馏水 | 24.5±3.9 |
模型组 | 等体积蒸馏水 | 24.4±2.6 |
对比物1组 | 10ml/kg | 24.5±3.8 |
对比物2组 | 10ml/kg | 25.5±1.8 |
组合物1组高剂量 | 10ml/kg | 25.7±2.0 |
组合物1组中剂量 | 10ml/kg | 25.7±2.1 |
组合物1组低剂量 | 10ml/kg | 25.4±1.8 |
组合物2组中剂量 | 10ml/kg | 25.4±3.5 |
阳性组 | 0.72g/kg | 24.7±3.1 |
由表8可知,随机分配后,各组体重无明显差异,可进行造模实验。
不同配方产品对肾阴虚小鼠脏器指数的影响
实验结束后称重末次体重,解剖小鼠取胸腺、脾、肾上腺,计算胸腺指数、脾指数、肾上腺指数,实验结果见表9所示。
注:与同期模型组比较*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,t检验。
由表9实验结果可得,模型组小鼠末次给药的体重与同期正常组相比明显减轻,胸腺、脾以及肾上腺的重量明显减轻,胸腺指数、脾指数和肾上腺指数缩小,上述指标与同期正常组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001)。连续给予左甲状素钠后,小鼠体内甲状腺素水平升高,促进小鼠体内的物质和能量代谢,机体消耗增加,小鼠心率加快、神经兴奋易暴怒打架;内分泌***表现为胸腺、脾重量减轻,同时还伴有肾上腺重量的减轻,符合肾阴虚证的临床症状表现,提示小鼠肾阴虚模型制备成功。
给予不同产品的小鼠体重的不同程度的增加,其中对比物1组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠体重明显增加,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001);此外,组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物2组中剂量组的小鼠胸腺重量增加,对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的脾重量增加,对比物1组、对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的肾上腺重量增加,以上脏器重量与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001);但只有组合物2组中剂量小鼠的脾指数和组合物1组高剂量、组合物1组中剂量组小鼠的肾上腺指数明显缩小,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05)。由此提示,各种配方的产品对肾阴虚模型小鼠的体重和脏器指数具有不同程度的调节作用;其中组合物1组高剂量和组合物1组中剂量即组合物1组中高剂量组的作用效果最好。
阳性药六味地黄丸能够明显增加小鼠的末次造模后的体重值,胸腺重量、脾重量和肾上腺重量明显增加,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01),但是脏器指数与同期模型组相比,无显著性差异(P>0.05)。
不同配方产品对肾阴虚小鼠甲状腺功能的影响
造模结束后小鼠眼眶采血,3000rpm离心后分离取血清,-20℃保存备用。用ELISA试剂盒检测血清的促甲状腺激素(TSH)、三碘甲状腺原氨酸(T3)、甲状腺素(T4),结果见表10所示。
组别 | 给药剂量 | TSH(pg/ml) | T3(pmol/L) | T4(pmol/L) |
正常组 | 等体积蒸馏水 | 73.93±5.04*** | 16.10±0.94*** | 954.4±133.6*** |
模型组 | 等体积蒸馏水 | 33.92±2.92 | 22.62±1.78 | 1433.1±53.1 |
对比物1组 | 10ml/kg | 64.15±7.74*** | 19.48±0.84*** | 997.87±95.5*** |
对比物2组 | 10ml/kg | 52.15±6.79*** | 20.26±0.97** | 1320.6±66.3*** |
组合物1组高剂量 | 10ml/kg | 64.41±9.18*** | 18.06±0.80*** | 1004.9±72.0*** |
组合物1组中剂量 | 10ml/kg | 69.15±5.73*** | 19.03±1.20*** | 1066.2±98.6*** |
组合物1组低剂量 | 10ml/kg | 56.12±2.99*** | 20.27±1.01** | 993.7±69.0*** |
组合物2组中剂量 | 10ml/kg | 66.39±12.67*** | 19.20±0.61*** | 1009.5±70.2*** |
阳性组 | 0.72g/kg | 44.19±4.93*** | 18.01±0.89*** | 1205.1±97.5*** |
注:与同期模型组比较*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,t检验。
由表10的实验结果可得,模型组小鼠TSH降低,T3和T4含量明显升高,与同期正常组相比,具有显著性差异(P<0.001)。造模药物左甲状素钠在临床上作为甲状腺素的补充剂使用,甲状腺素(T4)和三碘甲状腺原氨酸(T3)的含量可反映甲状腺素功能。连续给药后引起机体的甲状腺素功能轻度亢进,T3和T4浓度升高,此时能够诱发机体出现类似甲亢的症状,对心血管***、内分泌***和神经***等均产生影响。促甲状腺激素TSH为垂体前叶嗜碱性细胞分泌的一种激素,具有刺激甲状腺细胞分泌T3和T4的功能,但由于下丘脑-垂体-甲状腺轴(HPT)的负反馈作用,即血液中T3和T4的浓度过高时,又抑制了腺垂体TSH的合成和释放,是以机体自我调节血液中的甲状腺素分泌的相对稳定。从模型组小鼠血清的甲状腺激素水平的变化,提示利用升高甲状激素加速机体代谢从而导致肾阴虚的动物模型制备成功。
给予不同配方的产品的各组小鼠TSH含量呈现不同程度的升高,其中对比物1组、对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的TSH含量升高,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.001);此外,给予不同配方的产品的各组小鼠血清的T3和T4含量呈现下降趋势,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.01、P<0.001);其中对比物1组、对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠血清降低的T4浓度效果最好(***P<0.001),提示这些配方具有较好的改善甲状腺功能亢进,改善HPT轴功能的作用。
阳性药六味地黄丸能够明显增加TSH浓度,降低T3和T4浓度,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.001),治疗期间小鼠的情绪稳定,暴怒和打斗较少,总体表现与其临床疗效相符合。
不同配方产品对肾阴虚小鼠肾上腺皮质功能的影响
造模结束后小鼠眼眶采血,3000rpm离心分离血清,-20℃保存备用。用ELISA试剂盒检测血清的促肾上腺激素释放激素(CRH)、促肾上腺皮质激素(ACTH)、皮质醇(CORT),结果见表11所示。
组别 | 给药剂量 | CRH(ng/L) | ACTH(ng/L) | CORT(μg/L) |
正常组 | 等体积蒸馏水 | 1094.6±59.4*** | 54.0±3.3*** | 18.20±1.72*** |
模型组 | 等体积蒸馏水 | 1475.9±63.1 | 72.1±7.8 | 23.04±2.17 |
对比物1组 | 10ml/kg | 1360.5±170.0 | 71.4±5.8 | 20.69±1.16** |
对比物2组 | 10ml/kg | 1355.7±152.8* | 74.5±7.8 | 21.80±1.10 |
组合物1组高剂量 | 10ml/kg | 1202.4±109.1*** | 60.4±3.4*** | 20.53±1.19** |
组合物1组中剂量 | 10ml/kg | 1238.1±131.6*** | 63.7±5.9* | 21.25±1.13* |
组合物1组低剂量 | 10ml/kg | 1355.3±142.2* | 72.3±7.9 | 20.39±2.09* |
组合物2组中剂量 | 10ml/kg | 1311.6±79.8*** | 63.8±4.6** | 20.83±1.44* |
阳性组 | 0.72g/kg | 1420.0±96.6 | 57.1±11.6** | 19.30±1.34*** |
注:与同期模型组比较*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,t检验。
由表11的实验结果可得,模型组小鼠CRH升高,ACTH和CORT明显升高,与同期正常组相比,具有显著性差异(P<0.001)。小鼠连续2周给予左甲状素钠后,引起机体的甲状腺素功能轻度亢进,早期时兴奋了下丘脑-垂体-肾上腺轴(HPA)的功能,HPA是神经内分泌环,参与控制应激的反应,并调节机体活动。HPA受到刺激后,促进内分泌功能,从而引发如CRH、糖皮质激素如ACTH和CORT等的分泌。促肾上腺皮质激素释放激素CRH是一种含个氨基酸的肽,其主要功能是自下丘脑室旁核(PVN)分泌,经垂体门脉血流到达垂体前叶并刺激垂体ACTH的分泌,后者经血液循环到达肾上腺,刺激束状带一网状带合成并分泌以皮质醇为中心的糖皮质激素(GC)。促肾上腺激素ACTH的作用是刺激肾上腺皮质的生长发育,增强机体代谢,促进肾上腺素的合成,兴奋神经***和抑制免疫***,对心脏和肾脏也有一定影响,可增加心率,刺激肾小球旁器分泌肾素。皮质醇CORT,亦称氢化可的松,是肾上腺皮质中对糖类代谢具有最强作用的肾上腺皮质激素,属于糖皮质激素的一种。当皮质醇水平超过正常值范围时,其负面效应开始显现为新陈代谢的变动:血糖升高、食欲增加、体重上升、***减退以及极度疲劳等等;由此可见,HPA轴功能在机体的内分泌调节中发挥着非常重要的作用。从模型组小鼠血清的肾上腺激素水平CRH、ACTH和CORT的变化,结合小鼠的精神状态,出现易暴怒以及打群架的现象,与临床的肾阴虚的症状类似,提示该模型制备成功。
给予不同配方的产品的各组小鼠肾上腺激素功能上升趋势呈现不同程度的减缓,其中对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的CRH含量减少,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.001);其次,给予不同配方的产品的各组小鼠血清的ACTH含量降低,其中组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物2组中剂量组小鼠的ACTH水平与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001);再次,给予不同配方的产品的各组小鼠血清的CORT含量降低,其中对比物1组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的CORT水平与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01)。以上所有配方中,组合物1组高剂量组的小鼠血清降低ACTH和CORT浓度较明显,而组合物1组高剂量、组合物1组中剂量组配方的降低CRH浓度效果较好。
阳性药六味地黄丸能够明显减缓ACTH和CORT的上升趋势,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.01、P<0.001),治疗期间小鼠的情绪稳定,暴怒和打斗减少,总体表现与其临床疗效相符合。不同配方产品对肾阴虚小鼠性激素水平的影响
造模结束后小鼠眼眶采血,3000rpm离心分离血清,-20℃保存备用。用ELISA试剂盒检测血清E2(***)、T(睾酮)含量及计算E2/T的比值,结果见表12所示。
注:与同期模型组比较*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,t检验。
由表12实验结果可得,模型组雄性小鼠的睾酮T含量降低,计算雄性小鼠的E2/T比值明显升高;而模型组雌性小鼠***E2含量降低,计算雌性小鼠的E2/T比值明显降低;上述指标与同期正常正常组相比,具有显著性差异(P<0.001);雄性小鼠的E2水平和雌性小鼠的T水平保持稳定,与同期正常组相比,无显著性差异(P>0.05)。小鼠连续2周给予左甲状素钠后,引起机体的甲状腺素功能轻度亢进而产生代谢紊乱,影响下丘脑-垂体-性腺轴(HPG)的功能,导致性激素分泌水平发生变化以及性腺功能发生改变。模型组小鼠血清E2和T的变化也与临床肾阴虚症状比较相似,提示肾阴虚的模型制备成功。
给予不同配方的产品对各组小鼠性激素分泌水平呈现不同程度的调节作用,其中对比物1组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组雌性小鼠的E2含量升高,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001);其次对比物1组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组雄性小鼠的T含量升高,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.001);从E2/T比值可见,对比物1组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组雄性小鼠明显降低(P<0.05、P<0.01、P<0.001);组合物1组高剂量、组合物1组中剂量组雌性小鼠明显升高(P<0.01);以上所有配方中,组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物2组中剂量组即组合物1组以及组合物2组具有较好的调节性激素分泌水平的效果。
阳性药六味地黄丸能够明显升高雌性小鼠的E2和雄性小鼠的T分泌水平,雄性小鼠的E2/T比值降低,而雌性小鼠的E2/T比值升高,上述指标均与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.01、P<0.001),提示六味地黄丸具有较好的对性激素分泌水平的调节作用,改善因甲状腺素水平升高而出现的肾阴虚表型,总体表现与其临床疗效相符合。
不同配方产品对肾阴虚小鼠环核苷酸***的影响
造模结束后小鼠眼眶采血,3000rpm离心分离血清,-20℃保存备用。用ELISA试剂盒检测血清cAMP、cGMP含量及计算cAMP/cGMP的比值,结果见表13所示。
组别 | 给药剂量 | cAMP(nmol/L) | cGMP(nmol/L) | cAMP/cGMP |
正常组 | 等体积蒸馏水 | 6.16±0.39*** | 22.52±1.56*** | 0.274±0.024* |
模型组 | 等体积蒸馏水 | 9.16±0.69 | 30.21±2.92 | 0.306±0.038 |
对比物1组 | 10ml/kg | 7.14±0.29*** | 25.68±1.82*** | 0.279±0.022 |
对比物2组 | 10ml/kg | 7.34±0.46*** | 27.29±2.72* | 0.271±0.028* |
组合物1组高剂量 | 10ml/kg | 6.38±0.28*** | 24.66±1.98*** | 0.260±0.024** |
组合物1组中剂量 | 10ml/kg | 6.46±0.25*** | 24.78±1.20*** | 0.261±0.017** |
组合物1组低剂量 | 10ml/kg | 6.97±0.52*** | 28.59±1.94 | 0.245±0.026*** |
组合物2组中剂量 | 10ml/kg | 6.71±0.57*** | 27.46±0.74** | 0.244±0.026*** |
阳性组 | 0.72g/kg | 6.30±0.30*** | 23.39±2.44*** | 0.271±0.028* |
注:与同期模型组比较*P<0.05、**P<0.01、***P<0.001,t检验。
cAMP和cGMP都是机体内广泛存在的具有生理活性的重要物质,cAMP是由腺苷酸环化酶催化ATP而合成,cGMP是由鸟苷酸环化酶催化GTP形成。cAMP和cGMP形成后,都可以被磷酸二脂酶所分解,生成AMP和GMP。cAMP在细胞内发挥激素调节生理机能和物质代谢作用,能改变细胞膜的功能,促使网织肌浆质内的钙离子进入肌纤维,从而增强心肌收缩,并可促进呼吸链氧化酶的活性,改善心肌缺氧;此外,对糖、脂肪代谢、核酸、蛋白质的合成调节等起着重要的作用。cAMP与cGMP的作用相反,cGMP有乙酰胆碱的作用,抑制心肌收缩力,降低心率,增加神经兴奋性,刺激白细胞溶酶体释放水解酶,刺激淋巴细胞***增殖,抑制糖异生以及兴奋副交感神经的功能。小鼠连续2周给予左甲状素钠后,引起机体的甲状腺素功能轻度亢进,此时机体代谢旺盛,对糖、蛋白质和脂肪的消耗增加,小鼠出现心率加快以及神经***的兴奋作用,这些都与环核苷酸***密切相关。由表13实验结果可得,模型组小鼠环磷酸腺苷cAMP和环磷酸鸟苷cGMP含量升高,cAMP/cGMP的比值明显升高,与同期正常正常组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.001)。由此可见,模型组小鼠血清的环核苷酸***指标的变化,在小鼠体内甲状腺素水平升高的早期,结合小鼠的精神状态,出现易暴怒以及打群架的现象,与临床的肾阴虚的症状类似,提示该模型制备成功。
给予不同配方的产品的各组小鼠环核苷酸***的上升趋势呈现不同程度的减缓,组合物1组和组合物2组的小鼠的cAMP含量明显减少,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.001);其次,对比物1组、对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物2组中剂量组小鼠的cGMP含量也降低,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001);再次,给予不同产品的cAMP/cGMP的比值不同程度的降低,其中对比物2组、组合物1组高剂量、组合物1组中剂量、组合物1组低剂量、组合物2组中剂量组小鼠的cAMP/cGMP的比值与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.01、P<0.001)。以上所有配方中,组合物1组和组合物2组配方的对环核苷酸***的调节效果较好,提示这些配方具有较好的改善甲状腺素升高导致的小鼠心、肾、神经以及内分泌***等的异常,可能对上述器官具有一定的保护和调节作用。
阳性药六味地黄丸能够明显减缓cAMP、cGMP以及cAMP/cGMP的比值的上升趋势,与同期模型组相比,具有显著性差异(P<0.05、P<0.001),治疗期间小鼠的体重未见明显减重,精神状态以及情绪稳定,小鼠笼内暴怒和打架的次数减少,总体表现与其临床疗效相符合。
中医根据药物对“证”的作用和结果来认定其功效,“证”分阴、阳、寒、热、虚、实,药有四气、五味、升降浮沉等药性。《黄帝内经》曰“精气夺则虚”,肾阴不足,不能制约阳热之气,使阳气相对旺盛而导致虚热内扰,进而耗气伤津,脏腑经络失去濡养而表现出筋骨酸软、五心烦热、神思迟钝、动作失灵等阴虚内热的症状。灌胃给予低剂量的左甲状腺素是建立肾阴虚模型常用的方法之一,左甲状腺素通过与特异性受体结合,激活细胞核RNA聚合酶活性,增加细胞膜ATP酶的含量,进而提高细胞能量代谢速率,加快能量消耗,机体表现出咽干口燥,乏力盗汗等肾阴虚疲劳症状。
本发明提供的组合物不同配方由黑木耳、茯苓、枸杞子、桑椹、龙眼肉、莲子、薏苡仁、大枣、玉竹提取物等按照不同的配比制备提取浓缩液,这些中药材均是具补气健脾,补肾活血,补血滋阴的中药材提取而成,还增加了养阴润燥、生津止渴的药材,以上均是液体浓缩液,易于吸收,由实验结果可见,合适的浓度配方能够通过调节阴虚状态下机体内分泌激素水平紊乱,包括不同程度的调节了机体甲状腺激素、肾上腺激素和性激素分泌水平,减慢能量消耗速率,改善肾阴虚的症状。不同配方产品的药效作用汇总见表14所示;综合来看,以组合物1组中高剂量组和组合物2组中剂量的作用效果最好,阳性药六味地黄丸由熟地黄、酒蓃肉、牡丹皮、山药、茯苓和泽泻组成,成药是浓缩丸,水溶性较差,实验结果表明其对肾阴虚模型小鼠也具有很好的治疗作用,部分治疗作用与其滋阴补肾,用于肾阴亏损、头晕耳鸣、腰膝酸软、骨蒸潮热、盗汗遗精的功效相符合。
表14不同配方产品给予对左甲状腺素导致小鼠肾阴虚模型的实验结果汇总
注:—表示阴性结果;+表示阳性结果。
注:—表示阴性结果;+表示阳性结果。
试验例3:粉剂研究
以实施例1配方为基础,按如下工艺:
步骤1):称取黑木耳40份、茯苓40份、莲子1.2份、薏苡仁1.2份、大枣1.2份,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):称取枸杞子40份、桑椹35份、龙眼肉24份,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至80℃,搅拌条件下分别加入玉竹提取物1.6份、麦芽糊精(用量如表15所示),搅拌至完全溶解后,真空带式干燥,所述真空带式干燥前四段热水温度分别设定为80~130℃、80~130℃、80~130℃、80~130℃,第五段冷却水温度20~50℃,布料摆杆的速度为160~280r/min,角度为6~26°,履带速度为10~30cm/min,布料速度为8~20L/h,真空度上下限值分别设定为500Pa、3500Pa;将干燥物料粉碎即得粉剂。
从以下四个方案研究麦芽糊精不同添加量的影响:
表15
由实验结论可知,当麦芽糊精添加量较少时,真空带式干燥带干粉粘带,生产过程不顺畅,收粉率低,同时物料流动性较差,后续填充生产不顺利,产品口感中草药味道偏重。随着麦芽糊精添加量增加,生产逐渐顺利。物料的流动性常用休止角来表示,测定休止角能反映物料的流动性。一般认为θ≤40°时可以满足生产过程中流动性的需求。从休止角的测定显示方案2、方案3、方案4能够满足生产过程中流动性的需求,且方案4与方案3差别不大,考虑中草药含量与有效成分含量,相比较方案3更优。
综合生产可行性与产品口感、有效物含量,本发明提供的麦芽糊精添加量方案为经过研究后获得的更优方案,具有更好的实用性。
试验例4:稳定性试验
取试验例3所述粉剂3进行加速稳定性试验,结果如表16所示。
表16
试验表明,本发明提供的粉剂具有较好的稳定性。
以上所述仅是本发明的优选实施方式,应当指出,对于本技术领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明原理的前提下,还可以做出若干改进和润饰,这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
Claims (10)
1.一种具有增强免疫力和调节肾阴虚功能的组合物,其特征在于,按质量份计,所述组合物由从黑木耳、茯苓、枸杞子、桑椹、龙眼肉、莲子、薏苡仁、大枣中提取的中药提取液和玉竹提取物组成;
其中,按质量份计,各原料与组分的量为:黑木耳30~50份、茯苓30~40份、枸杞子30~50份、桑椹30~40份、龙眼肉20~30份、莲子0.5~2份、薏苡仁0.5~2份、大枣0.5~2份、玉竹提取物1~2份。
2.如权利要求1所述组合物,其特征在于,按质量份计,各原料与组分的量为:黑木耳40~50份、茯苓36~40份、枸杞子30~40份、桑椹30~40份、龙眼肉24~30份、莲子1.2~2份、薏苡仁1.2~2份、大枣1.2~2份、玉竹提取物1.6份。
3.一种包含权利要求1或2所述组合物的粉剂,其特征在于,按质量份计,还包含糊精30~40份,所述糊精选自麦芽糊精、α-环状糊精、β-环状糊精或其组合。
4.如权利要求3所述粉剂,其特征在于,所述粉剂由包括以下步骤的方法制得:
步骤1):按比例称取黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣,加入所述五种原料总质量15~25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~3h,过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量15~25倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~2.5h,过滤,收集第二滤液;
步骤2):按比例称取枸杞子、桑椹、龙眼肉,加入所述三种原料总质量8~15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~3h,过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量8~15倍水提取,加热沸腾后保沸提取1~2.5h,过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至50~80℃,搅拌条件下分别按比例加入玉竹提取物、麦芽糊精,搅拌至完全溶解后,干燥,将干燥物料粉碎即得粉剂。
5.如权利要求4所述粉剂,其特征在于,在步骤1)、步骤2)、步骤3)中,所述过滤孔径为50~100目。
6.如权利要求4所述粉剂,其特征在于,在步骤3)中,所述浓缩温度为80~95℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩。
7.如权利要求4所述粉剂,其特征在于,在步骤4)中,所述干燥为真空带式干燥:前四段热水温度分别设定为80~130℃、80~130℃、80~130℃、80~130℃,第五段冷却水温度20~50℃,布料摆杆的速度为160~280r/min,角度为6~26°,履带速度为10~30cm/min,布料速度为8~20L/h,真空度上下限值分别设定为500Pa、3500Pa。
8.如权利要求4所述粉剂,其特征在于,所述粉剂由包括以下步骤的方法制得:
步骤1):按比例称取黑木耳、茯苓、薏苡仁、莲子、大枣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第一滤液;取滤渣,加入所述五种原料总质量20倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第二滤液;
步骤2):按比例称取枸杞子、桑椹、龙眼肉,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取2h,经80目筛网过滤,收集第三滤液;取滤渣,加入所述三种原料总质量10倍水提取,加热沸腾后保沸提取1.5h,经80目筛网过滤,收集第四滤液;
步骤3):将所述第一滤液、第二滤液、第三滤液、第四滤液混合,浓缩,所述浓缩温度为85℃,真空度为-0.03Mpa~-0.08Mpa,待浓缩至固形物含量为40±10%时停止浓缩,经80目筛网过滤,收集浓缩液;
步骤4):将所述浓缩液加热至80℃,搅拌条件下分别按比例加入玉竹提取物、麦芽糊精,搅拌至完全溶解后,真空带式干燥,所述真空带式干燥前四段热水温度分别设定为80~130℃、80~130℃、80~130℃、80~130℃,第五段冷却水温度20~50℃,布料摆杆的速度为160~280r/min,角度为6~26°,履带速度为10~30cm/min,布料速度为8~20L/h,真空度上下限值分别设定为500Pa、3500Pa;将干燥物料粉碎即得粉剂。
9.如权利要求3~8任一所述粉剂在制备增强免疫力、改善肾阴虚的药物中的应用。
10.如权利要求3~8任一所述粉剂在制备增强免疫力的保健食品中的应用。
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