CN105994250A - 一种基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法 - Google Patents
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Abstract
本发明为了解决小体积样品的细胞低温保护剂添加或去除、人工操作带来的问题等,提出了一种基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法。本发明采用主要的技术方案:利用微流控技术建立微流控芯片***;利用膜分离技术在微流控芯片上构造膜分离***;使用夹具结构将二者有机结合起来形成一个完整的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除***;利用该***实现细胞低温保护剂添加或去除过程。该方法通过微流体在半透膜两侧的跨膜传质实现添加或去除低温保护剂,实现平稳可控的低温保护剂处理,减小处理过程中细胞环境的渗透压突变,并避免产生额外的机械损伤。此方法在处理低温保护剂的添加或去除过程,能够高效、安全的实现小体积样品细胞的低温保护剂添加或去除,并且提高低温保护剂添加或去除过程中细胞的生存率。
Description
技术领域
本发明涉及到细胞低温保存中低温保护剂添加或去除领域,具体为一种应用微流控和膜分离技术实现对细胞的低温保护剂添加或去除的方法。
背景技术
低温保存是目前众多细胞、组织等生物材料长期保存的唯一有效手段,在国民经济的众多领域都正发挥着不可替代的作用。在临床医学领域,大规模生物材料的长期低温保存,是解决细胞、组织来源问题的最有效途径之一,也是众多现代诊疗技术的基础。虽然生物材料可以在深低温下长期安全保存,但保存过程中的其他处理环节(如降温、复温等)都有可能对生物材料造成一定的损伤,即所谓的低温损伤。为了避免或减小低温损伤,常常在低温保存过程添加低温保护剂,以及在复苏冷冻细胞的过程中去除低温保护剂。
传统的低温保护剂添加或去除的方法是基于离心分离的一步法和分步法。处理过程通常比较繁琐,而且容易导致比较大量的细胞损失。Antonenas等人研究发现,脐带血干细胞在复温后应用离心处理程序去除低温保护剂过程中,损失的有核细胞高达27-30%;为了提高低温保护剂处理效率和效果,Valeri等人陆续开发ACP系列的细胞清洗仪,Arnaud等人则应用中空纤维膜建立了一套处理***;Hubel等人利用微流控技术建立一个去除低温保护剂的实验装置,采用垂直三流法得到的实验结果表明低温保护剂去除率达到95%以上,同时提高了细胞的回收率。
总得来说,低温保护剂添加或去除工作已经取得了一系列的工作,但是目前的低温保护剂添加或去除方法仍有不足之处,具体表现如下:
目前的低温保护剂去除/添加的方法针对特定的对象进行处理,通用性有限,特别是针对微小体积的细胞的处理;其次目前的微小体积的处理是采用人工操作的方法,不仅处理效率低下,极容易收到人工因素影响,而且现有方法中繁琐操作过程不可避免地造成细胞在高浓度低温保护剂中暴露较长时间,从而将造成不可忽视的细胞损伤;再次是低温保护剂对细胞会有一定的毒副作用,特别在玻璃化低温保存中应用高浓度的低温保护剂,长期作用下会对细胞功能产生较大的损害。在低温保护剂处理过程中,处理效率和细胞回收率总是一对相互矛盾的需求:一方面,希望样品中的低温保护剂浓度能尽快升高或降低至目标值,即具有较高的处理效率;另一方面又希望细胞内外溶液浓度不会变化过快,以减小细胞渗透性体积变化,保证细胞安全性。因此,低温保护剂处理程序通常需要结合实际情况优化以实现两个方面的平衡。
为了解决小体积样品的低温保护剂处理,提高细胞处理效率以及保证细胞的安全性,本发明提出了一种基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法。
微流控技术是近年来出现的一种新兴技术,是芯片实验室、微全分析***等先进工程理念的核心。微流体技术是指在微观尺度下控制操作复杂流体的技术,由于细胞和其管道宽度大小相当,所以非常容易对细胞进行操作和控制。流体或者细胞通过微流体或者微流控芯片,实现对其流动的速度和方式的控制,达到对流体或者细胞的操控。Hubel等人利用微流控技术建立一个去除低温保护剂的实验装置,采用垂直三流法得到的实验结果表明低温保护剂去除率达到95%以上,同时提高了细胞的回收率;Song等人提出的一种基于微流控技术的方法建立了低温保护剂添加或去除***,制作了三入口的微流控芯片用于肝细胞的低温保护剂添加或去除,细胞流从中间入口进入,保护剂从两边入口进入,随着细胞在通道内流动,保护剂逐渐向中心扩散,实现了沿着通道方向保护剂浓度的连续改变。相对于一步法肝细胞的存活率提高25%,相对于两步法肝细胞的存活率提高了10%。
膜分离技术是指利用膜的选择性透过来进行分离或浓缩的方法。膜作为分离介质,当其两侧存在某种驱动力如压力差、浓度差、电位差等时,原料侧组分选择性地透过膜,以达到分离、提纯等目的。膜分离过程具有高效、节能、过程简单、容易操作控制、不污染环境等优点。膜分离技术应用十分广泛,尤其在生物医学,化工等等方面。透析膜分离技术又是一种扩散控制的,以浓度梯度为驱动力的膜分离方法。在膜的两侧分别放置不同浓度的溶液,液体中的大分子物质不能透过半透膜,液体中的小分子可以穿过半透膜而互相渗透。
本发明旨在利用微流控技术和膜分离技术实现对细胞低温保护剂添加或去除工作,减少细胞的损伤,从而提高低温保存过程中细胞存活的成功率。采用这种方法实现细胞的低温保护剂添加或去除,相对于其他方法安全、高效、可控,能够满足不同类型、微小体积到小体积细胞需求,可以更广泛应用各种细胞的低温保护剂添加或去除工作。
发明内容
本发明为了解决小体积样品的低温保护剂添加或去除、人工操作等带来的问题,提出了一种基于微流控和膜分离技术的低温保护剂添加或去除的方法。此方法在处理低温保护剂的添加或去除过程,能够高效、安全的实现小体积样品细胞的低温保护剂添加或去除,并且提高低温保护剂添加或去除过程中细胞的生存率。
为了克服上述现有的问题,本发明采用以下的技术方案:利用微流控技术和膜分离技术分别在微流控芯片上构造膜分离***,通过微流体在半透膜两侧的跨膜传质实现添加或去除低温保护剂,实现平稳可控的低温保护剂处理,减小处理过程中细胞环境的渗透压突变,并避免产生额外的机械损伤。
本发明是通过以下的实施步骤实现的,提供了一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,具体方法如下:
步骤1:制备微流控芯片
利用微加工技术,选择聚合物材料进行加工,制作出两片整体尺寸相同、微流道相对的微流控芯片;
步骤2:建立膜分离***
步骤2.1:选择高分子微孔滤膜,将微孔滤膜裁剪成与步骤1中的微流控芯片的尺寸大小相同;
步骤2.2:在微流控芯片上构建膜分离***,将微孔滤膜放入两片微流控芯片中,同时确保两片微流控芯片的微流道正相对,微流道分布在微孔滤膜两侧;
步骤3:夹具结构建立
步骤3.1:制作金属材料的两片夹具,夹具中心开槽,中心槽的尺寸与步骤1中的微流控芯片尺寸相同;
步骤3.2:两片夹具中部预留出通孔,便于微流控芯片进出口的外接;两片夹具的四周留出螺栓孔,便于整个装置紧固;
步骤4:微流控***建立
步骤4.1:本发明将步骤2中膜分离***放入步骤3中已建立的夹具中,使用紧固螺栓进行整体紧固;
步骤4.2:本发明将上述装置安装相应的进出口装置,就形成了一套完整了基于微流控和膜分离技术的低温保护剂添加或去除的***;
步骤5:低温保护剂的添加或去除过程;
通过***中的注射泵控制微孔滤膜一侧细胞液和另一侧置换液的流动速度,微孔滤膜两侧流体中低温保护剂浓度和压力不同,在浓度差和压力差驱动下,小分子物质透过膜,两侧流体发生跨膜传质,物质由高浓度流向低浓度,而细胞是大分子物质不能通过膜结构,从而实现了低温保护剂添加或去除过程。
进一步的,所述步骤1中选择的聚合物材料为:PMMA、PC或ABS。
进一步的,在步骤1中所述的两片微流控芯片的尺寸范围为:宽度1-100mm,长度1-100mm,厚度1-10mm;
进一步的,在步骤1中所述的两片微流控芯片的微流道的布局可以为“S”型、“L”型或“分型”,微流道的宽度范围0.1-1mm,深度范围0.1-1mm;
进一步的,在步骤2中所述的微孔滤膜孔径范围为0.001-100um,厚度范围为0.1-1mm,微孔滤膜的整体尺寸与步骤1所述的微流控芯片的尺寸大小相同,微孔滤膜具有亲水或者亲有机液体的特性;
进一步的,在步骤C中所述的夹具采用的材料为铝、钢、铜或者硬质合金材料,夹具的厚度范围10-100mm,长度范围1-100mm,宽度范围1-100mm,夹具四周留出螺栓孔,孔径范围1-20mm。
与现有技术相比,本发明的有益效果是:
本发明的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法具有高效的处理效率。Song等人提出的一种基于微流控技术的方法建立了低温保护剂添加或去除***,制作了三入口的微流控芯片用于肝细胞的低温保护剂添加/去除,相对于一步法肝细胞的存活率提高了25%,相对于两步法肝细胞的存活率提高了10%;同时申请者利用膜分离技术的方法建立一套***能高效的完成红细胞低温保护剂添加或去除工作。从以上两个方面,基于本发明的基于微流控和膜分离技术的第细胞低温保护剂添加或去除的方法有望高效的实现细胞的低温保护剂添加或去除。
本发明的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法具有处理不同类型,微小体积或小体积的细胞材料。低温保存的红细胞、干细胞、脐带血、***或者***等小体积生物材料都可以用基于本发明的装置进行低温保护剂添加或去除工作,通用性十分广泛。
本发明的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法为封闭式***,有效避免生物材料的污染和损坏。
本发明的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法主要基于高精度微加工设备,适于大批量生产,并可与其他微流控***集成,同时可以重复更换其中微孔滤膜而重复使用该装置,有效地提高处理过程的自动化水平,精确可控的对细胞材料的操作,并减小人因素造成的额外损伤。
附图说明
下面对本发明实施例中所用附图作简要说明:
图1为本发明所述的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法的原理示意图;
图2为微流控芯片的结构图;
图3为在微流控芯片上构建膜分离***;
图4为夹具结构设计和建立;
图5为细胞低温保护剂添加或去除装置的结构分解图;
图6为低温保护剂添加或去除***结构图。
图7为利用为本发明所述的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法建立的细胞低温保护剂添加或去除***装置进行低温保护剂去除实验测试,在生理盐水的流速为30ml/h情况下得到的该***的去除低温保护剂的过程;
图8为利用为本发明所述的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法建立的细胞低温保护剂添加或去除***装置进行低温保护剂添加实验测试,在CPA溶液的流速为30ml/h情况下得到的该***的去除低温保护剂的过程。
图9为利用为本发明所述的基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除方法建立的细胞低温保护剂添加或去除***装置进行低温保护剂去除实验测试,在生理盐水的流速为45ml/h情况下得到的该***的完全去除低温保护剂的过程;
具体的实施方式
下面结合实施例对本发明的实施方案进行详细说明,但是对本领域技术人员而言,下列实施例仅用于说明本发明,而不应视为限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市场购买获得的常规产品。
下面提供本发明所述的一种基于微流控和膜分离技术的细胞低温保护剂添加或去除的方法的具体实施方式:
A、微流控技术制备微流控芯片
本发明利用微加工技术,选择聚合物材料(PMMA,PC,ABS等)进行加工,制作出两片整体尺寸相同的高精度微流控芯片。
B、建立膜分离***
(1)本发明选择实验用微孔滤膜(混合纤维素酯等高分子化学材料),将微孔滤膜裁剪成与步骤A中的微流控芯片的尺寸大小相同;
(2)在微流控芯片上构建膜分离***,将微孔滤膜放入两片微流控芯片中,同时确保两片微流控芯片的微流道正相对,微流道分布在微孔滤膜两侧;
C、夹具结构建立
(1)本发明利用高精度微加工设备,加工出金属材料的两片夹具,夹具中心开槽,中心槽的尺寸与步骤A中的微流控芯片尺寸相同;
(2)本发明在两片夹具中部预留出螺纹孔,便于进出口的外接;两片夹具的四周留出螺栓孔,便于整个装置紧固;
D、微流控***建立
(1)本发明将步骤B中膜分离***放入步骤C中已建立的夹具中,使用紧固螺栓进行整体紧固;
(2)本发明将上述装置安装相应的进出口装置,就形成了一套完整了基于微流控和膜分离技术的低温保护剂添加或去除的***。
E、低温保护剂的添加或去除过程
本发明利用上述步骤D中建立微流控***实现低温保护剂添加或去除过程。通过***中的注射泵控制细胞液和置换液的流动速度,微孔滤膜两侧流体中低温保护剂浓度和压力不同,在浓度差和压力差驱动下,小分子物质透过膜,两侧流体发生跨膜传质,物质由高浓度流向低浓度,而细胞是大分子物质不能通过膜结构,从而实现了低温保护剂添加或去除过程。
后续实验步骤如下:
本发明的实例红细胞的低温保护剂添加和去除,对于红细胞来说,常用的低温保护剂是40%(w/v)的甘油溶液。
低温保护剂(甘油)添加过程:
a)按照上述步骤完成***装置的组装,将注射泵连接到***内,形成一个完整的***;
b)进行初步的调试,测试***的漏液以及运行情况;
c)将***中注射泵的两个注射器分别注入生理盐水和40%的甘油溶液,然后设置注射泵的运行速度,同时启动注射泵的两个注射器并且进行实验;
d)分别经过1-10min后采集多组样品,并且保存下来;
e)使用冰点渗透压计对每一个实验样品进行测试样品的渗透压值,并且记录下来;
f)将记录的数据经过处理后形成低温保护剂(甘油)添加过程的曲线图(图7)。
低温保护剂(甘油)去除过程:
g)按照上述步骤完成***装置的组装,将注射泵连接到***内,形成一个完整的***(图6);
h)进行初步的调试,以及更换其中的微孔滤膜,进行再次测试***的漏液以及运行情况;
i)将***中注射泵的两个注射器分别注入40%的甘油溶液和生理盐水,然后设置注射泵的运行速度,同时启动注射泵的两个注射器并且进行实验;
j)分别经过1-10min后采集多组样品,并且保存下来;
k)使用冰点渗透压计对每一个实验样品进行测试样品是渗透压值,并且记录下来;
l)将记录的数据经过处理后形成低温保护剂(甘油)去除过程的曲线图(图8)。
由图7和图8可见,本发明的基于微流控和膜分离技术的低温保护剂处理方法能够实现平稳的低温保护剂处理,且具有较好的可控性和可重复性,能够解决微小生物样品的低温保护剂处理难题。延长低温保护剂(甘油)的去除时间,按照上述的低温保护剂(甘油)去除的实验步骤进行实验,并且使用冰点渗透压计测量出每一个实验样品的渗透压值,并且处理这些数据形成了低温保护剂(甘油)完全去除的曲线图(图9)。
由此可见,本发明利用微流控技术和膜分离技术建立的微流控***,实现对细胞低温保护剂添加或去除,减少细胞的损伤,从而提高低温保存过程中细胞存活的成功率。采用这种方法实现细胞的低温保护剂添加或去除,相对于其他方法安全、高效、可控,能够满足不同类型、微小体积到小体积细胞需求,可以更广泛应用各种细胞的低温保护剂添加或去除工作。
上面所述仅是本发明的基本原理和操作步骤,并非是对本发明做出限制,显然,本领域的技术人员可以对发明做出各种改动和变型而不脱离本发明的范围和精神,倘若这些修改和变型属于本发明权利要求及其等同技术的范围之内,则本发明也意图包括这些改动和变型在内。
Claims (6)
1.一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,具体方法如下:
步骤1:制备微流控芯片
利用微加工技术,选择聚合物材料进行加工,制作出两片整体尺寸相同、微流道相对的微流控芯片;
步骤2:建立膜分离***
步骤2.1:选择高分子微孔滤膜,将微孔滤膜裁剪成与步骤1中的微流控芯片的尺寸大小相同;
步骤2.2:在微流控芯片上构建膜分离***,将微孔滤膜放入两片微流控芯片中,同时确保两片微流控芯片的微流道正相对,微流道分布在微孔滤膜两侧;
步骤3:夹具结构建立
步骤3.1:制作金属材料的两片夹具,夹具中心开槽,中心槽的尺寸与步骤1中的微流控芯片尺寸相同;
步骤3.2:两片夹具中部预留出通孔,便于微流控芯片进出口的外接;两片夹具的四周留出螺栓孔,便于整个装置紧固;
步骤4:微流控***建立
步骤4.1:本发明将步骤2中膜分离***放入步骤3中已建立的夹具中,使用紧固螺栓进行整体紧固;
步骤4.2:本发明将上述装置安装相应的进出口装置,就形成了一套完整了基于微流控和膜分离技术的低温保护剂添加或去除的***;
步骤5:低温保护剂的添加或去除过程;
通过***中的注射泵控制微孔滤膜一侧细胞液和另一侧置换液的流动速度,微孔滤膜两侧流体中低温保护剂浓度和压力不同,在浓度差和压力差驱动下,小分子物质透过膜,两侧流体发生跨膜传质,物质由高浓度流向低浓度,而细胞是大分子物质不能通过膜结构,从而实现了低温保护剂添加或去除过程。
2.如权利要求1所述的一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,其特征在于所述步骤1中选择的聚合物材料为:PMMA、PC或ABS。
3.如权利要求1所述的一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,其特征在于在步骤1中所述的两片微流控芯片的尺寸范围为:宽度1-100mm,长度1-100mm,厚度1-10mm。
4.如权利要求1所述的一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,其特征在于在步骤1中所述的两片微流控芯片的微流道的布局可以为“S”型、“L”型或“分型”,微流道的宽度范围0.1-1mm,深度范围0.1-1mm。
5.如权利要求1所述的一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,其特征在于在步骤2中所述的微孔滤膜孔径范围为0.001-100um,厚度范围为0.1-1mm,微孔滤膜的整体尺寸与步骤1所述的微流控芯片的尺寸大小相同,微孔滤膜具有亲水或者亲有机液体的特性。
6.如权利要求1所述的一种基于微流控技术和膜分离技术的低温保护剂添加或去除方法,其特征在于在步骤3中所述的夹具采用的材料为铝、钢、铜或者硬质合金材料,夹具的厚度范围10-100mm,长度范围1-100mm,宽度范围1-100mm,夹具四周留出螺栓孔,孔径范围1-20mm。
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