CN112430531B - 微流控芯片、精确定量的生物样品微流操作的装置和方法 - Google Patents

Abstract

微流控芯片、精确定量的生物样品微流操作的装置和方法。本发明针对生物样品微流操作提出一种全新的可数字化操作的装置和方法，通过在微流控芯片内集成的数字液滴流量计首次实现了液体吸入移出的精确定量，配合外部可反复加载的施压机构和阀门使用，可用数字式液滴生成的方式使生物样品周围的液体浓度梯度连续可调，进而实现连续的数字式液体稀释，同时可以定量控制冻融时与生物样品接触的液量，大大提高生物样品冻融换液过程中细胞和样本的活性。

Description

微流控芯片、精确定量的生物样品微流操作的装置和方法

技术领域

本发明属于针对生物样品的精确定量的微流操作技术领域，具体涉及一种微流控芯片、精确定量的生物样品微流操作的装置和方法。

背景技术

低温冷冻保存生物样品通常是指在超低温(零下196摄氏度)的液氮中保存活体，以维持其融化复原后的活性。低温保存技术当前被广泛应用于细胞、组织和器官的长期储存并且已经在诸多领域获得突破性的进展，例如在辅助生殖领域(卵子、***、胚胎的冷冻等)以及干细胞冷冻领域等。低温冷冻保存当前的技术难点是生物样品的细胞内部和外部的水份在冷冻的过程中会结成冰晶，容易导致细胞死亡。当前的解决方案是在冷冻前加入冷冻保护剂(冷冻液)以置换细胞内的水分，同时通过优化冷冻过程以避免产生冰晶。目前，低温保存技术主要可分为两类，一是缓慢冷冻技术，二是玻璃化快速冷冻技术。慢速冷冻通过控制温度下降速度(冷却速度约1摄氏度每分钟)，减少冷冻过程中冰晶的形成。玻璃化冷冻法是通过添加高浓度的冷冻液使得细胞在超低温环境下快速冷冻(冷却速度约10000摄氏度每分钟)，形成不规则的玻璃化样固体，避免了冷冻的过程中生成冰晶。由于其冷冻速度快以及对细胞的损失小(没有产生冰晶)，玻璃化快速冷冻技术是现在最常用的低温冷冻保存技术。然而，玻璃化冷冻技术的一大难点是细胞会被暴露在高浓度的冷冻液中，而高浓度冷冻液对细胞有化学毒性。为了解决这一问题，常见的解决方案是对细胞逐步置换带浓度梯度的缓冲液以及冷冻液，让细胞逐步接触和适应浓度从低到高的冷冻液以缓慢达到内外渗透压的平衡，减小化学毒性。

当前细胞换液的方式有两大类，一是手动换液，二是自动化换液。传统的手动换液通常是用实验室常用的巴斯德吸管吸取细胞，然后将细胞依次加在预先配制好的浓度从低到高的三种平衡液(稀释后的冷冻液)中，最后再加到冷冻液中。该方法的每一步都涉及到用吸管对细胞进行吸取和挤出，对细胞的损伤大且操作的难度大，因而耗时长。此外，传统的方法在细胞冷冻前需要将细胞转移到外置的

装置的载杆中进行，并需要手动地吸除细胞周围的冷冻液(冷冻前细胞周围残余的冷冻液越少越好)，进一步增加了操作难度。另一个新的设计方案是利用特制的吸管来限制住细胞的位置，然后将带细胞的吸管依次浸入不同浓度的液体中，利用毛细作用吸取液体使得液体与细胞接触。例如专利CN108135155A公开了一种制备用于低温程序的生物样品的装置及方法，该专利将细胞的位置相对固定在特制的吸管中，在换液的过程中无需对细胞进行移入移出的操作，对细胞的损伤小且操作简单。另外，该吸管可以直接***液氮中进行冻融操作，无需传统的

装置，简化了整个冻融流程。在另一个类似的设计(CN10317982B)中，细胞被固定地卡在带有微型凹槽(又叫断片)的容器中，而凹槽的上游和下游连通了可用于添加和移除液体的储液器。在换液过程中，细胞位置可以被固定在凹槽内，从而避免了换液过程对细胞的机械损伤；此外，在冷冻前，可将储液器内的液体全部除去，只剩下凹槽内的极少量体积的残余冷冻液与细胞直接接触，可以大大提高玻璃化冷冻的效果(冷冻过程中与细胞接触的冷冻液越少越好)。自动化换液的方案主要借助特定的微流控芯片将细胞的位置固定，将带细胞的微流控芯片置于液体中，然后用自动化移液平台依次添加和抽离细胞培养液、平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液和洗液等，例如美国专利US20190008142A1公开了一种对至少一个生物样品进行低温程序的带有一个或多个样品转运容器的自动化装置。类似的，该方案将细胞的位置限制住，整个换液过程只对液体进行操纵而无需操纵细胞，对细胞的伤害小且整个过程可实现自动化。然而，无论是上述的手动方案还是自动方案，都是用传统的类似移液枪稀释的方式，通常只能产生特定浓度梯度的平衡液和冷冻液，难以产生大范围的跨多个浓度的梯度，有进一步的改进空间。为了使得换液过程对细胞的活性的影响降到最小，理想的换液方式是产生从低到高连续的多个精确可控的浓度梯度，而当前的方案都无法实现这个功能。另外，当前的方案无法精确定量地控制冷冻前同生物样品接触的冷冻液的液量，有待进一步改进。

发明内容

为解决上述问题，本发明针对生物样品微流操作提出一种全新的可数字化操作的微流控芯片，以及精确定量的生物样品微流操作的装置和方法。

本发明中，微流操作主要包括：吸取和挤出细胞、吸取和挤出液体、细胞换液、定量控制细胞周围的液量、细胞冷冻、低温保存、细胞解冻等操作步骤的全部或者部分。本发明中，生物样品主要是指人或其他生物的***、胚胎、***、干细胞和胚泡等生物材料，也称“细胞样品”，或者简称“细胞”。本发明中的生物样品从物理形态上来说通常是一个细胞或是一个细胞团，例如***、胚胎等等，但也不排除可以是两个或多个细胞或细胞团。

本发明的具体技术方案包括以下几组：

方案一：一种微流控芯片，包括芯片基体及其内部配置的第一通道、细胞筛、数字液滴流量计和第二通道；所述数字液滴流量计被构造为具有依次连接的液滴生成部、气体密封腔和液滴移除部；所述第一通道的一端与液滴生成部连接，另一端为与外部连通的吸头；所述第二通道的一端与液滴移除部连接，另一端与外部施压机构连接；所述细胞筛位于第一通道，用于捕获进入第一通道的生物样品，且在生物样品被捕获时仍能保证液体通过；所述数字液滴流量计还被构造为：在施压机构提供负压时，将第一通道内的液体以液滴形式数字式移至第二通道；以及在施压机构提供正压时，将进入第二通道的液体引入第一通道以推动被细胞筛捕获的生物样品脱离细胞筛。

方案二：一种微流控芯片，包括芯片基体及其内部配置的第一通道、细胞筛、数字液滴流量计、第二通道和第三通道；所述数字液滴流量计被构造为具有依次连接的液滴生成部、气体密封腔和液滴移除部；所述第一通道的一端与液滴生成部连接，另一端为与外部连通的吸头；所述第二通道的一端与液滴移除部连接，另一端与外部施压机构连接；第三通道的一端与气体密封腔连通，另一端通过第一阀门与外部大气连通；所述细胞筛位于第一通道，用于捕获进入第一通道的生物样品，且在生物样品被捕获时仍能保证液体通过；所述数字液滴流量计还被构造为：在施压机构提供负压且第一阀门关闭时，通过气体密封腔将第一通道内的液体以液滴形式数字式移至第二通道；在施压机构提供负压且第一阀门开启时，气体密封腔与外部大气连通，阻断第一通道内液体移至第二通道；以及在施压机构提供正压且第一阀门关闭时，将进入第二通道内的液体引入第一通道以推动被细胞筛捕获的生物样品脱离细胞筛。

上述方案一和方案二中：可选的，所述第一通道具有一截样品捕获段，用于避免生物样品进入第一通道后因重力作用回落至吸头处；所述细胞筛位于第一通道的样品捕获段。例如，所述第一通道被构造为具有依次连接的第一竖部、横部和第二竖部，第一竖部的另一端为吸头，第二竖部的另一端连接液滴生成部，所述样品捕获段位于所述横部；或者，所述第一通道被构造为具有第一竖部、向下倾斜部和第二竖部，所述第一竖部的一端为吸头，另一端连接向下倾斜部的上端，所述第二竖部的一端连接向下倾斜部的下端，另一端连接液滴生成部，所述样品捕获段位于所述向下倾斜部；又或者，所述第一通道被构造为具有一段弧口向上的弧部，所述样品捕获段位于所述弧部。

可选的，所述细胞筛被构造为具有至少一个碗口朝向生物样品进入方向的碗状结构。例如，所述细胞筛为一个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时向第一通道的壁面倾斜。例如，所述细胞筛为两个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时向第一通道中心倾斜；或者，所述细胞筛为两个或多个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时分别向第一通道不同区域的壁面倾斜。

可选的，所述细胞筛被构造为与第一通道的壁面垂直且具有多个通孔的平面结构；或者，被构造为弧口朝向样品捕获段中生物样品进入方向且具有多个通孔的弧面结构。

可选的，所述第一通道、细胞筛、数字液滴流量计、第二通道和第三通道在加工时一体成型。

可选的，微流控芯片整体厚度为0.01～5mm，优选0.1～2mm。

可选的，微流控芯片的材料选用具备良好导热性和热扩散性且能被灭菌的生物惰性材料。

方案三：一种精确定量的生物样品微流操作装置，包括方案一及其可选方案中任意一项所述的微流控芯片，以及施压机构。

方案四：一种精确定量的生物样品微流操作装置，包括方案二及其可选方案中任意一项所述的微流控芯片，以及第一阀门和施压机构。

上述方案三中：可选的，所述施压机构通过软管连接第二通道。

上述方案四中：可选的，所述第一阀门通过软管连接第三通道；所述施压机构通过软管连接第二通道。

上述方案三和方案四中：可选的，所述施压机构可以是手持泵；所述施压机构也可以是电控控制的压力泵。例如，所述施压机构为电控控制的压力泵时，被构造为包括压力密封腔、进液管、第二阀门和气压源连通管路，其中，进液管的一端连接第二通道，另一端伸入压力密封腔内，第二阀门布置在进液管上，气压源连通管路连接气压源，接收气压源提供的正压或负压。又例如，所述施压机构为电控控制的压力泵时，被构造为包括压力密封腔、进液管、第二阀门和气压源连通管路，其中，进液管的一端连接第二通道，另一端伸入压力密封腔内，第二阀门布置在气压源连通管路上，气压源连通管路连接气压源，接收气压源提供的正压或负压。第二阀门可选用具有毫秒级响应的阀门，例如电磁阀。

方案五：一种精确定量的生物样品微流操作方法，基于方案三及其可选方案中任意一项生物样品微流操作装置，包括：将装载有生物样品和第一液体的微流控芯片的吸头***第二液体，调节施压机构输出负压，第二液体被吸入第一通道，控制第一通道内第一液体或第一液体和第二液体的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，第一通道内生物样品周围第二液体的浓度呈数字式连续变化。

可选的，方案五还包括：将吸头移出第二液体，施压机构继续输出负压，控制第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直至第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

方案六：一种精确定量的生物样品微流操作方法，基于方案三及其可选方案中任意一项生物样品微流操作装置，包括：将吸头***承载有生物样品的第一液体，调节施压机构输出负压，第一液体被吸入第一通道，生物样品在第一通道被细胞筛捕获；和/或，将吸头***第一液体或第二液体，施压机构调至正压，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入第一液体或第二液体。

方案七：一种精确定量的生物样品微流操作方法，也即一种玻璃化冻融方法，基于方案三及其可选方案中任意一项生物样品微流操作装置，包括：将吸头***承载有生物样品的培养液，调节施压机构输出负压，培养液被吸入第一通道，生物样品被细胞筛捕获；将吸头***冷冻液，施压机构继续输出负压，冷冻液被吸入第一通道，控制培养液或培养液和冷冻液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围冷冻液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的培养液全部被冷冻液替换；将吸头移出冷冻液，断开微流控芯片与施压机构的连接，将吸头***液氮中，对微流控芯片中装载的生物样品进行玻璃化冷冻。

可选的，方案七还包括：在培养液被替换后，对生物样品冷冻前，将吸头移出冷冻液，施压机构继续输出负压，控制第一通道内的冷冻液被数字式移出微流控芯片，直至第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

可选的，方案七还包括：将冷冻后的微流控芯片进行低温保存。

可选的，方案七还包括：将微流控芯片与施压机构连接，将吸头***解冻液，调节施压机构输出负压，所述解冻液被吸入第一通道，对微流控芯片中装载的生物样品进行解冻。

可选的，方案七还包括：将吸头***稀释液，所述稀释液被吸入第一通道，控制解冻液或解冻液和稀释液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围稀释液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的解冻液全部被稀释液替换。

可选的，方案七还包括：将吸头***洗液，所述洗液被吸入第一通道，控制稀释液或稀释液和洗液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，使所述生物样品周围洗液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的稀释液全部被洗液替换。

可选的，方案七还包括：将吸头再***培养液，施压机构调至正压，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入培养液。

方案八：一种精确定量的生物样品微流操作方法，基于方案四及其可选方案中任意一项生物样品微流操作装置，包括：将装载有生物样品和第一液体的微流控芯片的吸头***第二液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，第二液体被吸入第一通道，第一通道内第一液体或第一液体和第二液体的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，控制第一通道内生物样品周围第二液体的浓度呈数字式连续变化。

可选的，该方法还包括：将吸头移出第二液体，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，控制第一通道内第二液体的移出量或剩余量满足预设条件时，开启第一阀门，阻断第一通道内第二液体继续移出。

可选的，该方法还包括：将吸头移出第二液体，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，控制第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直到第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

方案九：一种精确定量的生物样品微流操作方法，基于方案四及其可选方案任意一项所述的生物样品微流操作装置，包括：将装载有生物样品和第一液体的微流控芯片的吸头移出第一液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，第一通道内第一液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，控制第一通道内第一液体的移出量或剩余量满足预设条件后，开启第一阀门，阻断第一通道内第一液体继续移出。

方案十：一种精确定量的生物样品微流操作方法，基于方案四及其可选方案任意一项所述的生物样品微流操作装置，包括：将吸头***承载有生物样品的第一液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，第一液体被吸入第一通道，生物样品在第一通道被细胞筛捕获；和/或，将吸头***第一液体或第二液体，第一阀门关闭，施压机构调至正压，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入第一液体或第二液体。

方案十一：一种精确定量的生物样品微流操作方法，也即一种玻璃化冻融方法，基于方案四及其可选方案任意一项所述的生物样品微流操作装置，包括：

将吸头***承载有生物样品的培养液，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，培养液被吸入第一通道，生物样品被细胞筛捕获；

将吸头***冷冻液，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，冷冻液被吸入第一通道，控制培养液或培养液和冷冻液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围冷冻液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的培养液全部被冷冻液替换；

将吸头移出冷冻液，断开微流控芯片与施压机构、第一阀门的连接，将吸头***液氮中，对微流控芯片中装载的生物样品进行玻璃化冷冻。

可选的，方案十一还包括：在培养液被替换后，对生物样品冷冻前，将吸头移出冷冻液，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，控制冷冻液以液滴形式数字式移出微流控芯片，第一通道内冷冻液的移出量或剩余量满足预设条件后，开启第一阀门，阻断第一通道内冷冻液继续移出，或者，控制第一通道内的冷冻液以液滴形式数字式移出微流控芯片，直至第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留冷冻液。

可选的，方案十一还包括：将冷冻后的微流控芯片进行低温保存。

可选的，方案十一还包括：将微流控芯片与施压机构和第一阀门连接，将吸头***解冻液，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，所述解冻液被吸入第一通道，对微流控芯片中装载的生物样品进行解冻。

可选的，方案十一还包括：将吸头***稀释液，所述稀释液被吸入第一通道，控制解冻液或解冻液和稀释液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，使所述生物样品周围稀释液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的解冻液全部被稀释液替换。

可选的，方案十一还包括：将吸头***洗液，所述洗液被吸入第一通道，控制稀释液或稀释液和洗液的混合液以液滴形式数字式移出微流控芯片，使所述生物样品周围洗液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的稀释液全部被洗液替换。

可选的，方案十一还包括：将吸头再***培养液，第一阀门关闭，施压机构调至正压，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入培养液。

在上述方案中，可选的，第一通道冷冻液的移出量满足预设条件是指，移出的液滴数或总量达到预设值；第一通道冷冻液的剩余量满足预设条件是指，第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

综上可见，本发明用一种数字式液滴生成的微流控芯片实现精确可调地产生连续的液体浓度梯度以最大程度提高细胞在换液过程中的活性。此外，本发明在微流控芯片中集成了一种细胞吸头，用细胞筛的方式在微流控芯片内实现细胞吸取以及实现可逆的细胞挤出功能，并且可以通过数字液滴流量计数字式地定量吸除多余的冷冻液，以精确控制冷冻前细胞周围的冷冻液的体积使之保持极小量。本发明的微流控芯片可实现直接***液氮进行冻融操作，另外本设计的微流控芯片是一次性、可更换、可抛的。

与现有技术相比，本发明具以下有益效果：

(1)本发明通过在微流控芯片内集成的数字液滴流量计首次实现了液体吸入移出的精确定量，并可通过对数字液滴流量计和第一通道(细胞捕获通道)等结构和尺寸的设计，有效控制液滴的分辨率(即体积大小)。这种微流控芯片配合施压机构的使用，可用数字液滴生成的方式使生物样品周围的液体浓度梯度连续可调，进而实现连续的数字式液体稀释，大大提高换液过程中细胞的活性，同时省去了传统做法中需要配置多种浓度的液体以及多次转移的复杂操作，使得细胞换液操作更简单，也降低了多次操作中引入的不可控风险。

(2)本发明微流控芯片内集成的数字液滴流量计采用空气密封腔阻断液体的设计，配合施压机构和阀门的使用，可实现定量移除生物样品周围液体，精确控制生物样品周围的液体体积量并使之保持微量。

(3)本发明微流控芯片配合施压机构和阀门使用，还可通过调节施压机构施压的大小以及阀门开启的时长等控制液体吸入移出的速度和量。

(4)本发明一方面可通过对微流控芯片内集成的第一通道(细胞捕获通道)的结构、形状和尺寸等设计控制生物样品周围的液体量使之保持微量，另一方面还能通过第一通道(细胞捕获通道)的结构设计以及细胞筛距离吸头的距离设计，使得生物样品可迅速接触液氮和解冻液，实现生物样品的快速冷冻和解冻。

(5)本发明通过微流控芯片内集成的细胞筛结构设计实现了可逆的细胞吸取和挤出，并且，可以通过细胞筛的设计，装载多个细胞或细胞团。

(6)本发明的微流控芯片结构简单、厚度薄，细胞周围冷冻液的液量超小，有利于热传导，可适配直接浸入液氮和解冻液中实现快速无创冻融；微流控芯片还可采用插拔式设计，可抛、一次性、可更换，方便用户操作。

(7)本发明可用于生物样品的微流操作，包括对细胞的捕获和挤出、数字式浓度梯度生成、液体定量移除、细胞玻璃化冷冻和解冻等操作。

(8)本发明还给出了简化版的微流控芯片设计，仅配合施压机构即可实现上述的生物样品微流操作，包括对细胞的捕获和挤出、数字式浓度梯度生成、液体定量移除、细胞玻璃化冷冻和解冻等操作。该简化版的微流控芯片设计的优点在于***可实现最简化，***操作也更方便。

附图说明

图1是实施例1所述的设备的核心组成部件示意图，其中，图1A展示的是分解示意，图1B展示的是吸入细胞样品和液体后的整体结构示意。

图2给出了微流控芯片的结构示意图。

图3给出了三种微流控芯片(微流移液管)的结构示意图。

图4给出了五种细胞筛的结构示意图。

图5给出了数字液滴流量计的结构示意图。

图6给出了两种施压机构的设计图，包括图6A显示的将阀门安装在液路中的设计，以及图6B展示的将阀门安装在气路中的设计。

图7是实施例2所述的细胞吸取和挤出以及细胞冻融的操作流程示意图，其中，图7A示意的是吸取培养液，图7B示意的是吸取细胞，图7C示意的是吸取平衡液，图7D示意的是吸取冷冻液，图7E示意的是定量吸除微流移液管内的部分冷冻液，图7F示意的是吸除液体流经通道内多余液体，图7G示意的是液氮冷冻，图7H示意的是低温保存，图7I示意的是吸取解冻液，图7J示意的是吸取稀释液，图7K示意的是吸取洗液，图7L示意的是挤出细胞。

图8给出了三种细胞周围的液量状态及两种操控方式示意图。

图9是实施例3所述的简化设备的核心组成部件示意图，其中，图9A展示的是分解示意，图9B展示的是吸入细胞样品和液体后的整体结构示意。

图10是实施例4所述的细胞吸取和挤出以及细胞冻融的操作流程示意图，其中，图10A示意的是吸取培养液，图10B示意的是吸取细胞，图10C示意的是吸取冷冻液，图10D示意的是吸除冷冻液，图10E示意的是液氮冷冻，图10F示意的是低温保存，图10G示意的是吸取解冻液，图10H示意的是吸取稀释液，图10I示意的是吸取洗液，图10J示意的是挤出细胞。

具体实施方式

在下面的描述中，对多于一个附图通用的部件可以由相同的附图标记表示。此外，除非另外具体指出，否则本说明书中所描述或引用的实施例可以是对本文所描述或引用的任何其它实施例的补充和/或替代。

实施例1公开了一种用于单个细胞样品微流操作的装置(简称“装置”)，如图1A所示，该装置主要包括三大组件，即微流控芯片1，以及与之联接的施压机构2和阀门3。微流控芯片1可以通过连接软管的方式同施压机构2和阀门3分别相连。图1B示出了该装置用于从细胞培养皿5中吸取带细胞培养液6的单细胞生物样品4时的工作状态。需要说明的是，实施例中的单个细胞包括了单个细胞和单个细胞团。

微流控芯片1主要用于细胞的捕获和挤出、各种玻璃化冻融过程用到的液体的吸取和挤出、在吸取和挤出液体的过程中通过液滴数字化的方式精确可控地在细胞周围生成不同的液体的浓度梯度，以及通过液滴数字式移除液体的方式定量控制细胞周围的液量。如图2所示，微流控芯片1的核心部件主要包括微流移液管11、细胞筛12、数字液滴流量计13、液体流经通道14和气体连通通道15，这些部件预先设计和集成在微流控芯片1的基底上。

微流移液管11主要用于吸取细胞和液体，本发明中也可称为细胞捕获通道11，这里的液体包括用于细胞样品微流操作的培养液、平衡液、冷冻液、解冻液、稀释液、洗液等。如图3所示，微流移液管11具体包括管体111、位于管体111一端的吸头112、位于管体111另一端的连接头113。细胞筛12装载于微流移液管11的管体111内，用于拦截和捕获从吸头112吸入后进入细胞捕获通道11的细胞，使其无法从连接头113处溜走。作为一种优选方案，细胞筛12的位置可尽量接近吸头112，这样可以使生物样品快速接触液氮实现快速冷冻；同理，可以使生物样品快速接触解冻液实现快速解冻。

如图3A所示，考虑到实际操作时，通常是将吸头朝下吸附液体，微流移液管11可采用折弯设计，例如，图3A所示的具有一段横部115，细胞筛12布置在横部115处，相应的，细胞捕获通道11具有两个90度折角或弧形倒角，这是为了使细胞停留在细胞捕获通道11的水平段，也即横部115，使得吸取液体的过程中细胞不会因为重力作用重新回落到吸头112处。又例如，图3B所示的具有一段向下倾斜部116(自细胞吸入方向看)，细胞捕获通道11具有两个小于90度的折角或弧形倒角，整体看类似一个“N”形，细胞筛12布置在向下倾斜部116处，这种结构使细胞可以更加可靠得被限制在中间段，使得吸液过程中细胞移动的几率进一步变小。又例如，图3C所示的具有开口朝上的弧部117，整体上类似一根“S”形弯管，细胞筛12布置在弧部117处。当然管体111也可以是上述形状的组合或者采用其它形状设计，例如，自细胞吸入方向依次具有一段横部和一段弧部。而管体111的形状也基本决定了细胞捕获通道11的形状。通过设计细胞捕获通道11的形状和几何尺寸，可以使得同细胞直接接触的液量保持超小且可控，有利于细胞玻璃化冷冻过程。需要说明的是，本发明中，细胞捕获通道11的形状指沿通道长度方向看的形状(也即图3所示的三种微流控芯片1的纵向剖面图中展示的形状)，以及径向方向的形状(也即细胞捕获通道11横截面的形状，通常为圆形、椭圆形、矩形或多边形)。例如，当细胞捕获通道11的横截面为圆形时，几何尺寸主要包括细胞捕获通道11的长度和直径；当细胞捕获通道11的横截面为矩形时，几何尺寸主要包括细胞捕获通道11的长度、宽度和深度。

细胞筛12集成在微流控芯片内，可以设计成碗状结构，碗口朝向细胞进入方向，碗口的口径略大于细胞的直径，通过碗状结构包裹住细胞，不让细胞漏过，实现细胞捕获的目的。同时碗状结构和通道壁面之间留有一定的间隙，间隙的大小通常小于细胞的直径，以避免细胞从间隙处溜走，间隙还可以保证在施压机构施加正压，液体反向从数字液滴流量计13向细胞捕获通道11流动的时候，能让细胞顺利地脱离细胞筛并最终从吸头处挤出，离开微流控芯片。

值得说明的是，细胞筛12还可以设计成多个碗状结构或是其他形状的替代结构，具体可以根据不同细胞的形状和尺寸以及需要捕获的细胞个数进行优化。图4例举了五种结构的细胞筛设计，图4A所示的细胞筛121采用了单个碗状结构设计，单个碗状结构设计时，碗口通常朝向细胞进入方向且向通道壁面倾斜；图4B所示的细胞筛122采用了两个碗状结构设计，两个细胞筛12之间以及细胞筛12与通道壁面之间均留一定间隙，两个碗口均朝向细胞进入方向且均向通道中心倾斜；图4C所示的细胞筛123同样采用了两个碗状结构设计，不同的是，这两个碗口均朝向细胞进入方向的同时分别向不同位置的通道壁面倾斜，类似一个“八“字形，细胞可以被两个碗状结构中的任意一个所捕获，该结构也可以实现两个细胞的捕获；细胞筛124采用了具有多孔结构的壁面设计，这里的壁面可以是图4D所示的直壁，也可以是图4E所示弧口朝向细胞样品进入方向的弧形壁125。前三种细胞筛均采用碗状结构设计，这类结构在使用时能较好将细胞的位置固定，包裹在碗状结构处，方便观察细胞；直壁结构设计最为简单，但相较于碗状结构，在细胞固定和细胞脱离操作时略有逊色。

以图4A所示的单个碗状结构为例，通过碗状结构的细胞筛设计，当施压机构施加负压，装载细胞的液体在正向流动时(即自吸头112向数字液滴流量计13方向流动)，细胞可以被卡在碗状结构处，液体主要从细胞的上方的通道流过；而当施压机构施加正压，液体在反向流动时(即自数字液滴流量计13向吸头112方向流动)，部分液体通过细胞筛和细胞捕获通道11的内壁之间的间隙可以推动细胞顺利地脱离细胞筛，由此，微流控芯片内细胞筛的设计实现了可逆的细胞吸取和挤出。

如图5所示，数字液滴流量计13具有依次连接的液滴生成部132、气体密封腔131和液滴移除部133，数字液滴流量计13同样是集成在微流控芯片中的，同微流移液管11、细胞筛12、液体流经通道14和气体连通通道15是一体成型的。在数字液滴流量计13中，从吸头112吸取来的液体从下往上流动经连接头113进入数字液滴流量计13。在数字液滴流量计13内，液体在流经液滴生成部132后被自发地挤成液滴7，液滴7经气体密封腔131后进入液滴移除部133，然后进入液体流经通道14，液滴7进入液体流经通道14的过程中，一旦接触液体流经通道14内的液体后，液滴与液体流经通道14内的液体会先融合形成液桥(liquidbridge)，然后液桥会在表面张力的作用下自发掐断(pinch off)，具体可参考我们之前的美国专利US16538307中的图4。也就是说，只要吸头112处持续有液体被吸上来，数字液滴流量计13就可以持续地生成液滴。液滴数字流量计13的单个液滴的分辨率(液滴体积)可以通过调整液滴数字流量计13的相关形状和几何尺寸来控制，液滴体积的范围可囊括从皮升到微升等多个数量级。这里需要说明的是，本发明的重点并非数字液滴流量计本身，只要能实现连续可控地产生和移除液滴等功能即可，例如，可使用专利US16538307所述的数字液滴流量计，关于该数字液滴流量计的设计和说明详见该专利，此处不再赘述。

液体流经通道14主要用于将数字液滴流量计13产生的液滴移出微流控芯片，其一端连接数字液滴流量计13的液滴移除部133，另一端连接施压机构2。气体连通通道15的一端连接气体密封腔131，另一端连接阀门3，主要用于连通外部大气。

值得一提的是，当微流控芯片1的吸头移出液体时，可开启阀门3，经气体连通通道15进入气体密封腔13内的气体阻断细胞捕获通道11内的液体流向液体流经通道14，这样一来使得细胞周围的液量即细胞捕获通道11内部的液体量。而细胞捕获通道11的液量可通过细胞捕获通道11的几何尺寸设计，保持超小且可控，这样有助于细胞玻璃化冷冻。

实施例1公开用于细胞样品微流操作的装置的同时也公开了一种微流控芯片的具体结构。本发明的微流控芯片1可采用一体化设计，其中的微流移液管11、细胞筛12、数字液滴流量计13等都集成在微流控芯片中，微流控芯片的加工可以一次成型。具体可采用常见的微流控芯片制备技术来加工，例如光刻、注塑、机加工等。图1至图3的视角均为微流控芯片的纵向剖面示意图，加工时，两个对称设计的半剖结构对齐键合即可。简单来说，先用光刻、注塑、机加工等常用的微加工技术制备出半剖结构，然后将两片半剖结构对齐后键合在一起。常见的键合技术包括热压键合、超声键合、激光键合等。微流控芯片13的材料可优选能被灭菌的生物惰性材料，并具备高导热性和高热扩散性，例如，可选择PP(聚丙烯)、PS(聚苯乙烯)、PMMA(聚甲基丙烯酸甲酯)、COC(环烯烃类共聚物)、COP(环烯烃类共聚物)等。微流控芯片的厚度可以是0.01mm到5mm，优选0.1mm到2mm，这种薄片式设计能提高导热效率。

施压机构2需要既能提供负压又能提供正压。负压主要用于吸取液体和细胞，而正压主要用于挤出液体和细胞。这里的施压机构可以是手持的泵以实现方便的无能耗的操纵，例如用移液枪、洗耳球等；施压机构也可以是电动控制的压力泵，结合高精度的电控阀以实现精确液体流动操纵。

在实际应用中，微流控芯片部分可采用插拔式设计，可抛、一次性、可更换。简单来说，微流控芯片1可设计成一次性可抛可更换的，而阀门3和施压机构2设计成可重复利用。使用前，可将微流控芯片***施压机构(拔插式设计)，然后连接上阀门即可开始微流操作。

图6示出了两种电动的施压机构的***设计。图6A显示的将一个高精度阀门安装在液路中的设计，即液阀设计。具体来说，图6A所示的施压机构主要包括进液管21、阀门22、压力密封腔23和气压源连通管路24。进液管21的一端***压力密封腔23，另一端通过软管与微流控芯片1中液体流经通道14的出液口连通，或者进液管21本身也可以采用软管设计，直接与液体流经通道14连通即可。气压源连通管路24可以根据需求切换连接外置的气压源，包括正压气压源和真空(负压)气压源。阀门22布置在进液管21内靠近压力密封腔23处，采用电动控制，例如可以是高精度毫秒级响应的电磁阀。在实际应用时，通过控制气压源的气压以及阀门22的开关时间，可以灵活地控制液滴的生成频率，进而控制一定时间内生成的浓度梯度以及定量吸除细胞周围的液体使得最终细胞周围的液量精确可控。

图6B展示了另一种将阀门安装在气路中的设计，即气阀设计。在该设计中，阀门25可被安置在气压源连通管路24中，同样可采用高精度毫秒级响应的电磁阀，但通常来说，气阀比液阀更常见也更容易获得，因而图6B所示的方案在阀门的选型上是有优势的。由此可见，图6A和图6B各自展示了液阀和气阀都可以用于本发明，也进一步说明了本发明的装置***设计的灵活性。

阀门3和气体连通通道15可通过软管手动相连，可以方便得使气体密封腔131与外部大气连通。阀门3可以选择手动阀门、电磁阀，也可以是其他类型的阀门，只要能实现控制气体进入通道的开关功能即可。

图7给出的实施例2示出了细胞吸取和挤出以及细胞冻融的操作流程，可基于实施例1所示的用于单个细胞样品微流操作的装置，主要包括12个步骤，分别对应图7A～图7L。具体如下：

步骤1，吸取培养液：在图7A中，施压机构2提供负压，阀门3调至关闭状态，细胞培养液被吸入并充满整个微流控芯片1。需要说明的是，液体首次充满微流移液管时是以连续流动的方式，而在微流移液管11内充满液体之后，进一步吸取的液体经数字液滴流量计被挤成液滴，因而流动状态从连续式流动转变为数字式流动。

步骤2，吸取细胞：在图7B中，将吸头112对准目标细胞，细胞连同培养液被一同吸入微流控芯片1，细胞被卡在细胞筛12的位置。当然，该步骤也可以和步骤1合并完成。

步骤3，吸取平衡液：在图7C中，平衡液被数字式吸入微流控芯片1，培养液被数字式移出微流控芯片1。在此过程中，就细胞周围的通道而言，细胞捕获通道11入口处是吸头112，液体被吸入；细胞捕获通道11出口处的连接头113连接数字液滴流量计13，液体经数字液滴流量计13后是以液滴的形式逐滴地被移出，这种逐滴移出方式在本发明中称之为“数字式移出”。因而细胞周围通道内的液体可以形成一个浓度梯度。值得说明的是，本发明所述的“数字式”是指液体流动的方式并非是连续式的，而是因数字液滴流量计13的作用，一滴一滴地被移出，而每次的移出量和移出的速度均可以被有效控制。从另一个角度来说，由于液体是一滴一滴地被移出微流移液管，在微流移液管吸头部分，液体也是按照一滴一滴地数字式地进入微流移液管，即“数字式吸入”。细胞周围的初始浓度是细胞培养液的浓度，而细胞周围的最终浓度是平衡液的浓度。我们可以通过控制气压源提供的气压大小以及连接气体进入通道的阀门开关的时长和频率调节液滴移除的速度，进而可以控制每一时刻的细胞周围的浓度梯度。而每次的移出量可通过数字液滴流量计内液滴生成部的形状大小、液滴移除部的形状大小，以及液滴生成部和液滴移除部之间的距离等参数进行控制。

步骤4，吸取冷冻液：在图7D中，冷冻液被数字式地吸入微流控芯片1，平衡液被数字式移出微流控芯片1，液体的吸入和移出过程同步骤3。值得一提的是，在传统的细胞换液操作中，细胞需要依次浸入预先配好的浓度逐步增加的平衡液(即稀释后的冷冻液)中以实现细胞周围的平衡液的浓度梯度逐步增加，最后再浸入冷冻液中(浓度最高)，因此图7C和图7D所示的步骤都必不可少，通常图7C还会有多个，即多种预先配好的浓度逐步增加的平衡液。而在本发明中，由于浓度梯度可以通过数字式地控制和连续生成，因而仅仅通过图7D的操作即可实现细胞周围的冷冻液的浓度从0到100％逐步增加。因此，在本发明中，图7C的操作是完全可以省去的，同传统的细胞换液相比操作更加简化。并且，我们还可以通过对细胞捕获通道11的几何尺寸设计，使细胞周围的液量保持超小，这也有助于玻璃化冷冻操作中提高细胞的活性。并且，在此过程中，我们还可以适当减小施压机构提供的压力大小以及降低施压机构的阀门开启的频率，使液体的浓度梯度变化更缓慢，进一步减小对细胞的损伤。

步骤5，定量吸除微流移液管内冷冻液：在图7E中，将微流控芯片1的吸头从放冷冻液的容器中取出，然后继续加负压，定量可控地将微流移液管11内细胞周围的液体继续移除。值得一提的是，通过这种方式，细胞周围的液体的量可以精确地得到控制，可以实现某个特定的液量，当然也可以实现理想状态的细胞周围液量几乎为零(仅剩余包覆于细胞表面的残留液体)。数字化移除冷冻液的控制方法，可控制细胞捕获通道11内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体体积，即微流移液管内液体总体积和通过数字流量计移除的液体体积之差。

步骤6，吸除液体流经通道内的多余液体：在图7F中，阀门3调至打开，数字液滴流量计13的气体密封腔131与大气相通；与此同时施压机构2仍然施加负压，使得液体流经通道内的多余液体可以被吸除，由于微流移液管11两端的气压相等，通常为标准大气压，使得在该过程中细胞周围的液体可以维持在原位。

图8例举了三种定量移除操作完成且液体流经通道内多余液体被吸除时细胞周围的液量状态。其中图8A示出了细胞周围液量几乎为零的状态。在该状态下，微流移液管内的液体几乎全部被移除，仅剩余部分液体因为表面张力的作用粘附在细胞表面。该状态定义了细胞周围液量的下限。图8B示出了细胞周围剩余部分冷冻液的状态，微流移液管内的部分液体被移除。剩余的液量可以通过数字液滴流量计控制。图8C示出了细胞周围剩余较为大量液体的状态，该状态通常是在将微流移液管移出冷冻液后即打开阀门3时出现，相当于步骤4后未进行步骤5的定量吸除操作，微流移液管内的液体体积接近微流移液管内部细胞捕获通道11的容量，该状态也定义了细胞周围液量的上限。在实际应用时，我们通常希望细胞周围剩余的冷冻液的液量越小越好，即图8A是一种最为理想的状态，图8B次之。通过本发明的数字式移除的精确定量方式，可控制细胞周围的剩余液量在图8A或其接近的状态。图8D示出了该装置的另一种操作方法，即整体过程始终保持阀门3关闭，即气体进入通道15不工作。该状态下，微流移液管移出冷冻液后，继续施加负压，直至微流控芯片1内仅剩余因为表面张力的作用粘附在细胞表面的少量液体，也即图8A中所示细胞周围的状态。

步骤7，液氮冷冻：在图7G中，将微流控芯片1与施压机构2以及阀门3分离，然后将微流控芯片1放入液氮容器中进行液氮冷冻。如图7G所示，该过程中，液氮可以进入微流控芯片1并与细胞接触。在实际应用中，我们可将细胞筛12的位置设计得尽可能靠近吸头112，而且设计芯片的总体厚度很薄导热迅速，这样细胞可以快速接触液氮实现快速冷冻。

步骤8，低温保存：在图7H中，将冷冻好的装载有细胞的微流控芯片1放入低温容器中保存。

步骤9，吸取解冻液：在图7I中，将低温保存中的微流控制芯片1取出，重新用软管将施压机构2以及阀门3跟微流控芯片1连接上，将微流控芯片1***装有解冻液的容器中，关闭阀门3，施压机构2提供负压，吸取解冻液。同样的，细胞捕获结构12的位置非常靠近吸头112，芯片的总体厚度又很薄，导热迅速，在***装有解冻液的容器时，解冻液可以迅速进入微流移液管并与细胞接触，实现细胞快速解冻。在此过程中，我们可以通过适当增加施压机构的压力大小，使细胞可以快速接触解冻液，缩短解冻时间，实现快速解冻。

步骤10，吸取稀释液：在图7J中，将微流控芯片1***装有稀释液的容器中，继续保持阀门3关闭，保持负压，微流控芯片1数字式地吸取稀释液，解冻液被数字式移除微流控芯片1，可以直到解冻液全部被洗除。

步骤11，吸取洗液：在图7K中，将微流控芯片1***装有洗液的容器中，继续保持阀门3关闭，保持负压，微流控芯片1数字式地吸取洗液，稀释液被数字式移除微流控芯片1，可以直到稀释液全部被洗除。

步骤12，挤出细胞：在图7L中，继续关闭阀门3，施压机构2设置成正压，在正压的推动下，施压机构2中压力密封腔23内的液体首先被推入和充满数字液滴流量计13的气体密封腔131，接着进入细胞捕获通道11，并且使细胞脱离细胞筛12，最终细胞进入预装有细胞培养液的培养皿中。

最后，可将细胞连同培养皿放入孵化箱中孵化，为下一步的细胞操纵做准备。本发明采用的数字化细胞换液方式通过液体逐滴吸入和逐滴移出细胞捕获通道，实现了精确可控地调节细胞捕获通道内细胞周围的液体的浓度，形成数字式的连续的浓度变化，也有望大大减少玻璃化冻融过程中用到的冷冻和解冻保护剂对细胞的毒性，从而大大提高微流操作中细胞的活性。

在实际应用时，实施例2所述的微流操作也可以是这12个步骤中的任意子步骤或它们的组合，具体可根据需求进行选择和组合。例如，步骤1、2、12可组合完成细胞的吸取和挤出；步骤1和3可组合完成数字式浓度梯度的生成；步骤1-7可组合用于细胞玻璃化冷冻；步骤1-8可组合用于细胞的芯片内玻璃化冷冻和保存；步骤1-9可组合用于细胞的芯片内玻璃化冷冻和解冻等。

实施例3公开了一种简化版的用于单个细胞样品微流操作的装置(简称“简化装置”)，如图9A所示，该装置主要包括微流控芯片1以及与之联接的施压机构2。微流控芯片1可以通过连接软管的方式同施压机构2相连。图9B示出了该装置用于从细胞培养皿5中吸取带细胞培养液6的单细胞生物样品4时的工作状态。同实施例1中所述的装置相比，主要区别在于，该简化装置省去了阀门3，相应的，微流控芯片1的结构也进一步简化，即省去了与阀门3连接的气体连通通道15。实施例3同样也同时公开了这种微流控芯片的简化结构。除此以外，微流控芯片1以及施压机构2的结构和功能同实施例1基本相同，在此不再赘述。

图10给出的实施例4示出了细胞吸取和挤出以及细胞冻融的操作流程，可基于实施例3所示的用于单个细胞样品微流操作的装置，主要包括10个步骤，分别对应图10A～图10J。具体如下：

步骤1，吸取培养液：在图10A中，施压机构2提供负压，细胞培养液首先被吸入并充满整个微流控芯片。

步骤2，吸取细胞：在图10B中，将吸头112对准目标细胞，细胞连同培养液被一同吸入微流控芯片1，细胞被卡在细胞筛12的位置。当然，该步骤也可以和步骤1合并完成。

步骤3，吸取冷冻液：在图10C中，冷冻液被数字式地吸入微流控芯片1，培养液被数字式移出微流控芯片1，实现细胞周围冷冻液浓度的数字式连续变化。

步骤4，吸除冷冻液：在图10D中，将微流控芯片1的吸头从放冷冻液的容器中取出，然后继续加负压，将微流移液管11内细胞周围的液体全部吸除，仅剩余由于表面张力的作用包覆在细胞表面的微量液体，即图8A所示的细胞的状态。

步骤5，液氮冷冻：在图10E中，将微流控芯片1与施压机构2断开连接，然后将微流控芯片1放入液氮容器中进行液氮冷冻。

步骤6，低温保存：在图10F中，将冷冻好的带细胞的微流控芯片1放入低温容器中保存。

步骤7，吸取解冻液：在图10G中，将低温保存中的微流控制芯片1取出，重新用软管将施压机构2跟微流控芯片1连接上，将微流控芯片1***装有解冻液的容器中，施压机构2提供负压，吸取解冻液。

步骤8，吸取稀释液：在图10H中，将微流控芯片1***装有稀释液的容器中，继续保持负压，数字式吸取稀释液，可以直到上一步的解冻液全部被洗除。

步骤9，吸取洗液：在图10I中，将微流控芯片1***装有洗液的容器中，继续保持保持负压，数字式吸取洗液，可以直到上一步的稀释液全部被洗除。

步骤10，挤出细胞：在图10J中，施压机构2设置成正压，在正压的推动下，施压机构2中压力密封腔23内的内的液体首先被推入和充满数字液滴流量计13的气体密封腔131，接着进入细胞捕获通道11，并且使细胞脱离细胞筛12，最终细胞进入预装有细胞培养液的培养皿中。

最后，可将细胞连同培养皿放入孵化箱中孵化，为下一步的细胞操纵做准备。

值得一提的是，该简化版的装置同实施例2中的装置相比，在功能上差异仅在于吸除冷冻液的效果。在实施例2中，配合阀门3的使用，可以实现定量控制细胞周围的冷冻液的液量，实现图8中所述的三种状态中的任意一种或它们的中间状态；而在实施例4中，仅能实现图8A中所示的状态，即微流移液管内的液体全部被移除，仅剩下由于表面张力的作用包覆于细胞表面的微量液体。

在实际应用时，实施例4所述的微流操作同样也可以是这10个步骤中的任意子步骤或它们的组合，具体可根据需求进行选择和组合。例如，步骤1、2、10可组合完成细胞的吸取和挤出；步骤1和3可组合完成数字式浓度梯度的生成；步骤1-5可组合用于细胞玻璃化冷冻；步骤1-6可组合用于细胞的芯片内玻璃化冷冻和保存；步骤1-7可组合用于细胞的芯片内玻璃化冷冻和解冻。

最后需要说明的是，尽管以上结合附图对本发明的实施方案进行了描述，但本发明并不局限于上述的具体实施方案和应用领域，上述的具体实施方案仅仅是示意性的、指导性的，而不是限制性的。本领域的普通技术人员在本说明书的启示下，在不脱离本发明权利要求所保护的范围的情况下，还可以做出很多种的形式，这些均属于本发明保护之列。

Claims (32)

1.一种微流控芯片，其特征在于，包括芯片基体及其内部配置的第一通道、细胞筛、数字液滴流量计和第二通道；

所述数字液滴流量计被构造为具有依次连接的液滴生成部、气体密封腔和液滴移除部；所述第一通道的一端与液滴生成部连接，另一端为与外部连通的吸头；所述第二通道的一端与液滴移除部连接，另一端与外部施压机构连接；所述细胞筛位于第一通道，用于捕获进入第一通道的生物样品，且在生物样品被捕获时仍能保证液体通过；

所述数字液滴流量计还被构造为：在施压机构提供负压时，将第一通道内的液体以液滴形式数字式移至第二通道；以及在施压机构提供正压时，将进入第二通道的液体引入第一通道以推动被细胞筛捕获的生物样品脱离细胞筛。

2.如权利要求1所述的微流控芯片，其特征在于，还包括第三通道，第三通道的一端与气体密封腔连通，另一端通过第一阀门与外部大气连通；

所述数字液滴流量计还被构造为：在施压机构提供负压且第一阀门关闭时，通过气体密封腔将第一通道内的液体以液滴形式数字式移至第二通道；在施压机构提供负压且第一阀门开启时，气体密封腔与外部大气连通，阻断第一通道内液体移至第二通道；以及在施压机构提供正压且第一阀门关闭时，将第二通道内的液体引入第一通道以推动被细胞筛捕获的生物样品脱离细胞筛。

3.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一通道具有一截样品捕获段，用于避免生物样品进入第一通道后因重力作用回落至吸头处；所述细胞筛位于第一通道的样品捕获段。

4.如权利要求3所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一通道被构造为具有依次连接的第一竖部、横部和第二竖部，第一竖部的另一端为吸头，第二竖部的另一端连接液滴生成部，所述样品捕获段位于所述横部；

或者，所述第一通道被构造为具有第一竖部、向下倾斜部和第二竖部，所述第一竖部的一端为吸头，另一端连接向下倾斜部的上端，所述第二竖部的一端连接向下倾斜部的下端，另一端连接液滴生成部，所述样品捕获段位于所述向下倾斜部；

或者，所述第一通道被构造为具有一段弧口向上的弧部，所述样品捕获段位于所述弧部。

5.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞筛被构造为具有至少一个碗口朝向生物样品进入方向的碗状结构。

6.如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞筛为一个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时向第一通道的壁面倾斜。

7.如权利要求5所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞筛为两个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时向第一通道中心倾斜；或者，所述细胞筛为两个或多个碗状结构时，碗口朝向生物样品进入方向的同时分别向第一通道不同区域的壁面倾斜。

8.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述细胞筛被构造为与第一通道的壁面垂直且具有多个通孔的平面结构；或者，被构造为弧口朝向生物样品进入方向且具有多个通孔的弧面结构。

9.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，所述第一通道、细胞筛、数字液滴流量计、第二通道和第三通道在加工时一体成型。

10.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，整体厚度为0.01～5mm。

11.如权利要求10所述的微流控芯片，其特征在于，整体厚度为0.1～2mm。

12.如权利要求1或2所述的微流控芯片，其特征在于，材料选用具备良好导热性和热扩散性且能被灭菌的生物惰性材料。

13.一种精确定量的生物样品微流操作装置，其特征在于，包括如权利要求1至12任意一项中数字液滴流量计不具有第三通道的微流控芯片，以及施压机构；或者包括如权利要求2至12任意一项中具有第三通道的微流控芯片，以及第一阀门和施压机构。

14.如权利要求13所述的生物样品微流操作装置，其特征在于，所述施压机构通过软管连接第二通道；所述第一阀门通过软管连接第三通道。

15.如权利要求13所述的生物样品微流操作装置，其特征在于，所述施压机构是手持泵，或者是电控控制的压力泵。

16.如权利要求15所述的生物样品微流操作装置，其特征在于，所述施压机构为电控控制的压力泵时，被构造为包括压力密封腔、进液管、第二阀门和气压源连通管路，其中，进液管的一端连接第二通道，另一端伸入压力密封腔内，第二阀门布置在进液管上，气压源连通管路连接气压源，接收气压源提供的正压或负压。

17.如权利要求15所述的生物样品微流操作装置，其特征在于，所述施压机构为电控控制的压力泵时，被构造为包括压力密封腔、进液管、第二阀门和气压源连通管路，其中，进液管的一端连接第二通道，另一端伸入压力密封腔内，第二阀门布置在气压源连通管路上，气压源连通管路连接气压源，接收气压源提供的正压或负压。

18.如权利要求16或17所述的生物样品微流操作装置，其特征在于，所述第二阀门选用毫秒级响应的阀门。

19.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计不具有第三通道的微流控芯片和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将装载有生物样品和第一液体的微流控芯片的吸头***第二液体，调节施压机构输出负压，第二液体被吸入第一通道，控制第一通道内第一液体或第一液体和第二液体的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，第一通道内生物样品周围第二液体的浓度呈数字式连续变化。

20.如权利要求19所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，还包括：将吸头移出第二液体，施压机构继续输出负压，控制第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直到第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

21.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计不具有第三通道的微流控芯片和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将吸头***承载有生物样品的第一液体，调节施压机构输出负压，控制第一液体被吸入第一通道，生物样品在第一通道内被细胞筛捕获；

和/或，将吸头***第一液体或第二液体，施压机构调至正压，第二通道内的液体被推入第一通道，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入第一液体或第二液体。

22.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计不具有第三通道的微流控芯片和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将吸头***承载有生物样品的培养液，调节施压机构输出负压，培养液被吸入第一通道，控制所述生物样品在第一通道内被细胞筛捕获；

将吸头***冷冻液，施压机构继续输出负压，冷冻液被吸入第一通道，控制第一通道内的培养液或培养液和冷冻液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围冷冻液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的培养液全部被冷冻液替换；

将吸头移出冷冻液，断开微流控芯片与施压机构的连接，将吸头***液氮中，对微流控芯片中装载的生物样品进行玻璃化冷冻；

将冷冻后的微流控芯片进行低温保存；

将微流控芯片与施压机构连接，将吸头***解冻液，调节施压机构输出负压，所述解冻液被吸入第一通道，对微流控芯片中装载的生物样品进行解冻；

将吸头***稀释液，所述稀释液被吸入第一通道，控制解冻液或解冻液和稀释液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围稀释液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的解冻液全部被稀释液替换；

将吸头***洗液，所述洗液被吸入第一通道，控制稀释液或稀释液和洗液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围洗液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的稀释液全部被洗液替换；

将吸头再***培养液，培养液被吸入第一通道，施压机构调至正压，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入培养液。

23.如权利要求22所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，还包括：在培养液被替换后，对生物样品冷冻前，将吸头移出冷冻液，施压机构继续输出负压，控制第一通道内的冷冻液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直至第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

24.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求1至18任意一项包括数字液滴流量计具有第三通道的微流控芯片以及第一阀门和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将装载有生物样品和第一液体的微流控芯片的吸头***第二液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，第二液体被吸入第一通道，控制第一通道内第一液体或第一液体和第二液体的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，第一通道内生物样品周围第二液体的浓度呈数字式连续变化。

25.如权利要求24所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，还包括：将吸头移出第二液体，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，控制第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，并在第一通道内液体的移出量或剩余量满足预设条件时，开启第一阀门，阻断第一通道内液体继续移出。

26.如权利要求25所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，第一通道内液体的移出量满足预设条件是指，移出的液滴数或总量达到预设值；和/或，第一通道内液体的剩余量满足预设条件是指，第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

27.如权利要求24所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，还包括：将吸头移出第二液体，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，控制第一通道内第二液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直到第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

28.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计具有第三通道的微流控芯片以及第一阀门和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将装载有生物样品的微流控芯片的吸头移出第一液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，控制第一通道内第一液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直到第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体；或者控制第一通道内第一液体以液滴形式被数字式移出微流控芯片，在第一通道内第一液体的移出量或剩余量满足预设条件后，开启第一阀门，阻断第一通道内第一液体继续移出。

29.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计具有第三通道的微流控芯片以及第一阀门和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将吸头***承载有生物样品的第一液体，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，控制第一液体被吸入第一通道，生物样品在第一通道被细胞筛捕获；

和/或，将吸头***第一液体或第二液体，第一阀门关闭，施压机构调至正压，第二通道内的液体被推入第一通道，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入第一液体或第二液体。

30.一种精确定量的生物样品微流操作方法，其特征在于，基于权利要求13至18任意一项包括数字液滴流量计具有第三通道的微流控芯片以及第一阀门和施压机构的生物样品微流操作装置，包括：

将吸头***承载有生物样品的培养液，关闭第一阀门，调节施压机构输出负压，控制培养液被吸入第一通道，生物样品被细胞筛捕获；

将吸头***冷冻液，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，冷冻液被吸入第一通道，控制培养液或培养液和冷冻液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围冷冻液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的培养液全部被冷冻液替换；

将吸头移出冷冻液，断开微流控芯片与施压机构、第一阀门的连接，将吸头***液氮中，对微流控芯片中装载的生物样品进行玻璃化冷冻；

将冷冻后的微流控芯片进行低温保存；

将微流控芯片与施压机构和第一阀门连接，关闭第一阀门，将吸头***解冻液，调节施压机构输出负压，所述解冻液被吸入第一通道，对微流控芯片中装载的生物样品进行解冻；

将吸头***稀释液，所述稀释液被吸入第一通道，控制第一通道内的解冻液或解冻液和稀释液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围稀释液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的解冻液全部被稀释液替换；

将吸头***洗液，所述洗液被吸入第一通道，控制第一通道内的稀释液或稀释液和洗液的混合液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，所述生物样品周围洗液的浓度呈数字式连续变化，直至第一通道内的稀释液全部被洗液替换；

将吸头再***培养液，第一阀门关闭，施压机构调至正压，第二通道内的液体被推入第一通道，控制第一通道内的生物样品在正压的推动下，脱离细胞筛，落入培养液。

31.如权利要求30所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，还包括：在培养液被替换后，对生物样品冷冻前，将吸头移出冷冻液，保持第一阀门关闭，施压机构继续输出负压，控制第一通道内的冷冻液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，第一通道内冷冻液的移出量或剩余量满足预设条件后，开启第一阀门，阻断第一通道内冷冻液继续移出；或者，控制第一通道内的冷冻液以液滴形式被数字式移出微流控芯片，直至第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留冷冻液。

32.如权利要求31所述的生物样品微流操作方法，其特征在于，第一通道内液体的移出量满足预设条件是指，移出的液滴数或总量达到预设值；和/或，第一通道内液体的剩余量满足预设条件是指，第一通道内仅剩余包覆于生物样品表面的残留液体。

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