CN106998675A - 用于生物材料的自动玻璃化的***和方法 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于哺乳动物***或胚胎的自动玻璃化的***和方法。所述***和方法能够自动处理在玻璃化溶液中的***或胚胎；机器人移动携带处理的细胞的玻璃化装置以在液氮中冷冻；自动密封冷冻的装置；并将密封的装置转移至自动贮藏***用于长期低温贮藏。

Description

用于生物材料的自动玻璃化的***和方法
发明领域
本发明总体上涉及生物细胞的检测、处理和操作领域，且特别是涉及用于哺乳动物***或胚胎的玻璃化的***和方法。
发明背景
哺乳动物生殖细胞的低温保存在IVF (体外人工受精)诊所中是一项重要的技术。***和胚胎通常被冷冻并保存，以供在稍后的时间使用。经受可将其生育力置于风险中的治疗程序(如化学疗法)的患者，具有保留其***以供将来通过IVF技术使用的选项。此外，受精胚胎往往更需要IVF处理的一个周期。剩下的受精胚胎通常冷冻保存，以供将来使用。
***/胚胎低温保存的技术分为两类，缓慢冷冻和快速冷冻(即，玻璃化)。缓慢冷冻是在二十世纪七十年代早期开发的一种确立的成熟技术，其利用可编程序列，或控制冷却速率。玻璃化或快速冷冻是一种更有效的低温贮藏方法，首次报道于1985年(见W.F. Rall和G. M. Fahy, “小鼠胚胎于-196℃经玻璃化的无冰低温保存(Ice-freecryopreservation of mouse embryos at -196 degrees C by vitrification)”,Nature, vol. 313, no. 6003, pp. 573-5, 1985)。玻璃化被认为优于缓慢冷冻，因为在冷冻期间，***/胚胎被玻璃化而没有晶体形成。在玻璃化中加入防冻剂增加胚胎粘度，并使玻璃化胚胎呈糖浆状。当在液氮中直接冷冻***/胚胎时，细胞内的糖浆状内容物形成无定形冰而不是冰晶，这使得在冷冻期间对细胞的活力损害最小化。
***/胚胎玻璃化在IVF诊所是手工进行的。操作员通过显微镜目镜观察并使用微量吸液管操作***/胚胎。首先将***/胚胎从培养皿中取出并用平衡溶液(ES)和一系列玻璃化溶液(VS)洗涤。在每一个步骤中，控制时间已被证明是至关重要的。在洗涤步骤后，将处理的***/胚胎放置到玻璃化吸管上或放置到冷冻-吸液管中。保留在吸管上的***/胚胎周围的溶液体积必须最少，以确保高的冷却速率。然后将玻璃化吸管***液氮中以供冷冻和长期低温保存。存在一些不同的市售玻璃化溶液和方案；然而，核心步骤在很大程度上是相同的。所有方案涉及使用ES和VS的多个洗涤步骤，将玻璃化***/胚胎放置到玻璃化吸管上，并在液氮中冷冻玻璃化吸管。
针对***/胚胎玻璃化的手动操作由于以下理由是一个要求很高但却乏味的任务：(1) 用高度粘性VS洗涤***/胚胎导致细胞渗透压休克，而渗透压休克可能是细胞损伤的主要原因；(2) 大多数防冻溶质(如，DMSO)对***/胚胎是有毒的。因此，在有毒的VS中的洗涤时间是至关重要的，但可能难以严格控制；(3) 由于***/胚胎的小尺寸(约150 µm)，它们可能难以检测和操作，尤其是当围绕细胞的介质在微量吸液管抽吸和分发期间动态变化时；(4) 手动过程具有严格的技术要求，而成功率和细胞存活率会因不同的操作员而变化。
Heo等开发了一种微流体平台以控制用于***低温保存的防冻剂的加载(见Y. Heo, H. Lee, B. Hassell, et al., “在微流体平台上防冻剂(CPAs)以线性和复杂的CPA特性对***的控制加载(Controlled loading of cryoprotectants (CPAs) tooocyte with linear and complex CPA profiles on a microfluidic platform)”, Labon a Chip, vol. 11, no. 20, pp. 3530-7, 2011)。当***/胚胎“停泊”在微流体平台的一个位置时，***/胚胎的一侧直接面向玻璃化溶液，而另一侧则不如此。因此，***/胚胎不如在标准手动方案中那样均匀地暴露于VS。在实践中，在容器或预设的位置停泊胚胎，在VS中洗涤后，对于取回胚胎可能带来显著的困难。将***/胚胎施加于VS的时间设置是至关重要的，因为在VS中的防冻剂可强加给胚胎有毒的影响，如果它们不能及时取回的话。
Genea Biomedx Inc.开发了一种用于***/胚胎玻璃化的自动化器械(美国专利申请公布号2013/0137080)。Genea***需要用户手动转移***/胚胎至称为“豆荚(pods)”的阵列孔中，每孔一个***/胚胎。在IVF诊所使用的本玻璃化方案中，***/胚胎被移进和移出不同的玻璃化溶液。不同地，Genea***中的***/胚胎保持在孔中，而玻璃化溶液被分发到各孔中及从各孔中吸出。由于***/胚胎总是位于孔底，与孔底接触的细胞表面不能如在细胞表面的其余部分那样均匀地暴露于玻璃化溶液。而且，Genea***基于体积控制来分发和抽吸液体，而不监测细胞位置；因此，该技术不能满足最小的体积需要以实现高的冷却速率。
类似于Genea Biomedx的自动玻璃化***，Samuel S. Kim等的专利申请公布号WO2013020032、Fred Burbank等的US2011/0207112，和Amir Arav的WO2013098825也公开了将***/胚胎停泊在预设位置并改变VS的方法。Samuel S. Kim等的WO2013020032描述了一种自动化装置，其包含防冻剂储存器、防冻剂分配器，和经定位以允许样本与来自所述防冻剂分配器的防冻剂接触的样本储存器。在这种装置中，***或胚胎在整个程序过程被保持在样本储存器(如，电子显微镜网格)中，同时VS被分发和排出以供洗涤样本。
在Fred Burbank等的美国专利申请公布号2011/0207112中，一个或多个***或胚胎被定位在处理容器中，处理容器被配置为允许流体流入和流出处理容器，其中两种或更多种流体流入和流出容器。
Amir Arav的WO2013098825公开一种包括引流区和毛细管引流元件的装置。引流区被配置为容纳生殖生物样本。毛细管引流元件，其开口在引流区内，被配置为从引流区排出液体，同时生殖细胞部分的生殖细胞成分保留在引流区中。
与将玻璃化***/胚胎放置在吸管-样载体的目前使用的玻璃化方案不同，Fuliang Du等的美国专利公布号2013/0157362、Xiangzhong Yang等的2002/0009704，和Utkan Demirci等的2012/0251999公开了生成包含生物样本的VSs的微米/纳米液滴，和直接在液氮中冷冻液滴的方法。
Milton Chin在美国专利申请公布号2009/0186405和2009/0123996中公开了为提高在液氮中的冷却率并实现在液氮中贮藏玻璃化样本的自-密封功能的装置设计。
Ru等在中国专利申请公布号202918907U中公开了用于胚胎玻璃化的半-自动***。该***需要手动输入几个关键步骤进行胚胎拾起并定位(pick-and-place)。在第0056段落中，***需要操作员通过从显微镜观察，获得微量吸液管顶端的位置，并将位置信息输入计算机。类似的人工输入是必需的(见第0062、0070和0072段)。自动化部分仅是使用机器人的机械手去拾起一个胚胎，移动到预设的位置，并将胚胎放入玻璃化溶液中。没有计算机视觉算法来自动检测胚胎和微量吸液管尖端。而且，使用机器人***的单一细胞拾起并定位的技术是公开的知识，例如由Z. Lu, C. Moraes, G. Ye, C.A. Simmons，和Y. Sun在“使用机器人***的单一细胞沉积和模式(Single cell deposition and patterningwith a robotic system)”, PLoS ONE, Vol. 5, e13542, 2010中公开。此外，在CN202918907U中公开的***只能使用特定的Cryotip®方法操作(见第0086段)，其对于通用应用是有限的。不在玻璃化溶液中洗涤胚胎，该***不能用于需要洗涤胚胎至少一次的其它方案(如，Kitazato的Cryotop方法，和Irvine玻璃化方案)。
需要的是自动玻璃化***，其设计为用玻璃化处理溶液自动处理***/胚胎和其它细胞类型，将玻璃化***/胚胎自动放置于玻璃化装置(如，Cryotop、Cryotip®、Cryoloop等)，从在装置上的玻璃化***/胚胎除去过多的介质，在密封机上用盖自动密封玻璃化装置，并在自动液氮储罐/***中冷冻。
发明概述
根据本发明的一个实施方案，在此提供一种用于自动化低温保存和解冻生物材料，例如细胞、***和胚胎的***。在一个实施方案中，自动化***包括(a) 载板，其具有(i)容纳或加载生物材料的区域，(ii) 容纳处理溶液的多孔区，和(iii) 容纳一个或多个玻璃化吸管的吸管区；(b) 连接于操作生物材料和处理溶液的机械手的第一机器人或机器人机械手；(c) 操作玻璃化吸管的第二机器人或机器人机械手；(d) 显微镜和可操作地连接于显微镜以捕获生物材料的图像的图像捕获装置、机械手和吸管；(e) 具有可执行的指令的计算机可读介质；和(f) 执行计算机可读介质的可执行指令的处理器；所述可执行指令包括以下自动化的指令：(i)处理捕获的图像，和(ii) 可操作地控制显微镜、图像捕获装置、第一机器人，和第二机器人。
根据本发明的这个实施方案的一个方面，所述***还包括吸管-密封机和自动低温贮藏装置，和可执行指令包括自动化控制吸管-密封机和自动低温贮藏装置的指令。
根据本发明的***的另一方面，可执行指令还包括以下指令：(i) 当生物材料是细胞、胚胎或***时，从捕获的图像检测处于不同发育阶段的细胞、胚胎或***；(ii) 跟踪三维空间中的生物材料；(iii) 监测生物材料的体积；(iv) 生成处理溶液的浓度梯度；(v) 将生物材料置于吸管上；和(vi) 从置于吸管上的生物材料除去过多的处理溶液。
根据这个实施方案的另一方面，显微镜与包括用于改变放大倍率和焦距的驱动器的控制器通信连通。
根据这个实施方案的另一方面，显微镜包括用于接受载板的X-Y载物台，X-Y载物台包括X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***。在本发明的一个方面，可执行指令包括可操作地控制X-Y载物台的指令。
根据这个实施方案的另一方面，显微镜与包括X和Y轴线性移动***的每一个的驱动器的控制器通信连通。
根据这个实施方案的另一方面，X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***是独立可控的。
根据这个实施方案的另一方面，载板与加热板集成为一体以使载板的生物材料容纳区维持适当的温度(例如约37℃)。
根据这个实施方案的另一方面，机械手是具有适合于操作生物材料的尖端直径(例如约100-200微米)的微量吸液管。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管连接于微量吸液管储存器，并连接于电动注射器。
根据这个实施方案的另一方面，将微量吸液管以尖端侧朝下的倾斜角度置于X-Z平面(即，垂直于Y轴)。
根据这个实施方案的另一方面，***还包括与包括控制线性移动的驱动器的控制器通信连通的电动注射器，和可执行的指令包括自动控制电动注射器的指令。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管储存器连接于第一机器人机械手。
根据这个实施方案的另一方面，第一机器人机械手具有沿着X、Y和Z的至少三个自由度。
根据这个实施方案的另一方面，第一机器人机械手与包括用于X、Y和Z轴线性移动***的每一个的驱动器的控制器通信连通。
根据这个实施方案的另一方面，以每秒30帧或更高的帧速率，从显微镜和图像捕获装置捕获实时图像，以提供具有连续的视觉信息的***。
根据这个实施方案的另一方面，当生物材料是胚胎时，***能够从捕获的图像自动检测在不同发育阶段的胚胎(如，2-细胞、4-细胞，和胚泡)。
根据这个实施方案的另一方面，***还包括生物材料检测算法。
根据这个实施方案的另一方面，***能够通过最大化聚焦测量，自动对焦于对象。
根据这个实施方案的另一方面，生物材料检测算法还包括自适应阈值算法以使灰度图像二值化。
根据这个实施方案的另一方面，生物材料检测算法还检测二值化图像中的所有对象的轮廓。
根据这个实施方案的另一方面，具有在特定范围内的轮廓区域的对象被视为潜在的生物材料目标。
根据这个实施方案的另一方面，为了避免错误的检测，潜在的生物材料目标的轮廓通过使用霍夫变换算法(Hough transform algorithm)进一步拟合圆，且圆的中心点被认为是生物材料位置。
根据这个实施方案的另一方面，***能够从捕获的图像自动检测微量吸液管尖端。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管尖端检测算法还包括两个沿着x和y轴的索贝尔过滤器(Sobel filters)。
根据这个实施方案的另一方面，沿着y-轴的索贝尔过滤器被用来确定微量吸液管的外壁，而沿着x-轴的Sobel被用来确定尖端位置。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管的外壁通过使用霍夫线性变换算法(Hough line transform algorithm)进一步检测。
根据这个实施方案的另一方面，当生物材料被抽吸到微量吸液管中时，微量吸液管尖端的外壁被用来确定用于生物材料检测的感兴趣的区域(ROI)。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管尖端和生物材料之间沿着Z轴的相对距离通过一种接触检测算法确定，该检测算法基于当微量吸液管尖端接触容纳生物材料的基层(例如培养皿)时检测水平滑行移动。
根据这个实施方案的另一方面，机器人机械手经由闭环视觉伺服控制，将微量吸液管尖端移近目标生物材料。
根据这个实施方案的另一方面，电动注射器被用来在尖端移近生物材料后，生成将目标生物材料抽吸到微量吸液管尖端中的负压。
根据这个实施方案的另一方面，电动注射器也被用来生成将目标生物材料从微量吸液管尖端分发到所需位置的正压。
根据这个实施方案的另一方面，计算机视觉算法被用来检测生物材料在微量吸液管内的位置。
根据这个实施方案的另一方面，通过控制电动注射器，将生物材料经由闭环视觉伺服控制，精确定位于微量吸液管内的所需位置。
根据这个实施方案的另一方面，生物材料自动从一个位置移动到另一个位置(如，从培养皿转移到多-孔板)。
根据这个实施方案的另一方面，通过重复生物材料抽吸和分发，在玻璃化溶液中自动洗涤生物材料。
根据这个实施方案的另一方面，当生物材料从ES转移到VS时，***能够自动跟踪在3D空间中的生物材料。
根据这个实施方案的另一方面，***能够通过按坐标移动微量吸液管尖端并分发低浓度的ES，自动生成在VS中的浓度梯度。
根据这个实施方案的另一方面，***能够自动监测生物材料的体积的实时变化，以提供在不同类型的溶液中优化洗涤时间的一个标准。
根据这个实施方案的另一方面，玻璃化生物材料当它达到最小体积时，经由微量吸液管抽吸从VS自动取出。
根据这个实施方案的另一方面，生物材料在VS中洗涤后被自动放置在玻璃化吸管上。
根据这个实施方案的另一方面，玻璃化吸管位置经计算机视觉算法自动检测。
根据这个实施方案的另一方面，玻璃化吸管检测还包括霍夫线性变换算法，以检测吸管的两个水平边缘。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管尖端和玻璃化吸管之间的垂直距离通过接触检测来检测，该检测基于由微量吸液管尖端的接触引起的玻璃化吸管尖端偏差移动。
根据这个实施方案的另一方面，微量吸液管尖端自动移到玻璃化吸管的中心并接触吸管表面。
根据这个实施方案的另一方面，玻璃化生物材料通过控制电动注射器施加正压被分发到吸管上。
根据这个实施方案的另一方面，生物材料周围的过多的介质通过微量吸液管在离开分发生物材料的位置的距离(如，300微米)的位置被自动抽吸掉。
根据这个实施方案的另一方面，当在吸管上的生物材料液滴体积没有进一步的变化时，过多的介质的抽吸会自动停止。
根据这个实施方案的另一方面，在尖端上具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管由机器人从载板拾起。
根据这个实施方案的另一方面，机器人将在尖端上具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管***子容器的液氮中以供快速冷冻。
根据这个实施方案的另一方面，玻璃化吸管在冷冻后被放置在密封机的滑动部分上。
根据这个实施方案的另一方面，预加载了玻璃化吸管盖的密封机，通过移动滑行部分给吸管加盖。
根据这个实施方案的另一方面，将用盖密封的玻璃化吸管***含有液氮的子容器的孔中。
根据这个实施方案的另一方面，子容器自动转移到自动液氮贮藏***以供长期低温保存。
根据这个实施方案的另一方面，洗涤溶液类型和浸泡时间可容易地通过***的软件界面，根据不同的玻璃化试剂盒和方案指定。
根据这个实施方案的另一方面，***能够用节省总的处理时间的优化程序处理多个生物材料。
本发明的实施方案也提供使用本发明的***，低温保存和解冻生物材料，特别是***、胚胎，和其它细胞材料的自动方法。在本发明的一个实施方案中，处理生物材料的方法包括，(a) 将生物材料自动(即不是人类操作员协助)和均匀地暴露于一系列玻璃化处理溶液，从而获得玻璃化生物材料，(b) 自动放置玻璃化生物材料在玻璃化吸管的表面，(c) 将携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管自动浸渍或***低温保存溶液中，(d) 自动密封携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管，(e) 自动贮藏密封的玻璃化吸管于低温保存溶液中，从而冷冻含有玻璃化生物材料的玻璃化吸管，以供长期低温保存。
在本发明的方法的另一个实施方案中，该方法还包括从低温保存溶液自动取回冷冻的密封玻璃化吸管，并将冷冻玻璃化生物材料自动和均匀地暴露于一系列处理溶液，从而解冻生物材料。
附图简述
以下各图举例说明本发明的各个方面和优选和备选的实施方案。
图1说明根据本发明的一个实施方案的自动机器人玻璃化***。
图2说明根据本发明的一个实施方案的承载胚胎培养皿、多-孔板，和多个玻璃化吸管的载板的顶视图。
图3是图示说明玻璃化和解冻过程的实施例方案的图。ES：平衡溶液，VS：玻璃化溶液，TS：解冻溶液，DS：稀释溶液，WS：洗涤溶液。
图4是图示说明本发明的机器人***的平行玻璃化的实施例进度表的图。在该实施例中，处理时间按照得自Kitazato Company的方案(Kitazato Inc., Cryotop SafetyKit Protocol, 2014)。
图5是显示通过使用在图像中包含的对象的面积和形状信息，用于微量吸液管检测的实施例算法的图像。(a) 矩形是检测结果。(b) 二值化的图像显示检测的前景对象。(c) 轮廓图像显示微量吸液管形状：霍夫线性变换被应用于拒绝微量吸液管的虚假检测。
图6是图示说明根据本发明的一个实施方案，确定微量吸液管的Z位置的接触检测算法的图。(a) 图示说明微量吸液管尖端当接触胚胎培养皿基层时，产生水平滑行移动的前视图。微量吸液管相对于培养皿底的Z位置通过检测这种水平滑行移动来确定。(b) 显示微量吸液管尖端当接触吸管尖端表面时使玻璃化吸管尖端变形的前视图。微量吸液管尖端相对于玻璃化吸管尖端的Z位置通过检测吸管尖端的变形确定。
图7是图示说明根据本发明的一个实施方案，用于胚胎检测的实施例方法的图。(a) 圈显示检测结果。(b) 二值化的图像显示检测的前景对象。(c) 轮廓图像显示形状信息：霍夫圆变换被应用于将圈拟合于潜在的胚胎目标，以避免错误的检测。
图8是根据本发明的一个实施方案，将胚胎定位于微量吸液管内的控制图。
图9是图示说明当***将胚胎从玻璃化溶液1 (VS1)转移至VS2时，生成浓度梯度的实施例方法的图。
图10是图示说明根据本发明的一个实施方案，在将胚胎放置于玻璃化吸管尖端后，自动除去过多的介质的图像。(a) 将含有胚胎的相对较大的介质沉积在吸管表面。(b)通过机器人拖动微量吸液管尖端至左边，在吸管表面上形成介质的薄膜。(c) 通过施加负压，自动抽吸掉将过多的介质。胚胎由于摩擦力停留在初始的位置。
图11示意显示根据本发明的一个实施方案，将盖置于玻璃化吸管的吸管盖密封机的实例。
图12是图示说明根据本发明的一个实施方案的自动液氮贮藏***的实施例设计的图。
图13说明根据本发明的一个实施方案，用于玻璃化样本贮藏的具有孔的液氮子容器的实施例设计：左区具有冷冻玻璃化吸管的开放空间，而右区具有许多用于贮藏冷冻样本的孔。盖子可放置于子容器上以保持玻璃化吸管在正确的位置。
发明详述
定义
除非另外定义，在此使用的所有技术和科学术语，具有本发明所属领域普通技术人员通常理解的相同意义。而且，除非另外指明，除了在权利要求书内，“或”的使用包括“和”，并且反之亦然。非限制性术语不应视为限制，除非明确地声明或文中另外清楚地指明(例如“包括”、“具有”和“包含”通常表示“包括但不限制”)。权利要求书中包括的单数形式例如“一”、“一个”和“该”包括复数指代，除非另外清楚地指明。引用的所有文件通过引用以其全文结合到本文中。为帮助理解和准备本发明，提供以下示例性的、非限制性实例。
如本文所用的“自动的/自动化”意指无操作人员的控制(例如手动和/或基于操纵杆的控制(joy-stick based control))或其中人工干预仅限于键入输入数据。软件(图像处理和移动控制)和硬件被集成在计算机机器内以减少或消除操作员的干预。
如本文所用的“电动的”意指装置例如定位装置、注射器等配备有经由控制算法和策略控制的一个或多个马达。
概述
本发明涉及硬件元件和计算机视觉算法以使玻璃化过程自动化，包括全自动化。本发明可被用来实施玻璃化试剂盒/方案。例如，Kitazato的试剂盒/方案(Kitazato Inc.,Cryotop Safety Kit Protocol, 2014)和Origio玻璃化方案(Origio MediCult Media,Medicult Vitrification Cooling Protocol, 2014)可在本发明的机器人***中，通过简单改变***/胚胎在玻璃化溶液中的洗涤时间进行。
本发明的机器人***被设计为全自动化的，包括自动生物材料加载和取回。***监控单个细胞在玻璃化溶液(VS)中的反应，以确定在VS中的最适洗涤时间。在VS中洗涤细胞后，玻璃化胚胎自动放置于玻璃化吸管上。然后于盖-密封机上用盖密封吸管。拾起密封的吸管并在低温保存子容器，例如液氮子容器中冷冻。最后将含有冷冻玻璃化吸管的子容器放置于自动液氮***中以供长期低温保存。机器人***以优化的并行方式执行任务，以处理多个细胞或细胞系。该***也允许用户容易地指定每一步骤的操作时间，以实现不同的玻璃化方案或开发新的方案。
A. 自动玻璃化***
本发明的实施方案涉及包括在两条轴上可移动的、用于在X-Y平面上移动样本的电动X-Y载物台显微镜，用于捕获图像的照相机，用于定位机械手、例如微量吸液管的机器人，用于抽吸和分发胚胎/***/细胞(生物材料)的与微量吸液管连接的电动注射器，用于容纳生物材料培养皿的载板，用于容纳处理溶液、例如玻璃化和解冻溶液和多个玻璃化吸管的多-孔板，用于处理玻璃化吸管的第二机器人，和用于长期低温保存玻璃化样本的自动液氮贮藏***的***。本章节描述了硬件***、***工作流程，和技术细节的实施方案。
玻璃化吸管可被描述为容纳胚胎，以供在例如液氮中冷冻和低温保存的物理载体。玻璃化吸管可分类为3类：基于开放的条状吸管(如，Cryotop)、基于微量吸液管的吸管(如，Cryopipette)，和基于CPA (防冻剂)膜的吸管(如，Cryoloop)。基于开放的条状吸管通常由一个附接到硬塑料把柄的聚丙烯条杆组成。将玻璃化胚胎直接放置在所述条杆上面。将胚胎放置在条杆上之后，用塑料盖密封吸管以避免在长期低温保存中的污染。基于微量吸液管的吸管使用直接抽吸玻璃化胚胎的微量吸液管。在玻璃化胚胎被抽吸进微量吸液管后，微量吸液管的开口用热封机密封。基于CPA膜的吸管，例如Cryoloop，包括一个可经由不锈钢棒集成到冷冻管的盖子的塑料环。在玻璃化期间，将CyroloopT浸入防冻液中以在环内创立溶液薄膜。然后将玻璃化胚胎转移至膜中并密封冷冻管。在本文中，术语“玻璃化吸管”指所有3个分类组。在所有的玻璃化吸管中，Cryotop是被广泛接受的方法，因为它涉及最少的围绕玻璃化胚胎的残余溶液，以供产生最高的冷却速率和最高的解冻后细胞存活率。因此，Cryotop被用作解释本发明的实例。
在一个实施方案中，参考图1，本发明的玻璃化***1可包括可配备有电动放大和电动聚焦功能的显微镜100。XY电动载物台200可固定在显微镜上或连接于显微镜。自定义设计的载板300与加热板400可放置在XY载物台200上。如在本文下面进一步描述和在图2中说明的，载板300可被配置为容纳生物材料培养皿301，含有生物材料处理溶液的多-孔板302，和多个玻璃化吸管303。第一机器人501或携带微量吸液管的机器人机械手510可被用来操作可被容纳在培养皿301中的生物材料例如***/胚胎/细胞。可控制电动注射器600以抽吸或分发生物材料进出微量吸液管510。照相机700可耦合至或连接至显微镜100，以提供可被用来实现基于视觉的机器人控制的视觉反馈。照相机700可以每秒30帧或更高的帧速率执行，以提供具有连续的视觉信息的***。第二机器人502可被用来操作玻璃化吸管以在液氮中冷冻。作为***1的部分，吸管-密封机800，其也可经自定义设计，可被用来用盖密封玻璃化吸管。此外，液氮(或其它低温保存溶液)子容器901可被设计以携带冷冻玻璃化吸管并贮藏在自动液氮贮藏***902中。***1也可包括一台具有当执行时经由运行自定义开发的控制软件控制所有的前述硬件和功能的指令的中心计算机50。
图1中所示的***1可包括正置显微镜100。显微镜100可包括电动X-Y载物台200。载物台200可具有厘米级的移行范围和沿着每一条轴优于1 µm的分辨率。显微镜100可具有一系列的放大倍率(如，0.7×-11.5×)，其可由***控制程序自动改变。此外，显微镜的焦距也可通过***自动化地经由自-聚焦算法而变化。
如图2中所示的，载板300可包括任何数目的工作区，例如3个工作区：生物材料加载区301、生物材料处理(即洗涤、平衡、玻璃化、解冻等)区302，和玻璃化吸管区304。生物材料加载区301可用于容纳标准生物材料培养皿(如，35mm Petri培养皿)。生物材料处理区302用于容纳可包括处理溶液例如平衡溶液(ES)、玻璃化溶液(VS)、洗涤溶液、解冻溶液的多-孔板，其可用来洗涤/浸泡生物材料。玻璃化吸管区304可包括用于容纳玻璃化吸管303的多个孔。具有多于或少于3个工作区的载板也是可能的。
在培养皿301中的生物材料，例如胚胎、***或细胞可通过使用机械手，例如微量吸液管510来操作。微量吸液管可具有适合于抽吸或分发生物材料的尖端直径。在胚胎的情况下，微量吸液管可具有在约100-200微米范围内的尖端直径。微量吸液管可被***连接于电动注射器600的微量吸液管储存器511中。微量吸液管储存器511被夹持到机器人机械手501，其具有厘米级的移行范围和沿着每一条轴优于1 µm的分辨率。
在载板300上处理生物材料(即，用一系列VS洗涤生物材料，然后将生物材料放置在玻璃化吸管上)后，在顶部具有玻璃化生物材料的玻璃化吸管303可被将吸管***或浸渍到子容器901的液氮中，以供快速冷冻的第二机器人502拾起。然后可通过机器人将冷冻玻璃化吸管放置在盖-密封机800上，以供用塑料盖密封玻璃化吸管。密封的吸管可最终被***子容器的贮藏孔中，而子容器被机器人502转移至自动液氮贮藏***902中。
机器人501和502可以是多个自由度的机器人。在一个实施方案中，机器人501和502可具有至少三个自由度。一个机器人可用来定位微量吸液管以拾起和放置细胞和溶液，而其它机器人可被用来处理玻璃化吸管。
参考图11，吸管-密封机800可包括固定部分801和移动部分802。固定部分801可包括从固定部分801的一端延伸的肩部803。移动部分802可被配置为在固定部分801的上表面朝向肩部803滑动。在本发明的一个实施方案中，肩部803可被配置用于接受和容纳吸管盖305。移动部分802可被配置以接受和容纳玻璃化-型吸管303。在这种情况下，移动部分802的滑行移动将导致玻璃化吸管303滑入盖305并密封玻璃化吸管(见图11 (a)和11 (b))。在另一个实施方案中，肩部803可接受和容纳吸管，而移动部分802可接受和容纳盖，以致于所述盖朝向吸管移动，从而密封它。
B. 自动化胚胎玻璃化工作流程
下述的玻璃化工作流程通过使用作为一个实例的Kitazato玻璃化方案的实施来解释。本发明的***也可能够自动执行其它方案，例如执行Origio玻璃化方案。图3图示地显示根据本发明的一个实施方案的自动化生物材料玻璃化方法的主要步骤。该实施例涉及到胚胎，然而应该理解，该***也能够自动化处理其它类型的生物材料，例如***和任何其它生物细胞。在以下实例中，微量吸液管的尖端显示指向右边方向。因此，相对于微量吸液管的尖端方向使用术语“左”和“右”。应该理解，***可能被逆转并使微量吸液管的尖端指向左边的方向。下述和图3中所示的实施例过程，参考图1，可作为机器-可访问的指令，利用任何不同的存储在计算机50中的编程代码执行。
步骤0. ***设置和准备
建立步骤是可包括可涉及操作员的子步骤的唯一步骤。该方法的所有其它步骤是全自动化的。
(a) 在开动时，***1自动移动X-Y载物台至原位置(即，右下角)并打开加热板。
(b) 将胚胎培养皿从孵箱取出并放置于载板300上的胚胎加载区。培养介质可用矿物油覆盖以防止蒸发，用于维持恒定的pH。
(c) 根据由玻璃化试剂盒供应商提供的方案，将ES (平衡溶液)和VS (玻璃化溶液)加入到多-孔板302中。
(d) 将玻璃化吸管303放置在载板300的吸管孔304中。
步骤1. 从培养皿中自动拾起胚胎
(a) 使***将胚胎加载区定位进入显微镜100下的视野(FOV)。
(b) 进行自动对焦以聚焦于胚胎。
(c) 从捕获的图像检测胚胎。
(d) 检测微量吸液管510尖端并使它定位于显微镜下的FOV的中心。
(e) 通过向培养皿底降低微量吸液管，检测尖端对培养皿基层的接触。
(f) 通过闭环视觉伺服控制，经移动X-Y载物台200，将目标胚胎移近微量吸液管尖端位置。
(g) 将胚胎抽吸进微量吸液管并通过控制电动注射器，使它定位于微量吸液管内的所需位置。
(h) 在培养皿底表面上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至多-孔板302的ES区。
步骤2. 在ES中自动洗涤胚胎
(a) ***1进行自动对焦以聚焦于多-孔培养皿区302上的ES区底部。
(b) 降低微量吸液管直至检测到与ES区底部接触。
(c) 通过从电动注射器施加正压，将胚胎分发至ES中。
(d) 通过重复微量吸液管抽吸和分发，将胚胎洗涤数次。
(e) 将胚胎保持在ES中适当的时间段(如，按Kitazato方案为12 min)。胚胎缩小至最小体积，然后逐渐地恢复到其最初体积，这表明平衡完成。对于每一个胚胎，可根据它们各自在ES中的体积变化，优化在ES中的洗涤时间，这能够通过***不断监测胚胎体积来实现。
(f) 通过控制电动注射器，将胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。
(g) 在培养皿底上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至多-孔培养皿302的VS区。
步骤3. 在VS中自动洗涤胚胎
(a) ***进行自动对焦以聚焦于多-孔培养皿区302上的VS区底部。
(b) 降低微量吸液管直至与检测到与VS区底部接触。
(c) 将胚胎分发到VS中。由于VS的较高浓度，在ES中平衡的胚胎在VS中向上漂浮，这造成胚胎的位置沿着Z轴改变。***1通过实时处理2D图像和向上移动焦平面以保持胚胎处于焦点，检测在3D空间中的胚胎。如果在VS中的多个洗涤步骤是方案所需要的(如，Kitazato方案需要VS1和VS2)，子步骤(a)、(b)和(c)可以重复。
(d) 当胚胎被检测具有其最小体积或由玻璃化方案指定的固定时间时，将胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。
(e) 在培养皿底上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至玻璃化吸管区304。
步骤4. 将胚胎自动放置于玻璃化吸管上
(a) ***1进行X-Y载物台200的视觉伺服控制以定位玻璃化吸管303至FOV的中心。
(b) 降低微量吸液管直至其尖端接触玻璃化吸管的表面。
(c) 控制电动注射器以注入相对较大的体积(如，5 µL)的玻璃化溶液(VS)，以确保胚胎自微量吸液管分发到玻璃化吸管的表面。
(d) 将微量吸液管尖端从其在吸管表面的初始位置移开至FOV的左侧。介质由于表面张力跟随微量吸液管尖端。
(f) 抽吸掉过多的介质直至胚胎液滴在吸管上的体积没有进一步的变化。
(g) 在玻璃化吸管上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至原位置。
步骤5. 自动冷冻、密封和低温保存玻璃化吸管
(a) 通过第二机器人502拾起在其表面顶部具有玻璃化胚胎的玻璃化吸管303并立即在含有液氮的子容器901中冷冻。
(b) 将冷冻吸管放置在盖密封机800上。
(c) 经由密封机上的引导机械移动一个塑料盖以密封吸管尖端。
(d) 将密封的冷冻吸管***液氮子容器901的孔中。
(e) 将子容器移入自动液氮贮藏***中供长期低温保存。
通常地，一个以上的***/胚胎/细胞需要在一批内处理。为缩短***空闲时间，可进行/优化任务程序安排。图4显示一个程序安排实例，假定是实施Kitazato玻璃化方案。根据这个程序安排，在第一个胚胎在ES内时，机器人501开始从培养皿拾起第二个胚胎。
C. 解冻过程
建立步骤是可包括可涉及操作员的子步骤的唯一步骤。所有其它步骤是全自动化的。
步骤0. ***设置和准备
(a) 为了解冻过程，打开***1并将X-Y载物台移至原位置。
(b) 根据所述方案，将预-温热的解冻溶液(TS)、稀释溶液(DS)，和洗涤溶液(WS)加入到多-孔培养皿中。
(c) 从自动液氮贮藏***取出含有胚胎的冷冻吸管。由第二机器人502从吸管除去密封盖。
(d) 将吸管***TS。轻轻地震摇吸管以使胚胎从吸管尖端落下。
步骤1. 自动解冻在TS中的胚胎
(a). ***将TS区移至显微镜下的FOV的中心。
(b). 进行自动对焦以聚焦于胚胎。
(c). 从捕获的图像检测和跟踪胚胎。
(d). 根据所使用的方案，使胚胎保持在ES中适当的时间段(如，如约1 min)。
(e). 检测微量吸液管尖端并定位于显微镜下的FOV的中心。
(f). 通过向培养皿底降低微量吸液管，检测尖端对培养皿基层的接触。
(g). 使解冻的胚胎移近微量吸液管尖端位置。
(h). 将胚胎抽吸进微量吸液管并通过控制电动注射器定位于微量吸液管内的所需位置。
(i). 在培养皿底上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至DS区。
步骤2. 将胚胎从TS自动转移至DS
(a). 进行自动对焦算法以聚焦在多-孔培养皿上的DS区底部。
(b). 降低微量吸液管直到检测到接触。
(c). 通过从电动注射器施加正压，将胚胎温和地分发至DS底部。
(d). 根据所述方案，将胚胎保持在ES中一定时间段(如，3 min)。
(e). 通过控制电动注射器，将胚胎抽吸和定位在微量吸液管中。
(f). 在培养皿底上方向上移动微量吸液管(如，3000 μm)，并移动X-Y载物台至WS区。
步骤3. 自动洗涤胚胎并转移至培养介质
(a). 根据要遵循的方案，可重复如在步骤2中的步骤以将胚胎从DS转移至WS，并将胚胎保持在WS中适当的时间段(如，5 min)。
(b). 通过将胚胎抽吸进微量吸液管中，并轻轻地将其放置于WS顶部，在WS中洗涤胚胎数次，例如2、3、4或更多次。可使胚胎自由地沉降到WS底部。***检测胚胎并在WS中洗涤期间，在3D空间跟踪它们。
(c). 类似于步骤2，将洗涤的胚胎转移至含有培养介质的培养皿中。
(d). 将胚胎培养皿放回到37℃孵箱中以使完全恢复。
D. 用于自动玻璃化的技术
下文描述用于执行在前面章节中讨论的工作流程的技术。这些技术包括：微量吸液管/玻璃化吸管检测，接触检测，自动对焦，胚胎检测/跟踪，定位在微量吸液管中的胚胎，在VS中产生适度的浓度梯度，从玻璃化吸管除去过多的VS，玻璃化吸管密封机，和自动液氮贮藏***。下述和参考图中说明的技术可作为机器-可访问的指令，利用任何不同的存储在计算机50中的编程代码执行。
微量吸液管和玻璃化吸管的检测
第一步骤可以使微量吸液管或玻璃化吸管的图像二值化并从背景提取目标对象。在IVF诊所中，立体立式显微镜通常被用来检查胚胎的内部形态细节。立体显微镜在捕获的图像上产生照明梯度。***运行一个基于直方图的阈值算法，以区分前景对象(如，微量吸液管，或玻璃化吸管)与背景。首先，可计算所有像素的灰度值的直方图。直方图可包括两个峰，其中一个表示背景像素，而另一个表示前景对象的像素。两个像素的中点可由***用作图像二值化的阈值，以提取前景对象，如在图5(a)(b)中所示。
图像二值化后，进行形态转换(即，腐蚀和膨胀)以除去嘈杂的小尺寸对象。由于微量吸液管远大于胚胎，在二值化的图像中被***拍摄的最大对象是微量吸液管。除了使用尺寸作为检测微量吸液管的标准，形状信息也被***使用以确保正确的检测。微量吸液管的外壁可被建模为两条线。因此，霍夫线性变换被应用于所检测对象的轮廓(见图5(c))。如果两条线是在最大的对象上，微量吸液管检测就被证实是正确的。否则，它就被认为是错误的检测。
在机器人***中，微量吸液管尖端指向右侧方向。根据这个具体的***设置，具有距图像的左边界的最大距离(在检测的微量吸液管对象上)的点被***考虑为微量吸液管尖端位置。在检测的微量吸液管内，提取一个较小的区域作为检测在微量吸液管内胚胎的感兴趣的区域(ROI)。
玻璃化吸管的检测类似于微量吸液管检测。差别在于玻璃化吸管的方向(其中尖端指向左侧)与微量吸液管相反。
接触检测
微量吸液管尖端和培养皿底或玻璃化吸管的表面之间沿着Z轴的相对距离对于成功从培养皿或吸管自动拾起/放置胚胎到培养皿或吸管中，可能是至关重要的。
微量吸液管尖端和培养皿底之间的相对距离可基于检测微量吸液管尖端在培养皿底上的滑行移动来检测。***不断地视觉跟踪尖端在x-y平面上的位置，同时降低微量吸液管向下至培养皿底。如在图6(a)中说明的，当微量吸液管510尖端接触培养皿底601时，进一步向下运动导致尖端在培养皿底上的水平滑行移动，这改变了尖端在x-y平面上的位置。然后将机器人机械手501的检测的Z位置记录为培养皿底的参考高度。
微量吸液管尖端在玻璃化吸管上的接触的检测是基于不同的原理。玻璃化吸管303具有低刚度且当接触微量吸液管尖端时容易偏离。因此，本发明的机器人***通过检测吸管的变形移动，检测微量吸液管尖端和吸管之间的接触(见图6(b))。各种移动检测算法可被用来检测吸管的变形，例如帧减法、背景减法、光流，或移动历史图像方法。
检测尖端接触玻璃化吸管的另一种方法是基于检测介质在吸管上的扩散。当微量吸液管尖端接触吸管时，微量吸液管内的介质由于表面张力而被动地流出到亲水性吸管表面。因此，接触位置可由检测扩散到微量吸液管尖端周围的介质确定。当对象出现在二值化图像中的尖端位置的周围时，接触被认为检测到。机器人机械手501然后停止向下运动并记参考Z位置。
自动对焦
用于前面提到的检测过程的一个必须具备的步骤是聚焦于参考表面(即，在培养皿底上或吸管表面上)。因此，***进行自动-对焦。自动对焦算法使用一个基于Tenenbaum梯度的焦点测量，以确定捕获的图像的焦点水平。这种算法使图像与Sobel算子卷积，然后求梯度向量分量的平方和。***调整显微镜焦平面直至聚焦度量达到最大值。聚焦度量的一阶导数被用来确定最大值。当焦平面移动至目标对象(如，胚胎或微量吸液管尖端)时，聚焦度量增加且一阶导数是正的。一旦一阶导数转为负数，焦平面已到达转折点的最佳位置并开始从目标对象移开。
胚胎检测/跟踪
为避免胚胎通过整个玻璃化过程的损失，可靠地检测和跟踪胚胎是很重要的。参考图7，***检测胚胎的第一步是图像二值化[见图7(a)(b)]。在二值化的图像中，***通过使用面积和形状信息从前景对象检测胚胎。具有范围从500至1000像素的面积的对象被认为是潜在的胚胎目标。此外，应用霍夫圆变换以拟合潜在目标的圆。具有圆形形状的对象被视为胚胎。拟合的圆形形状的数量表明胚胎发育阶段(如，2-细胞、4-细胞、胚泡阶段)。各个胚胎的区域由***实时监控，以提供一个优化在VS中的浸没时间的标准。当在VS中洗涤胚胎时，胚胎在开始时由于渗透压收缩。然后它们再膨胀至与VS平衡。由于VS的溶质是有毒的，用VS平衡理想地应该被避免。因此，一旦胚胎达到它们的最小尺寸/体积，则理想地应该将它们从VS中取出。然而，在目前的手动操作中，所有的胚胎经历相同的时间选择。
为了使胚胎快速地定位于相对较大的培养皿中，胚胎检测算法还涉及显微镜放大倍率的变化和X-Y载物台的移动。***首先在较低的放大倍率(即，较大的FOV)下检测潜在的胚胎对象。然后通过移动X-Y载物台，将潜在的胚胎对象定位于FOV的中心。然后***自动转换显微镜至更高的放大倍数，并再次执行胚胎检测以验证来自较低放大倍率的检测结果并分析胚胎的内部形态。
当将胚胎从较低-浓度的ES转移至VS或在洗涤步骤期间，由于微量吸液管运动/分发引起的浮力和/或液流，胚胎可在溶液内上下移动。为跟踪在3D空间中的胚胎，通过动态地移动焦平面以保持被跟踪的胚胎(s)在焦点中，胚胎检测算法与自动对焦算法结合。
在微量吸液管中定位胚胎
在胚胎抽吸和分发期间，机器人***对在微量吸液管中的胚胎快速地和精确地定位。胚胎的位置经视觉跟踪以提供给***实现闭环视觉伺服控制的位置反馈。在微量吸液管内的所需位置是距尖端一个预先确定的距离。这个距离不能太长，因为当分发胚胎进入下一个玻璃化溶液中时，它将引入太大体积的溶液。另一方面，距离不能太短，因为胚胎很可能自微量吸液管尖端“逃避”掉，导致***/胚胎丢失。基于所需位置和检测的位置之间的错误，***运行控制器(如，比例-积分-导数(proportional-integral-derivative) (PID)或鲁棒控制器(robust controller))算法以控制电动注射器和抽吸或分发直至***/胚胎达到所需位置。图8显示将胚胎定位于微量吸液管中的控制图。
适度的浓度梯度的生成
在玻璃化中，ES通常具有与VS相同的溶质，但浓度较低。在ES中平衡后，当转移到VS中时，由于浓度变化，胚胎遭遇渗透压休克。为减少细胞损伤，这种渗透压休克可减少至最低水平。因此，机器人***可在VS中生成适度的浓度梯度。为生成适度的浓度变化，***沿着X轴移动微量吸液管至左侧，同时分发ES至VS中。ES介质以恒定的速率(如，以5 µl/sec)分发，同时微量吸液管运动的速度保持逐渐增加，直至微量吸液管尖端移至FOV边缘。由于ES和VS之间的混合速率是恒定的，浓度梯度沿着微量吸液管的移动途径生成。
当胚胎从微量吸液管尖端分发出来时，它们首先定位在浓度较低的位置(即，类似于ES)。然后使胚胎沿着浓度梯度递增的方向(即，从右到左)温和地移动。此后，通过抽吸进入微量吸液管和从微量吸液管分发出来，洗涤胚胎数次。
图9说明用于生成浓度梯度的实例方法。VS2通常具有与VS1相同的溶质，但浓度较高。为生成一种浓度梯度，将VS1以恒定速率注入VS2，同时机器人使微量吸液管以恒定的加速度加速向左侧方向移动。
最大限度地减少渗透压休克压力的另一种方法是采用一系列具有适度的浓度变化的玻璃化溶液。然而，这种方法涉及更多类型的VS和更多步骤的胚胎拾起并定位。
从玻璃化吸管除去过多的VS
在机器人501放置玻璃化胚胎到吸管上后，***除去过多的介质以实现高的冷却速率。如在图10 (a)(b)中所示，***首先将在相对大量的VS溶液中的胚胎分发到玻璃化吸管上。然后机器人501将吸管表面上的微量吸液管从最初的分发位置移开以形成VS薄膜。机器人***控制电动注射器抽吸VS，直至胚胎液滴的体积停止改变[图10(c)]。在VS介质被抽吸到微量吸液管中时，摩擦力保持胚胎在其最初的位置。
贯穿该步骤，***利用图像处理以监测液滴体积变化和微量吸液管尖端位置。通过使用在前面的章节“胚胎检测/跟踪”中描述的方法，也从吸管ROI检测胚胎。由于胚胎被过多的介质包围，检测的对象的体积与过多的介质的体积成正比。因此，当检测的胚胎体积停止变化时，认为所有过多的介质已从玻璃化胚胎除去。
玻璃化吸管密封
玻璃化吸管密封机被设计以自动放置塑料盖至吸管尖端以避免在长期低温保存期间的污染。如在图11中所示，密封机包括机械引导装置，其允许滑动部分向固定部分移动。玻璃化吸管和塑料盖(taps)分别安装在滑动部分和固定部分的预定孔/位置上。由机器人502将吸管放置在密封机上后，***控制马达以驱动滑动部分移向固定部分，直至触发限位开关，其完成加盖/密封过程。
自动液氮贮藏***
作为机器人玻璃化***的部分，设计了自动液氮贮藏***。自动贮藏***包含液氮罐、内置3-轴传送***，和液氮子容器。3-轴传送***903自动定位子容器901并将其移进或移出含有液氮的储罐904。如在图12中所示，传送***903可包括3个平移运动轴或2个平移轴加1个转动轴以旋转储罐内的子容器。作为传送***的末端效应器，机械配对框905夹持子容器的把柄。
如在图13中所示，子容器901被设为用于冷冻和贮藏玻璃化吸管的自动贮藏***902的亚单位。子容器901具有用于传送***的末端效应器连接的把柄906，玻璃化冷冻区907，和具有多个用于冷冻吸管***的孔的贮藏区908。为防止玻璃化吸管在贮藏区中的自由移动，子容器还包括盖909以覆盖贮藏区。
E. 优势
本发明的***自动实施广泛接受的玻璃化方案。无需改变完全-确立的方案或修饰胚胎处理途径，本发明的***可容易为诊所所接受。
在贯穿整个玻璃化过程中实时监测胚胎，这可有效地避免胚胎损失。
本发明的***和方法是全自动的，包括加载和取回胚胎(对比在微流体玻璃化中的手动加载)，和检测胚胎在溶液中的位置(与Ru等在中国专利申请公布号202918907U的专利中的手动输入相反)。
本发明的***和方法可生成一种适度的浓度梯度，其可使渗透压最小化并且还增加细胞的存活率。
本发明的***和方法可自动将玻璃化胚胎放置在玻璃化吸管上和除去周围的过多的溶液以实现“最小的体积”，以获得用于冷冻的高的冷却速率。
本发明的***和方法能够用节省总的处理时间的优化程序表处理多个胚胎。
本发明的***和方法包括可用来将盖放置在玻璃化吸管的自动密封机，和可消除在胚胎处理中的人为错误的自动低温贮藏***。
***、胚胎和细胞被暴露于与标准手动方案同样均匀的不同的处理溶液(即洗涤、平衡、玻璃化、解冻溶液)。
通过说明和描述的实施方案，描述了目前考虑的制备和使用本发明的最佳模式。无需进一步阐明，认为本领域普通技术人员可基于本文提供的描述，充分地利用本发明。
虽然上面的描述包含许多特殊性，但这些不应视为限制本发明的范围，而是仅仅作为提供某些目前的本发明实施方案的示例。因此本发明的范围应由所附的权利要求书及其合法的等价物确定，而不是由给出的实施例确定。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种自动化生物材料低温贮藏***，其包含：
(a) 载板，其具有(i) 容纳生物材料的区域，(ii) 容纳生物材料处理溶液的多孔区，和(iii) 容纳一个或多个玻璃化吸管的吸管区；
(b) 连接于操作生物材料和处理溶液的机械手的第一机器人；
(c) 操作玻璃化吸管的第二机器人；
(d) 显微镜和可操作地连接于显微镜以捕获生物材料的图像的图像捕获装置，机械手和玻璃化吸管；
(e) 具有可执行的指令的计算机可读介质；和
(f) 执行计算机可读介质的可执行指令的处理器；所述可执行指令包括以下自动化的指令：(i) 处理捕获的图像，(ii) 可操作地控制显微镜、图像捕获装置、第一机器人，和第二机器人，和(iii) 跟踪三维空间的生物材料。
2.权利要求1的***，其中***还包含吸管-密封机和自动低温贮藏装置，和其中可执行指令还包括自动化可操作地控制吸管-密封机和自动低温贮藏装置的指令。
3.权利要求1的***，其中可执行指令还包括以下指令：
(i) 当生物材料是细胞、胚胎或***时，从捕获的图像检测处于不同发育阶段的细胞、胚胎或***；
(ii) 监测生物材料的体积；
(iiii) 生成处理溶液的浓度梯度；
(iv) 将生物材料置于玻璃化吸管；和
(v) 从置于玻璃化吸管的生物材料除去过多的处理溶液。
4.权利要求1的***，其中可执行指令还包括自动改变显微镜的焦距和放大倍率的指令。
5.权利要求1的***，其中所述显微镜包括用于接受载板的X-Y载物台，X-Y载物台包括X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***，和其中可执行指令还包括可操作地控制X-Y载物台的指令。
6.权利要求5的***，其中显微镜被可操作地连接于具有用于每个所述X和Y轴线性移动***的驱动器的控制器。
7.权利要求6的***，其中所述X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***是独立可控的。
8.权利要求1的***，其中所述第一和第二机器人具有至少三个自由度。
9.权利要求1的***，其中所述容纳生物材料的区域与加热板集成为一体。
10.权利要求2的***，其中所述吸管密封机包括预设的吸管加载位置，预设的吸管盖加载位置，和将盖移向玻璃化吸管的机械导引机械装置。
11.权利要求2的***，其中所述自动低温贮藏***包括用于容纳低温保存溶液的低温保存溶液槽，可移动的子容器和自动定位和传送子容器的3-轴传送***。
12.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有至少一个容纳至少一个玻璃化吸管的位置。
13.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有带有直接冷冻玻璃化吸管的开放空间的冷冻区。
14.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有至少一个连接至内置传送***的把柄。
15.权利要求14的***，其中内置传送***具有至少一个线性移动部分，其中所述线性移动部分受控进行往复移动，以将子容器从槽中取出，或将它放入槽中。
16.权利要求3的***，其中用于检测在不同发育阶段的细胞、胚胎或***的所述计算机可执行指令包括：产生二值化图像的图像二值化，从二值化图像中的前景对象检测潜在的细胞目标，并对潜在的细胞目标拟合圆。
17.权利要求16的***，其中所述检测涉及自动改变显微镜的放大倍率和按坐标移动X-Y载物台。
18.权利要求17的***，其中所述检测开始于以较低放大倍率检测细胞、胚胎或***，然后自动控制X-Y载物台，以移动检测的细胞、胚胎或***至视野的中心。
19.权利要求1的***，其中用于跟踪在三维空间中的生物材料的所述计算机可执行指令还检测生物材料的Z位置。
20.权利要求19的***，其中所述检测生物材料的Z位置涉及显微镜的焦平面沿着Z轴的自动调整。
21.权利要求1的***，其中用于自动放置生物材料至玻璃化吸管的所述计算机可执行指令还包括机械手尖端接触玻璃化吸管尖端的检测。
22.权利要求21的***，其中接触玻璃化吸管尖端的所述检测是基于检测因机械手尖端与玻璃化吸管尖端接触产生的玻璃化吸管尖端的偏差。
23.权利要求22的***，其中吸管尖端偏差的所述检测是经由移动检测。
24.权利要求1的***，其中机械手是微量吸液管，和***还包含电动注射器以产生用于微量吸液管抽吸或分发的压力。
25.权利要求1的***，其中生物材料是细胞、***和/或胚胎。
26. 权利要求1的***，其中生物材料是细胞、胚胎或***，和其中可执行指令还包括以下自动化的指令：(i) 改变显微镜的焦距和放大倍率，(ii) 从捕获的图像检测在不同发育阶段的细胞、胚胎或***；(iii) 聚焦于细胞、胚胎或***，(iv) 沿着Z轴调整显微镜的焦平面，和(v) 整合检测指令和聚焦指令以跟踪三维空间的生物材料。
27.权利要求3的***，其中玻璃化吸管选自基于开放的条状吸管、基于微量吸液管的吸管和基于防冻剂膜的吸管，和其中将生物材料放置于玻璃化吸管的所述计算机可执行指令包括将生物材料放置在基于开放的条状吸管上，或基于微量吸液管的吸管内或基于防冻剂膜的吸管的环内。
28.一种处理生物材料的自动化方法，其包括：(a) 通过一系列玻璃化处理溶液，自动和均匀地暴露生物材料，从而获得玻璃化生物材料，(b) 在玻璃化处理溶液内自动跟踪三维空间的生物材料，(c) 自动放置玻璃化生物材料在玻璃化吸管的表面，(d) 将携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管自动***低温保存溶液中，(e) 自动密封携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管，和(f) 在低温保存溶液中自动贮藏密封的玻璃化吸管，从而冷冻含有玻璃化生物材料的玻璃化吸管，以供长期低温保存。
29.权利要求28的自动化方法，其中方法还包括从低温保存溶液自动取回冷冻的密封玻璃化吸管，并通过一系列处理溶液自动和均匀地暴露冷冻的玻璃化生物材料，从而解冻生物材料。
30. 权利要求28的自动化方法，其中生物材料是细胞、胚胎或***，和其中步骤(b)包括(i) 使用连接于显微镜的照相机以捕获细胞、胚胎或***的图像，(ii) 从捕获的图像检测在不同发育阶段的细胞、胚胎或***；(iii) 聚焦于细胞、胚胎或***，(iv) 沿着Z轴调整显微镜的焦平面，和(v) 整合检测步骤和聚焦步骤以跟踪三维空间的生物材料。
31.权利要求28的方法，其中玻璃化吸管选自基于开放的条状吸管、基于微量吸液管的吸管和基于防冻剂膜的吸管，和其中步骤(c)包括将生物材料放置在基于开放的条状吸管上，或基于微量吸液管的吸管内和基于防冻剂膜的吸管的环内。

Claims (27)

1.一种自动化生物材料低温贮藏和解冻***，其包含：
(a) 载板，其具有(i) 容纳生物材料的区域，(ii) 容纳生物材料处理溶液的多孔区，和(iii) 容纳一个或多个玻璃化吸管的吸管区；
(b) 连接于操作生物材料和处理溶液的机械手的第一机器人；
(c) 操作玻璃化吸管的第二机器人；
(d) 显微镜和可操作地连接于显微镜以捕获生物材料的图像的图像捕获装置，机械手和玻璃化吸管；
(e) 具有可执行的指令的计算机可读介质；和
(f) 执行计算机可读介质的可执行指令的处理器；所述可执行指令包括以下自动化的指令：(i) 处理捕获的图像，和(ii) 可操作地控制显微镜、图像捕获装置、第一机器人，和第二机器人。
2.权利要求1的***，其中***还包含吸管-密封机和自动低温贮藏装置，和其中可执行指令还包括自动化可操作地控制吸管-密封机和自动低温贮藏装置的指令。
3.权利要求1的***，其中可执行指令还包括以下指令：
(i) 当生物材料是细胞、胚胎或***时，从捕获的图像检测处于不同发育阶段的细胞、胚胎或***；
(ii) 跟踪三维空间的生物材料；
(iii) 监测生物材料的体积；
(iv) 生成处理溶液的浓度梯度；
(v) 将生物材料置于玻璃化吸管上；和
(vi) 从置于玻璃化吸管上的生物材料除去过多的处理溶液。
4.权利要求1的***，其中可执行指令还包括自动改变显微镜的焦距和放大倍率的指令。
5.权利要求1的***，其中所述显微镜包括用于接受载板的X-Y载物台，X-Y载物台包括X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***，和其中可执行指令还包括可操作地控制X-Y载物台的指令。
6.权利要求5的***，其中显微镜被可操作地连接于具有用于每个所述X和Y轴线性移动***的驱动器的控制器。
7.权利要求6的***，其中所述X-轴线性移动***和Y-轴线性移动***是独立可控的。
8.权利要求1的***，其中所述第一和第二机器人具有至少三个自由度。
9.权利要求1的***，其中所述容纳生物材料的区域与加热板集成为一体。
10.权利要求2的***，其中所述吸管密封机包括预设的吸管加载位置，预设的吸管盖加载位置，和将盖移向玻璃化吸管的机械导引机械装置。
11.权利要求2的***，其中所述自动低温贮藏***包括用于容纳低温保存溶液的低温保存溶液槽，可移动的子容器和自动定位和传送子容器的3-轴传送***。
12.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有至少一个容纳至少一个玻璃化吸管的位置。
13.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有带有直接冷冻玻璃化吸管的开放空间的冷冻区。
14.权利要求11的***，其中所述可移动的子容器具有至少一个连接至内置传送***的把柄。
15.权利要求14的***，其中内置传送***具有至少一个线性移动部分，其中所述线性移动部分受控进行往复移动，以将子容器从槽中取出，或将它放入槽中。
16.权利要求3的***，其中用于检测在不同发育阶段的细胞、胚胎或***的所述计算机可执行指令包括：产生二值化图像的图像二值化，从二值化图像中的前景对象检测潜在的细胞目标，并对潜在的细胞目标拟合圆。
17.权利要求16的***，其中所述检测涉及自动改变显微镜的放大倍率和按坐标移动X-Y载物台。
18.权利要求17的***，其中所述检测开始于以较低放大倍率检测细胞、胚胎或***，然后自动控制X-Y载物台，以移动检测的细胞、胚胎或***至视野的中心。
19.权利要求3的***，其中用于跟踪在三维空间中的生物材料的所述计算机可执行指令还检测生物材料的Z位置。
20.权利要求19的***，其中所述检测生物材料的Z位置涉及显微镜的焦平面沿着Z轴的自动调整。
21.权利要求1的***，其中用于自动放置生物材料在玻璃化吸管上的所述计算机可执行指令还包括机械手尖端接触玻璃化吸管尖端的检测。
22.权利要求21的***，其中接触玻璃化吸管尖端的所述检测是基于检测因机械手尖端与玻璃化吸管尖端接触产生的玻璃化吸管尖端的偏差。
23.权利要求22的***，其中吸管尖端偏差的所述检测是经由移动检测。
24.权利要求1的***，其中机械手是微量吸液管，和***还包含电动注射器以产生用于微量吸液管抽吸或分发的压力。
25.权利要求1的***，其中生物材料是细胞、***和/或胚胎。
26. 一种处理生物材料的自动化方法，其包括：(a) 通过一系列玻璃化处理溶液，自动和均匀地暴露生物材料，从而获得玻璃化生物材料，(b) 自动放置玻璃化生物材料在玻璃化吸管的表面，(c) 将携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管自动***低温保存溶液中，(d)自动密封携带玻璃化生物材料的玻璃化吸管，和(e) 在低温保存溶液中自动贮藏密封的玻璃化吸管，从而冷冻含有玻璃化生物材料的玻璃化吸管，以供长期低温保存。
27.权利要求26的自动化方法，其中方法还包括从低温保存溶液自动取回冷冻的密封玻璃化吸管，并通过一系列处理溶液自动和均匀地暴露冷冻的玻璃化生物材料，从而解冻生物材料。
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