CN111838133B - ***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法 - Google Patents

Abstract

本发明提供了一种微流体细胞处理模块，及包含该模块的***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置。该装置可实现对***及胚胎进行低温保护剂加载、冷冻、复温和低温保护剂去除的操作。

Description

***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法

技术领域

本发明涉及一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，该装置采用微流控技术对***及胚胎直接在石英毛细管中进行低温保护剂加载和自动玻璃化保存，并在复温后进行低温保护剂去除。

背景技术

世界范围内***率逐年升高，发达国家***症患病率达5％～8％，而发展中国家可高达30％。***及胚胎的冷冻保存可为由于年龄及医疗因素引起的卵巢功能衰退的女性保存生育能力。通过胚胎冷冻保存，可以增加进行体外受精-胚胎移植患者的妊娠机会，根据患者具体情况选择移植时间，减少严重卵巢过度刺激综合征，还能避免多余胚胎的浪费，减少治疗费用，但该方法主要适用于已有配偶或有供精的育龄期女性。若患者没有***或在取卵手术当日取精失败时为了不放弃治疗周期，可选择***低温保存技术。

哺乳动物的***和胚胎在冷冻保存过程中很容易受到不同类型的冷冻损伤，这些损伤的发生是与***或者胚胎的低温生物学特性密切相关的，如对低温的敏感性、质膜对水和冷冻保护剂的渗透性、对冷冻保护剂化学毒性的灵敏度以及对渗透性膨胀和收缩的耐受性等。为此，要达到成功冷冻保存的效果,就要建立一种损伤最小化同时能保持高存活率的方法。目前的研究表明，慢速冷冻法由于形成了细胞内外的冰晶，对细胞内部骨架结构和亚细胞器膜产生尖锐刺伤和牵拉断裂，冻存后***和胚胎的成活率和移植率低。玻璃化冷冻是以极快的降温速率将高浓度低温保护剂在短时间内直接转化为非晶态固体的过程，由于有效避免了冰晶的产生，是一种高效的冷冻保存方法。

实现玻璃化冷冻需要在细胞内外加载高浓度的低温保护剂，为了减少高浓度的低温保护剂对细胞造成的渗透损伤，需要采用分步法加载和去除保护剂。目前，临床上多采用crytop法进行***和胚胎的玻璃化保存，其步骤如下：低温保护剂加载和玻璃化步骤中，首先需要将细胞移入20uL基础溶液(Basic Solution，BS)[组织培养液(TCM)199]中，然后分三次加入平衡溶液(Equilibration Solution，ES)[组织培养液(TCM)199+7.5％EG+7.5％DMSO]20uL、20uL、240uL，分别处理3min、3min、9min，之后再利用巴斯德管分两次把细胞移入各300uL玻璃化溶液(Vitrification Solution，VS)[组织培养液(TCM)199+15％EG+15％DMSO+0.5mol/L蔗糖]中分别处理0.5min、0.5min，最后将细胞在显微镜下转移到cryotop载体上，快速浸入液氮中玻璃化；复温和低温保护剂去除步骤中，首先需要将加载有细胞的Cryotop快速移入已预热好的4mL复温溶液(Thawing Solution，TS)[组织培养液(TCM)199+1mol/L蔗糖]中将细胞从Cryotop载体上脱离并快速复温1min，然后用巴斯德管将细胞转移入300uL稀释溶液(Diluent Solution，DS)[组织培养液(TCM)199+0.5mol/L蔗糖]中处理3min，最后分两次将细胞移入各300uL洗涤溶液(Washing Solution，WS)[组织培养液(TCM)199]中分别处理5min、1min，处理完毕后将细胞转移到培养油中放入培养箱恢复。分步加载-去除保护剂的方法使细胞在不同浓度的溶液间转移，虽在一定程度上减少了渗透损伤，但细胞外溶液渗透压在转移过程中仍会发生阶梯状突变，此时***还是会受到较大的渗透损伤。另一方面，保护剂加载和去除过程需要操作人员精确控制细胞在保护剂中的渗透时间，在短时间内完成细胞的多次转移，在转移过程中极易造成细胞丢失，对操作人员的技术要求高。目前***和胚胎的玻璃化保存全部由人工操作，完成效率低，一个熟练的操作员一天也只能处理3～5个患者的细胞，随着逐年保存需求的增大，人工操作将逐渐难以满足保存需求，且人为因素存在着一定的不确定性，开发***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置十分有必要。

针对现有技术存在的上述问题，中国专利公开号CN105831105A公开了一种微流体细胞处理芯片及其应用方法，提供一种在保护剂加载/去除过程中能使低温保护剂浓度连续变化的微流体细胞处理芯片，操作时低温保护剂经蛇形通道混合流入细胞操作腔，通过使用细胞口吸器人工控制细胞进出细胞操作腔，并依靠操作腔中的圆柱形障碍物将细胞限制于细胞腔中，该种芯片及细胞处理方法虽然可以完成***及胚胎冷冻保护剂的连续性加载与去除，但在制作与应用方面仍然存在诸多问题：(1)芯片采用软光刻法制作，需要经过光刻开模，倒胶成型、分层键合等步骤，工艺较为复杂，制作成本较高；(2)细胞通过细胞口吸器人工控制进出细胞操作腔，完成保护剂加载后需要将细胞从芯片中取出，再加载至载体，增加了操作难度且后期较难实现自动化。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对上述缺陷，提供一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置及其应用方法。采用微流控技术实现保护剂溶液浓度的连续变化，取代了细胞在不同浓度的溶液间的人工转移；采用石英毛细管作为保护剂加载和去除以及细胞冷冻载体，简化了原有的细胞进入及取出芯片方式；设计了可旋转细胞冷冻台，将冷冻载体与液氮容器进行整合实现了低温保护剂加载/细胞冷冻/保护剂去除一体化，实现了装置的自动化。另外在加工工艺方面用PMMA材料替代原有的PDMS材料采用激光切割技术批量制作芯片，与PDMS材料制作方法相比大大简化了芯片的加工工艺，节省减小了加工成本。

本发明的目的之一是提供一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，该装置包括微流体细胞处理芯片***、石英毛细管、旋转细胞冷冻台。

本发明的目的之二是提供一***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置的应用方法，将保护剂加载/玻璃化冷冻/保护剂去除过程整合起来，实现***及胚胎的自动玻璃化保存。

具体地：

本发明提供了一种微流体细胞处理模块，其特征在于：包括微流体芯片本体；

所述微流控芯片本体包括顶层、通道层、底层；

所述通道层设置于顶层和底层之间；

所述通道层上设有的至少两个试剂流入通道、蛇形试剂混合管道和混合试剂流出通道；

所述各试剂流入通道互呈一定角度的设置于蛇形试剂混合管道的头端；

所述混合试剂流出通道设置于蛇形试剂混合管道的末端。

进一步地，本发明提供的一种微流体细胞处理模块，其特征还在于：所述试剂流入通道，包括第一试剂流入通道和第二试剂流入通道；

所述第一试剂流入通道和第二试剂流入通道互呈锐角的夹角。

进一步地，本发明提供的一种微流体细胞处理模块，其特征还在于：所述蛇形试剂混合管道的深度与宽度比为1-2：1。

另外，本发明还提供了一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：包括上述的微流体细胞处理模块、进样模块、毛细管模块；

其中，所述进样模块，包括可与试剂流入通道连通的进样设备；

所述进样设备与试剂流入通道一一对应；

所述毛细管模块，包括毛细管载体单元和细胞冷冻平台；

所述毛细管载体单元，包括毛细管载体和升降机构；

所述毛细管载体呈漏斗状的第一端部与混合试剂流出通道连通，在升降机构的作用下进行垂直方向的往复运动；

所述细胞冷冻平台，包括至少两个安装于细胞冷冻平台外视面上的容器和控制细胞冷冻平台转动的转动机构；

所述容器，在转动机构的作用下，于毛细管载体的下方进行切换。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：所述容器中的至少一个，具有滤片；

所述毛细管载体在向下运动的过程中，其第二端部正好贴合在滤片表面；

所述容器中的至少一个，内置有冷却介质。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：所述滤片的孔径小于目标***及胚胎的直径。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：所述毛细管载体单元还包括转接机构；

所述转接机构安装于毛细管载体的第一端部和混合试剂流出通道之间；

所述升降机构控制转接机构的升降行为。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：

所述毛细管载体的管体部分外径为0.2-0.4mm，壁厚0.01-0.05mm，长为8-12cm；所述漏斗状的第一端部，其开口直径为5-10mm，长为1-2cm。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：其特征在于，具有如下至少一种的用途：

A.对***及胚胎的进行低温保护剂加载；

B.对***及胚胎的进行冷冻；

C.对***及胚胎的进行复温；

D.对***及胚胎的进行低温保护剂去除。

进一步地，本发明提供的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征还在于：

所述对***及胚胎的进行低温保护剂加载的具体步骤为：

设置所述进样设备，使其包括低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器；

S1.将细胞从培养液中从毛细管载体的第二端部吸入；

S2.将混合试剂流出通道，通过转接机构，连通毛细管载体的第一端部，控制升降机构和转动机构，使毛细管载体的第二端部垂直的紧贴按压在滤片上；

S3.打开低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器，并设置低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加；

S4.当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，将毛细管载体中的液体回吸，防止细胞从毛细管载体端口溢出，随后关闭双通道注射泵，完成加载过程；

对***及胚胎的进行冷冻的具体步骤为：

S1.将毛细管载体保护套提前放入具有冷却介质的容器中预冷；

S2.控制升降机构，使毛细管载体远离滤片，控制转动机构，使具有冷却介质的容器位于毛细管载体的下方；

S3.控制升降机构，使毛细管载体浸入冷却介质中，在指定的时间后，取下毛细管载体，并将其在液氮中装入已预冷的保护套中，完成冷冻过程；

对***及胚胎的进行复温及低温保护剂去除的具体步骤为：

设置所述进样设备，使其包括复温溶液微量微量进样器和缓冲溶液微量进样器；

S1.复温前，先将复温试剂倒在培养皿中放入培养箱预热至指定的温度；

S2.在具有冷却介质的容器中，取出毛细管载体后，迅速放入预热好的复温试剂中静置指定的时间；

S3.将混合试剂流出通道，通过转接机构，连通毛细管载体的第一端部，控制升降机构和转动机构，使毛细管载体的第二端部垂直的紧贴按压在滤片上；

S4.打开复温溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器，并设置复温溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，使得混合后的溶液中复温溶液的浓度连续减小；

S5.当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，将毛细管载体中的液体回吸，防止细胞从毛细管载体端口溢出，随后关闭双通道

当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，随后关闭双通道注射泵，将毛细管载体取下，将细胞从毛细管载体的第二端吹入培养油中，完成复温及保护剂去除过程。

本发明的有益效果是：

本发明的***及胚胎低温保护剂加载和去除的微流体方法是基于在微观尺寸下控制、操作和检测复杂流体的微流体技术，保护剂溶液和缓冲溶液通过不同入口进入微流体通道，并以层流方式在通道内流动，通过扩散方式在蛇形通道内混合。根据需求设置保护剂和缓冲溶液的输入线型即可实现保护剂浓度的连续改变，从而减小保护剂浓度的突然改变对细胞造成的渗透冲击以及细胞在高浓度保护剂中的毒性损伤。

本发明的一体式微流体细胞玻璃化保存装置将微流体混合芯片和细胞冷冻载体集成，可对***及胚胎直接在石英毛细管中进行自动冷冻前处理和后处理，改变现有的细胞加载-细胞处理-细胞取出再加载至冷冻载体的模式，将保护剂的加载和去除过程直接在载体上完成，实现了细胞加载和低温保护剂加载的一体化。

本发明的一体式微流体细胞玻璃化保存装置将低温保护剂加载/去除过程和细胞玻璃化保存过程整合，细胞在石英毛细管中进行完低温保护剂加载过程后，可通过控制冷冻台旋转和升降，直接在冷冻台上完成玻璃化。一体式装置受人为因素影响小，操作更精准，减少人工操作，满足逐年增长的***及胚胎的保存需求，有助于建立***及胚胎的标准化冷冻保存流程。

本发明的***及胚胎低温保护剂加载和去除的微流体细胞处理芯片采用激光切割技术制作，与原有制作工艺相比，无需开模、灌胶等复杂操作，具有批量制作方便廉价的优点。

附图说明

图1、本实施例涉及的微流体细胞处理芯片的结构示意图；

图2、本实施例涉及的***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置的结构示意图；

图3、本实施例涉及的旋转冷冻台的结构示意图；

图4本实施例涉及的旋转冷冻台的结构示意图。

具体实施方式

如图2所示，本实施例提供的一体式微流体细胞玻璃化保存装置，由微流体细胞处理芯片、石英毛细管细胞冷冻载体以及旋转冷冻台三部分组成，芯片部分与两个双通道微注射泵的微量进样器16、17通过微流体芯片钢针导管连接，并固定在微流体芯片夹。

如图1所示，述微流控芯片本体包括顶层1、通道层2、底层3；

该通道层2设置于顶层1和底层3之间；

该通道层2上设有设有蛇形试剂混合管道6，蛇形试剂混合管道的试剂流入口上设有第一试剂流入通道4和第二试剂流入通道5，蛇形试剂混合管道6的试剂流出口7通过鲁尔接头9连接石英毛细管载体10的漏斗端。

其中，该通道层2上设有的试剂流入通道4、5、蛇形试剂混合管道6、混合试剂流出通道7的深度均为0.5mm，宽度均为0.25mm，深宽比为2:1；第一试剂流入通道4和第二试剂流入通道5夹角为60°；蛇形混合通道6的转弯半径为1mm，长度约为135mm。

如图2所示，石英毛细管载体10管体部分内径0.18mm，壁厚0.01mm，长为8cm，导热系数为1.46W/(m·K)，毛细管两端均开口，其中尾端设有一段漏斗；漏斗部分开口直径5mm，长为1cm，漏斗端与芯片的混合试剂出口7通过钢针导管相连。

微流体芯片部分与微注射泵通过芯片顶层1设有的钢针导管连接，该微注射泵的型号为Pump 11Pico Plus Elite(Harvard,USA)；

芯片顶层设置的限定开口分别用于通入缓冲溶液和低温保护剂或复温溶液；两个入口对称于蛇形混合管道6的试剂流入口，且开口直径相同；并且分别通过试剂流入口设置的钢针导管与两个双通道微注射泵的两个微量进样器16、17连接；

两个试剂入口通过流入通道与蛇形试剂混合管道6相连通，低温保护剂和缓冲溶液可在蛇形混合管道6内均匀混合，使得混合试剂出口处7的试剂浓度能连续变化；

如图2和3所示，旋转冷冻台包括一大一小两个容器12、13、一个电动推杆和一个可旋转的底座15；大容器用于放置液氮槽13，小容器用于放置溶液收集管12和细胞过滤装置11，冷冻台主体平台14部分与所述旋转底座15连接；细胞过滤装置11架于废液收集管12开口处，且细胞过滤装置11所用滤网孔径小于***及胚胎的直径；石英毛细管载体10的漏斗部分连接电动推杆8顶端的双向鲁尔接头9；石英毛细管前端垂直按压于细胞过滤装置11的滤网上，溶液经滤网流至溶液收集管12中。

芯片外部大小应该与固定芯片的芯片夹相匹配；

如图1所示，微流体细胞处理芯片主要分为三层，三层材质均为聚甲基丙烯酸甲酯(polymethyl methacrylate，PMMA)。首先在图形绘制软件上确定芯片各层以及通道的形状尺寸，再将图纸上传至激光切割机，每层分别打印后用超声波清洗机清洗掉通道内残留的PMMA粉末。为保证通道尺寸的精确性，采用PSA膜键合技术，放入真空贴合机去除芯片各层中的气泡，确保芯片的气密性。处理后的芯片在顶层1粘合钢针导管和聚四氟乙烯管，完成芯片部分的制作。

本实施例的一体式微流体细胞处理装置在***及胚胎低温保护剂加载和去除中的应用方法，包括低温保护剂加载方法、冷冻保存方法、复温及低温保护剂去除的方法。

本实施例设备在进行***及胚胎低温保护剂的加载应用方法的步骤如下：

1)将微流体细胞处理芯片安放固定在微流体芯片夹上；

2)先推动装有缓冲溶液的微量进样器16，使通道内充满缓冲溶液，排尽通道内的空气，防止加载时通道内产生气泡进入石英毛细管载体10对细胞造成损伤；

3)用手指堵住石英毛细管载体10尾端的漏斗开口，利用毛细作用将细胞从培养液中吸入石英毛细管10前端；细胞处理芯片混合试剂出口7处连接聚四氟乙烯管并连接至电动推杆8顶端固定的双向鲁尔接头9的一端；将石英毛细管载体10漏斗部分连接至双向鲁尔接头9的另一端固定；手动调整电动推杆8的高度和旋转冷冻平台14的角度使石英毛细管10前端能垂直按压于细胞过滤装置11的滤网上，保证毛细管中的液体能顺利流出而细胞不会被冲出；

4)调整好石英毛细管10和旋转冷冻台后，分别在两台双通道微注射泵16、17上设置注射程序；双通道微注射泵17控制低温保护剂[组织培养液(TCM)199+15％EG+15％DMSO]的注射，设置流速从0缓慢增加至30μl/min；双通道微注射泵16控制缓冲溶液[组织培养液(TCM)199]的注射，设置流速从30μl/min缓慢减小至0；

5)同时打开双通道微注射泵16和17，使两种溶液经对应入口流入混合通道内进行混合，混合好的溶液经混合溶液出口流入石英毛细管载体10内，使得石英毛细管内的保护剂浓度实现连续变化；流经细胞的废液通过石英毛细管尖端流入废液收集管12内；

6)当低温保护剂流速达到30μL/min，缓冲溶液流速为0时，低温保护剂加载完毕(加载时间根据不同细胞类型和不同低温保护剂配方而不同，***的加载时间一般为8min)，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序将石英毛细管载体中的液体回吸，防止细胞从石英毛细管10口溢出，随后关闭双通道注射泵，加载过程结束。

本发明进行***及胚胎低温保存应用方法步骤如下：

1)电动推杆8和旋转冷冻台底座15的延时程序结束，电动推杆8自动上升使石英毛细管10悬于细胞过滤装置11上方后暂停，此时旋转冷冻平台14旋转45°后停止，使液氮罐13位于石英毛细管载体10下方，电动推杆8再次启动快速下降使石英毛细管载体10浸入液氮中，10s后取下固定的石英毛细管10，用镊子将石英毛细管在液氮中装入已预冷的保护套18中，冷冻过程完毕；

本发明在进行***及胚胎低温保护剂的去除应用方法的步骤如下：

1)复温前，先将复温溶液[组织培养液(TCM)199+0.5mol/L蔗糖]倒在培养皿中放入培养箱预热至37℃；

2)打开保护套18的盖子，并小心将石英毛细管载体10夹出迅速放入预热好的复温试剂TS中静置1min。

3)将微流体细胞处理芯片安放固定在微流体芯片夹上；

4)推动装有复温溶液的微量进样器17，使通道内充满复温溶液，排尽通道内的空气，防止加载时通道内产生气泡进入石英毛细管对细胞造成损伤；

5)细胞处理芯片混合试剂出口处7连接聚四氟乙烯管并连接至电动推杆8顶端固定的双向鲁尔接头9的一端；将石英毛细管载体10漏斗部分连接至双向鲁尔接头9的另一端固定；手动调整电动推杆8的高度和旋转冷冻平台14的角度使石英毛细管10前端能垂直按压于细胞过滤装置11的滤网上，保证毛细管中的液体能顺利流出而细胞不会被冲出；

6)调整好石英毛细管11和旋转冷冻台后，分别在两台双通道微注射泵上设置注射程序；双通道微注射泵17控制复温溶液[组织培养液(TCM)199+0.5mol/L蔗糖]的注射，设置流速从30μL/min缓慢减小至0；双通道微注射泵16控制缓冲溶液[组织培养液(TCM)199]的注射，设置流速从0缓慢增加至30μl/min；

7)同时打开双通道微注射泵16和17，使两种溶液经对应入口流入混合通道内进行混合，混合好的溶液经混合溶液出口7流入石英毛细管载体10内，使得石英毛细管内的保护剂浓度实现连续变化；流经细胞的溶液通过石英毛细管尖端流入溶液收集管12内；

8)当缓冲溶液流速达到30μl/min，复温溶液流速为0时，低温保护剂去除完毕(去除时间根据不同细胞类型和不同低温保护剂配方而不同，***的去除时间一般为8min)，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序将石英毛细管载体10中的液体回吸，随后关闭双通道注射泵，将石英毛细管取下；

9)将细胞从石英毛细管尖端吹入培养油中，放入培养箱中恢复。

Claims (8)

1.一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：包括微流体细胞处理模块、进样模块、毛细管模块；

其中，所述进样模块，包括可与试剂流入通道连通的进样设备；

所述进样设备与试剂流入通道一一对应；

所述毛细管模块，包括毛细管载体单元和细胞冷冻平台；

所述毛细管载体单元，包括毛细管载体和升降机构；

所述毛细管载体呈漏斗状的第一端部与混合试剂流出通道连通，在升降机构的作用下进行垂直方向的往复运动；

所述细胞冷冻平台，包括至少两个安装于细胞冷冻平台外视面上的容器和控制细胞冷冻平台转动的转动机构；

所述容器，在转动机构的作用下，于毛细管载体的下方进行切换；

所述微流体细胞处理模块，包括微流体芯片本体；

所述微流控芯片本体包括顶层、通道层、底层；

所述通道层设置于顶层和底层之间；

所述通道层上设有的至少两个试剂流入通道、蛇形试剂混合管道和混合试剂流出通道；

所述各试剂流入通道互呈一定角度的设置于蛇形试剂混合管道的头端；

所述混合试剂流出通道设置于蛇形试剂混合管道的末端；

所述容器中的至少一个，具有滤片；

所述毛细管载体在向下运动的过程中，其第二端部正好贴合在滤片表面；

所述容器中的至少一个，内置有冷却介质。

2.如权利要求1所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述试剂流入通道，包括第一试剂流入通道和第二试剂流入通道；

所述第一试剂流入通道和第二试剂流入通道互呈锐角的夹角。

3.如权利要求1所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述蛇形试剂混合管道的深度与宽度比为1-2：1。

4.如权利要求1所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述滤片的孔径小于目标***及胚胎的直径。

5.如权利要求1所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述毛细管载体单元还包括转接机构；

所述转接机构安装于毛细管载体的第一端部和混合试剂流出通道之间；

所述升降机构控制转接机构的升降行为。

6.如权利要求1所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述毛细管载体的管体部分外径为0.2-0.4mm，壁厚0.01-0.05mm，长为8-12cm；所述漏斗状的第一端部，其开口直径为5-10mm，长为1-2cm。

7.如权利要求1-6任一所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于，具有如下至少一种的用途：

A.对***及胚胎的进行低温保护剂加载；

B.对***及胚胎的进行冷冻；

C.对***及胚胎的进行复温；

D.对***及胚胎的进行低温保护剂去除。

8.如权利要求7所述的一种***及胚胎自动玻璃化保存一体化装置，其特征在于：

所述对***及胚胎的进行低温保护剂加载的具体步骤为：

设置所述进样设备，使其包括低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器；

S1.将细胞从培养液中从毛细管载体的第二端部吸入；

S2.将混合试剂流出通道，通过转接机构，连通毛细管载体的第一端部，控制升降机构和转动机构，使毛细管载体的第二端部垂直的紧贴按压在滤片上；

S3.打开低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器，并设置低温保护剂微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，使得混合后的溶液中低温保护剂的浓度连续增加；

S4.当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，将毛细管载体中的液体回吸，防止细胞从毛细管载体端口溢出，随后关闭双通道注射泵，完成加载过程；

对***及胚胎的进行冷冻的具体步骤为：

S1.将毛细管载体保护套提前放入具有冷却介质的容器中预冷；

S2.控制升降机构，使毛细管载体远离滤片，控制转动机构，使具有冷却介质的容器位于毛细管载体的下方；

S3.控制升降机构，使毛细管载体浸入冷却介质中，在指定的时间后，取下毛细管载体，并将其在液氮中装入已预冷的保护套中，完成冷冻过程；

对***及胚胎的进行复温及低温保护剂去除的具体步骤为：

设置所述进样设备，使其包括复温溶液微量微量进样器和缓冲溶液微量进样器；

S1.复温前，先将复温试剂倒在培养皿中放入培养箱预热至指定的温度；

S2.在具有冷却介质的容器中，取出毛细管载体后，迅速放入预热好的复温试剂中静置指定的时间；

S3.将混合试剂流出通道，通过转接机构，连通毛细管载体的第一端部，控制升降机构和转动机构，使毛细管载体的第二端部垂直的紧贴按压在滤片上；

S4.打开复温溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器，并设置复温溶液微量进样器和缓冲溶液微量进样器的推进速度，使得混合后的溶液中复温溶液的浓度连续减小；

S5.当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，将毛细管载体中的液体回吸，防止细胞从毛细管载体端口溢出，随后关闭双通道

当细胞达到处理要求后，停止双通道注射泵的注射程序，进行抽吸程序，随后关闭双通道注射泵，将毛细管载体取下，将细胞从毛细管载体的第二端吹入培养油中，完成复温及保护剂去除过程。

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