JP2001033453A

JP2001033453A - リガンドの測定方法

Info

Publication number: JP2001033453A
Application number: JP11210424A
Authority: JP
Inventors: Shin Suai; 伸諏合; Norio Shibata; 典緒柴田; Yoshiyuki Ohiro; 義幸大広
Original assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Current assignee: Eiken Chemical Co Ltd
Priority date: 1999-07-26
Filing date: 1999-07-26
Publication date: 2001-02-09

Abstract

(57)【要約】【課題】本発明は、標識レセプターとリガンドとを反応
させて形成する複合体を分離手段により分離し、リガン
ドとの反応に関与しないで分離手段を通過した標識レセ
プターを測定する新規なリガンドの測定方法であり、従
来の方法に比べて一層精密な試料中の微量成分の測定が
可能となるリガンドの測定方法の提供。【解決手段】以下の工程を含むリガンドの測定方法。 (a)リガンドに対して特異的なレセプター、および／ま
たは表面に前記リガンドに対して特異的な前記レセプタ
ーを有する粒子と、前記リガンドに対して特異的な標識
レセプター、および／または表面に前記リガンドに対し
て特異的な前記標識レセプターを有する粒子と、前記リ
ガンドを含む試料とを反応させて複合体を形成する工
程、(b)形成した前記複合体を分離手段により分離する
工程、(c)前記リガンドとの反応に関与しないで前記分
離手段を通過した未反応の前記標識レセプター、および
／または該未反応の標識レセプターを有する粒子を展開
相で展開する工程、(d)展開した前記未反応の標識レセ
プター量を測定する工程。

Description

【発明の詳細な説明】

【０００１】

【発明の属する技術分野】本発明は、生体試料中のリガ
ンドの測定方法に関し、特に妊娠の診断、便潜血の有無
の判定、細菌やウイルス検査などを目的として、尿、糞
便、血液などの生体試料中に含有されるリガンドをクロ
マトグラフィー媒体を利用して測定する方法に関するも
のである。

【０００２】

【従来の技術】従来から、医学診断薬の分野で液体試料
中に含まれる微量物質の測定法として種々の分析法が開
発されている。とりわけ、高感度測定法として抗原抗体
反応を利用した免疫分析法が幅広く用いられ、臨床分野
ではこの測定原理を応用した装置を用いて微量物質を分
析している（特開昭４７−１８５９７号公報、同５３−
４７５１８号公報等）。

【０００３】更に、医院や一般家庭でも、この免疫反応
を利用した簡易測定の必要性が高まり、その目的のため
の簡易型測定装置の開発も進歩しつつあり、中でもいわ
ゆる「スティック」と呼ばれる測定装置または免疫測定
方法が数多く提案されている（特表昭６２−５０１０３
４号公報、特開昭６３−１１８６５７号公報、同６４−
４６３号公報等）。

【０００４】この免疫測定方法では、一般にクロマトグ
ラフィー媒体を用いて展開された試料中の抗原を酵素、
蛍光物質または発光物質などの標識物質で標識された第
一抗体と反応させ、クロマトグラフィー媒体上に固定さ
れた第二抗体との間で抗体−抗原−標識抗体複合体の所
謂サンドイッチ型免疫複合体を形成させ、固定化された
マーカーに由来する発色、蛍光、発光に基づいて測定対
象物質量を測定するというものである（特開平５−１５
０８８１号公報、同５−１５０８８２号公報等）。

【０００５】しかしながら、これらの方法においては、
マーカー標識抗体として、測定対象物質の認識部位が測
定対象物質中に通常１つしかないモノクローナル抗体を
用いた場合には、固定化抗体−測定対象物質−マーカー
標識抗体からなる所謂サンドイッチ型免疫複合体中のマ
ーカー粒子（金コロイド、着色ラテックス等）は、測定
対象物質１個に対して少なくとも１個にしかなり得ない
ため必ずしも充分な感度が得られない、という問題点が
あった（特開平１０−６８７３０号公報）。

【０００６】この問題を解決するため、少なくとも２種
類のモノクローナル抗体を用いたり、また、ポリクロー
ナル抗体を用いる場合には、これとは別に１種以上のモ
ノクローナル抗体を用いていて感度の向上を図ってい
た。しかしながら、このような組み合わせを選定するす
るためには、一般に酵素免疫測定法を利用して行われる
が、良い組み合わせが見つからない場合には、再度抗体
を作製し直さなければならないという問題があった。

【０００７】この抗体の組み合わせという煩雑な選定手
段を解消するため、液体中に存在する抗原と、その抗原
に対して特異的な抗体とを免疫学的に結合し、かつ標識
抗体とを反応させて免疫複合体を形成した後、その免疫
複合体と未反応物を物理的大きさに分けるためのフィル
タを備え、未反応物を含む溶液を吸収すると共に、その
免疫複合体を保持し、測定することにより試料の有無を
検知または定量する免疫測定装置が提案されている（特
開平９−２７４０３９号公報）。

【０００８】

【発明が解決しようとする課題】しかしながら、上述し
た免疫測定装置や免疫測定方法は、いずれも免疫複合体
を定性的または半定量的に測定するに止まり、免疫複合
体を濾過手段等により分離し、濾過手段を通過した未反
応の標識物質を測定する方法については、全く示唆され
ていない。従って本発明は、標識レセプターとリガンド
とを反応させて形成する複合体を分離手段により分離
し、リガンドとの反応に関与しないで分離手段を通過し
た未反応の標識レセプターを測定する新規なリガンドの
測定方法を提供することを目的とする。

【０００９】

【課題を解決するための手段】本発明者らは、上記課題
を解決すべく鋭意研究した結果、リガンドと標識レセプ
ターとの複合体を分離手段で捕捉し、分離手段を通過し
た未反応の標識レセプター量または未反応の標識リガン
ド量を測定することによって、更に一層精密な試料中の
微量成分の測定が可能となることを見出し、本発明に到
達した。

【００１０】本発明は、以下の工程を含むリガンドの測
定方法を特徴とする。 (a)リガンドに対して特異的なレセプター、および／ま
たは表面に前記リガンドに対して特異的な前記レセプタ
ーを有する粒子と、前記リガンドに対して特異的な標識
レセプター、および／または表面に前記リガンドに対し
て特異的な前記標識レセプターを有する粒子と、前記リ
ガンドを含む試料とを反応させて複合体を形成する工
程、(b)形成した前記複合体を分離手段により分離する
工程、(c)前記リガンドとの反応に関与しないで前記分
離手段を通過した未反応の前記標識レセプター、または
該未反応の標識レセプターを有する粒子を展開相で展開
する工程、(d)展開した前記未反応の標識レセプター量
を測定する工程。

【００１１】また、本発明は、以下の工程を含むリガン
ドの測定方法を特徴とする。 (a)リガンドに対して特異的なレセプターおよび／また
は表面に前記リガンドに対して特異的な前記レセプター
を有する粒子と、標識リガンドおよび／または標識リガ
ンドを有する粒子と、前記リガンドを含む試料とを反応
させて複合体を形成する工程、(b)形成した前記複合体
を分離手段により分離する工程、(c)前記レセプターと
の反応に関与しないで前記分離手段を通過した未反応の
標識リガンド、または標識リガンドを有する粒子を展開
相で展開する工程、(d)展開した前記未反応の標識リガ
ンド量を測定する工程。

【００１２】以下、本発明について更に詳細に説明す
る。

【００１３】本発明において、測定可能なリガンドとし
ては、レセプターと特異的結合作用を有する限り、公知
のものの中から適宜選択することができる。このリガン
ド／レセプターの具体例としては、抗原／抗体に限定さ
れず、酵素／基質、一本鎖ＤＮＡ／ＤＮＡの相補鎖、ビ
オチン／アビジンなどが挙げられる。特に免疫学的測定
法に使用する場合には、リガンドは抗原(または抗体)に
相当し、レセプターが抗体(または抗原)に相当する。抗
体としては、抗原と特異的結合作用を有する限り、特に
制限されず、通常使用されるポリクローナル抗体やモノ
クローナル抗体に加えて、重合化抗体、半分子抗体（ha
lf IgG）、Facb、F(ab')2、Fab、Fab'、Fv抗体フラグメ
ントなどの加工抗体も好適に使用しうる。ここで、重合
化抗体とは、抗体または蛋白質と抗体との共有結合性重
合体をいい、半分子抗体とは、例えば還元剤で断片化し
た抗体分子をいう。このような免疫学的測定法として
は、サンドイッチ型反応や競合型反応が好ましい方法と
して挙げられる。

【００１４】本発明に適用できる試料検体としては、流
体試料である、あらゆる形態の溶液やコロイド溶液が挙
げられるが、好ましくは生物由来の流体試料、例えば、
血液、血清、血漿、尿、糞便懸濁液、髄液、唾液などが
挙げられる。これら試料検体中に含まれるリガンドとし
ては、例えば、アルブミン、グロブリン、便中ヘモグロ
ビンなどの蛋白質、ヒト絨毛性性腺刺激ホルモン（ｈＣ
Ｇ）、甲状腺刺激ホルモン（ＴＳＨ）、インスリン、サ
イロキシン、エストロゲン等のホルモン、癌胎児性蛋白
(ＣＥＡ)、アルファフェトプロティン(ＡＦＰ)塩基性フ
ェトプロテイン（ＢＦＰ）等の癌マーカー、ヒト免疫不
全ウイルス（ＨＩＶ）、ヒト成人Ｔ細胞白血病ウイルス
（ＡＴＬＶ）、Ｂ型肝炎ウイルス（ＨＢＶ）等のウイル
ス、インターロイキン−１(ＩＬ−１)、ＩＬ−２、ＩＬ
−６等のサイトカイン、テオフィリン、フェニトイン、
バルプロ酸等の薬剤、上皮成長因子(ＥＧＦ)、血小板由
来成長因子(ＰＤＧＦ)、肝細胞増殖因子(ＨＧＦ)、血管
内皮細胞成長因子(ＶＥＧＦ)等の各種成長因子、Ｃ反応
性蛋白(ＣＲＰ)等の炎症に関連する蛋白質、細菌や細胞
等、またはこれらに対する抗体が挙げられる。

【００１５】分析対象物の測定の指標となる標識は、ク
ロマトグラフィー媒体上で反応させてリガンドと標識レ
セプターとの複合体を形成させて、この反応にあずから
なかった未反応の標識レセプターまたは標識リガンドを
検出手段で測定できる限り、公知の標識の中から適宜選
択して使用することができる。その具体例としては、酵
素、発色団、蛍光団、発光団、放射性同位元素、染色ゲ
ル、金属コロイド、着色ラテックスなどが挙げられる
が、特に測定の容易さや定量性の正確さを考慮すると酵
素が好ましい。

【００１６】このような酵素としては、パーオキシダー
ゼ、グルコースオキシダーゼ、コレステロールオキシダ
ーゼ、グリセロール燐酸オキシダーゼ、サルコシンオキ
シダーゼ、コリンオキシダーゼ、アシルCoAオキシダー
ゼ、アミノ酸オキシダーゼ、ウリカーゼ、アルカリホス
ファターゼ、酸性ホスファターゼ、β−ガラクトシダー
ゼ、およびβ−Ｄ−グルコシダーゼから成る群から選択
されるものが挙げられる。

【００１７】本発明において、複合体の分離手段として
は、公知の複合体の捕捉手段の中から適宜選択すれば良
く、例えばフィルターなどの多孔性膜、濾紙、多孔性セ
ラミック、繊維層等の物理的分離手段が挙げられが、特
にメンブランフィルターが好ましい。この分離手段のポ
アサイズは、標識レセプター、または標識レセプター結
合粒子は通過させるが、リガンドと標識レセプターまた
は標識レセプター結合粒子との複合体は通過させないサ
イズであり、具体的には、１０ｎｍから１０μｍの範囲
であることが好ましい。

【００１８】本発明においては、この分離手段を通過し
たリガンドとの反応に関与しなかった未反応の標識レセ
プター、それを有する粒子または標識リガンドを展開相
で展開する工程が最も特徴とする点である。この未反応
の標識レセプターや未反応の標識リガンドを測定するこ
とで従来法では得られなかった高い感度でリガンド量を
測定することができる。また、測定手段としては、目視
による定性測定や半定量的測定、分光光度計や反射率測
定装置等の検出器による定量測定が挙げられる。特に、
反射率や透過率によって光学的に測定することで、更に
一層精密な試料中の微量成分の定量測定が可能となる。

【００１９】本発明で使用する展開相は、未反応の標識
レセプターや未反応の標識リガンドを毛細管現象の作用
により移行させるための媒体として機能するものであ
り、このような機能を有する限り、その材質は特に制限
されるものではない。

【００２０】そのような材料としては、例えば、濾紙、
セルロース膜、ガラス繊維膜、ニトロセルロース膜、セ
ルロースアセテート膜などが挙げられ、これらを単独で
用いても良く、複合して用いても良い。これらの材料の
中でも、特に濾紙やセルロースアセテート膜が抗体等の
物理的吸着能や展開速度を容易に制御できるという観点
から好ましい。クロマトグラフィー媒体の寸法も特に制
限されないが、使用時においては、例えば幅２〜１０ｍ
ｍ、長さ５〜１５０ｍｍ、厚さ０．０２〜１．５ｍｍの
ものが好ましい。

【００２１】本発明において使用される不溶性担体粒子
としては、従来から免疫反応用の担体粒子として使用さ
れているものの中から適宜選択して使用することができ
る。その具体例としては、例えば無機物質粉末や有機高
分子物質粉末などが挙げられる。無機物質としては、特
に限定されないが、金、チタン、鉄、ニッケル等の金
属、アルミナ、チタニア等の金属酸化物、シリカ等が挙
げられる。有機高分子としては、特に限定されないが、
スチレン重合体、スチレン−スチレンスルホン酸塩共重
合体、メタクリル酸重合体、アクリル酸重合体、アクリ
ルニトリル−ブダジエン−スチレン共重合体、塩化ビニ
ル−アクリル酸エステル共重合体、酢酸ビニル−アクリ
ル酸エステル共重合体等が挙げられるが、特にこれらの
重合体粉末を水に均一に懸濁させたラテックス粒子が好
ましい。

【００２２】これら不溶性担体粒子への抗原または抗体
の感作は、公知の方法に従って行うことができる。その
具体例としては、例えば、グルタルアルデヒド、ビスジ
アゾベンジジン、トリレンジトイソシアネート、ジフロ
ロニトロベンゼン、カルボジイミド類、キノン類、塩化
クロム、タンニン酸等のいわゆるカップリング剤を用い
た化学的結合法や抗原または抗体と担体を水溶性溶媒中
（例えば、水、生理食塩水、各種緩衝液など）で接触さ
せる物理的吸着法等が挙げられる。

【００２３】本発明には、特に必要とされないが、反応
層や展開層における毛管現象の流速を調節するため、ポ
リエチレングリコール、ポリオキシエチレンオクチルフ
ェニルエーテル、ポリビニルアルコールなどの界面活性
剤などを添加することも可能である。添加する界面活性
剤としては、系全体の反応に悪影響を及ぼさない粘度を
変化させるものならば、特に制限されず、公知の界面活
性剤の中から適宜選択すれば良い。

【００２４】

【発明の効果】本発明は、標識レセプターとリガンドと
を反応させて形成する複合体を分離手段により分離し、
リガンドとの反応に関与しないで分離手段を通過した未
反応の標識レセプターを測定する新規なリガンドの測定
方法であり、従来の方法に比べて一層精密な試料中の微
量成分の測定が可能となる。

【００２５】

【実施例】以下、本発明を試験例および実施例に基づき
説明するが、本発明はこれらによって限定されるもので
はない。

【００２６】試験例１．マウス抗ヒトアルブミンモノク
ローナル抗体結合ラテックス懸濁液の調製マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（自家製、
クローン１）600μg/mlの1mlと20mg/mlのラテックス乳
液{セラダイン(株)社製, 直径0.3 μm}1mlとを0.02Mの
PBS pH7.2溶液5ml中に混合し、37℃で60分間インキュベ
ーションした後、15,000rpmで20分間遠心した。得られ
た沈殿物に、10mg/mlのスキムミルク液を添加して、25
℃で3時間インキュベーションした後、抗体結合ラテッ
クス懸濁液を得た。

【００２７】試験例２．パーオキシダーゼ標識マウス抗
ヒトアルブミンモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁
液の作製酵素免疫学的測定法(医学書院石川栄治,河合忠,宮井
潔編集p108-109 1987年度版)に従って過ヨウ素酸法に
よりパーオキシダーゼ{東洋紡(株)製}とマウス抗ヒトア
ルブミンモノクローナル抗体（自家製、クローン２）と
からパーオキシダーゼ標識マウス抗ヒトアルブミンモノ
クローナル抗体を作成した。作成したパーオキシダーゼ
標識マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体 600μ
g/mlの1mlと20mg/mlのラテックス懸濁液{セラダイン
(株)製, 直径0.3 μm}1mlとを0.02MのPBS pH7.2溶液5ml
中に混合し、37℃で3時間インキュベーションした後、1
5,000 rpmで 20分間遠心した。得られた沈殿物に、10mg
/mlのスキムミルク液を添加して、25℃で3時間インキュ
ベーションした後、パーオキシダーゼ標識マウス抗ヒト
アルブミンモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁液を
得た。

【００２８】試験例３．ラテックス懸濁液含有シートの
作製試験例1で得た40mg/mlのマウス抗ヒトアルブミンモノク
ローナル抗体結合ラテックス懸濁液 1 ml 、試験例2で
得た40mg/mlのパーオキシダーゼ標識マウス抗ヒトアル
ブミンモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁液 1 m
l、および 100mg/mlのグルコース液2mlを含有する0.1M
のリン酸緩衝液(pH7.2)10mlを調製した。この調製液に
ポリエチレン製シート{旭化成（株）厚さ1mm,含水量40
μl/cm²}を浸漬後、これを凍結乾燥してラテックス懸濁
液含有シートを得た。

【００２９】試験例４．ラテックス懸濁液および酵素結
合抗体固定シートの作製試験例1で得た40mg/mlのマウス抗ヒトアルブミンモノク
ローナル抗体結合ラテックス懸濁液 1 ml 、試験例2で
得た5mg/mlのパーオキシダーゼ標識マウス抗ヒトアルブ
ミンモノクローナル抗体液 0.5 ml、および 100mg/mlの
グルコース液2mlを含有する0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.2)
10mlを調製した。この調製液にポリエチレン製シート
(厚さ1mm,吸水量40μl/cm²)を浸漬後、これを凍結乾燥
して酵素結合抗体固定シートを得た。

【００３０】試験例５．パーオキシダーゼ検出用パッド
の作製グルコースオキシダーゼ{ロッシュ(株)社製 200 u/m
g｝2.5 mgと2,7-ジアミノフルオレン塩酸塩{シグマ(株)
社製}0.27 mgとを溶解した0.1Mの MES 緩衝液 (pH6.0)1
00mlを調製した。この調製液に白濾紙{東洋濾紙(株) N
o.1,吸水量10μl/cm²}を浸漬後、45℃で2時間送風乾燥
し、さらに真空デシケーター中で3時間乾燥してパーオ
キシダーゼ検出用パッドを得た。

【００３１】試験例６．展開相の作製幅5mm長さ20mmに切断した白濾紙{東洋濾紙(株)製 No.
1, 吸水量10μl/cm²}を幅5mm長さ50mmの塩化ビニル製支
持体5の一端から15mmの位置に両面テープで張り付けて
展開用白濾紙(展開相)3を得た。

【００３２】実施例１．ヒトアルブミンの定量試験例6で得た展開相3の一方の端に、試験例5で得た一
辺5mm角切断のパーオキシダーゼ検出用パッド(酵素検出
発色パッド)4を重ねた。他方の端に7mm角の濾過用メン
ブレンフィルター2{東洋濾紙(株)製,セルロースアセテ
ート膜, ポアサイズ 0.45 μm}を重ね、更に下部の展
開相3に直接触れないように、試験例3で得たラテックス
懸濁液含有シート(抗原抗体反応パッド）1(幅5mm 長さ2
0mm)を重ね、ラテックス懸濁液含有シート1の一端から2
mmの距離に位置する5mm角の部分を除いて全体をカバー
フィルムにて覆い各々部品を固定して試験片を作製した
(図1参照)。

【００３３】作製した試験片のラテックス懸濁液含有パ
ッド1部分に、ヒトアルブミン{シグマ(株）製}をそれぞ
れ0、6.25、12.5、25、50μg/ml含有するリン酸緩衝液1
00μlを滴下し、4分後に青色に呈色したパーオキシダー
ゼ検出用パッド4を色差計{東京電色(株）の商品名：カ
ラーアナライザー TC-1800M}で測定した。測定した600n
mの反射率(R値)を基に下記式にて算出したK/S値を縦軸
に、ヒトアルブミン濃度を横軸にプロットし、標準定量
曲線を作成した(図2参照)。図2に示すように、ヒトアル
ブミンの濃度に依存して、K/S値は小さくなる逆シグモ
イドの曲線を描き、本方法は定量性を有することが判明
した。K/Sを算出するための計算式 K/S=(1-a)2/2a, a=(600nmにおける反射率)/100

【００３４】実施例２.ヒトアルブミンの定量抗体固定シートとして試験例4で得たラテックス懸濁液
および酵素標識抗体固定シートを、メンブレンフィルタ
ーとして東洋濾紙(株)製(セルロースアセテート膜, ポ
アサイズ 0.22 μm)に使用した以外は、実施例1と全く
同様の方法により試験片を作製した。作製した試験片の
ラテックス懸濁液および酵素結合抗体固定シート部分
に、ヒトアルブミン｛シグマ(株)製}をそれぞれ0、6.2
5、12.5、25、50μg/ml含有するリン酸緩衝液100μlを
滴下し、4分後に青色に呈色したパーオキシダーゼ検出
用パッドを色差計{東京電色(株)の商品名：カラーアナ
ライザー TC-1800M}を用いて測定した。測定した600nm
の反射率を基に実施例1.の式にて算出したK/S値を縦軸
に、ヒトアルブミン濃度を横軸にプロットし、標準定量
曲線を作成した(図3参照)。図3に示すように、ヒトアル
ブミンの濃度に依存して、K/S値は小さくなる逆シグモ
イドの曲線を描き、本方法は定量性を有することが判明
した。

【００３５】試験例７．マウス抗塩基性フェトプロテイ
ンモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁液の調製マウス抗塩基性フェトプロテインモノクローナル抗体
{日本化薬(株)製}クローン No.K1 300μg/ml、およびク
ローン No.5C6 300μg/mlの20mg/mlのラテックス乳液
{セラダイン(株)製, 直径0.3 μm}1mlとを0.02MのPBS p
H7.2溶液5ml中に混合し、37℃で60分間インキュベーシ
ョンした後、15,000rpmで20分間遠心した。得られた沈
殿物に、10mg/mlのウシアルブミン液を添加して、25℃
で3時間インキュベーションした後、抗体結合ラテック
ス懸濁液を得た。

【００３６】試験例８.パーオキシダーゼ標識マウス抗
塩基性フェトプロテインモノクローナル抗体結合ラテッ
クス懸濁液の作製試験例２と全く同様の方法によりパーオキシダーゼとマ
ウス抗塩基性フェトプロテインモノクローナル抗体{日
本化薬(株)製、クローンNo.5C2}とからパーオキシダー
ゼ標識マウス抗塩基性フェトプロテインモノクローナル
抗体を得た。得られたパーオキシダーゼ標識マウス抗塩
基性フェトプロテインモノクローナル抗体 600μg/mlの
1mlと20mg/mlのラテックス懸濁液{セラダイン(株)製,
直径0.3 μm}1mlとを0.02MのPBS pH7.2溶液5ml中で混合
し、37℃で3時間インキュベーションした後、15,000 rp
m で20分間遠心した。得られた沈殿物に、10mg/mlのウ
シアルブミン液を添加して、25℃で3時間インキュベー
ションした後、パーオキシダーゼ標識マウス抗塩基性フ
ェトプロテインモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁
液を得た。

【００３７】試験例９.ラテックス懸濁液含有シートの
作製試験例7で得た20mg/mlのマウス抗塩基性フェトプロテイ
ンモノクローナル抗体結合ラテックス懸濁液1ml 、試験
例8で得た20mg/mlのパーオキシダーゼ標識マウス抗塩基
性フェトプロテインモノクローナル抗体結合ラテックス
懸濁液1ml、200mg/mlのポリエチレングリコール(#6000)
2ml、および100mg/mlのグルコース液2mlを含有する0.1
Mのリン酸緩衝液(pH7.2)10mlを調製した。この調製液に
ポリエチレン製シート(厚さ1mm,吸水量40μl/cm²)を浸
漬後、これを凍結乾燥してラテックス懸濁液含有シート
を得た。

【００３８】試験例１０.展開相の作製幅5mm長さ20mmに切断した白濾紙{東洋濾紙(株)製,No.1,
吸水量10μl/cm²}を幅5mm長さ60mmの塩化ビニル製支持
体5の一端から30mmの位置に両面テープにて張り付けて
展開相3を得た。

【００３９】実施例３.塩基性フェトプロテインの定量試験例10で得た展開相3の一方の端に、試験例5で得た一
辺5mm角切断のパーオキシダーゼ検出用パッド4を重ね
た。他方の展開相3の端に一辺7mm角のメンブレンフィル
ター2{東洋濾紙(株)製,セルロースアセテート膜, ポア
サイズ 0.45 μm}を重ね、更に下部の展開相3に直接触
れないように、幅5mm 長さ20mm の展開相3(白濾紙){東
洋濾紙(株)製,No.1,吸水量10μl/cm²}の一端をフィルタ
ー2上に重ねた(一辺5mm角で重なるように)。更に、その
展開相3の他端に試験例9で得たラテックス懸濁液含有シ
ート1(幅5mm 長さ20mm)を重ね(一辺5mm角で重なるよう
に)、ラテックス懸濁液含有シート1の一端より2mmの距
離に位置する一辺5mm角の部分を除いて全体をカバーフ
ィルムにて覆い各々部品を固定して、試験片を作製した
(図4参照)。

【００４０】作製した試験片のラテックス懸濁液含有シ
ート部分に、塩基性フェトプロテイン（自家製）をそれ
ぞれ0、2、10、50、250ng/ml含有するリン酸緩衝液100
μlを滴下し、10分後に青色に呈色したパーオキシダー
ゼ検出用パッドを色差計{東京電色(株)製の商品名：カ
ラーアナライザー TC-1800M}を用いて測定した。測定し
た600nmの反射率を基に実施例1の式にて算出したK/S値
を縦軸に、塩基性フェトプロテイン濃度を横軸にプロッ
トし、標準定量曲線を作成した(図5参照)。図5に示すよ
うに、塩基性フェトプロテインの濃度に依存して、K/S
値は小さくなる逆シグモイドの曲線を描き、本方法は定
量性を有することが判明した。

【００４１】試験例１１.抗体へのマレイミド基導入マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（自家製）
5mgを0.1Mのりん酸緩衝液pH7.2 360μlに溶解した。こ
の溶解液にジメチルホルムアミド10mg／mlに溶解したN-
(8-マレイミドカプリルオキシ)スルホスクシンイミドナ
トリウム塩{同仁化学(株)社製の商品名：Sulfo-HMCS}70
μlを加え、30℃で30〜60分間反応させた。反応後、PD-
10{ファルマシア(株)製の商品名}を用いてゲルろ過し、
タンパク質部分を回収した。その後、マレイミド基導入
IgGの回収液を遠心濃縮にて、3.5mg/ml程度まで濃縮し
た。

【００４２】試験例１２.抗体へのチオール基導入マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（自家製）
10mgを0.1Mのりん酸緩衝液pH7.2 1.0mlに溶解した。こ
の溶解液にジメチルホルムアミド1mlに10mgのN-スクシ
ニンイミジル S-アセチルチオアセテート{ピアース(株)
社製}を溶解した溶液を39μlを加えた。30℃で30〜90分
間反応させた後、１Mのトリス（ヒドロキシメチル）ア
ミノメタン塩酸緩衝液pH8.0 200μl、1Mの塩酸ヒドロキ
シルアミン溶液100μl、および0.1Mのエチレンジアミン
四酢酸−0.1Mのトリス（ヒドロキシメチル）アミノメタ
ン溶液50μlを順次添加し、30℃で10〜30分間反応させ
た。反応後、0.01M のエチレンジアミン四酢酸を含有し
た0.1Mのりん酸緩衝液を溶離液として、PD-10{ファルマ
シア(株)製の商品名}を用いてゲルろ過し、タンパク質
部分を回収した。さらに、SH基導入抗体の回収液を遠心
濃縮にて3.5mg/ml程度まで濃縮した。

【００４３】試験例１３.重合化抗体の作製試験例11で得た3.6mgのマレイミド基導入マウス抗ヒト
アルブミンモノクローナル抗体と試験例12で得た3.6mg
のチオール基導入マウス抗ヒトアルブミンモノクローナ
ル抗体とを混合し（反応比1:1）、30℃で30〜60分間イ
ンキュベートした後、ゲル状の反応生成物を得た。得ら
れた反応生成物を凍結乾燥して秤量した後、0.1Mの HEP
ES-NaOH緩衝液pH7.5を加えて再びゲルを水和し、氷冷し
ながら10分間超音波処理してゲルを破砕し、重合化抗体
の懸濁液を調製した。粒度分布計ELS-800(OTSUKA ELECT
RONICS)を用いて重合化抗体の粒径を測定したところ、
平均粒径0.2463μmであった。

【００４４】試験例１４.パーオキシダーゼ標識重合化
抗体の作製試験例11から13と全く同様にして、マウス抗ヒトアルブ
ミンモノクローナル抗体（自家製）の均一重合化抗体を
作製した。さらに均一重合化抗体の残存チオール基を利
用して、パーオキシダーゼと化学結合させ、パーオキシ
ダーゼ標識重合化抗体を作製した。

【００４５】試験例１５．マレイミド基導入パーオキシ
ダーゼの作製パーオキシダーゼ{東洋紡(株)製} 8mgを0.1Mのリン酸緩
衝液pH7.2 ,0.6mlに溶解した。この溶解液に、DMF200μ
lに溶解した10mgの N-(6-マレイミドカプロイルオキシ)
スクシンイミド｛同仁化学(株)製の商品名：EMCS}60μl
を加えて、30℃で60〜90分間インキュベーションした。
反応後、0.1Ｍのリン酸緩衝液pH7.2を溶出液とし、PD-1
0{ファルマシア(株)製}でゲルろ過し、マレイミド基導
入パーオキシダーゼ部分を得た。

【００４６】試験例１６．均一重合化抗体とマレイミド
基導入パーオキシダーゼとの反応マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体（自家製）
の均一重合化抗体3.5mg/ml溶液0.4mlと1.2mg/mlマレイ
ミド基導入パーオキシダーゼ0.4mlとを混合し、30℃で6
0〜90分間インキュベーションした。反応後、0.1Mのリ
ン酸緩衝液（pH6.5）を用いて、TSK-GEL G4000SWXL{東
ソー(株)製}でゲルろ過し、未反応のパーオキシダーゼ
を除去し、パーオキシダーゼ標識重合化抗体部分を得
た。

【００４７】試験例１７.重合化抗体とパーオキシダー
ゼ標識重合化抗体との固定シートの作製試験例13で得た10mg/mlのマウス抗ヒトアルブミンモノ
クローナル抗体（自家製）の重合化抗体液 1 ml 、試験
例14で得た10mg/mlのパーオキシダーゼ標識マウス抗ヒ
トアルブミンモノクローナル抗体（自家製）の重合化抗
体液1 ml、200mg/mlのポリエチレングリコール(#6000)
2ml、および100mg/mlのグルコース液2mlを含有する0.1M
のリン酸緩衝液(pH7.2)10mlを調製した。この調製液に
ポリエチレン製シート(厚さ1mm,吸水量40μl/cm²)を浸
漬後、これを凍結乾燥して抗体固定シートを得た。

【００４８】試験例１８.展開相の作製幅5mm長さ30mmに切断した白濾紙{東洋濾紙(株)製,吸水
量10μl/cm²}を幅5mm長さ80mmの塩化ビニル製支持体5の
一端から30mmの位置に両面テープにて張り付けて展開相
3を得た。

【００４９】実施例４.ヒトアルブミンの定量試験例18の方法で得た展開相3の一方の端(支持体の端か
ら25mmの位置)から15mm離れた位置に、試験例5で得た一
辺5mm角のパーオキシダーゼ検出用パッド4を重ね、他方
の端に一辺5mm角の吸収性のメンブラン通過液吸収パッ
ド6{ワットマン社(株)製の商品名：7クロマト,吸水量40
μl/cm²}を重ねた。更に、展開相の一端(支持体の端か
ら30mmの位置)に一辺7mm角のメンブレンフィルター2{東
洋濾紙(株)製,セルロースアセテート膜, ポアサイズ 0.
45 μm}を重ね、下部の展開相3に直接触れないように、
幅5mm 長さ20mm の展開相3{東洋濾紙(株)製,吸水量10μ
l/cm²}の一端をフィルター2上に重ねた(一辺5mm角で重
なるように)。更に、その展開相3の他端に試験例17で得
た重合化抗体とパーオキシダーゼ標識重合化抗体との固
定シート(幅5mm 長さ20mm)を重ね(一辺5mm角で重なるよ
うに)、ラテックス懸濁液含有シート1の一端より2mmの
距離に位置する一辺5mm角の部分を除いて全体をカバー
フィルムで覆い各々部品を固定して、試験片を作製した
(図6参照)。

【００５０】作製した試験片の重合化抗体およびパーオ
キシダーゼ標識重合化抗体との固定シート部分に、ヒト
アルブミン{シグマ(株)製}をそれぞれ 0、6.25、12.5、
25、50μg/ml含有するリン酸緩衝液150μlを滴下し、5
分後に青色に呈色したパーオキシダーゼ検出用パッドを
色差計{東京電色(株)の商品名：カラーアナライザーTC-
1800M)を用いて測定した。測定した600nmの反射率を基
に実施例1の式にて算出したK/S値を縦軸に、ヒトアルブ
ミン濃度を横軸にプロットし、標準定量曲線を作成した
(図7参照)。図7に示すように、ヒトアルブミンの濃度に
依存して、K/S値は小さくなる逆シグモイドの曲線を描
き、本方法は定量性を有することが判明した。

【００５１】実施例５.ヒトアルブミンの定量抗体固定シートとして試験例17で得た重合化抗体とパー
オキシダーゼ標識抗体との固定シートを、メンブレンフ
ィルター2として東洋濾紙(株)製,セルロースアセテート
膜, ポアサイズ0.1μmに使用した以外は、実施例4と全
く同様の方法により試験片を作製した。作製した試験片
の重合化抗体およびパーオキシダーゼ標識抗体との固定
シート部分に、ヒトアルブミン{シグマ(株)製}をそれぞ
れ0、6.25、12.5、25、50μg/ml含有するリン酸緩衝液1
50μlを滴下し、5分後に青色に呈色したパーオキシダー
ゼ検出用パッドを色差計{東京電色(株)の商品名：カラ
ーアナライザー TC-1800M}を用いて測定した。測定した
600nmの反射率を基に実施例1の式にて算出したK/S値を
縦軸に、ヒトアルブミン濃度を横軸にプロットし、標準
定量曲線を作成した(図8参照)。図8に示すように、ヒト
アルブミンの濃度に依存して、K/S値は小さくなる逆シ
グモイドの曲線を描き、本方法は定量性を有することが
判明した。

【００５２】試験例１９．パーオキシダーゼ標識ヒトア
ルブミンの調製マウス抗ヒトアルブミンモノクローナル抗体の代りにヒ
トアルブミンを用いたこと以外は、試験例２.と全く同
様な方法により、パーオキシダーゼ標識ヒトアルブミン
を調製した。

【００５３】試験例２０．パーオキシダーゼ標識ヒトア
ルブミン固定シートの作製試験例19.で得た500μg/mlのパーオキシダーゼ標識ヒト
アルブミン溶液1ml、および100mg/mlのグルコース溶液2
mlを含有する0.1Mのリン酸緩衝液(pH7.2)10mlを調製し
た。この調製液にポリエチレン製シート(厚さ1mm,含水
量40μl/cm²)を浸漬後、これを凍結乾燥してパーオキシ
ダーゼ標識ヒトアルブミン固定シートを得た。

【００５４】試験例２１．ラテックス懸濁液含有シート
の作製試験例1で得た40mg/mlのマウス抗ヒトアルブミンモノク
ローナル抗体結合ラテックス懸濁液1 mlおよび 100mg/m
lのグルコース液2mlを含有する0.1Mのリン酸緩衝液(pH
7.2)10mlを調製した。この調製液にポリエチレン製シー
ト(厚さ1mm,含水量40μl/cm²)を浸漬後、これを凍結乾
燥してラテックス懸濁液含有シートを得た。

【００５５】試験例２２. 展開相の作製幅5mm長さ20mmに切断した白濾紙{東洋濾紙(株)製,吸水
量10μl/cm²}を幅5mm長さ80mmの塩化ビニル製支持体5の
一端から45mmの位置に両面テープにて張り付けて展開相
3を得た。

【００５６】実施例６.ヒトアルブミンの定量試験例22の方法で得た展開相3の一方の端(支持体の端か
ら15mmの位置)に、試験例5で得た一辺5mm角のパーオキ
シダーゼ検出用パッド4を重ねた。更に、展開相3の一方
の端(支持体の端から45mmの位置)に一辺7mm角のメンブ
レンフィルター2{東洋濾紙(株)製,セルロースアセテー
ト膜, ポアサイズ 0.20 μm}を重ね、下部の展開相3に
直接触れないように、幅5mm 長さ20mm の展開相3（白濾
紙）{東洋濾紙(株)製,吸水量10μl/cm²}の一端をフィル
ター上に重ねた(一辺5mm角で重なるように)。その展開
相3の他端に試験例21で得たラテックス懸濁液固定シー
ト1(幅5mm 長さ20mm) を重ねた(一辺5mm角で重なるよう
に)。更に、そのラテックス懸濁液含有シート1の一端に
試験例20で得たパーオキシダーゼ標識ヒトアルブミン固
定パッド7(幅5mm 長さ20mm)を入れ(2mmの重なりとなる
ように)、パーオキシダーゼ標識ヒトアルブミン固定シ
ート7の一端より2mmの距離に位置する一辺5mm角の部分
を除いて全体をカバーフィルムにて覆い各々部品を固定
して、試験片を作製した(図9参照）。

【００５７】作製した試験片のパーオキシダーゼ標識ヒ
トアルブミン固定シート７の部分に、ヒトアルブミン
{シグマ(株)製}をそれぞれ 0、12.5、25、50、100μg/m
l含有するリン酸緩衝液150μlを滴下し、5分後に青色に
呈色したパーオキシダーゼ検出用パッドを色差計{東京
電色(株)の商品名：カラーアナライザー TC-1800M)を用
いて測定した。測定した600nmの反射率を基に実施例1の
式にて算出したK/S値を縦軸に、ヒトアルブミン濃度を
横軸にプロットし、標準定量曲線を作成した(図10参
照)。図10に示すように、ヒトアルブミンの濃度に依存
して、K/S値は大きくなるシグモイドの曲線を描き、本
方法は定量性を有することが判明した。

【図面の簡単な説明】

【図１】本発明に係る一実施例である試験片の模式図で
ある。

【図２】本発明に係る試験片を用いたヒトアルブミン検
体測定の実施例１におけるアルブミン濃度と600nmの反
射率から算出されるK/S値をプロットしたグラフであ
る。

【図３】本発明に係る試験片を用いたヒトアルブミン検
体測定の実施例２におけるアルブミン濃度と600nmの反
射率から算出されるK/S値をプロットしたグラフであ
る。

【図４】本発明に係る試験片の好ましい形態の一例の模
式図である。

【図５】本発明に係る試験片を用いた塩基性フェトプロ
テイン検体測定の実施例3.における塩基性フェトプロテ
イン濃度と600nmの反射率から算出されるK/S値をプロッ
トした曲線を示すグラフである。

【図６】本発明に係る試験片の好ましい形態の一例の模
式図である。

【図７】本発明に係る試験片を用いたヒトアルブミン検
体測定の実施例4.におけるアルブミン濃度と600nmの反
射率から算出されるK/S値をプロットした曲線を示すグ
ラフである。

【図８】本発明に係る試験片を用いたヒトアルブミン検
体測定の実施例5.におけるアルブミン濃度と600nmの反
射率から算出されるK/S値をプロットした曲線を示すグ
ラフである。

【図９】本発明に係る試験片の好ましい形態の一例の模
式図である。

【図１０】本発明に係る試験片を用いたヒトアルブミン
検体測定の実施例6.におけるアルブミン濃度と600nmの
反射率から算出されるK/S値をプロットした曲線を示す
グラフである。

【符号の説明】

１抗原抗体反応用パッド２メンブレンフィルター３展開相４酵素検出発色パッド５支持体６メンブレン通過液吸収パッド７固定シート

───────────────────────────────────────────────────── フロントページの続き (51)Int.Cl.⁷ 識別記号ＦＩテーマコート゛(参考）Ｇ０１Ｎ 33/545 Ｇ０１Ｎ 33/545 Ａ 33/553 33/553 // Ｇ０１Ｎ 33/537 33/537 Ｆターム(参考） 4B033 NA22 NB12 NB27 NB32 NB45 NB62 NB63 NB65 NB68 ND03 NG09 NG10 NH06 4B063 QA01 QA18 QQ01 QQ03 QQ67 QQ70 QQ75 QQ79 QQ87 QR02 QR13 QR82 QR85 QS15 QS17 QX01

Claims

【特許請求の範囲】

【請求項１】以下の工程を含むリガンドの測定方法。 (a)リガンドに対して特異的なレセプター、および／ま
たは表面に前記リガンドに対して特異的な前記レセプタ
ーを有する粒子と、前記リガンドに対して特異的な標識
レセプター、および／または表面に前記リガンドに対し
て特異的な前記標識レセプターを有する粒子と、前記リ
ガンドを含む試料検体とを反応させて複合体を形成する
工程、(b)形成した前記複合体を分離手段により分離す
る工程、(c)前記リガンドとの反応に関与しないで前記
分離手段を通過した未反応の前記標識レセプター、およ
び／または該未反応の標識レセプターを有する粒子を展
開相で展開する工程、(d)展開した前記未反応の標識レ
セプター量を測定する工程。
【請求項２】以下の工程を含むリガンドの測定方法。 (a)リガンドに対して特異的なレセプター、および／ま
たは表面に前記リガンドに対して特異的な前記レセプタ
ーを有する粒子と、標識リガンドおよび／または標識リ
ガンドを有する粒子と、前記リガンドを含む試料検体と
を反応させて複合体を形成する工程、(b)形成した前記
複合体を分離手段により分離する工程、(c)前記レセプ
ターとの反応に関与しないで前記分離手段を通過した未
反応の標識リガンド、または標識リガンドを有する粒子
を展開相で展開する工程、(d)展開した前記未反応の標
識リガンド量を測定する工程。
【請求項３】分離手段がフィルターなどの多孔性膜、濾
紙、多孔性セラミック、繊維層等の物理的分離手段であ
る請求項１または２記載の方法。
【請求項４】リガンドが抗原(または抗体)、酵素、一本
鎖ＤＮＡ、ビオチンであり、それぞれに対応するレセプ
ターが抗体(または抗原)、基質、前記ＤＮＡの相補鎖、
アビジンである請求項１または２記載の方法。
【請求項５】リガンドが抗原(または抗体)であり、レセ
プターが抗体(または抗原)または加工抗体である請求項
４記載の方法。
【請求項６】加工抗体が重合化抗体、half IgG、Facb、
F(ab')2、Fab、Fab'、Fvである請求項５記載の方法。
【請求項７】標識が酵素、発色団、蛍光団、発光団、放
射性同位元素、染色ゲル、金属コロイド、着色ラテック
スである請求項１または２記載の方法。
【請求項８】測定が反射率または透過率によって定量的
に行われる請求項１または２記載の方法。
【請求項９】粒子が不溶性担体粒子、好ましくはラテッ
クス粒子である請求項１または２記載の方法。