KR101418876B1 - 피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법 - Google Patents

피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법 Download PDF

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Abstract

본 발명은 피부성체 줄기세포의 분화를 조절하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분화된 피부세포에서 상대적으로 많이 발현하는 miRNA-135b의 발현을 억제함으로써 p63의 발현을 증가시키는 피부성체 줄기 세포의 분화 조절 방법에 관한 것이다.
본 발명의 피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법은 피부세포의 분화 속도를 조절하고 줄기세포능을 유지시켜서 피부세포의 증식능을 오래 지속시킬 수 있으며, 피부성체줄기세포의 증식 분화를 조절하는 다양한 연구에서 활용할 수 있다.

Description

피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법{A METHOD FOR REGULATING DIFFERENTIATION OF SKIN ADULT STEM CELL}
본 발명은 피부성체 줄기세포의 분화를 조절하는 방법에 관한 것으로서, 더욱 상세하게는 분화된 피부세포에서 상대적으로 많이 발현하는 miRNA-135b의 발현을 억제함으로써 p63의 발현을 증가시키는 피부성체 줄기 세포의 분화 조절 방법에 관한 것이다.
성체 줄기세포에 관한 연구는 세포 치료를 목적으로 배아줄기세포를 사용하는 데 있어서 발생하는 윤리적인 문제를 해결하고 환자 본인의 세포를 이용하고자 하는 데서 출발하였다.
그러나, 자가 세포 치료에 있어서도 성체줄기세포의 분리과정, 체외배양과정, 세포 주입 과정 중에 사용되는 여러 물질들에 대한 안전성의 문제들이 여전히 존재한다. 이러한 문제들을 제외하고도 연구 중에 반복되는 계대 배양으로 인하여 배아줄기세포든 성체줄기세포든 예외 없이 줄기세포로서의 고유한 특성 즉, 줄기세포능을 잃고 분화된 세포로 그 특성이 변하게 된다. 그러므로 도출된 연구결과가 줄기세포로부터 나온 것이라고 확신할 수 없기 때문에, 실제 활용되었을 때 어떠한 효과가 나타날지 예상하기 어렵다.
상기 문제점들로 인하여 연구자들은 줄기세포만의 특성을 정확하게 규명하기 위해 줄기세포의 분화를 조절할 수 있는 방법과 기전에 관심을 갖게 되었다. 줄기세포의 분화를 조절할 수 있다면 해당 줄기세포나 그 줄기세포를 이용한 장기를 인공적으로 배양하여 신규 물질이나 제품의 안전성과 효능 실험 등을 효과적으로 수행할 수 있다. 이는 동물들을 대상으로 실험하거나 일반인이나 환자들을 대상으로 임상실험 하는 데 들어가는 시간과 비용을 줄일 수 있게 할 수 있음을 의미한다.
피부는 표피와 진피로 이루어져 있으며, 표피는 각질형성세포가 대부분을 차지하는 중층 편평 상피로서 진피로부터 기저층, 유극층, 과립층, 각질층 순의 4개 층으로 이루어져 있다.　 기저층에서 각질형성세포의 분열이 일어난 후 각질형성 세포는 피부의 표면으로 이동하면서 여러 단계의 분화과정을 거치게 된다. 피부의 성체줄기세포는 이러한 과정을 통하여 피부재생에 기여한다. 따라서, 피부성체줄기세포의 줄기세포능을 오래 유지할 수 있다면 피부의 재생능력을 오래 유지할 수 있고, 피부를 보다 건강하게 만들 수 있을 것이다.
피부성체줄기세포를 포함하는 성체줄기세포의 분화 조절은 유전자 발현을 통해 조절되게 되므로 성체줄기세포의 줄기세포능 유지 및 증식능 등의 조절에 miRNA의 유전적 조절이 관여할 것이라 추정된다.
마이크로 RNA (microRNA, miRNA)는 염기서열이 22개 이내의 암호화되지 않은 RNA로서, 타겟 mRNA를 분해하거나 타겟 mRNA의 전사(translation)을 억제하여 유전자 발현을 조절한다. miRNA의 발현 조절은 세포 분화 및 증식과 관련되어 있지만 miRNA의 발현을 조절하는 정확한 기전은 아직 밝혀지지 않고 있다.
miRNA 중 miRNA-135b는 예후가 나쁜 것으로 알려진 pancreatic ductal adenocarcinoma의 바이오 마커로 보고 되었으며(Munding JB et al. Global microRNA expression profiling of microdissected tissues identified miR-135b as a novel biomarker for pancreatic ductal adenocaricinoma. International journal of cancer. 2012 Jul 15;131(2):E86-95), 사람의 탯줄에서 발견된 unrestricted somatic stem cells (USSCs) 의 골분화에 관여한다는 등의 보고(Schaap-Oziemlak AM et al. MicroRNA has-miR-135b regulates mineralization in osteogenic differentiation of human unrestricted somatic stem cells. Stem cells and development. 2010 Jun;19(6):877-85)가 있다.
피부의 경우 건선 환자의 피부에서 miR-135b의 발현이 관찰된다는 소견(Joyce CE et al. Deep sequencing of small RNAs from human skin reveals major alterations in the psoriasis miRNAome. Human molecular genetics. 2011 Oct 15;20(20):4025-40)이 보고되었다.
miRNA가 건선을 비롯하여 아토피성 습진과 같은 염증성 피부질환과 관련이 있다는 특허문헌(US 2010/0202973 A1, 2008. 05. 13)이 있으나, miRNA-203, miRNA-146a, miRNA-21, miRNA-125b를 특히 중요하게 언급하면서 miRNA-135b를 포함한 수십 개의 다른 miRNA들의 가능성을 제시하고 있어 miRNA-135b의 특이성이 상대적으로 낮다. 게다가 상기 miRNA들을 염증성 피부질환의 진단과 치료 방법을 위한 표적으로 제시할 뿐 피부성체줄기세포의 분화나 줄기세포능을 조절하는 분야와 거리가 멀다.
또한 편평세포암종(squamous cell carcinoma)이나 기저세포암(basal cell carcinoma)과 같은 피부암에서 특정적으로 발현하는 miRNA들에 관한 특허문헌(US 2011/0107440 A1, 2009. 06. 04)이 있으나, miRNA-135b를 포함한 miRNA들을 피부암의 진단과 치료 표적으로서의 유용성을 언급했을 뿐 피부성체줄기세포의 분화나 줄기세포능을 조절하는 분야와 차이가 있다. 즉, 종래 miRNA-135b가 피부세포의 분화 조절이나 줄기세포능 조절 효과가 있다는 언급은 찾을 수 없다.
또한, 줄기세포의 증식, 분화 및 노화를 조절하려는 기술과 관련한 특허문헌들(KR 10-2010-0085989, 2010. 09. 02; KR 10-2011-0029908, 2011. 03. 31)이 있었으나, 상기 발명에서 실제 실시한 세포는 지방 또는 제대혈 유래 중간엽 줄기세포이고, 조절하고자 하는 miRNA들이 miRNA-486과 miRNA-598, miRNA-23a, miRNA-26a, 또는 miRNA-30a로서 표적 miRNA들의 종류가 달랐다.
본 발명자들은 제4형 콜라겐에 대한 부착능에 따라 피부의 성체줄기세포와 분화세포를 분리할 수 있는 방법을 개발한 바 있으며(Kim DS, Cho HJ, Choi HR, Kwon SB, Park KC. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cellular and molecular life sciences. 2004 Nov;61(21):2774-81), 상기 방법에 따라 분리한 피부성체줄기세포와 분화세포에서 miRNA들의 발현의 차이를 비교하여 피부성체줄기세포에 비해 분화된 피부세포에서 miRNA-135b의 발현이 증가하는 것을 발견하고 본 발명을 완성하였다.
US 2010/0202973 A1, 2008. 05. 13 US 2011/0107440 A1, 2009. 06. 04 KR 10-2010-0085989, 2010. 09. 02 KR 10-2011-0029908, 2011. 03. 31
1. Kim DS, Cho HJ, Choi HR, Kwon SB, Park KC. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cellular and molecular life sciences. 2004 Nov;61(21):2774-81 2. Munding JB et al. Global microRNA expression profiling of microdissected tissues identified miR-135b as a novel biomarker for pancreatic ductal adenocaricinoma. International journal of cancer. 2012 Jul 15;131(2):E86-95 3. Schaap-Oziemlak AM et al. MicroRNA has-miR-135b regulates mineralization in osteogenic differentiation of human unrestricted somatic stem cells. Stem cells and development. 2010 Jun;19(6):877-85 4. Joyce CE et al. Deep sequencing of small RNAs from human skin reveals major alterations in the psoriasis miRNAome. Human molecular genetics. 2011 Oct 15;20(20):4025-40
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위해 피부 성체줄기 세포의 분화와 연관된 miRNA 의 발현을 조절함으로써 피부성체줄기세포의 분화를 조절할 수 있는 방법을 제공한다.
본 발명은 또한, 피부 성체줄기 세포의 분화와 연관된 miRNA 의 발현을 조절할 수 있는 조절제를 유효 성분으로 포함하는 피부성체 줄기세포의 분화 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명은 상기와 같은 과제를 해결하기 위하여 피부 성체줄기 세포 배양시 miRNA-135b의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법을 제공한다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 miRNA-135b의 발현을 억제시키기 위해 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 사용하는 것을 특징으로 한다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제는 안티마이크로 RNA(anti - miRNA), 저해 마이크로 RNA(ib - miRNA), siRNA(Small interfering RNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명에서 '안티 마이크로RNA' 혹은 '저해 마이크로 RNA'는 특정 miRNA에 특이적으로 결합하여 해당 miRNA의 발현을 조절하는 것을 말하며, mRNA의 발현을 조절하는 siRNA와 구별하여 사용하기 위해 제조회사들에서 명명한 것으로서 siRNA와 그 특성, 제조방법, 실험방법 등이 유사하다. 다양한 생명현상에서 miRNA의 역할이 중요하게 대두되면서 특정 miRNA의 역할을 규명하기 위한 실험 도구로써 많은 회사들에서 안티 마이크로 RNA를 제조하여 판매하고 있고 연구자들의 요청에 따라 주문형도 생산하고 있다.
또한, 본 발명의 'siRNA'는 일반적으로 상보적 서열을 갖는 mRNA에 특이적으로 결합하여 발현을 조절하는 것을 말한다. 그러나 miRNA 관련 연구가 증가하면서 miRNA에 특이적으로 결합하여 해당 miRNA의 발현을 조절하는 목적으로 사용되는 작은 RNA 조각도 siRNA라고 부른다. 본 발명의 목적상 여기서의 siRNA는 상기 miRNA의 발현을 조절하는 것을 의미한다.
본 발명의 '안티센스 올리고뉴클레오티드'sms miRNA에 상보적으로 결합하여 발현을 억제하는 염기서열로서, 이에 제한되지 않으나 안티센스 RNA, 안타고니스트(antagonist)RNA를 포함한다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 miRNA-135b의 발현을 억제시킴으로써 p63의 발현이 증가 되는 것을 특징으로 한다. 피부성체 줄기세포의 표식자로 잘 알려진 p63의 발현의 증가는 본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법에 의하여 피부성체줄기세포의 줄기세포능이 잘 유지되고 있음을 의미하고 기존의 인공피부 모델보다 실제 피부에 가까운 모델임을 증명하는 것이다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법에 있어서, 상기 miRNA-135b의 발현을 억제시킴으로써 제4형 콜라겐, β1 인테그린 및 α6 인테그린의 발현이 증가되는 것을 특징으로 한다.
줄기세포능을 잘 유지하려면 줄기세포가 위치하는 공간, 즉 니치(stem cell niche)가 적절하게 유지되어야 한다. 피부성체줄기세포는 기저막 바로 위에 존재하기 때문에 피부성체줄기세포와 관련하여 중요한 기저막 구성 단백질 중의 하나인 제 4 형 콜라겐이 잘 발현되어야 한다. 또한, 피부성체줄기세포가 니치 구조에 잘 붙어 있으려면 기저막 단백질과 결합할 수 β1 인테그린 과 α6 인테그린을 필요로 한다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 방법은 제4형 콜라겐, β1 인테그린 및 α6 인테그린의 발현이 증가되어 기저막의 상태가 개선되고, 피부성체줄기세포로서의 줄기세포능을 잘 유지하고 있음을 증명하는 것이다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화조절 방법에 있어서, 상기 miRNA-135b의 염기서열은 하기 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 한다.
UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA (서열번호 1)
본 발명은 또한, miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 유효 성분으로 포함하는 피부성체 줄기세포의 분화 조절용 조성물을 제공한다.
본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 조성물에 있어서, 상기 miRNA-135b의 상보적 염기서열은 안티마이크로 RNA(anti - miRNA), 저해 마이크로 RNA(ib - miRNA), siRNA(Small interfering RNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 한다.
본 발명은 또한, 본 발명의 피부성체줄기세포의 분화 조절 조성물을 포함하는 피부성체줄기세포 분화 조절용 키트를 제공한다.
본 발명의 피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법은 miRNA-135b의 발현 조절제를 첨가함으로써 피부세포의 분화 속도를 조절하고 줄기세포능을 유지시켜서 피부세포의 증식능을 오래 지속시킬 수 있으며, 본 발명의 피부성체 줄기세포의 분화 조절 방법은 피부성체줄기세포의 증식 분화를 조절하는 다양한 연구에서 활용할 수 있다.
도 1은 miRNA 시료들에서 Quantitative Real-Time PCR 기법으로 검증한 결과를 나타낸다.
도 2는 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하여 배양한 실시예와 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하지 않은 비교예의 세포를 계대 배양하면서 세포 개수를 측정하고, 누적 세포 개수를 표시한 그래프이다.
도 3은 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하여 배양한 실시예와 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하지 않은 비교예의 세포를 배양한 후 조직화학염색(H&E)과 p63과 PCNA에 대한 면역조직화학염색결과를 보여주는 사진이다.
도 4는 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하여 배양한 실시예와 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 첨가하지 않은 비교예의 세포로 제조된 삼차원 인공피부모델에서 제 4형 콜라겐,β1 인테그린과 α6 인테그린에 대한 발현 결과를 면역조직화학염색을 통해 보여주는 사진이다.
이하에서는 본 실시예에 의하여 더욱 상세히 설명한다. 그러나, 본 발명이 아래 실시예에 의하여 한정되는 것은 아니다.
< 실험예 1> 섬유아세포와 각질형성세포의 배양
이하의 실시예에서 다음의 실험 재료 및 방법을 사용하였다. 각질형성세포와 섬유아세포는 어린아이의 포경수술을 통하여 얻어진 포피에서 분리하고, 피부조직에서 잔여 피하 지방을 제거 후 잘게 절개하여 서몰리신(thermolysin) 용액에서 37?에서 1시간 반응시켰다. 반응시킨 조직을 핀셋을 이용하여 표피와 진피로 분리하여 각각을 트립신(trypsin) 용액에 담아 37?에서 15분간 반응 후 단일 세포로 분리되도록 진탕한 후, '레인왈드 및 그린(Rheinwald JG, Green H. Serial cultivation of strains of human epidermal keratinocytes: the formation of keratinizing colonies from single cells. Cell. 1975 Nov;6(3):331-43)'의 방법을 따라 배양하였다.
분리한 각질형성세포는 각질형성세포 성장 배지(Clonetics KGM BulletKit, Lonza, Walkersville, MD, USA)에서 배양하였고, 섬유모세포는 10% FBS(Fetal Bovine Serum)가 포함된 DMEM (Dulbecco's modified Eagle's medium, Welgene, Daegu, Republic of Korea)사용하여 37℃ 배양기에서 7 일 내지 10일간 배양하였다.
< 실험예 2> miRNA 발현 비교 분석
과거 본 발명자들이 개발한 기술(Kim DS, Cho HJ, Choi HR, Kwon SB, Park KC. Isolation of human epidermal stem cells by adherence and the reconstruction of skin equivalents. Cellular and molecular life sciences. 2004 Nov;61(21):2774-81)에 따라, 제4형 콜라겐이 코팅된 부위에 상기 실험예 1 에서 배양된 표피 세포들을 접촉시킨 후 콜라겐에 부착된 세포만을 분리함으로써 제4형 콜라겐에 대한 부착능에 따라 줄기 세포와 분화 세포로 분리한 후 miRNAs를 추출하였다.
추출한 miRNAs 시료들에서 Quantitative Real-Time PCR 기법으로 miRNA-135b의 발현을 검증하였다. 3명의 샘플에서 TaqMan Small RNA has-miR-135b Assay (Applied biosystems, Foster City, CA, USA)를 이용하여 Quantitative Real-Time PCR 을 실시한 결과를 도 1에 나타내었다. 도 1에서 RA는 제4형 콜라겐이 코팅된 배양용기에 5분 내에 빨리 붙는 세포(Rapidly adherent cells)이고, SA는 24시간 내에 천천히 붙는 세포(Slowly adherent cells)를 의미한다. 모든 샘플에서 줄기 세포인 RA 대비 분화된 세포인 SA에서 모두 miRNA-135b의 발현이 증가되어 있음을 확인하였다.
< 실시예 1> miRNA -135b 조절제 첨가
배양 용기에 상기 실험예 2에서 분리된 피부의 분화세포를 뿌려 24시간 배양한 후, miRNA-135b의 발현 조절제로서 Ambion Anti-miR miR135b inhibitor (Austin, TX, USA)를 최종 농도가 30 nM이 되도록 첨가하여 형질감염(transfection) 하였다.
비교예로서 Ambion Anti-miR miRNA inhibitors-Negative Control #1을 최종농도가 30 nM이 되도록 첨가하였다.
이 때 배지는 항생제가 첨가되지 않은 각질형성세포 성장 배지를 사용하였고, 형질감염(transfection) 용액은 Lipofectamine 2000 Transfection Reagent (Invitrogen, Carlsbad, CA, USA)를 사용하였다.
24시간 동안 형질감염(transfection)시킨 후 항생제가 첨가되지 않은 각질형성세포 성장 배지로 바꿔주고, 세포가 배양 용기 면적의 약 80%까지 자랄 때까지 형질감염(transfection) 과정을 반복하면서 계대 배양을 수행하였다.
< 실험예 3>계대 배양시 분화 조절 확인
상기 실시예 1에서 계대 배양시마다 세포의 개수를 측정하였고 누적 피부 성체 줄기 세포의 개수를 계산하여 그 결과를 도 2에 나타내었다.
도 2에서 miRNA-135b의 발현 조절제를 첨가하여 배양한 실시예의 경우 miRNA-135b의 발현 조절제를 첨가하지 않은 비교예보다 세포의 증식능이 월등함을 보여주었다. 이는 miRNA-135b의 발현 조절제를 첨가하여 miRNA-135b의 발현을 억제하는 경우 이로 인하여 피부성체줄기세포의 분화가 조절되어 줄기세포능이 유지됨으로써 결과적으로 누적 세포의 개수가 대조군보다 월등하게 나타났음을 의미한다.
< 실험예 4> 삼차원 인공피부모델 제조
< 실험예 4-1> 진피 대용물의 제조
먼저 진피 대용물을 제조하기 위해 쥐꼬리로부터 분리 채취한 힘줄(tendon)을 4 ℃의 1:1000 빙초산(glacial acetic acid) 희석액 1 리터에 48시간 동안 교반하여 녹인 제1형 콜라겐 용액과 10 x DMEM과 완충액(0.05 N NaOH, 0.26 mM NaHCO3, 및 200 mM HEPES)을 8:1:1의 부피비로 혼합하여, 콜라겐 기질을 제조하였다. 이와 같이 얻어진 콜라겐 기질 3.5 mL 당 섬유아세포 오십만 개를 첨가하여 혼합하였다. 이후 상기 혼합액을 30 mm의 밀리셀(millicell, Millipore, Billerica, MA, USA)에 3.5 mL씩 넣어 37℃, 5% CO2 배양기에서 굳혀서 진피 대용물을 제조하였다.
< 실험예 4-2> 3차원 인공피부모델의 제조
이와 같이 제조된 진피 대용물 위에 상기 실시예 1에서 배양된 miRNA-135b의 발현이 조절된 세포와 비교예의 miRNA-135b의 발현이 조절되지 않은 세포 일백만 개를 각각 접종하고, 1일간 배지 침지시켜 배양한 다음 다시 12일간 공기에 노출시켜 배양함으로써 3차원 인공피부 모델을 제조하였다.
이때, 배양 온도는 37℃로 하였고, 상기 배지는 5% FBS, 0.4 mg/mL 하이드로코르티손, 1 mM 이소프로테레놀, 25 mg/mL 아스코르빈산 및 5 mg/mL 인슐린이 포함된 DMEM 배지와, 함스 영양 혼합물 F12(Ham's nutrient mixture F12)을 3:1의 비율로 혼합한 혼합 용액을 사용하였다. 상기 침지 배양을 위한 배지에는 저농도 EGF (Epidermal Growth Factor, Invitrogen, 1 ng/mL)를 첨가하였고, 12일간의 공기 노출 배양 시에는 배지에 고농도 EGF(10 ng/mL)를 첨가하였다. 배지는 일주일에 3회 교환하였고, 상기 실험은 동일조건으로 최소 3번 반복 실시하였다.
< 실험예 5> miRNA -135b의 발현 조절 효과 확인
< 실험예 5-1> 헤마톡실린 및 에오신 (H&E) 염색
상기 실험예 4에서 얻어진 3차원 인공피부 모델 조직에 대해서 miRNA-135b의 발현 조절의 효과를 확인하기 위해 핵과 세포질을 쉽게 구별할 수 있게 해주는 헤마톡실린 및 에오신(H&E)으로 염색하고 그 결과를 도 3에 나타내었다.
< 실험예 5-2> 면역조직화학 염색
상기 실험예 4에서 얻어진 3차원 인공피부 모델 조직에 대해서 면역조직화학염색을 수행하여 miRNA-135b의 발현 조절의 효과를 확인할 수 있는 단백질들의 발현양상을 비교하고 그 결과를 도 3 및 도 4에 나타내었다.
면역조직화학 염색은 아비딘-비오틴-퍼옥시다아제 복합 기법 (avidin-biotin-peroxidase complex techniques)을 사용하여 수행하였다. 면역조직화학염색의 일차항체로서 p63 (#sc-8431 from Santa Cruz Biotechnology, Santa Cruz, CA, USA), PCNA (#M0879 from DAKO, Glostrup, Denmark), 제4형 콜라겐, β1 인테그린(#sc-9970 from Santa Cruz Biotechnology), σ6 인테그린(#sc-6597 from Santa Cruz Biotechnology)에 대한 항체를 이용하였다.
상기 p63는 피부에서 줄기세포 표식자로 알려졌고, PCNA 는 증식하는 세포에서 발현하는 특성이 있다. 또한 제 4형 콜라겐은 피부성체줄기세포가 위치한 피부 기저막의 주성분이며, β1 인테그린과 α6 인테그린은 피부성체줄기세포가 기저막 구조 단백질들과 결합할 수 있게 해주는 세포외 부착 수용체이다.
도 3에서 miRNA-135b 의 발현을 조절한 세포로 만든 실시예의 경우 miRNA-135b 의 발현을 조절하지 않은 비교예보다 피부성체줄기세포 표식자인 p63 의 발현과 증식 표식자인 PCNA의 발현이 증가함을 알 수 있다. 이는 miRNA-135b 의 발현을 조절할 경우 피부성체줄기세포의 분화가 지연되어 피부성체줄기세포 표식자와 증식자의 발현이 증가함으로써 결과적으로 줄기세포능이 유지되고 있음을 의미한다.
또한, 도 4 에서 miRNA-135b 의 발현을 조절한 실시예의 경우, miRNA-135b 의 발현을 조절하지 않은 비교예보다 기저막 주성분인 제4형 콜라겐 뿐만 아니라 β1 인테그린과 σ6 인테그린의 발현도 함께 증가함을 알 수 있다. 이는 miRNA-135b의 발현을 조절할 경우 피부성체줄기세포의 분화가 지연되어 피부성체줄기세포 고유의 미세 환경인 니치(stem cell niche)의 주요 구조 단백질과 피부성체줄기세포가 니치에 결합할 수 있게 해주는 인테그린의 발현이 함께 증가함으로써 줄기세포능이 유지되고 있음을 의미한다.
<110> Seoul National University Bundang Hospital <120> A METHOD FOR REGULATING DIFFERENTIATION OF SKIN ADULT STEM CELL <130> DPP-2012-0077 <160> 1 <170> KopatentIn 2.0 <210> 1 <211> 23 <212> RNA <213> Artificial Sequence <220> <223> miRNA-135b <400> 1 uauggcuuuu cauuccuaug uga 23

Claims (10)

  1. 피부 성체줄기 세포 배양시 miRNA-135b의 발현을 억제시키는 것을 특징으로 하는 피부성체줄기세포의 분화 억제 방법.
  2. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA-135b의 발현을 억제시키키 위해 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 사용하는 것을 특징으로 하는 피부성체줄기세포의 분화 억제 방법.
  3. 제 2항에 있어서,
    상기 miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제는 안티마이크로 RNA(anti - miRNA), 저해 마이크로 RNA(ib - miRNA), siRNA(Small interfering RNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로 하는 피부성체 줄기세포의 분화 억제 방법.
  4. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA-135b의 발현을 억제시킴으로써 p63의 발현이 증가 되는 것을 특징으로 하는 피부성체 줄기세포의 분화 억제 방법.
  5. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA-135b의 발현을 억제시킴으로써 제4형 콜라겐, β1 인테그린과 α6 인테그린의 발현이 증가되는 것을 특징으로 하는 피부성체줄기세포의 분화 억제 방법.
  6. 제 1항에 있어서,
    상기 miRNA-135b 은 아래 서열번호 1의 염기 서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부성체 줄기세포의 분화 억제 방법.
    UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA (서열번호 1)
  7. miRNA-135b를 표적으로 하는 조절제를 유효 성분으로 포함하는 피부성체 줄기세포의 분화 억제용 조성물.
  8. 제 7 항에 있어서,
    상기 피부성체 줄기세포의 분화 억제용 조성물은 아래 서열 번호 1에 대한 상보적 염기서열을 포함하는 것을 특징으로 하는 피부성체줄기세포의 분화 억제용 조성물.
    UAUGGCUUUUCAUUCCUAUGUGA (서열번호 1)
  9. 제 7항에 있어서,
    상기 miRNA-135b의 상보적 염기서열은 안티마이크로 RNA(anti - miRNA), 저해 마이크로 RNA(ib - miRNA), siRNA(Small interfering RNA), 앱타머(aptamer), 안티센스 올리고 뉴클레오티드 및 화합물로 구성된 군에서 선택되는 것을 특징으로하는 피부성체줄기세포의 분화 억제용 조성물.
  10. 제 8항 또는 제 9항의 피부성체줄기세포의 분화 억제용 조성물을 포함하는 피부성체줄기세포 분화 억제용 키트.
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