CN112011480B - 一株芳香烃降解菌及其应用 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一株芳香烃降解菌及其应用。该降解菌为红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391，该菌株已于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61076。该菌株能快速降解2‑氯‑4‑硝基苯酚、联苯等多种芳香烃类化合物，可用于苯系有机污染物的治理。应用对象可包括含有芳香烃类有机污染物的水或土壤环境、工农业生活废水废渣，减少芳香烃对生态环境安全造成的危害。利用该菌降解芳香烃具有节能、环保特点，具有广阔的应用前景。

Description

一株芳香烃降解菌及其应用
技术领域
本发明涉及微生物技术领域，具体涉及一株芳香烃降解菌及其应用。
背景技术
工业革命以来，科学技术迅猛发展，给人类物质生活带来了前所未有的改变，文明得以快速进步，然而伴随工业化，全球资源环境问题日益尖锐，环境污染、生态破坏、资源环境已成为人类社会健康可持续发展的障碍，环境问题已经成为全世界人类面临的共同问题，保障生态安全构建生态文明社会是我国提出的新时代民族发展大计，也是国际科技研究热点。环境污染物是指进入环境后残留时间超过预期，直接或间接的危害人体健康或造成自然生态环境衰退的物质。环境中的污染物根据其组成元素可划分为两类：1)无机污染物：包括重金属及其氧化物、盐类、硫化物等；2)有机污染物：主要包括农药、***、持久性有机污染物(POPs)、橡胶、增塑剂及各种工业原料(如苯胺、硝基苯类等)等人工合成的各种有机化合物。
在众多有机污染物中，芳香族化合物是自然界中分布最广的一类物质，因其具有稳定的六元环结构、不易分解、较强绝缘性以及低水溶性等特点，常被用作化工原料及合成中间体，广泛地应用于工业、农业、医药业以及人们的日常生活中。据统计，这类化合物正以每年百万吨的生产量被人工大量合成与利用，然而多种的芳香族化合物如联苯、多氯联苯、硝基苯酚类以及多环芳烃类(PAHs)等已被证明具有较强的毒性即三致效应(致突变、致癌和致畸)，已被许多国家列为优先控制的污染物。因此，如何绿色、高效地修复环境中的芳香族污染物成为了科学家们研究的热点。
相较于传统物理化学修复，微生物修复具有低能耗、绿色高效等优点，在有机污染物环境修复方向开发前景广阔。已经发现许多微生物能在营养贫乏的环境中利用异型生物质作为能源物质生长繁殖，实现异型生物质的转化分解。目前研究较多的芳香烃有机物降解菌主要集中于假单胞菌属(Pseudomonas)、红球菌属(Rhodococcus)、芽孢杆菌属(Bacillus)、节杆菌属(Arthrobacter)、罗尔斯通菌属(Ralstonia)、分枝杆菌属(Mycobacterium)成员。尽管上述降解菌对单一芳香烃具有较高降解效率，然而，鲜有一种细菌可同时降解多种芳香烃类有机物的报道。水体土壤等环境往往存在多种污染物质，是否具备宽泛的降解底物谱是环境污染物微生物削减应用的重要考量因素，开发多功能降解菌株在保障环境洁净安全方面具有现实意义。
发明内容
为了解决上述环境芳香烃有机污染严重的问题，本发明提供了一种多功能芳香烃降解红球菌及其应用。本发明中的红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391能降解2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴。旨在促进微生物技术在环境芳香烃类有机污染物治理中的应用，解决环境苯系有机污染物的污染问题。
本发明是通过以下技术方案予以实现的：
本发明发现一株红球菌对芳香烃类化合物具有很好的降解效果，可用于芳香烃类污染的降解治理。
本发明从三亚红树林土壤中筛选获得一株芳香烃降解菌，命名为红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391，已于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，其保藏编号为GDMCC No：61076。
因此，红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391在降解转化芳香烃类化合物方面的应用或在提高芳香烃类降解去除率中的应用，以及在治理受芳香烃类污染的水环境和土壤方面的应用，均应在本发明的保护范围之内。
优选，所述的芳香烃为苯系有机污染物。
优选，所述的苯系有机污染物选自2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴中的至少一种。
一种芳香烃降解菌剂，其特征在于，含有上述的红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO21391。
优选，所述降解菌剂为红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391菌株的菌悬液。
优选，所述降解菌剂是红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391菌株活化培养后制备而成。具体是将红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391菌株在TSB培养基或细菌培养基中培养活化，离心收集沉淀物，经洗涤后稀释制备而成。
更优选，所述降解菌剂的制备方法为：将斜面或冷冻甘油保存的红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391接种到液体TSB培养基中，于25～30℃、150～250r/min恒温振荡培养24～48h，制得活化种子液；按1～10％v/v接种量将种子液接种到新鲜培养基，继续于25～30℃、150～250r/min恒温振荡扩大培养36～48h；然后25℃、5000r/min离心10min，弃上清收集菌体，无菌水洗涤2～3次，最后用无菌水配置成1g/L的菌悬液，即得到降解菌剂。
所述TSB培养基的配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，溶剂为水，pH为7.2，高温高压灭菌。
与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：
本发明筛选得到一株红球菌，可降解2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚和β-萘酚，72h去除率达90％以上；亦可降解芘和芴，72h去除率为10％，可用于芳香烃类有机污染的降解治理，应用对象可包括含有芳香烃类有机污染物的水或土壤等，能减少芳香烃对生态环境安全产生的危害。利用本发明的红球菌处理芳香烃污染，与物理吸附和化学降解等方法相比，具有节能、环保等优点，应用前景广阔。
本发明的红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心(GDMCC)，地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼，保藏编号为：GDMCC NO：61076。
附图说明
图1为红球菌SCSIO 21391的平板生长形态。
图2为红球菌SCSIO 21391的透射电镜成像图。
图3为红球菌SCSIO 21391的***发育树。
图4为红球菌SCSIO 21391对几种芳香烃类化合物的降解效果，图中从左到右的芳香烃类化合物依次为芘、芴、β-萘酚、联苯、2-氯-4-硝基苯酚、二溴联苯醚、联苯醚。
具体实施方式
以下结合说明书附图和具体实施例来进一步说明本发明，但实施例并不对本发明做任何形式的限定。除非特别说明，本发明采用的试剂、方法和设备为本技术领域常规试剂、方法和设备。
实施例1芳香烃降解菌的分离与鉴定
1、实验材料
无机盐培养基：(NH4)2SO4 2.0g/L，MgSO4 0.2g/L，CaCl2 0.01g/L，FeSO4 0.005g/L，Na2HPO4 1.5g/L，KH2PO4 1.5g/L，溶剂为水，pH 7.0。当制作固体培养基时，在上述的培养基成分的基础上加入18g/L的琼脂粉，具体是将上述各成分按其含量混合均匀。所述的培养基置于高压蒸汽灭菌锅中灭菌处理，121℃灭菌15min。
2、菌株的分离与鉴定
(1)芳香烃降解菌的筛选纯化
采集三亚红树林土壤样品，在超净台中将土壤加到100mL含芳香烃化合物(20mg/L)的无机盐培养基中，30℃，150r/min恒温摇床培养10d进行富集培养。取1mL富集培养物至新鲜的100mL含芳香烃化合物(50mg/L)的无机盐培养基中继续培养10d。将第二轮富集培养液按10-1-10-6梯度稀释，取200μL稀释液涂布于含20mg/L芳香烃化合物的固体无机盐培养基上，30℃倒置培养3d。对长出的菌落进行编号，并分别挑出单菌落进一步划线分离纯化。分别将单一菌落接种到含50mg/L芳香烃化合物的液体无机盐培养基中进行降解实验，考察每株菌对芳香烃类化合物的降解能力。所述的芳香烃类化合物为2-氯-4-硝基苯酚。
(2)芳香烃降解菌的鉴定
挑取对芳香烃类化合物降解效率最高的菌株SCSIO 21391至TSB固体平板上，30℃恒温培养箱静置培养3d，观察菌株形态形貌如图1所示，菌落呈现橙红色，表面干燥且凹凸不平。收集适量培养好的细菌，用磷酸盐缓冲液(pH 7.2)冲洗后，用2.5％戊二醛进行固定24h，乙醇逐级脱水，环氧丙烷置换，并利用Spurr树脂浸透包埋，最后在70℃烘箱中聚合，日立JEM1230透射电镜观察如图2所示，其细胞为长约3μm，宽约0.5μm的棒杆状，无鞭毛。
所述的TSB培养基的配方为：胰蛋白胨15g/L，大豆蛋白胨5g/L，氯化钠5g/L，溶剂为水，pH为7.2，121℃灭菌15min，其配制方法是将各成分混合均匀，灭菌。当制作固体培养基时，在上述的培养基成分的基础上加入18g/L的琼脂粉。
提取菌株SCSIO 21391的基因组DNA，以基因组DNA为模板，使用16S rDNA扩增通用引物27F(5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3')和1492R(5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3')进行PCR扩增。对产物进行Sanger测序，测序委托上海生工生物工程有限公司完成，其16S rDNA的序列如SEQ ID NO.1所示。对获得的16S rDNA进行Blast比对，发现与Rhodococcusimtechensis的亲缘关系最近(99％一致性)。构建了***发育树，如图3所示。
综合上述的形态与分子鉴定结果，本发明筛选得到的菌株SCSIO 21391鉴定为红球菌Rhodococcus sp.将其命名为：红球菌(Rhodococcus sp.)SCSIO 21391。并于2020年7月13日保藏于广东省微生物菌种保藏中心，保藏编号为GDMCC No：61076；保藏地址：广州市先烈中路100号大院59号楼5楼。
实施例3红球菌SCSIO 21391对芳香烃的降解实验
(1)菌悬液的制备
从斜面或甘油保藏液中刮取1环红球菌SCSIO 21391，接入已灭菌的TSB培养基中，置于恒温摇床(30℃，150r/min)培养48h，制得活化种子液；按1％v/v接种量将种子液接种到新鲜培养基，继续于30℃、150r/min恒温振荡扩大培养48h。取红球菌SCSIO 21391培养液，在25℃、5000r/min下离心10min，弃上清收集菌体，用无菌水洗涤2次后用磷酸盐缓冲液(50mM，pH 7.2)重悬至OD600为2.0左右，得到菌悬液，置于4℃冰箱中备用。
(2)芳香烃化合物的检测
以岛津气相色谱质谱联用仪(GCMS-QP2010 Ultra)对样品进行GC-MS分析，色谱柱为Varian CP-Sil 8CB column(0.25mm×30m×0.25μm)，进样口和检测器的温度均为300℃，柱温箱条件如下：40℃保持1min，然后5℃/min升至280℃，以氦气为载气，流速为1mL/min，进样量为1μL。
以安捷伦1260高效液相对样品进行检测，仪器配置为：Zorbax SB-C18ODS色谱柱(4.6×150mm，5μm，Agilent Technologies,Palo Alto,CA,USA)，检测器为二级阵列检测器(Diode array detector，DAD)，检测波长为320nm。流动相：A：含有0.1％(v/v)冰乙酸的去离子水；B：含有0.1％(v/v)冰乙酸的甲醇。梯度洗脱条件为：0-5min，5％B；5-25min，5％B线性增加至100％B；并保持5min。流速为1.0mL/min，柱温保持30℃。
(3)红球菌SCSIO 21391对芳香烃化合物的降解效应
将步骤(1)得到的菌悬液接种至含有50mg/L葡萄糖的无机盐培养基中，分别添加不同芳香烃化合物芘、芴、β-萘酚、联苯、2-氯-4-硝基苯酚、二溴二苯醚、二苯醚。芳香烃化合物的终浓度分别为50mg/L。控制接种红球菌SCSIO 21391终浓度为OD600＝0.1，于30℃，150r/min恒温摇床培养72h后，使用气相/液相检测培养液中芳香烃的残留量，与不添加菌悬液的对照组进行比较。结果如图4所示，在上述实验条件下，2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚和β-萘酚的去除率达90％以上，芘和芴的去除率为10％。文献报道与红球菌SCSIO 21391亲缘关系最近的物种Rhodococcus imtechensis RKJ300可降解对硝基苯酚和2-氯-4-硝基苯酚(Ghosh A,Khurana M,Chauhan A,et al.Degradation of 4-nitrophenol,2-chloro-4-nitrophenol,and 2,4-dinitrophenol by Rhodococcusimtechensis strain RKJ300[J].Environmental Science&Technology:2010,44:1069-1077.)，Rhodococcus wratislaviensis可降解2-氯-4-硝基苯酚(Gemini V,Gallego A,DeOliveira V,et al.Biodegradation and detoxification of p-nitrophenol byRhodococcus wratislaviensis[J].International Biodeterioration&Biodegradation,2005,55:103-108.)，但是未有报道上述菌株可同时降解2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴。本发明所述红球菌SCSIO 21391具有宽泛的降解芳香烃底物谱，优于文献报道同属物种，这种宽泛的芳香烃底物适应特性使该菌株在环境有机污染物质的降解修复方面具有应用前景。
以上仅是本发明的优选实施方式，应当指出的是，上述优选实施方式不应视为对本发明的限制，本发明的保护范围应当以权利要求所限定的范围为准。对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明的精神和范围内，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
序列表
<110> 中国科学院南海海洋研究所
<120> 一株芳香烃降解菌及其应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1328
<212> DNA
<213> 红球菌 SCSIO 21391(Rhodococcus sp.SCSIO 21391)
<400> 1
ggtacacgag cggcgaacgg gtgagtaaca cgtgggtgat ctgccctgca cttcgggata 60
agcctgggaa actgggtcta ataccggata tgaccttcgg ctgcatggct gagggtggaa 120
aggtttactg gtgcaggatg ggcccgcggc ctatcagctt gttggtgggg taatggccta 180
ccaaggcgac gacgggtagc cgacctgaga gggtgaccgg ccacactggg actgagacac 240
ggcccagact cctacgggag gcagcagtgg ggaatattgc acaatgggcg aaagcctgat 300
gcagcgacgc cgcgtgaggg atgacggcct tcgggttgta aacctctttc agcagggacg 360
aagcgaaagt gacggtacct gcagaagaag caccggccaa ctacgtgcca gcagccgcgg 420
taatacgtag ggtgcaagcg ttgtccggaa ttactgggcg taaagagctc gtaggcggtt 480
tgtcgcgtcg tctgtgaaaa ctcgaggctc aacctcgagc ttgcaggcga tacgggcaga 540
cttgagtact gcaggggaga ctggaattcc tggtgtagcg gtgaaatgcg cagatatcag 600
gaggaacacc ggtggcgaag gcgggtctct gggcagtaac tgacgctgag gagcgaaagc 660
gtgggtagcg aacaggatta gataccctgg tagtccacgc cgtaaacggt gggcgctagg 720
tgtgggtttc cttccacggg atccgtgccg tagctaacgc attaagcgcc ccgcctgggg 780
agtacggccg caaggctaaa actcaaagga attgacgggg gcccgcacaa gcggcggagc 840
atgtggatta attcgatgca acgcgaagaa ccttacctgg gtttgacata taccggaaag 900
ccgtagagat acggcccccc ttgtggtcgg tatacaggtg gtgcatggct gtcgtcagct 960
cgtgtcgtga gatgttgggt taagtcccgc aacgagcgca acccttgtct tatgttgcca 1020
gcacgtaatg gtggggactc gtaagagact gccggggtca actcggagga aggtggggac 1080
gacgtcaagt catcatgccc cttatgtcca gggcttcaca catgctacaa tggccagtac 1140
agagggctgc gagaccgtga ggtggagcga atcccttaaa gctggtctca gttcggatcg 1200
gggtctgcaa ctcgaccccg tgaagtcgga gtcgctagta atcgcagatc agcaacgctg 1260
cggtgaatac gttcccgggc cttgtacaca ccgcccgtca cgtcatgaaa gtcggtaaca 1320
cccgaagc 1328

Claims (7)

1.一株可降解芳香烃的红球菌（Rhodococcus sp.）SCSIO 21391，其保藏编号为：GDMCCNo：61076，所述的芳香烃选自2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴中的至少一种。
2.权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）SCSIO 21391在降解芳香烃中的应用，所述的芳香烃选自2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴中的至少一种。
3.权利要求1所述的红球菌（Rhodococcus sp.）SCSIO 21391在芳香烃污染的土壤和/或水体的生物修复中的应用，所述的芳香烃选自2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴中的至少一种。
4.一种芳香烃降解菌剂，其特征在于，含有权利要求1所述的红球菌（Rhodococcussp.）SCSIO 21391，所述的芳香烃选自2-氯-4-硝基苯酚、联苯、联苯醚、二溴联苯醚、β-萘酚、芘和芴中的至少一种。
5.根据权利要求4所述的芳香烃降解菌剂，其特征在于，所述降解菌剂为红球菌（Rhodococcussp.）SCSIO 21391菌株的菌悬液。
6.根据权利要求4或5所述的芳香烃降解菌剂，其特征在于，所述降解菌剂是红球菌（Rhodococcus sp.）SCSIO 21391菌株活化培养后制备而成。
7.根据权利要求6所述的芳香烃降解菌剂，其特征在于，所述降解菌剂的制备方法为：将红球菌（Rhodococcus sp.）SCSIO 21391接种到液体TSB培养基中，恒温振荡培养制得活化种子液；将种子液接种到新鲜培养基，继续扩大培养后，离心弃上清液收集菌体，重悬得到菌悬液，即为降解菌剂。
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