CN101624576B

CN101624576B - 具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌及其应用

Info

Publication number: CN101624576B
Application number: CN2009100960289A
Authority: CN
Inventors: 陈建孟; 张丽丽; 王家德; 朱润晔
Original assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Current assignee: Zhejiang University of Technology ZJUT
Priority date: 2009-01-23
Filing date: 2009-01-23
Publication date: 2010-12-08
Anticipated expiration: 2029-01-23
Also published as: CN101624576A

Abstract

本发明提供了一株具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌(Mycobacterium cosmeticum)byf-4及其应用，所述分枝杆菌byf-4保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430074，保藏日期：2008年10月29日，保藏编号：CCTCC No：M208180。本发明的有益效果主要体现在：本发明菌株可高效、快速降解各类苯系化合物，对于苯系化合物及其衍生物引起的污染物的生物净化的工程实践具有重要意义。

Description

具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌及其应用

(一)技术领域

本发明涉及一株具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌(Mycobacterium cosmeticum)byf-4及其应用。

(二)背景技术

苯系化合物是一类易挥发的单环芳香类化合物，包括苯、甲苯、乙苯、二甲苯等，简称为BTEX，广泛应用于石油、化工、农药、纺织、造纸、油漆、制鞋等工业的生产过程，是环境中分布较广的一类有毒化合物。BTEX具有“三致效应”，被许多国家列入优先控制污染物，且已被确认为强致癌物质。研发废水、废气中BTEX的污染控制技术显得十分重要和迫切。目前，生物降解技术是降解这类物质的最有效方法之一。

采用生物法净化废水、废气中BTEX等有毒化合物的关键之一便是获得具有高效降解BTEX能力的优良菌株。人们已经分离出了多株单环芳香类化合物降解菌，主要有假单胞菌(Pseudomonas)、不动杆菌(Acinetobacter)、红球菌(Rhodococcus)、罗尔斯通氏菌(Ralstonia)、产碱杆菌(Alcaligenes)、黄杆菌属(Flavobacterium)、孢瓶霉属真菌(Cladophialophora)、诺卡氏菌(Nocardia)等。这些降解菌株仅能降解某一种或两种苯系化合物，且大多数菌株的降解效率有待进一步提高，而对BTEX混合物中各物质均能实现高效降解的菌株并不多见。

(三)发明内容

本发明的目的是提供一株高效、快速降解苯系化合物的菌种及其应用。

本发明采用的技术方案是：

具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌(Mycobacterium cosmeticum)byf-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，地址：中国武汉武汉大学，430074，保藏日期：2008年10月29日，保藏编号：CCTCC No：M 208180。本发明的降解菌株可实现高效降解BTEX混合物，因此，在实际应用中可发挥更重要的作用。经检索，目前未有在好氧条件下应用Mycobacteriumcosmeticum降解BTEX的报道，因此该降解菌的发现对BTEX类污染物生物净化的工程实践具有重要意义。

所述Mycobacterium cosmeticum byf-4(CCTCC No：M 208180)来源于中国石化浙江镇海炼化污水处理厂曝气池中的活性污泥中，经驯化、分离、纯化获得。

该菌株在固体培养基中呈淡乳白色，圆形，边缘整齐，光滑湿润，直径为0.5～1mm；菌体的形态为短杆菌，长度在2μm左右；无芽孢；好氧，革兰氏染色阴性，接触氧化酶阴性，能以BTEX混合物或其中的单一物质为唯一碳源，其生理生化特征如表1所示。Mycobacterium cosmeticumbyf-4CCTCC No：M 208180的16S rDNA序列如下：

ttaacacatgcaagtcgaacggaaaggcccttcggggtgctcgagtggcgaacgggtgagtaacacgtgggtgatctgccctgcactttgggataagcctgggaaactgggtctaataccgaataggactccggccttcatgggttggggtggaaagcttttgcggtgtgggatgggcccgcggcctatcagcttgttggtggggtaatggcctaccaaggcgacgacgggtagccggcctgagagggtgaccggccacactgggactgagatacggcccagactcctacgggaggcagcagtggggaatattgcacaatgggcgcaagcctgatgcagcgacgccgcgtgagggatgacggccttcgggttgtaaacctctttcagcacagacgaagcgcaagtgacggtatgtgcagaagaaggaccggccaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtagggtccgagcgttgtccggaattactgggcgtaaagagctcgtaggtggtttgtcgcgttgttcgtgaaaactcacagcttaactgtgggcgtgcgggcgatacgggcaga ctggagtactgcaggggagactggaattcctggtgtagcggtggaatgcgcagatatcaggaggaacaccggtggcgaaggcgggtctctgggcagtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattagataccctggtagtccacgccgtaaacggtgggtactaggtgtgggtttccttccttgggatccgtgccgtagctaacgcattaagtaccccgcctggggagtacggccgcaaggctaaaactcaaaggaattgacgggggcccgcacaagcggcggagcatgtggattaattcgatgcaacgcgaagaaccttacctgggtttgacatgcacaggacgctggtagagatatcagttcccttgtggcctgtgtgcaggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgagcgcaacccttgtcctatgttgccagcgggttatgccggggactcgtaggagactgccggggtcaactcggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgtccagggcttcacacatgctacaatggccggtacaaagggctgcgatgccgtgaggtggagcgaatccttgtaaagccggtctcagttcggatcggggtctgcaactcgaccccgtgaagtcggagtcgctagtaatcgcagatcagcaacgctgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtcacgtcatgaaagtcggtaacacccgaagccggtggcctaaccccttgtgggagggagccgtcgaaggtgggatcggcgattgggacgaagtcgaacaa

该降解菌株生理生化性能见表1：

表1：Mycobacterium cosmeticum byf-4的生理生化特征

实验项目	结果
		M.R(甲基红)	-
V.P实验	-
		淀粉水解酶	-
吲哚实验	+
		硝酸盐还原	+
明胶实验	+
		H<sub>2</sub>S实验	-
葡萄糖	+
		乳糖	-

附注：“+”表示能利用或反应阳性；“-”表示不能利用或反应阴性

本发明还涉及所述的分枝杆菌byf-4在降解苯系化合物及其衍生物中的应用。

所述分枝杆菌byf-4可用于降解工业废水或废气中的苯系化合物及其衍生物。用于降解废水中的苯系化合物时，按照本领域常规方法将分枝杆菌byf-4接种至含有苯系化合物的废水中，在适宜分支杆菌生长的条件下进行培养即可；用于降解废气中的苯系化合物时，按照本领域常规方法，在适宜分支杆菌生长的条件下，将废气通入分枝杆菌byf-4的菌液中进行处理即可。

具体的，所述应用为：将分枝杆菌byf-4菌体悬浮于含有苯系化合物及其衍生物的废水中，在15～35℃、pH5～9条件下培养，降解废水中的苯系化合物及其衍生物。

优选的，所述应用为：将分枝杆菌byf-4菌体悬浮于含有苯系化合物及其衍生物的废水中，在30℃、pH7条件下培养，降解废水中的苯系化合物及其衍生物。

所述苯系化合物优选为下列之一或其中两种以上的混合物：苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯。

本发明的有益效果主要体现在：本发明菌株可高效、快速降解各类苯系化合物，对于苯系化合物及其衍生物引起的污染物的生物净化的工程实践具有重要意义。

(四)附图说明

图1为Mycobacterium cosmeticum byf-4显微镜和扫描、透射电镜照片(a，革兰氏染色显微镜图片；b，扫描电镜图片；c，透射电镜图片)；

图2为Mycobacterium cosmeticum byf-4的***发育树图；

图3为不同温度下菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解曲线图；

图4为不同pH下菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解曲线；

图5为菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对不同初始浓度的苯的降解曲线图；

图6为菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对不同初始浓度的甲苯的降解曲线图；

图7为菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对不同初始浓度的乙苯的降解曲线图；

图8为菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对不同初始浓度的邻二甲苯的降解曲线图；

图9为菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对混合底物的降解曲线图。

(五)具体实施方式

下面结合具体实施例对本发明进行进一步描述，但本发明的保护范围并不仅限于此(如未特别说明，实施例中百分比浓度均指质量百分比浓度)：

实施例1：Mycobacterium cosmeticum byf-4的分离、纯化及其鉴定

1.Mycobacterium cosmeticum byf-4的分离及纯化

Mycobacterium cosmeticum byf-4是从浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥中取样，经驯化、分离及纯化得到的一株革兰氏阴性菌。具体步骤如下：

(1)污泥定向驯化

取浙江镇海炼化污水处理厂曝气池的活性污泥。活性污泥进行苯系化合物(BTEX)定向驯化，每5天为一驯化周期，驯化3个月，直至活性污泥对苯系化合物实现稳定高效降解。

(2)菌株的筛选与纯化

利用苯系物降解菌筛选培养基对活性污泥进行菌株筛选。苯系物降解菌筛选培养基配制：KH₂PO₄，0.5g；K₂HPO₄，0.5g；NaCl，0.01g；NH₄Cl，1g；MgCl₂·6H₂O，0.2g；CaCl₂，0.02g；MnSO₄，0.339mg；ZnSO₄，0.428mg；钼酸铵，0.347mg；琼脂，15g；蒸馏水，1000ml；pH 7.2～7.4。苯系物另外分别添加：苯，200mg/l；甲苯，200mg/l；乙苯，200mg/l；邻二甲苯：200mg/l。

按照菌株分离纯化的常规方法，在恒温培养箱28℃培养2～3天，挑取平板上长出的单菌落，得到多株纯菌落。

将筛选到的多株苯系物降解菌在含有苯系化合物为唯一碳源的无机盐培养基中考察菌株对苯系化合物的去除效果，通过同空白实验的对照，结果得到了一株高效降解苯系化合物的菌株byf-4。所用的培养基成分为：苯0.1g/L，甲苯0.1g/L，乙苯0.1g/L，邻二甲苯0.1g/L，NH₄Cl 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.08g/L，K₂HPO₄0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，溶剂为水，pH 7.2～7.4。

2.Mycobacterium cosmeticum byf-4的16S rDNA鉴定

通过16S rRNA序列分析和Biolog微生物鉴定***鉴定，确定byf-4菌为Mycobacterium cosmeticum。具体步骤如下：

采用3S柱离心式环境样品DNA回收试剂盒(V2.2，上海申能***生物科技有限公司)提取Mycobacterium cosmeticum byf-4的DNA，4℃保存。然后作为PCR反应的模板，设计引物，扩增Mycobacteriumcosmeticum byf-4的全序列DNA，上下游引物序列分别如下：

BSF8/20：5′-AGAGT TTGAT CCTGG CTCAG-3′

BSR1541/20：5′-AAGGA GGTGA TCCAGCCGCA-3′

PCR反应程序设定为：先94℃预变性4min；然后94℃变性1min，59℃退火1min，72℃延伸1.5min，循环35个周期；然后72℃延伸10min；最后4℃保持10min。将PCR产物进行测序(上海英骏)，测序结果见SEQID No.1。

将byf-4的16S rDNA序列上传到Genbank，获得Genbank的登录号FJ169473，同时同Genbank中的基因序列进行同源性比较，发现其属于Mycobacterium属，然后通过***发育树的建立，byf-4可能为Mycobacterium cosmeticum，图2为该菌的***发育树图，图1为该菌的显微镜和扫描、透射电镜照片。为了进一步确定鉴定结果，通过各项生理生化实验以及Biolog微生物鉴定***的分析，最终确定byf-4为Mycobacterium cosmeticum。

实施例2：Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX生物降解性能检测

1.不同温度下菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的生物降解特性

在不同温度下实施Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解实验，发现其在25～35℃具有较高的降解苯系化合物的能力，从实际应用角度看，30℃为最为适宜的温度，此时去除率最高，具体实施步骤如下：

在含有苯系化合物为唯一碳源的无机培养基(终浓度组成为：苯50mg/L、甲苯50mg/L、乙苯50mg/L、邻二甲苯50mg/L，NH₄Cl 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.08g/L，K₂HPO₄0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，溶剂为水，pH 7.2～7.4)加入新鲜培养的byf-4的菌悬液，OD₆₀₀为0.2，接种量为1ml/50ml，分取50ml培养基分装至5个250ml的盐水瓶中，分别置于15℃、 20℃、25℃、30℃、35℃的摇床中160rpm培养；另外准备5个同样的未接菌的培养基分别置于对应的温度同时培养，作为空白对照。培养48h后，取样气相检测苯系化合物的浓度，同时测定菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制苯系物去除率曲线图。

结果如图3所示，表明在温度为15℃时，菌株对苯系化合物的去除率较低。随着温度的逐渐提高，菌株对苯系化合物的去除率也随之提高；在温度为25～35℃时为该菌株较为适宜生长的温度，菌株的生长和对苯系物的去除率都达到了较高的值；温度30℃时达到了最大值，48h对苯系物的去除率分别为苯，98.2％；甲苯，95.6％；乙苯，78.3％；邻二甲苯，68.4％。随着温度的进一步提高，菌株的生长和降解能力开始下降。

2.不同pH下菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解特性

在不同pH下实施Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解实验，结果表明其最佳的生长降解pH值为7，具体实施方案如下：

在5个250ml的盐水瓶中加入50ml等量的无机盐培养基，苯系化合物作为唯一碳源，培养基终浓度组成同上，分别调节pH至5、6、7、8、9；同时准备5瓶相同的培养基作为空白对照。均接种1ml新鲜培养的byf-4菌悬液，OD₆₀₀为0.2，在30℃，160rpm下培养。分别在0h，48h取样，检测培养基中的苯系化合物浓度变化和菌株的菌密度(OD₆₀₀)，绘制苯系物去除率曲线图。

结果如图4所示，在pH为5、9时，byf-4对苯系物去除效率较差。在pH为5的培养液中，溶液较澄清，同空白溶液一样，表明菌株生长十分不好。在pH为5～9的条件下，细菌都能以苯系化合物为唯一碳源生长，只是生长和降解速率有所不同，在pH为时，菌株byf-4的生长和降解速率最快，对苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯48h的去除率分别为97.4％、95.8％、86.5％、60.5％。

3.菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对不同初始浓度的BTEX的降解情况

在不同苯系物初始浓度下，实施byf-4对苯、甲苯、乙苯和邻二甲苯四种苯系物的降解，结果发现byf-4对苯、甲苯、乙苯和邻二甲苯的耐受浓度为500mg/1、300mg/l、125mg/l、200mg/l。具体实施方案如下：

在250ml的盐水瓶中加入50ml的无机盐培养基(除碳源外其他组分终浓度为：NH₄Cl 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.08g/L，K₂HPO₄0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，溶剂为水，pH 7.2～7.4)，苯系化合物作为唯一碳源。苯的终浓度分别为25、50、150、300、500mg/l；甲苯的终浓度分别为25、50、150、200、300mg/l；乙苯的终浓度分别为25、50、75、100、125mg/l；邻二甲苯的终浓度分别为25、50、100、150、200mg/l。分别接种等量1mlOD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养，间隔一段时间取样，绘制byf-4对苯系物的降解曲线图。

从图5～图8可以看出在苯浓度低于500mg/l时，byf-4可快速地降解苯，细菌生长良好，而高于500mg/l时，菌株受到强烈抑制；由于受甲苯在水中的溶解度限制，甲苯的最高浓度只做到300mg/l，当甲苯浓度在300mg/l以内时，byf-4都可快速地降解甲苯，细菌生长良好；byf-4对乙苯、邻二甲苯的降解速度要慢于苯和甲苯，当乙苯、邻二甲苯浓度分别大于125mg/l、150mg/l时，byf-4的生长降解受到抑制，不能高效降解。

4.菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对混合底物的降解情况

在以苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯四种苯系物为混合底物，实施菌Mycobacterium cosmeticum byf-4对BTEX的降解特性，结果表明其对四种物质的降解难易程度为邻二甲苯＞乙苯＞苯＞甲苯。具体实施方案如下：

在250ml的盐水瓶中加入50ml的无机盐培养基(终浓度组成为：苯50mg/L、甲苯50mg/L、乙苯50mg/L、邻二甲苯50mg/L，NH₄Cl 0.1g/L，MgCl₂·6H₂O 0.08g/L，K₂HPO₄0.25g/L，CaCl₂·2H₂O 0.1g/L，溶剂为水，pH 7.2～7.4)，苯系化合物作为唯一碳源，总浓度分别都为50mg/L。接种1ml OD₆₀₀为0.2的菌悬液，30℃，160rpm培养。每隔一段时间取样，检测培养基中的苯系化合物浓度和菌密度(OD₆₀₀)，直到降解完全。绘制苯系物的降解曲线和菌株生长图。

结果如图9所示，在降解初期，菌株对苯系物的降解有5～10h左右的延滞期，同时菌株生长缓慢；在15h后，菌株开始适应该环境，进入对数生长期，苯系物被快速降解，从图中可以看出，byf-4对甲苯的去除速率要明显快于苯、乙苯和邻二甲苯；在35h时，甲苯被降解完全，苯、乙苯、邻二甲苯先后在41h、45h、50h被降解完。菌株的菌密度在30～45h达到最大值，50h后菌株进入衰退期。

SEQUENCE LISTING

<110>浙江工业大学

<120>具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌byf-4及其应用

<130>

<160>3

<170>PatentIn version 3.2

<210>1

<211>1433

<212>DNA

<213>Mycobacterium cosmeticum

<400>1

ttaacacatg caagtcgaac ggaaaggccc ttcggggtgc tcgagtggcg aacgggtgag 60

taacacgtgg gtgatctgcc ctgcactttg ggataagcct gggaaactgg gtctaatacc 120

gaataggact ccggccttca tgggttgggg tggaaagctt ttgcggtgtg ggatgggccc 180

gcggcctatc agcttgttgg tggggtaatg gcctaccaag gcgacgacgg gtagccggcc 240

tgagagggtg accggccaca ctgggactga gatacggccc agactcctac gggaggcagc 300

agtggggaat attgcacaat gggcgcaagc ctgatgcagc gacgccgcgt gagggatgac 360

ggccttcggg ttgtaaacct ctttcagcac agacgaagcg caagtgacgg tatgtgcaga 420

agaaggaccg gccaactacg tgccagcagc cgcggtaata cgtagggtcc gagcgttgtc 480

cggaattact gggcgtaaag agctcgtagg tggtttgtcg cgttgttcgt gaaaactcac 540

agcttaactg tgggcgtgcg ggcgatacgg gcagactgga gtactgcagg ggagactgga 600

attcctggtg tagcggtgga atgcgcagat atcaggagga acaccggtgg cgaaggcggg 660

tctctgggca gtaactgacg ctgaggagcg aaagcgtggg gagcgaacag gattagatac 720

cctggtagtc cacgccgtaa acggtgggta ctaggtgtgg gtttccttcc ttgggatccg 780

tgccgtagct aacgcattaa gtaccccgcc tggggagtac ggccgcaagg ctaaaactca 840

aaggaattga cgggggcccg cacaagcggc ggagcatgtg gattaattcg atgcaacgcg 900

aagaacctta cctgggtttg acatgcacag gacgctggta gagatatcag ttcccttgtg 960

gcctgtgtgc aggtggtgca tggctgtcgt cagctcgtgt cgtgagatgt tgggttaagt 1020

cccgcaacga gcgcaaccct tgtcctatgt tgccagcggg ttatgccggg gactcgtagg 1080

agactgccgg ggtcaactcg gaggaaggtg gggatgacgt caagtcatca tgccccttat 1140

gtccagggct tcacacatgc tacaatggcc ggtacaaagg gctgcgatgc cgtgaggtgg 1200

agcgaatcct tgtaaagccg gtctcagttc ggatcggggt ctgcaactcg accccgtgaa 1260

gtcggagtcg ctagtaatcg cagatcagca acgctgcggt gaatacgttc ccgggccttg 1320

tacacaccgc ccgtcacgtc atgaaagtcg gtaacacccg aagccggtgg cctaacccct 1380

tgtgggaggg agccgtcgaa ggtgggatcg gcgattggga cgaagtcgaa caa 1433

<210>2

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>2

agagtttgat cctggctcag 20

<210>3

<211>20

<212>DNA

<213>Unknown

<220>

<223>人工序列

<400>3

aaggaggtga tccagccgca 20

Claims

1.具有降解苯系化合物能力的分枝杆菌(Mycobacterium cosmeticum)byf-4，保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC No：M208180。

2.如权利要求1所述的分枝杆菌byf-4在降解苯系化合物中的应用，所述苯系化合物为下列之一或其中两种以上的混合物：苯、甲苯、乙苯、邻二甲苯。

3.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述分枝杆菌byf-4用于降解工业废水或废气中的苯系化合物。

4.如权利要求2所述的应用，其特征在于所述应用为：将分枝杆菌byf-4菌体悬浮于含有苯系化合物的废水中，在15～35℃、pH5～9条件下培养，降解废水中的苯系化合物。

5.如权利要求4所述的应用，其特征在于所述应用为：将分枝杆菌byf-4菌体悬浮于含有苯系化合物的废水中，在30℃、pH7条件下培养，降解废水中的苯系化合物。