CN104099300A - 可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用 - Google Patents

Abstract

本发明涉及一种用于牛免疫球蛋白IgG检测的可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株的筛选方法及杂交瘤细胞株，其分泌的单克隆抗体及其在牛免疫球蛋白IgG检测领域的应用。该杂交瘤细胞，保藏在湖北省武汉市武昌珞珈山武汉大学中国典型培养物保藏中心，保藏号是CCTCCNo：2013183。上述杂交瘤细胞分泌的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体具有特异性强、亲和力大、效价高等优点，可广泛应用于牛免疫球蛋白IgG的检测试剂或检测设备领域。基于免疫层析原理建立的牛免疫球蛋白IgG的快速检测卡可应用于初乳及其制品、牛血液等样品中牛免疫球蛋白的IgG检测中，在特异性、灵敏性和检测效率等方面较之常规检测方法具有显著的优势。

Description

可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及其应用

技术领域

本发明涉及牛免疫球蛋白IgG免疫检测领域，尤其是涉及一种可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株9C6及其应用。

背景技术

牛免疫球蛋白体系在理化性质和分类命名上与其它哺乳动物及其相似，主要包括IgG、IgA 和IgM。IgG 分为IgG1和IgG2两个亚类，其中IgG1为主要成分。IgG分子由4条肽链组成，2条长链称为重链(heavy chain，H)，由大约440个氨基酸残基组成，分子量约50～70kD；2条短链称为轻链(light chain，L)，由大约220个氨基酸组成，分子量约22.5kD。4条肽链通过链间二硫键(-S·S-)连在一起。牛免疫球蛋白在牛的体液中广泛分布，在初乳、血液中含量较高。在初乳的许多生物活性物质中，免疫球蛋白G（IgG）是最重要的一种。牛初乳中IgG的含量受乳牛的年龄、泌乳期和饲喂环境等多种因素制约。研究表明，免疫球蛋白具有抗菌、调节免疫力、保护肠道粘膜等多种生物活性。在初乳制品的开发上，IgG的含量直接决定产品的质量和价格。因此研究开发抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体，建立快速检测牛IgG的方法具有重要的意义。

目前牛免疫球蛋白IgG的检测方法主要包括琼脂扩散法（SRD）、液相色谱法（HPLC）和酶联免疫法（ELISA）等 。其中琼脂扩散法操作简便，设备简单，测定成本较低结果直观。但由于扩散直径测量误差，导致结果差异较大，准确度和灵敏度较低，同时劳动强度大，耗时长。高效液相色谱法分析准确，重复性好，但是需要复杂仪器设备，样品前处理过程繁琐，检测过程耗时长，对实验环境要求高，难以实现快速检测。酶联免疫法灵敏度高，特异性强，可同时测定几十甚至几百个样品，在国外的研究中应用普遍，但是该法操作复杂，耗时长，费用高。免疫层析法具有特异性强、灵敏度高、样品前处理简单、检测成本低等优点，适于现场批量检测，近年来发展较快。在初乳加工及质量检测和奶牛犊牛饲喂管理的生产实际中，迫切需要建立针对初乳、血液和尿液的牛免疫球蛋白IgG的快速免疫学检测方法。这些快速方法都需要特异性识别牛免疫球蛋白IgG（包括IgG1和IgG2）的单克隆抗体。因此，利用杂交瘤技术制备分泌抗牛免疫球蛋白IgG（包括IgG1和IgG2）的单克隆抗体，并在此基础上研究开发牛免疫球蛋白IgG快速免疫学检测技术，具有重要意义。

发明内容

本发明所要解决的问题是利用杂交瘤技术选育可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的杂交瘤细胞株及利用其产生的单克隆抗体建立免疫学检测方法。

本发明提供了杂交瘤细胞株9C6，该细胞株已于2013年11月28日保藏于中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏地址是，中国，武汉，武汉大学，保藏编号为CCTCC NO.C2013183，分类命名为小鼠杂交瘤细胞9C6。

抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体，它由保藏编号为CCTCC NO.C2013183的杂交瘤细胞株9C6分泌产生。该抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体可以识别免疫球蛋白IgG1和IgG2。

抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体在牛免疫球蛋白IgG测定中的应用。

本发明的有益效果在于:

(1)本发明提供的杂交瘤细胞株9C6可以用于制备高效价抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体，抗牛免疫球蛋白IgG小鼠腹水抗体酶联免疫吸附分析(ELISA)法测得的效价可达5.12×10⁵（抗原包被浓度2μg/mL）。

(2)本发明提供的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体灵敏度高、特异性好，与牛乳酪蛋白、牛乳清蛋白、牛乳乳铁蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白的交叉反应率均小于1%，不与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG以及牛IgM反应。

(3)本发明提供的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体可应用于测定牛初乳及其制品、血液等样品中的牛免疫球蛋白IgG含量。

(4) 本发明提供的金标免疫层析法可应用于牛初乳及其制品、牛血液等样品中的牛免疫球蛋白IgG含量的现场快速检测和生产质量控制。

附图说明

图1为本发明实施例3制备的牛免疫球蛋白IgG免疫层析检测卡的正视图。

图2为本发明实施例3制备的牛免疫球蛋白IgG免疫层析检测卡的切面图。

图3为应用本发明实施例3提供的牛免疫球蛋白IgG免疫层析试纸条检测样品的结果判定图。

具体实施方式

实施例1:杂交瘤细胞株9C6的筛选

1.动物免疫

选取6周龄雌性BALB/c小鼠4只，用牛免疫球蛋白IgG（由Sigma-Aldrich公司生产，货号I5506）免疫3次，首次100μg/只，等量完全弗氏佐剂，充分乳化，腹腔注射；2周后进行第二次免疫，100μg/只，等量不完全弗氏佐剂，充分乳化，腹腔注射；2周后进行第三次免疫，操作同第二次免疫。测定血清效价，选择血清效价最高者在融合前3天加强免疫，100μg/只，不加佐剂，腹腔注射。

2.细胞融合

加强免疫3天后， 按常规方法取小鼠脾细胞，与小鼠骨髓瘤细胞SP2/0融合。采用聚乙二醇(PEG，分子量为1450)作融合剂，按常规方法进行融合细胞的培养。

3.细胞株的筛选及克隆

细胞融合后第8-14天，细胞集落长到孔底面积的1/4-1/2大小，培养液变黄，进行抗体检测。采用改进的夹心ELISA方法对有杂交瘤细胞生长的培养孔进行抗体检测。采用有限稀释法进行克隆，克隆后8-12天左右采用同样的方法进行检测，如此重复克隆2-3次后，获得杂交瘤细胞株9C6。

其中，改进的夹心ELISA法检测杂交瘤细胞上清抗体的具体步骤为：

（1）包被：用包被液将羊抗牛IgG抗体（Sigma-Aldrich公司，B1645）稀释1000倍。在酶标板的每个反应孔中加100μL，4℃过夜（或37℃温育2~3h）。次日，弃去孔内溶液，各孔加PBS-T洗涤缓冲液220μL，振荡1分钟，甩净孔内液体，再加入PBS-T洗涤缓冲液，如此洗涤3次。

（2）封闭：加200μL封闭液于上述已包被的反应孔中，置37℃温育1h。然后洗涤3次。

（3）加样：加杂交瘤细胞株培养液上清100μL于反应孔中，置37℃温育1h。然后洗涤3次。(同时以阴性培养液上清做阴性对照，以阳性血清做阳性对照，以PBS缓冲液做空白对照)。

（4）加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的羊抗鼠酶标抗体（Sigma-Aldrich公司，A3673）100μL。37℃温育40min，洗涤5次。

（5）加底物液显色：向各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液100μL，37℃暗处温育10min。

（6）终止反应：向各反应孔中加入终止液50μL，立即读数。

（7）酶标仪读数： 450nm下读出各孔吸光度值。

所述的包被缓冲液为1.59g碳酸钠，2.93g碳酸氢钠，加蒸馏水至1000mL，调节pH值至9.6。

所述的PBS缓冲液为8g氯化钠，2.9g十二水磷酸氢二钠，0.2g氯化钾，0.2g磷酸二氢钾，加蒸馏水定容至1000mL所得。

所述的PBS-T洗涤缓冲液为0.5mL Tween-20，加PBS缓冲液1000mL所得。

所述的封闭液为 5.349g 氯化铵，加蒸馏水1000mL所得。

所述的底物溶液为A、B液TMB显色液（济南泰天和生物科技公司生产）。

所述的终止液为2M硫酸水溶液。

实施例2:抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的制备纯化、亚型和特性鉴定

将实施例1获得的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株系9C6注射预先用福氏不完全佐剂处理过的BALB/c小鼠，收集该小鼠的腹水，离心脱脂后，采用Protein A亲和纯化方法纯化抗体（具体按说明书操作）。纯化后立即对0.01M pH7.2磷酸盐缓冲液透析，调整蛋白浓度至10mg/mL，-70℃冰箱冷冻，备用；

用亚型鉴定试剂盒鉴定杂交瘤细胞株9C6分泌的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体的亚型为IgG1。

用常规间接ELISA法测得9C6的鼠腹水抗体的效价可达5.12×10⁵（抗原包被浓度2μg/mL），可与牛IgG1和IgG2反应，与牛乳酪蛋白、牛乳清蛋白、牛乳乳铁蛋白、牛血清白蛋白、卵白蛋白的交叉反应率均小于1%，不与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG以及牛IgM反应。

实施例3 免疫层析检测卡或试纸条的制备及应用

将实施例2获得的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体用于制备牛免疫球蛋白IgG免疫层析检测卡，制备方法包括以下步骤:

（1）抗体的制备

选用所述的细胞株分泌产生的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体作为标记抗体，选用兔、牛、马、驴等来源的抗牛多克隆抗体作为检测线（T线）包被抗体，羊抗鼠多克隆抗体作为质控线（C线）包被抗体。

（2）检测膜的制备

将T线包被抗体和C线包被抗体分别用T线包被液和C线包被液配制成0.5-2.0mg/mL的浓度，使用Bio-dot定量喷涂装置分别将二者以0.4-1cm的间隔喷涂于硝酸纤维素膜条上，喷量为1μg/cm，得到T线和C线，置于37℃条件下干燥30-60分钟，然后浸入封闭液中浸泡10分钟后，于30℃条件下干燥3-6小时，加入干燥剂封存，备用。

所述的T线包被液为0.01M pH7.2-7.4 磷酸缓冲液，0.14M氯化钠，加5g/L蔗糖，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，2周内使用。

所述的C线包被液为0.01M pH7.2-7.4 磷酸缓冲液，加5g/L蔗糖，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，2周内使用。

所述的封闭液为0.01M pH7.2 PBS缓冲液，加10g/L蔗糖，10g/L 鱼明胶，0.22μm滤膜过滤除菌，4℃保存，1周内使用。

（3）样品垫的制备

将玻璃纤维或聚脂样品垫剪裁成长300mm，宽25mm长条，放入样品垫预处理液中浸泡1小时后，取出，于37℃条件下干燥6小时，加入干燥剂封存，备用。所述的样品垫预处理液含有1-10g/L聚乙烯吡咯烷酮以及0.1-2.0g/L的吐温-20的0.01M pH7.2 磷酸缓冲液。

（4） 金标垫的制备

A、纳米金标记的单克隆抗体的制备

在标记前将单克隆抗体在含0.05g/L氯化钠的四重蒸馏水中透析过夜。取纳米金溶液（颗粒粒径为20-40nm），用0.2 M碳酸钾调pH值至8.2，磁力搅拌的条件下，按每毫升纳米金中加入8-10μg抗体的量，逐滴加入纯化的单克隆抗体，搅拌15 min。加入卵清白蛋白溶液至终浓度5g/L，继续搅拌10 min。500×g离心15 min，去除沉淀，取上清，12 000×g离心30 min。吸出上清，将沉淀的胶体金探针用原体积的重悬液复溶并离心，吸出上清，保留沉淀，加入原体积1/10的金标保存液，4℃保存，备用。

所述的重悬液为含有5g/L卵清白蛋白，0.2g/L叠氮钠的0.01M pH7.2 PB缓冲液，过0.22μm滤膜，4℃保存。

所述的标记保存液为含有5g/L卵清白蛋白，100g/L蔗糖，25g/L海藻糖，0.2g/L叠氮钠的0.01M pH7.2 PB缓冲液，过0.22μm滤膜，4℃保存。

B、金标垫的制备

将玻璃纤维裁剪成长300mm，5mm宽度细条，用Bio-dot喷金装置将纳米金标记的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体以1μg/cm的喷量横向喷涂，然后真空冷冻干燥6h-24h，加入干燥剂，密封保存。

(5) 吸收垫的制备

将吸水纸剪裁成长300mm，宽30mm的规格，即得吸水垫;

(6)试纸条的组装:在PVC背板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm。

(7)试纸条的裁切：用Bio-dot切条机将组装好试纸条裁切成3mm宽的小条，即得牛免疫球蛋白IgG免疫层析试纸条。

(8)检测卡的组装，将本发明所述的切割好的单份试纸条置于塑料底卡的卡槽内，盖上上盖，压紧，见图1和图2。加入干燥剂，密封保存。

（9）样品缓冲液配方：0.05M Tris,0.3M氯化钠，0.2g/L叠氮钠，0.005M EDTA，pH7.2-7.4.

上述牛免疫球蛋白IgG免疫层析试纸条的应用:

取样品1mL，然后加入24mL样品缓冲液混合均匀，取200μL加入检测卡加样孔内，静置15分钟后读取结果，若检测线显红色，质控线线显红色，则判为阳性结果，表明待测样品中的牛免疫球蛋白IgG的含量大于或等于12mg/mL，见图3中1；若检测线不显色，质控线线显红色，则判为阴性结果，表明待测样品中的牛免疫球蛋白IgG的含量小于12mg/mL，见图3中2；若质控线线不显色，则判定为无效检测，见图3中3。

Claims (5)

1.一种杂交瘤细胞株9C6，其特征在于可分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体，它保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO.C2013183。

2.一种抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体，亚型为IgG1，它由保藏编号为CCTCCNO.C2013183的杂交瘤细胞株9C6分泌产生，其特征在于用常规间接ELISA法测得的小鼠腹水抗体的效价可达5.12×10⁵，可与牛IgG1和IgG2反应，与牛乳酪蛋白、牛乳清蛋白、牛乳乳铁蛋白、牛血清白蛋白、卵清白蛋白的交叉反应率均小于1%，不与山羊IgG、绵羊IgG、兔IgG以及牛IgM反应。

3.一种分泌抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体杂交瘤细胞株的筛选方法，其特征在于通过改进的夹心酶联免疫分析模式可检测出在含牛血清培养液中已形成抗原抗体复合物的单克隆抗体，具体包括以下步骤：

检测杂交瘤细胞上清抗体的具体步骤为：

（1）包被：用包被液将羊抗牛IgG抗体稀释1000倍，在酶标板的每个反应孔中加100μL，4℃过夜，次日，弃去孔内溶液，各孔加PBS-T洗涤缓冲液220μL，振荡1分钟，甩净孔内液体，再加入PBS-T洗涤缓冲液，如此洗涤3次；

（2）封闭：加200μL封闭液于上述已包被的反应孔中，置37℃温育1h，然后洗涤3次；

（3）加样：加杂交瘤细胞株培养液上清100μL于反应孔中，置37℃温育1h，然后洗涤3次，同时以阴性培养液上清做阴性对照，以阳性血清做阳性对照，以PBS缓冲液做空白对照；

（4）加酶标二抗：各反应孔中加入新稀释的羊抗鼠酶标抗体100μL。37℃温育40min，洗涤5次；

（5）加底物液显色：向各反应孔中加入刚刚配制的TMB底物溶液100μL，37℃暗处温育10min；

（6）终止反应：向各反应孔中加入终止液50μL，立即读数；

（7）酶标仪读数： 450nm下读出各孔吸光度值。

4.一种牛免疫球蛋白IgG的检测卡或试纸条的制备，其特征在于：包括以下步骤： 

（1）抗体的制备

选用权利要求2所述的杂交瘤细胞株9C6分泌产生的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体作为标记抗体，选用兔、牛、马、驴等来源的抗牛多克隆抗体作为检测线包被抗体，羊抗鼠多克隆抗体作为质控线包被抗体；

（2）检测膜的制备

将检测线包被抗体和质控线包被抗体分别用检测线包被液和质控线包被液配制成0.5-2.0mg/mL的浓度，使用Bio-dot定量喷涂装置分别将二者以0.4-1cm的间隔喷涂于硝酸纤维素膜条上，喷量为1μg/cm，得到检测线和质控线，置于37℃条件下干燥30-60分钟，然后浸入封闭液中浸泡10分钟后，于30℃条件下干燥3-6小时，加入干燥剂封存，备用；

（3）样品垫的制备

将玻璃纤维或聚脂样品垫剪裁成长300mm，宽25mm长条，放入样品垫预处理液中浸泡1小时后，取出，于37℃条件下干燥6小时，加入干燥剂封存，备用；

（4） 金标垫的制备

用Bio-dot喷金装置将纳米金标记的抗牛免疫球蛋白IgG单克隆抗体以1μg/cm的喷量喷涂于玻璃纤维上，然后真空冷冻干燥6h-24h，加入干燥剂，密封保存；

（5） 吸收垫的制备

将吸水纸剪裁成长300mm，宽30mm的规格，即得吸水垫；

（6）试纸条的组装:在PVC背板的一面相应部位依次粘贴检测膜、金标垫、样品垫和吸水垫，相邻各部分在连接处重叠1mm；

（7）试纸条的裁切：用Bio-dot切条机将组装好试纸条裁切成3mm宽的小条；

（8）检测卡的组装，将本发明所述的切割好的单份试纸条置于塑料底卡的卡槽内，盖上上盖，压紧。加入干燥剂，密封保存；

（9）样品缓冲液配方：0.05M Tris,0.3M氯化钠，0.2g/L叠氮钠，0.005M EDTA，pH7.2-7.4。

5.根据权利要求4所述的牛免疫球蛋白IgG的检测卡或试纸条的制备，其特征在于：第（4） 步骤的金标垫的制备包括以下步骤： 

在标记前将单克隆抗体在含0.05g/L氯化钠的四重蒸馏水中透析过夜；取颗粒粒径为20-40nm纳米金溶液，用0.2 M碳酸钾调pH值至8.2，磁力搅拌的条件下，按每毫升纳米金中加入8-10μg抗体的量，逐滴加入纯化的单克隆抗体，搅拌15 min。加入卵清白蛋白溶液至终浓度5g/L，继续搅拌10 min。500×g离心15 min，去除沉淀，取上清，12 000×g离心30 min，吸出上清，将沉淀的胶体金探针用原体积的重悬液复溶并离心，吸出上清，保留沉淀，加入纳米金溶液原体积1/10的金标保存液，4℃保存，备用；

所述的重悬液为含有5g/L卵清白蛋白，0.2g/L叠氮钠的0.01M pH7.2 PB缓冲液，过0.22μm滤膜，4℃保存；

所述的标记保存液为含有5g/L卵清白蛋白，100g/L蔗糖，25g/L海藻糖，0.2g/L叠氮钠的0.01M pH7.2 PB缓冲液，过0.22μm滤膜，4℃保存。