CN112048453B - 一株产生物乳化剂的嗜热菌及其应用 - Google Patents

一株产生物乳化剂的嗜热菌及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明提供一种嗜热微生物菌株及制备的物乳化剂，所述的嗜热微生物为地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)L‑22株，菌种保藏号CGMCC NO:20421。本发明的嗜热菌株L‑22其所产生的乳化剂对于温度、pH、盐度耐受能力强，在石油污染环境中能够具有较强的适应能力。将该菌株用于治理原油污染土壤的应用中，且与已报道的产乳化剂菌株XS2‑450相比，其在治理原油污染土壤的应用中，处理效果更佳。因此该菌株可以应用于微生物提高石油采收率，修复环境污染等石油行业，丰富了我国高效产生物乳化剂菌株。

Description

一株产生物乳化剂的嗜热菌及其应用
技术领域
本发明属于微生物代谢产物和生物乳化剂技术领域，具体涉及一株产生物乳化剂的嗜热菌及其应用。
背景技术
石油污染是指在开采、炼制、贮运、使用的过程中，原油和各种石油制品进入环境而造成的污染，其中土壤污染尤为严重。20世纪80年代以前，治理石油烃污染土壤只是采用物理或化学方法，但是这些方法会破坏土壤结构和组分，造成二次污染，且价格昂贵而很难实施。后续出现的微生物修复法因其价格低廉、无二次污染，成为处理土壤石油污染的研究热点。
在石油污染土壤生物修复过程中，生物乳化剂起到了重要作用。乳化剂能够改善乳浊液中各种构成相之间的表面张力，使之形成均匀稳定的分散体系或乳浊液。乳化剂是表面活性物质，可以降低界面张力、减少形成乳状液所需要的能量，从而提高乳状液的能量，使土壤中的油更易于与微生物接触，或者使原油易于与土壤分离，提高修复效率。
目前对于产乳化剂菌株的研究较少，且能够高效产生物乳化剂的菌株较少，并且菌株所产生的乳化剂活性不稳定，对于环境的耐受能力弱，在应用时，受环境因素的影响导致乳化剂失活，从而使处理效果差，增加土壤修复的难度。本发明是关于一株能够高效产生物乳化剂菌株的研究。
发明内容
本发明的目的是提供一种嗜热微生物菌株及其制备的生物乳化剂，以及在处理原油污染土壤中的应用。
本发明的嗜热微生物，为地芽孢杆菌属(Geobacillus sp.)L-22株，菌种保藏号CGMCC NO:20421，保藏日期为2020年7月23日；保藏单位为中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，地址为北京市朝阳区北辰西路1号院3号。
本发明的菌株的最适生长温度为60℃，乳化活性E24为71±0.24％。
本发明的L-22株用于生产生物乳化剂；
本发明菌株所产生的生物乳化剂在20℃-100℃温度范围、pH在4-12范围内，盐度在0-20％范围内其乳化液体石蜡的能力几乎不变。
本发明的L-22株还用于修复石油污染环境。
本发明的嗜热菌株L-22其所产生的乳化剂对于温度、pH、盐度耐受能力强，在石油污染环境中能够具有较强的适应能力。将该菌株用于治理原油污染土壤的应用中，且与已报道的产乳化剂菌株XS2-450相比，其在治理原油污染土壤的应用中，处理效果更佳。因此该菌株可以应用于微生物提高石油采收率，修复环境污染等石油行业，丰富了我国高效产生物乳化剂菌株。
附图说明
图1：菌株L-22在平板上的培养图；
图2：菌株L-22发酵液的乳化活性E24及其与XS2-450的发酵液乳化活性及***发育差异比较图；
图3：菌株L-22乳化活性E24随盐度变化图；
图4：菌株L-22乳化活性E24随温度变化图；
图5：菌株L-22乳化活性E24随pH变化图；
图6：L22和XS2-450菌所产乳化剂不同条件下的活性比较图；
图7：菌株L-22乳化原油效果图；
图8：三种不统油泥样品使用L-22处理前后样品对比图。
具体实施方式
本申请中的嗜热菌株L-22筛选分离自阿尔及利亚落地石油土壤，可以利用葡萄糖为碳源生产乳化剂，该菌株所产生的乳化剂乳化活性高，且稳定性较高，该菌株所产乳化剂用于处理不同油泥样品。
下面结合实施例和附图对本发明进行详细的描述。
实施例1菌株Geobacillus sp.L-22培养与活性分析
1、菌株筛选
100ml无机盐培养基(无机盐培养基配方：葡萄糖2％，硝酸钠0.3％，磷酸二氢钾0.042％，磷酸氢二钾0.12％，硫酸亚铁0.005％，硫酸镁0.05％，氯化钙0.005％，pH 7.5)，添加10g阿尔及利亚含油土壤，添加3％的高温灭菌的长庆280-1#油田采出液，将摇瓶置于60℃、180rpm摇床培养，每隔一周传代一次。取第三代菌群培养液，分别稀释至10-1、10-2、10-3，各取100ul稀释液涂布于LB平板上(LB培养基配方：蛋白胨1％，酵母提取物0.5％，氯化钠1％)，放置于60℃培养箱中培养。将平板生长的单菌落接种至无机盐原油培养基中，于60℃、180rpm摇床培养，观察菌落乳化效果。取乳化效果较好的单菌落，测定菌液的表面活性和乳化活性，得到一株乳化活性较高的菌株L-22，其乳化活性E24为71.43％(E24为混合液中乳化层高度与液体总高度之比)，表面张力为62.55mN/m。该菌株在无机盐培养基上的菌落形态见图1箭头所指方向。
2、菌株培养活性分析
将菌株使用LB培养基活化培养1d后，按照接种量为10％转接至无机盐培养基中，具体操作如下：5000rpm离心5min去除上清液，使用无菌水洗涤三次，接种至无机盐/葡萄糖培养基培养，于30℃、180rpm摇床培养2d。
将培养2d后的发酵液使用冷冻离心机离心，去除细胞，离心条件为10000rpm、20min，取等量的发酵液上清液和液体石蜡混合震荡2min，静置24h，测定菌液的乳化活性E24(图2a)。L-22菌液的乳化活性为71±0.24％，与同样条件下培养的XS2-450乳化活性比较，XS2-450的乳化活性E24为56.72±0.72％，单因素方差分析的结果显示L-22发酵液的乳化活性显著高于XS2-450(图2b).
进一步通过***发育分析发现两株菌存在16S序列差异，在***发育树上分别占据不同的两个分支，见图2c，为了明确区分两株菌的序列差异，L-22的16S序列使用了两次，分别为L22_1和L22_2。两株菌的16S rRNA部分基因序列如下：
>XS2-450(SEQ ID NO:1)
CGCATGGATTGATTATTATGTTATATCTATTGGACGACGGGAGCTTGCTCCCTTAGGTCAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCTGTAAGACTGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATGCTTGATTGAACCGCATGGTTCAATCATAAAAGGTGGCTTTTAGCTACCACTTACAGATGGACCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGACCTGAGAGGGTGATCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCAACGCCGCGTGAGTGATGAAGGTTTTCGGATCGTAAAACTCTGTTGTTAGGGAAGAACAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGCACCTTGACGGTACCTAACCAGAAAGCCACGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGTGGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTTTCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCCCGGCTCAACCGGGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGAACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGTGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGACTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGTTAGAGGGTTTCCGCCCTTTAGTGCTGCAGCAAACGCATTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGTCGCAAGACTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGTGGAGCATGTGTTTAATTCGAAGCAACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTGACATCCTCTGACAACCCTAGAGATAGGGCTTCCCCTTCGGGGCAGGTGACAGTGGTGCATGGTTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGAATGTTGGGTTAAGTCCCGCCACGAGCGCACCCTTGATCTTAGTTGCAGCATTCAGTTGGCACCTCTAGTGACTGCGTGACACCGAGAGGTGGATGACGTCATTCATCATGCCCTTATGACCTGACTACACCGTGCTACAATGGGCGACAGGTACGAACGCAGCCTAGCCATTCCCATATTCGTTTCTCCAGTTCCGGAATTCGCGA
>L-22(SEQ ID NO:1)
CACGGGTGCTATACTGCAGTCGAGCGGACCGAACGGAAGCTTGCTTCTGTTCGGTTAGCGGCGGACGGGTGAGTAACACGTGGGTAACCTGCCCGTAAGACCGGGATAACTCCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATAACACCGAAGACCGCATGGTCTTCGGTTGAAAGGTGGCTTTTGCTACCACTTACGGATGGGCCCGCGGCGCATTAGCTAGTTGGTGAGGTAACGGCTCACCAAGGCGACGATGCGTAGCCGGCCTGAGAGGGTGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTAGGGAATCTTCCGCAATGGACGAAAGTCTGACGGAGCGACGCCGCGTGAGCGAAGAAGGTCTTCGGATCGTAAAGCTCTGTTGTTAGGGAAGAAGAAGTACCGTTCGAATAGGGCGGTACGGTGACGGTACCTAACGAGAAAGCCCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGGGCGAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGCGCGCGCAGGCGGTCCCTTAAGTCTGATGTGAAAGCCCACGGCTCAACCGTGGAGGGTCATTGGAAACTGGGGGACTTGAGTGCAGAAGAGGAGAGCGGAATTCCACGTGTAGCGGTGAAATGCGTAGAGATGTGGAGGAACACCAGTGGCGAAGGCGGCTCTCTGGTCTGTAACTGACGCTGAGGCGCGAAAGCGTGGGGAGCAAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGATGAGTGCTAAGTGGTTAGAGGGGTTTTCCCTTTAGTGCTGTAGCTAACGCGTTAAGCACTCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTGAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGGGGAGCATGTGGTTTAATTCGAAGCACGCGAAGAACCTTACCAGGTCTTG
3、乳化剂的分离与稳定性
将发酵液在4℃，10000rpm条件下离心30min除去菌体，旋转蒸发仪按5：1的比例浓缩上清液，转移到烧杯中，加入三倍体积冷甲醇溶液(预先-20℃预冷30min)，4℃静置过夜，11000rpm，4℃离心25min收集沉淀，即为生物乳化剂粗产物。将上述提取的生物乳化剂重悬于蒸馏水，调节重悬液的pH、温度、盐度，测定其在不同条件下的乳化活性，通过测定可以得出该菌株所产的生物乳化剂在20-100℃温度，2-14的pH范围和0-25％(w/v)的盐度中的E24几乎不变，见图3-图5，和已报道的XS2-450菌株相比，XS2-450菌株所产生物乳化剂可以耐受30-60℃温度，pH值3-12的范围和1-20％(w/v)的盐度。可见该菌株产生的乳化剂适用范围比已报道菌株XS2-450所产乳化剂适用的条件更加广泛。
分别在温度为100℃、80℃和盐度为25％的条件下测定了L-22和XS2-450所产乳化剂的活性，发现在上述三种条件下，L-22菌株所产乳化剂的活性比XS2-450所产乳化剂活性均显著更高(图6)，说明L-22菌株所产乳化剂更稳定(表1)。
表1：L22和XS2-450菌所产乳化剂不同条件下的活性比较表
Figure BDA0002663038370000071
实施例2:L-22菌株对原油的乳化
将实施例1中筛选的L-22菌株使用无机盐培养基培养2d；获得的菌液中添加10％的长庆原油，在60℃、180rpm摇床震荡培养2d，以无机盐培养基作为对照。从图7中可以看出，使用长庆原油添加至L-22菌液中2d后，其完全溶解于菌液中，添加至无机盐培养基中的长庆原油2d后，其完全漂浮在液体上表面，说明L-22菌株所产生的乳化剂对于长庆原油有很强乳化活性，能够使原油溶解于发酵液中。
实施例3 L-22菌株在处理含油土壤中的应用
由于石油开采、运输等过程中，造成的石油泄漏，使土壤中含有大量的原油，为了达到国家的排放要求，因此需要对此进行处理。目前微生物处理是当下最有发展前景的一种处理方式。本发明的菌株对于原油的乳化能力较强，因此将该菌株用于处理含油土壤的应用中，并与已报道的菌株XS2-450为对照菌株进行比较。
将L-22、XS2-450菌株分别按照实例1中的培养方法进行培养。两株菌株的发酵液各取100ml，分别加入10g油泥样品，至于60℃、180rpm摇床震荡培养24h，在60℃条件下充分震荡，使其乳化油泥中的原油，静置，沉降的油渣进行深度脱油，脱除残余高黏成分，从而达到油泥中的油和残渣分离的目的，最后将乳化的上层原油全部进行回收。本实验共选取3个油泥样品，分别为大庆含油站、大庆六厂油泥、唐山油泥。图7和表2是各样品经过不同菌剂处理后的效果。
表2：菌株L-22和XS2-450乳化原油效果表
Figure BDA0002663038370000081
Figure BDA0002663038370000091
通过以上处理结果可以看出，在处理含油土壤的应用中，以L-22为菌剂进行处理时，对于各种不同来源的油泥均能够达到使油泥中的油和残渣分离的目的，且效果优于已报道的产乳化剂菌株XS2-450，因此该菌株处理含油土壤时，能够发挥巨大作用，且广泛性较强，因此该菌株在微生物处理油泥污染土壤上有很大的应用价值。
实施例4：L-22菌株在含油废弃泥浆中的应用
钻井废弃泥浆是在油田钻井过程中产生的主要污染物，其表现为油-水-泥的废弃混合物，是一种粘性高、稳定性强的多相胶体—悬浮体系，不易失水干结。这类污染物不经处理，随意排放或者处理不当，极易造成生态环境的严重破坏，危害周边区域内土壤、水、植被、动物的生存环境。针对油田钻井泥浆中的有害成分，选取具有高效转化能力的微生物，通过微生物在废弃泥浆中的生长繁殖，经过复杂的生物、化学过程对废弃泥浆中危害环境的有害成分进行高效的降解转化，使其脱毒、脱胶、脱盐碱，达到生物无害化处理的目的。
本发明分析了大庆油田废弃泥浆的理化性质，确定了其污染物主要为盐碱性石油烃污染，其含水量为60.5％，含油量为10.4％，固体物质为18.4％，其他有机物及挥发物质10.7％。处理过程：按照实例1中的方法，培养5L发酵液，将培养好的L-22菌株与大庆油田废弃泥浆按照1：1比例混合，在60℃摇床震荡培养1周后，发现钻井泥浆中的油状物易乳化分散降解，通过正己烷测定处理后的钻井泥浆中的石油烃，其降解率达到了81.73％，其含油率为1.9％，符合国家排放标准，显示了该菌株在恶劣环境中强大的生存能力以及广泛的应用性。
序列表
<110> 中国科学院天津工业生物技术研究所
<120> 一株产生物乳化剂的嗜热菌及其应用
<160> 2
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1256
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
cgcatggatt gattattatg ttatatctat tggacgacgg gagcttgctc ccttaggtca 60
gcggcggacg ggtgagtaac acgtgggtaa cctgcctgta agactgggat aactccggga 120
aaccggggct aataccggat gcttgattga accgcatggt tcaatcataa aaggtggctt 180
ttagctacca cttacagatg gacccgcggc gcattagcta gttggtgagg taacggctca 240
ccaaggcgac gatgcgtagc cgacctgaga gggtgatcgg ccacactggg actgagacac 300
ggcccagact cctacgggag gcagcagtag ggaatcttcc gcaatggacg aaagtctgac 360
ggagcaacgc cgcgtgagtg atgaaggttt tcggatcgta aaactctgtt gttagggaag 420
aacaagtacc gttcgaatag ggcggcacct tgacggtacc taaccagaaa gccacggcta 480
actacgtgcc agcagccgcg gtaatacgta ggtggcaagc gttgtccgga attattgggc 540
gtaaagcgcg cgcaggcggt ttcttaagtc tgatgtgaaa gcccccggct caaccgggga 600
gggtcattgg aaactgggga acttgagtgc agaagaggag agtggaattc cacgtgtagc 660
ggtgaaatgc gtagagatgt ggaggaacac cagtggcgaa ggcgactctc tggtctgtaa 720
ctgacgctga ggcgcgaaag cgtggggagc gaacaggatt agataccctg gtagtccacg 780
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Claims (4)

1.一种嗜热微生物，其特征在于，所述的嗜热微生物为地芽孢杆菌属（Geobacillussp.）菌株，其保藏编号为CGMCC NO:20421。
2.权利要求1所述的嗜热微生物在制备生物乳化剂中的应用。
3.权利要求1所述嗜热微生物在修复石油污染环境中的应用。
4.一种生物乳化剂，其特征在于，所述的生物乳化剂是由权利要求1所述的嗜热微生物发酵制备的。
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