KR102547900B1 - 눈물샘 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도 - Google Patents

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Abstract

본 발명은 눈물샘 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 눈물샘 오가노이드, 상기 눈물샘 오가노이드를 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료 제제, 및 상기 눈물샘 오가노이드를 이용한 안구건조증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
본 발명에 따라 제조된 눈물샘 오가노이드는 인간 눈물샘 조직과 조직 유사성이 높고, 눈물 분비능이 우수하며, 특히 생체 내로 이식되는 경우 손상된 눈물샘 조직을 재생시켜 눈물 분비능을 정상화시킬 수 있다. 따라서, 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드의 제조방법은 생체 조직과 조직의 형태 및 기능이 유사한 눈물샘 오가노이드를 제조하는데 활용될 수 있고, 상기 제조된 눈물샘 오가노이드는 쇼그렌 증후군, 각막 건조증 등의 안구건조증의 치료 물질로서 사용되거나, 또는 상기 안구건조증의 치료 물질을 스크리닝하는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.

Description

눈물샘 오가노이드의 제조방법 및 이의 용도{PREPARATION METHOD OF LACRIMAL GLAND AND USE THEREOF}
본 발명은 눈물샘 오가노이드의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 제조방법으로 제조된 눈물샘 오가노이드, 상기 눈물샘 오가노이드를 포함하는 안구건조증의 예방 또는 치료 제제, 및 상기 눈물샘 오가노이드를 이용한 안구건조증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에 관한 것이다.
안구건조증(Dry eye disease)은 전세계 인구의 11 내지 22% 정도가 앓고 있는 비교적 흔한 질병이며, 이중에서 절반은 눈물샘이 구조적, 기능적으로 손상된 중증의 안구건조증 환자이다. 안구건조증은 주로 눈물샘의 물리적인 손상 및 기능적 교란에 의해 발생하고, 눈물막 안정성 부족을 특징으로 하는 안구 표면의 다인성 질환으로 정의되고 있다. 또한, 눈물막의 불안전성, 과삼투압(hyper osmolarity), 안구 표면 염증 및 손상, 신경 감각 이상 등의 증상을 동반한다. 이러한 안구건조증의 1차적인 원인은 눈물샘의 외상 또는 기능 이상이며, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 류마티스성 관절염, 전신성 홍반성 루푸스와 같은 전신성 자가면역질환 등도 안구건조증을 야기하는 2차적인 원인으로 여겨지고 있다.
한편, 눈물을 생성하는 기관인 눈물샘은 샘꽈리 세포(acini cell), 췌관 세포(ductal cell) 및 근상피 세포(myoepithelial cells)의 세 종류의 세포로 이루어져 있고, 샘꽈리 세포는 분비과립으로 채워져 있으며 눈물 등을 생성하는 장액 세포(serous cell)로 구성되어 있다. 근상피세포가 샘꽈리 세포와 췌관 세포의 기저면을 둘려싸고 있는 형태이며, 이들 세포는 샘꽈리 세포에 압력을 가하여 액체를 관으로 배출한다. 이러한 눈물샘은 다양한 원인에 의해 손상될 수 있다. 예를 들어, 암 치료를 위한 방사선 조사에 의해서도 손상된다고 알려져 있으며(S S Batth et al., Br J Radiol. 2013 Dec, 86(1032): 20130459.), 눈물샘이 손상되어 발병한 안구건조증은 완치가 어려우며 심할 경우 각막이 말라 시력이 심하게 저하될 우려가 있다.
현재 개발된 안구건조증의 치료 방법으로는 안구 표면에 수분 및 추가 윤활을 공급하는 인공 눈물 점안제를 사용하고 있으며, 만성 염증 증상을 해결하기 위해 항염증제 및 국소 면역 억제제를 사용하기도 한다. 그러나, 치료제로 사용하는 이러한 스테로이드 계열의 약물은 단시간의 효과는 볼 수 있으나, 부작용이 심하고 완전히 손상된 눈물샘 조직에서의 효능은 없다는 단점이 있었다.
이에 따라, 손상된 눈물샘을 재생할 수 있는 오가노이드 제제가 새로운 전략으로 대두되고 있다. 오가노이드는 특정 줄기세포에서 분화한 세포의 집합체로서, 체내의 실제 조직과 매우 유사한 구조적, 조직학적 특성을 가지고 있기 때문에 손상된 조직의 재생에 사용 가능하다. 특히, 오가노이드는 조직의 특성을 유지하면서 in vitro 배양이 가능하다는 점에서, 세포 및 동물실험을 대체할 수 있어 당업계에서 많은 기대를 받고 있다.
관련하여, 당업계에서는 실제 조직과 유사한 형태의 오가노이드를 활용하기 위한 연구를 활발히 진행하고 있다. 예를 들어, 눈물샘 재생을 위한 치료제로서 2차원 배양을 통한 중간엽 줄기세포를 이용한 연구가 진행된바 있었다(Samantha You et al., Invest Ophthalmol Vis Sci. 2011 Apr 4, 52(5):2087-94.). 다만, 제조된 줄기세포치료제의 안구건조증에 대한 치료 효과는 아직까지 검증되지 않은 상태이다.
이에, 본 발명자들은 손상된 눈물샘 조직을 재생시킴으로써 안구건조증을 치료하는 눈물샘 오가노이드를 개발하기 위한 다양한 연구를 진행하였다. 그 결과, 특정 배양 성분이 조합된 배지와 마트리겔을 이용한 3차원 배양을 통해 인간 눈물샘 오가노이드를 제조하는 방법을 개발하였고, 상기 방법으로 제조된 오가노이드는 실제 눈물샘 조직과 조직 형태가 유사하고, 눈물 분비능이 유사하며, 특히 생체 내 이식되는 경우 손상된 눈물샘 조직을 재생시킬 수 있음을 실험적으로 입증함에 따라 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명에서 개시된 각각의 설명 및 실시형태는 각각의 다른 설명 및 실시 형태에도 적용될 수 있다. 즉, 본 발명에서 개시된 다양한 요소들의 모든 조합이 본 발명의 범주에 속한다. 또한, 하기 기술된 구체적인 서술에 의하여 본 발명의 범주가 제한된다고 볼 수 없다.
또한, 본 명세서에서 특별히 정의되지 않은 용어들에 대해서는 본 발명이 속하는 기술 분야에서 통상적으로 사용되는 의미를 갖는 것으로 이해되어야 할 것이다. 또한, 문맥상 특별히 정의하지 않은 경우라면, 단수는 복수를 포함하며, 복수는 단수를 포함한다.
본 발명의 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 눈물샘 오가노이드의 제조방법을 제공한다: a) 개체에서 분리된 눈물샘 조직에서 세포를 분리하는 단계; 및 b) 상기 단계 a)에서 분리한 세포를 마트리겔 내에서 배양하는 단계.
용어, "오가노이드(organoid)"는 3D 입체구조를 가지는 세포덩어리를 의미한다. 동물 등에서 수집, 취득, 채취하지 않고 인공적인 배양 과정을 통하여 제조한 것으로서, 축소되고 단순화된 버전의 기관으로 정의된다.
상기 a) 단계는 개체에서 분리된 눈물샘 조직에서 세포를 분리하는 단계로서, 눈물샘 유래 줄기세포를 수득하는 단계이다.
용어, "개체"는 안구건조증이 발병된 적이 없는 개체, 발병될 가능성이 있는 개체, 발병된 개체, 또는 발병된 후 완치된 개체를 모두 포함하며, 인간 또는 임의의 비인간 동물 등을 제한 없이 포함할 수 있다. 상기 비인간 동물은 척추동물, 예컨대 영장류, 개, 소, 말, 돼지, 설치류, 예컨대 마우스, 래트, 햄스터, 기니피그 등일 수 있다. 본 명세서에서, 상기 "개체"는 "대상체" 또는 "환자"와 상호교환적으로 사용될 수 있다.
상기 눈물샘 조직에서 분리되는 세포는 눈물샘 조직을 절단하는 과정 및 효소 분해 과정을 통해 분리되는 것일 수 있다. 구체적으로, 상기 절단은 물리적인 절단 또는 기계적인 절단을 모두 포함하며, 당업계에 알려진 일반적인 조직의 절단 방법으로 수행될 수 있다. 또한, 상기 효소 분해는 당업계에 알려진 일반적인 효소 분해 조건으로 수행될 수 있으며, 예로서 디스파아제(dispase) Ⅱ, DNA 분해효소(DNase) Ⅰ 및 콜라겐 분해효소(collagenase) Ⅱ로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상의 효소를 사용하여 수행될 수 있다.
상기 b) 단계는 상기 단계 a)에서 분리한 세포를 마트리겔 내에서 배양하는 단계로서, 눈물샘 유래 세포 또는 줄기세포를 마트리겔을 이용하여 3차원으로 배양함으로써 조직과 유사한 형태의 눈물샘 오가노이드를 형성시키는 단계이다.
용어, "마트리겔(matrigel)"은 EHS (Engelbreth-Holm-Swarm) 마우스의 육종세포에서 추출된 단백질 복합체(BD Bioscience사의 제품명)를 의미한다. 상기 마트리겔은 라미닌(lamonin), 콜라겐(collagen), 헤파란 설페이트 프로테오글리칸(heparin sulfate proteoglycan)과 같은 세포외 매트릭스(extracellular matrix; ECM), 및 섬유아세포 성장인자(fibroblast growth factor; FGF), 상피세포 성장인자(epiderma growth factor; EFG), 인슐린 성장인자(insulin-like growth factor; IGF), 형질전환 성장인자-베타(transforming growth factor-beta; TGF-β), 혈소판 유래 성장인자(platelet-derived growth factor; PDGF)와 같은 성장인자를 포함하고 있다.
본 발명에서, 상기 마트리겔은 배양 플레이트에 부착되어 돔 형태를 갖는 것일 수 있다. 오가노이드, 또는 이를 포함하는 마트리겔을 배양 플레이트에 부착하여 배양하는 경우, 부착되지 않고 떠다니는 형태의 플로팅 배양(floating culture)보다 배양 효율면에서 다양한 이점을 갖는다. 예로서, 5일 이상의 장기간으로 배양하는 경우에는 2 내지 3일 간격으로 배양 배지를 교체하는 것이 필수적인데, 플로팅 배양의 경우에는 배지 교체 시 오가노이드가 손실될 우려가 높지만, 배양 플레이트에 부착되어 고정된 경우에는 배지 교체 시 오가노이드의 손실이 없고, 배지 교체 시간이 단축될 수 있다.
본 발명에서, 상기 배양은 Wnt, R-스폰딘(R-Spondin), FGF-2, N2, 니코틴아마이드(Nicotinamide), A83-01, 노긴(Noggin), EGF, 인슐린(Insulin), 덱사메타손(Dexametasone), Y-27632, N-아세틸-L-시스테인(N-Acetyl-L-cysteine)을 포함하는 DMEM/F12(Dulbecco's Modified Eagle Medium/Nutrient Mixture F-12)로 수행되는 것일 수 있다.
오가노이드 제조방법에 대한 당업계의 종래 기술은 성분이 각각 다른 최소 2 종류의 배양 배지를 사용하고 있다. 예로서, 배양 초기에는 오가노이드의 크기 등을 성장시키기 위한 성장 배지를 사용하고, 이후 상기 성장 배지를 제거한 후에 오가노이드를 특정 조직으로 분화시키기 위한 분화 배지를 사용하였다. 그러나, 서로 다른 성분의 배양 배지를 2 종류 이상 사용하는 기존의 오가노이드 제조 방법은 비용이 많이 들고, 제조 공정이 복잡해지는 단점이 있었다.
또한, 오가노이드는 그 특성상 배양 조건에 따라 제조 결과가 현저히 달라지는 특징을 갖는다. 배양 조건의 예로서, 배양일, 배양 온도, 배양 배지, 배양 기질 등의 배양 조건이 오가노이드의 특성을 결정하는 중요한 요인이며, 그 중에서도 배지 조건이 줄기세포에 다양한 신호전달 경로를 조절함으로써 오가노이드가 원하는 조직 또는 기관과 유사한 특성을 갖도록 성장시키는데 가장 큰 역할을 수행한다.
본 발명에서는, 서로 다른 배지 조건에서 배양한 오가노이드는 실제 조직과의 유사성 또는 생존능 측면에서 매우 다른 특성을 나타냄을 확인하였고, 실제 조직과 형태, 기능이 매우 유사하고, 특히 생존능이 증가하여 치료 물질 또는 치료 물질의 스크리닝 등에 활용할 수 있는 정도의 충분한 수의 오가노이드를 수득할 수 있는 최적의 배양 배지 조건을 확립하였다. 나아가, 상기 배양 배지를 사용하는 경우에는 2 종류 이상의 배양 배지를 사용하지 않고, 상기 1 종류의 배양 배지만을 사용하여도 오가노이드의 성장 및 분화를 성공적으로 유도할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드 제조방법은 Wnt, R-스폰딘(R-Spondin), FGF-2, N2, 니코틴아마이드, A83-01, 노긴(Noggin), EGF, 인슐린, 덱사메타손, Y-27632, N-아세틸-L-시스테인을 포함하는 배양 배지를 사용하는 것일 수 있다. 상기 Wnt는 Wnt 조건화 배지 (Wnt conditioned media)에서 수득된 것이거나, 또는 Wnt 조건화 배지일 수 있다. 또한, 상기 R-스폰딘은 R-스폰딘 조건화 배지에서 수득된 것이거나, 또는 R-스폰딘일 수 있다.
바람직하게, Wnt는 40 내지 60 v/v%, 더욱 구체적으로 45 내지 55 v/v%, 가장 구체적으로 50 v/v%으로 사용될 수 있고; R-스폰딘은 1 내지 20 v/v%, 더욱 구체적으로 5 내지 15 v/v%, 가장 구체적으로 10 v/v%으로 사용될 수 있고; FGF-2는 10 내지 30 ng/㎖, 더욱 구체적으로 15 내지 25 ng/㎖, 가장 구체적으로 20 ng/㎖으로 사용될 수 있고; N2는 0.1 내지 2X, 더욱 구체적으로 0.5 내지 1.5X, 가장 구체적으로 1X로 사용될 수 있고; 니코틴아마이드는 1 내지 20 mM, 더욱 구체적으로 5 내지 15 mM, 가장 구체적으로 10 mM으로 사용될 수 있고; A83-01는 300 내지 700 nM, 더욱 구체적으로 400 내지 500 nM, 가장 구체적으로 500 nM으로 사용될 수 있고; 노긴은 1 내지 200 ng/㎖, 더욱 구체적으로 50 내지 150 ng/㎖, 가장 구체적으로 100 ng/㎖으로 사용될 수 있고; EGF는 10 내지 30 ng/㎖, 더욱 구체적으로 15 내지 25 ng/㎖, 가장 구체적으로 20 ng/㎖으로 사용될 수 있고; 인슐린은 1 내지 20 ㎍/㎖, 더욱 구체적으로 5 내지 15 ㎍/㎖, 가장 구체적으로 10 ㎍/㎖으로 사용될 수 있고; 덱사메타손은 0.1 내지 2 μM, 더욱 구체적으로 0.5 내지 1.5 μM, 가장 구체적으로 1 μM으로 사용될 수 있고; Y-27632는 1 내지 20 μM, 더욱 구체적으로 5 내지 15 μM, 가장 구체적으로 10 μM로 사용될 수 있고; 및 N-아세틸-L-시스테인은 100 내지 1,000 μM, 더욱 구체적으로 250 내지 750 μM, 가장 구체적으로 500 μM로 사용될 수 있다.
또한, 상기 단계 b)의 배양은 1 내지 19 계대(passage) 수행되는 것일 수 있다.
용어, "계대(passage)"는 배양 중인 세포 또는 이로부터 형성된 오가노이드의 일부 또는 전부를 새로운 배양 환경(플레이트)로 옮기는 과정을 의미하며, 오가노이드를 목적하는 양으로 수득하기 위하여 수행된다. 계대가 증가할수록 동일한 특성을 갖는 오가노이드를 더 많은 양으로 수득할 수 있으나, 오가노이드를 새로운 배양 플레이트로 옮기는 과정 중에 세포가 손상을 입을 수 있기 때문에 계대 수를 증가시킬 수 있는 오가노이드의 배양 방법의 개발이 시급하였다. 본 발명에서는, 전술한 배지 조건을 사용하는 경우, 오가노이드를 손상시키지 않으면서, 오가노이드의 배양을 1 내지 19 계대 수행할 수 있음을 확인하였다.
구체적으로, 상기 1 계대는 1 내지 20일 동안 수행되는 것일 수 있다. 1 내지 20일의 배양 기간 동안 크기가 커짐과 동시에 실제 조직과 유사한 조직학적 특성을 갖추게 되며, 종국적으로 실제 조직과 유사한 기능을 수행할 수 있게 된다.
본 발명에서, 상기 눈물샘 오가노이드는 리소좀(Lysozyme; LYZ), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5; AQP5), E-카드헤린(E-Cadherin; E-CAD) 및 비멘틴(Vimentin; VIM)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 특이적으로 발현하는 것일 수 있다. 상기 리소좀, α-SMA, 아쿠아포린 5, E-카드헤린 및 비멘틴 단백질은 줄기세포에서 눈물샘 조직으로의 분화 및 발달 시 특이적으로 관찰되는 단백질이며, 눈물샘 오가노이드의 마커로 사용되고 있다(Zaki Hakami et al., Eur J Oral Sci. 2020 Oct, 128(5):379-385; Shubha Tiwari et al., PLoS One. 2012, 7(1):e29458.).
또한, 상기 눈물샘 오가노이드는 분비과립(secretory granule)을 포함하는 것일 수 있다.
용어, "분비과립"은 분비 물질을 저장하고, 분비를 조절하는 세포 소기관을 의미하며, 주로 신경내분비 세포(neuroendocrine cell), 백혈구의 일종인 과립구(granulocyte), 눈물샘에 존재하는 샘꽈리 세포(acini cell), 장액 세포(serous cell) 등의 세포에 존재한다고 알려져 있다. 구체적으로, 상기 분비과립은 눈물을 생성하고, 이를 저장하며, 이를 분비하는 것일 수 있다.
또한, 상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료 물질 처리 시 Ca2+ 흡수량, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현량 또는 시크리톰(secretome) 분비량이 증가하는 것일 수 있다. 이때, 상기 안구건조증 안구건조증의 예방 또는 치료 물질의 구체적인 예로는 필로카프린(pilocarpine), 세비메린(cevimeline), 시클로스포린(ciclosporin) 및 레바미피드(rebamipid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있으나, 안구건조증의 치료에 사용되는 한, 이에 제한되지 않는다.
구체적으로, 눈물샘에서 눈물이 분비되기 위해서는 먼저 눈물샘을 구성하는 세포막의 Ca2+ 이온 채널을 통해 세포 밖에 존재하는 Ca2+가 세포 내로 흡수(uptake)되게 된다. 이러한 세포 내부로의 Ca2+ 흡수 및 농도 증가는 눈물 분비를 유도하는데, 쇼그렌 증후군을 앓는 등의 안구건조증 환자는 세포막에 Ca2+ 채널이 존재하지 않기 때문에 Ca2+ 신호전달경로가 제대로 이루어지지 않는다고 알려져 있다(Imada T et al., Sci Rep. 2017, 7(1):6965; Garcia-Posadas L et al., Am J Pathol. 2020, 190(10):2067-2079.; Imada T et al., Sci Rep. 2017;7(1):6965.). 또한, 리소좀 단백질의 일종인 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)는 주로 눈물이나 혈장의 리소좀에 포함되어 있다고 알려져 있으며, 안구 표면에서 병원균 또는 독성 물질을 분해하여 안구를 보호하는 역할을 수행한다(Sofia V Andersson et al., Glycobiology. 2005 Mar, 15(3):211-20.). 또한, 시크리톰(secretome)은 세포에서 발현되고, 세포외 공간으로 분비되는 단백질의 집합이며, 사이토카인, 성장인자, 접합분자, 프로테아제, 세포외 기질 단백질 등이 포함되어 있다고 알려져 있다. 본 발명의 시크리톰은 세포외 소기관, 엑소좀, 소낭 등을 구성하는 단백질로서 눈물을 생성하는데 관여하는 단백들의 집합일 수 있다.
본 발명에서, 상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있다.
용어, "안구건조증"은 눈물이 부족하거나 눈물이 지나치게 증발해 생기는 질환으로서, 눈물이 마르거나 흐르지 않아 안구 표면이 쉽게 손상되는 질환을 의미한다. 눈물샘 손상에 의한 안구건조증, 안구표면의 손상에 의한 안구건조증, 노화에 의한 안구건조증, 방사선 조사에 의한 안구건조증, 누선염, 누낭염, 눈물길 협착, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 무루증(alacrima), 건성각결막염(Keratoconjunctivitis sicca), 스티븐 존슨 증후군(Stevens Johnson syndrome) 및 이식편대숙주질환(Graft versus host disease)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상일 수 있으나 이에 제한되지 않으며, 안구건조를 야기하는 질환이라면 모두 포함된다.
본 발명의 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된 눈물샘 오가노이드를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 제조방법으로 제조된 눈물샘 오가노이드를 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료 제제를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 상기 방법에 따라 제조된 눈물샘 오가노이드를 개체에 이식하는 단계를 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료 방법을 제공한다.
본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드, 안구건조증의 예방 또는 치료 제제, 및 안구건조증의 예방 또는 치료 방법에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 눈물샘 오가노이드의 제조방법에서 설명한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드는 인간의 눈물샘과 매우 유사한 조직학적 구성 및 기능을 가지고 있다. 따라서, 생체 내로 투여되는 경우 손상된 눈물샘을 재생시킬 수 있으므로, 안구건조증 등의 눈물샘 손상 관련 예방 또는 치료 제제로서 사용될 수 있고, 또한 눈물샘 관련 질환의 동물실험 모델에 대한 대안으로 사용될 수 있다.
용어 "치료"는 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드의 이식 또는 투여에 의해 안구건조증의 증상이 호전되거나 완치되는 모든 행위를 의미한다. 또한, 용어 “예방”은 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드의 이식 또는 투여에 의해 안구건조증의 증상을 억제 또는 지연시키는 모든 행위를 의미한다.
본 발명에서, 상기 눈물샘 오가노이드는 리소좀(Lysozyme; LYZ), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5; AQP5), E-카드헤린(E-Cadherin; E-CAD) 및 비멘틴(Vimentin; VIM)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 특이적으로 발현하는 것일 수 있고, 또한 상기 눈물샘 오가노이드는 분비과립(secretory granule)을 포함하는 것일 수 있다. 또한, 상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료 물질 처리 시 Ca2+ 흡수량, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현량 또는 시크리톰(secretome) 분비량이 증가하는 것일 수 있다. 이때, 상기 안구건조증의 예방 또는 치료 물질은 필로카프린(pilocarpine), 세비메린(cevimeline), 시클로스포린(ciclosporin) 및 레바미피드(rebamipid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상일 수 있다.
또한, 상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료를 위한 것일 수 있고, 상기 안구건조증은 눈물샘 손상에 의한 안구건조증, 안구표면의 손상에 의한 안구건조증, 방사선 조사에 의한 안구건조증, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 무루증(alacrima), 건성각결막염(Keratoconjunctivitis sicca), 스티븐 존슨 증후군(Stevens Johnson syndrome) 및 이식편대숙주질환(Graft versus host disease)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상일 수 있다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는 하기 단계를 포함하는, 안구건조증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법을 제공한다: a) 상기 눈물샘 오가노이드에 안구건조증의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계; 및 b) 상기 후보물질이 처리된 눈물샘 오가노이드의 눈물 분비능을 대조군과 비교하는 단계.
본 발명에 따른 안구건조증의 예방 또는 치료 물질의 스크리닝 방법에서, 각 용어는 특별히 언급하지 않는 한 상기 눈물샘 오가노이드의 제조방법에서 설명한 바와 동일한 의미를 갖는다.
본 발명에서, 상기 a) 단계는 상기 눈물샘 오가노이드에 안구건조증의 예방 또는 치료 후보물질을 처리하는 단계이다.
용어, "후보물질"은 안구건조증을 치료할 수 있을 것으로 예상되는 물질을 의미한다. 구체적으로, 직접 또는 간접적으로 안구건조증을 호전 또는 개선시킬 수 있을 것으로 예상되는 물질이면 제한 없이 사용 가능하며, 화합물, 유전자 또는 단백질 등의 치료가능 예상물질을 모두 포함한다.
상기 후보물질의 처리는 당업계에 공지된 방법을 사용하여 수행될 수 있다. 구체적인 예로, 상기 눈물샘 오가노이드에 상기 후보물질을 처리하여 함께 배양하거나, 또는 상기 눈물샘 오가노이드를 포함하는 생체 내에 투여함으로써 상기 후보물질을 처리할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.
또한, 상기 b) 단계는 상기 후보물질이 처리된 눈물샘 오가노이드의 눈물 분비능을 대조군과 비교하는 단계이다.
용어, "대조군"은 후보물질이 처리되지 않은 눈물샘 오가노이드, 또는 안구건조증의 예방 또는 치료 물질이 처리된 눈물샘 오가노이드를 의미하며, 상기 후보물질이 처리된 눈물샘 오가노이드와 눈물 분비능을 비교하기 위해 사용된다.
상기 눈물 분비능은 Ca2+ 흡수량, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현량 또는 시크리톰(secretome) 분비량의 증가를 통해 확인하는 것일 수 있다. 따라서, 상기 b) 단계는 오가노이드의 Ca2+ 흡수량, 베타-헥소사미니다아제 발현량 또는 시크리톰 분비량이 증가하는 경우, 안구건조증의 예방 또는 치료 물질로 결정하는 단계일 수 있다.
상기 Ca2+ 흡수, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현 또는 시크리톰(secretome) 분비는 눈물의 생성 및 분비에 중요한 역할을 수행한다. 먼저, 눈물샘에서 눈물이 분비되기 위하여, 눈물샘을 구성하는 세포막의 Ca2+ 이온 채널을 통해 세포 밖에 존재하는 Ca2+가 세포 내로 흡수(uptake)되게 된다. 이러한 세포 내부로의 Ca2+ 흡수 및 농도 증가는 눈물 분비를 유도하는데, 쇼그렌 증후군을 앓는 등의 안구건조증 환자는 세포막에 Ca2+ 채널이 존재하지 않기 때문에 Ca2+ 신호전달경로가 제대로 이루어지지 않는다고 알려져 있다(Imada T et al., Sci Rep. 2017, 7(1):6965; Garcia-Posadas L et al., Am J Pathol. 2020, 190(10):2067-2079.; Imada T et al., Sci Rep. 2017;7(1):6965.). 또한, 리소좀 단백질의 일종인 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)는 주로 눈물이나 혈장의 리소좀에 포함되어 있다고 알려져 있으며, 안구 표면에서 병원균 또는 독성 물질을 분해하여 안구를 보호하는 역할을 수행한다(Sofia V Andersson et al., Glycobiology. 2005 Mar, 15(3):211-20.). 또한, 시크리톰(secretome)은 세포에서 발현되고, 세포외 공간으로 분비되는 단백질의 집합이며, 사이토카인, 성장인자, 접합분자, 프로테아제, 세포외 기질 단백질 등이 포함되어 있다고 알려져 있다. 본 발명의 시크리톰은 세포외 소기관, 엑소좀, 소낭 등을 구성하는 단백질로서 눈물을 생성하는데 관여하는 단백들의 집합일 수 있다.
본 발명에서는, 알려진 안구건조증의 예방 또는 치료 물질인 필로카핀(pilocarpine)을 눈물샘 오가노이드에 처리하는 경우, 오가노이드 내 Ca2+ 흡수속도 및 흡수량이 증가하고, 오가노이드에서 베타-헥소사미니다아제의 발현량이 증가하고, 오가노이드의 시크리톰 분비량이 증가함을 확인하였다. 따라서, 상기 눈물샘 오가노이드에 처리되었을 때 Ca2+ 흡수능, 베타-헥소사미니다아제 발현능 또는 시크리톰(secretome) 분비능을 증가시키는 후보물질은 안구건조증의 예방 또는 치료 물질인 것으로 판단할 수 있다.
상기 Ca2+ 흡수능, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현능 또는 시크리톰(secretome) 분비능은 당업자에게 공지된 방법을 사용하여 측정될 수 있다. 구체적인 예로, 웨스턴블롯(Western blot), 공동-면역침전 어세이(Co-Immunoprecipitation assay), ELISA(Enzyme Linked Immunosorbent Assay), 조직 면역염색(Immunostaining), 유세포분석법(Flowcytometry analysis), 형광 기반 어세이(Fluorescence-based assays), 전자 현미경 분석법(electron microscopic analysis) 등이 사용될 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니며, 당업자라면 본 발명의 목적에 맞는 방법을 사용할 수 있을 것이다.
본 발명에 따라 제조된 눈물샘 오가노이드는 인간 눈물샘 조직과 조직 유사성이 높고, 눈물 분비능이 우수하며, 특히 생체 내로 이식되는 경우 손상된 눈물샘 조직을 재생시켜 눈물 분비능을 정상화시킬 수 있다.
따라서, 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드의 제조방법은 생체 조직과 조직의 형태 및 기능이 유사한 눈물샘 오가노이드를 제조하는데 활용될 수 있고, 상기 제조된 눈물샘 오가노이드는 쇼그렌 증후군, 각막 건조증 등의 안구건조증의 치료 물질로서 사용되거나, 또는 상기 안구건조증의 치료 물질을 스크리닝하는 방법으로 유용하게 활용될 수 있다.
도 1은 본 발명에 따른 눈물샘 오가노이드의 제조방법을 보여주는 개요도이다.
도 2는 각 배지에 따른 눈물샘 오가노이드의 형성 및 성장 특성에 관한 것으로서, A는 각 배지로 제조된 오가노이드의 계대(passage)에 따른 성장 정도를 보여주는 이미지(10× 확대, 스케일바 500 ㎛), B는 각 배지로 제조된 오가노이드의 생존 가능한 계대 수를 보여주는 그래프, C는 실험군 5의 배지로 제조된 오가노이드의 배양일 경과에 따른 형태를 보여주는 이미지이다(스케일바 100 ㎛).
도 3은 제조된 정상 눈물샘 오가노이드 또는 쇼그렌 증후군 눈물샘 오가노이드의 계대에 따른 성장 정도를 보여주는 이미지이다(10× 확대, 스케일바 500 ㎛).
도 4는 제조된 정상 눈물샘 오가노이드의 눈물샘 조직과의 유사성에 관한 것으로서, A는 H&E, 앨리시안 블루(Alcian Blue), PAS 및 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome)의 조직화학적 염색 결과를 보여주는 이미지(40× 확대, 스케일바 100 ㎛), B는 투과전자현미경(TEM) 분석 결과를 보여주는 이미지(스케일바 5 ㎛), C는 리소좀(Lysozyme), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5), E-카드헤린(E-Cadherin) 및 비멘틴(Vimentin) 단백질에 대한 면역형광염색 결과를 보여주는 이미지이다(스케일바 50 ㎛).
도 5는 제조된 정상 눈물샘 오가노이드 또는 쇼그렌 증후군 눈물샘 오가노이드의 눈물샘 조직과의 유사성에 관한 것으로서, A는 H&E, 앨리시안 블루(Alcian Blue), PAS 및 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome)의 조직화학적 염색 결과를 보여주는 이미지(40× 확대, 스케일바 100 ㎛), B는 리소좀(Lysozyme), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5), E-카드헤린(E-Cadherin) 및 비멘틴(Vimentin) 단백질에 대한 면역형광염색 결과를 보여주는 이미지이다(100× 확대, 스케일바 50 ㎛).
도 6은 제조된 정상 눈물샘 오가노이드 또는 쇼그렌 증후군 눈물샘 오가노이드의 눈물샘 조직과의 유사성에 관한 것으로서, AQP5 단백질 발현량 분석 결과를 보여주는 그래프이다.
도 7은 제조된 정상 눈물샘 오가노이드의 분비 기능에 관한 것으로서, A는 필로카프린(pilocarpine)의 처리 전후에 따른 Ca2+ 흡수(uptake) 정도를 보여주는 이미지(10× 확대, 스케일바 100 ㎛), B는 필로카프린의 처리 전후에 따른 Ca2+ 흡수 정도를 정량화한 그래프, C는 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 발현량을 보여주는 MAG 어세이 분석 결과에 관한 그래프, D는 시크리톰(secretome)에 대한 투과전자현미경(TEM) 분석 결과를 보여주는 이미지이다(스케일바 10 ㎛).
도 8은 제조된 정상 눈물샘 오가노이드로부터 분비된 단백질에 대한 프로테오믹 분석 결과에 관한 것으로서, A는 프로테오믹 분석 결과에 대한 히트맵, B는 분비된 단백질 종류에 대한 벤다이어그램, C는 분비된 단백질 종류에 대한 유전자 온톨로지(gene ontology; GO) 용어 분석 결과 그래프, D는 DEPs (differentially expressed proteins)를 분석한 히트맵이다.
도 9는 제조된 정상 눈물샘 오가노이드의 손상된 눈물샘 조직에 대한 재생 효과에 관한 것으로서, A는 재생 효과를 확인하기 위한 실험 일정을 보여주는 개요도, B는 눈물샘 오가노이드가 이식된 눈물샘 조직의 면역형광염색 결과를 보여주는 이미지이다(40× 확대, 스케일바 100 ㎛).
이하, 실시예를 통하여 본 발명을 더욱 상세히 설명하고자 한다. 이들 실시예는 본 발명을 보다 구체적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 의해 제한되지 않는다.
실시예 1. 인간 눈물샘 오가노이드의 제조
인간 눈물샘 오가노이드로서, 정상 기능을 나타내는 눈물샘 오가노이드와 안구건조증을 모사하는 눈물샘 오가노이드로서 쇼그렌 증후군의 특징을 갖는 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome) 눈물샘 오가노이드를 제조하였다.
구체적으로, 도 1에 나타낸 바와 같이, 정상인 또는 쇼그렌 증후군 환자로부터 눈물샘(Lacrimal gland) 조직을 채취하고, 세척 후 잘게 잘라 분리 버퍼 (dissociation buffer; 0.125 ㎎/㎖ dispase II, 0.1 ㎎/㎖ DNase I, 0.125 ㎎/㎖ collagenase II 및 1 v/v% 페니실린-스트렙토마이신을 포함하는 DMEM/F12)를 넣고 37℃에서 60분간 150 rpm으로 쉐이킹 인큐베이션하여 눈물샘 유래 세포를 분리하였다. 그 다음, 분리한 눈물샘 유래 세포를 원심분리하여 펠렛 상태에서 배양배지로 5×105 세포/㎖의 밀도로 현탁하고, 마트리겔(Matrigel)과 1:1의 비율로 혼합하여 48웰 플레이트에 20 ㎕씩 분주하였다. 이때, 상기 마트리겔은 돔(dome) 형태이며, 상기 세포 현탁액을 포함하는데, 37℃에서 60분간 중합(polymerization)시켜 제조하였다. 이후, 눈물샘 오가노이드 배양배지를 각 웰당 300 ㎕씩 넣고 2-3일에 한 번씩 배지교환을 하며 1 계대(passage)당 20일 동안 배양하였다.
또한, 오가노이드의 제조 효율을 극대화시키기 위하여, 오가노이드 배양 배지의 조성 및 비율을 다양하게 조합하여 테스트하였다(표 1). 이때, 실험군 1 내지 5의 모든 실험군의 배지에는 R-스폰딘 조건화 배지(R-Spondin Conditioned media)를 10 v/v%의 농도로 첨가하였고, 실험군 2를 제외한 나머지 실험군의 배지에는 Wnt 조건화 배지(Wnt Conditioned media)를 50 v/v%의 농도로 첨가하였다.
실험군 1 실험군 2 실험군 3 실험군 4 실험군 5
FGF2 5 ng/㎖ 5 ng/㎖ 20 ng/㎖ 20 ng/ml 20 ng/㎖
FGF10 10 ng/㎖ 10 ng/㎖ - 10 ng/ml -
N2 1X - 1X 1X 1X
B27 1X 1X - - -
니코틴아마이드 10 mM 10 mM - - 10 mM
A83-01 5 μM 5 μM - - 500nM
노긴(Noggin) 100 ng/㎖ 100 ng/㎖ - - 100 ng/㎖
EGF 25 ng/㎖ 25 ng/㎖ 20 ng/㎖ 20 ng/㎖ 20 ng/㎖
SB202190 3 μM 3 μM - 3 μM -
프로스타글란딘 E2 1 μM 1 μM - 1 μM -
인슐린 10 ㎍/㎖ - 10 ㎍/㎖ 10 ㎍/㎖ 10 ㎍/㎖
덱사메타손 1 μM - 1 μM 1 μM 1 μM
Y-27632 10 μM - 10 μM 10 μM 10 μM
N-아세틸-L-시스테인 500 μM - 500 μM 500 μM 500 μM
그 결과, 도 2의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 상기 표 1에 기재된 5개의 배지 중에서도 FGF-2(20 ng/㎖), N2(1X), 니코틴아마이드(10 mM), A83-01(500 nM), 노긴(100 ng/㎖), EGF(20 ng/㎖), 인슐린(10 ㎍/㎖), 덱사메타손(1 μM), Y-27632(10 μM), N-아세틸-L-시스테인(500 μM)을 포함하는 DMEM/F12의 실험군 5 배지로 배양하는 경우에 오가노이드가 효율적으로 제조됨을 확인하였다.
구체적으로, 실험군 1 내지 4의 배지는 계대가 0일 때에도 오가노이드가 잘 형성되지 않을뿐만 아니라, 계대가 증가하는 경우에는 오가노이드가 생존하지 못하고 대부분 사멸됨을 확인하였다. 반면에, 상기 실험군 5의 배지로 배양하는 경우에는 계대가 증가할수록 오가노이드의 수도 급격히 증가하며, 계대가 3이 될 때에는 계대가 0인 경우에 비하여 그 수가 약 8배 이상 증가하는 것을 확인하였다. 특히, 계대가 19가 될 때까지 생존할 수 있음을 확인하였다(도 2의 A 및 B).
또한, 도 2의 C에서 볼 수 있듯이, 상기 실험군 5의 배지로 배양한 눈물샘 오가노이드는 배양일이 경과할수록 구의 크기가 커지는데, 배양 시작 6일 후부터 지름이 약 100 ㎛ 정도의 크기를 갖는 구 형태의 눈물샘 오가노이드가 형성되고, 배양 시작 15일까지 그 크기가 증가하여 지름이 약 150 ㎛까지 성장함을 확인하였다.
또한, 도 3에서 볼 수 있듯이, 상기 실험군 5의 배지로 배양한 쇼그렌 증후군 눈물샘 오가노이드도 계대가 증가할수록 형성되는 오가노이드의 수가 급격히 증가하며, 이는 정상 눈물샘 오가노이드와 동일한 수준임을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 상기 실험군 5의 배지를 사용하는 경우, 눈물샘 오가노이드를 효율적으로 제조할 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 2. 인간 눈물샘 오가노이드의 조직 유사성
본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 인간 눈물샘 오가노이드가 실제 인간의 눈물샘과 조직학적으로 유사한지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 따라 실험군 5의 배지를 사용하여 제조한 인간 눈물샘 오가노이드와 실제 인간으로부터 채취한 눈물샘 조직에 대하여 H&E, 앨리시안 블루(Alcian Blue), PAS 및 메이슨 트리크롬(Masson's Trichrome) 등의 조직화학적 염색을 수행하였다. 또한, 눈물샘 오가노이드의 세포 내 구조를 확인하기 위하여 투과전자현미경(TEM) 분석을 수행하였고, 눈물샘 조직에서 특이적으로 발현한다고 알려진 리소좀(Lysozyme; LYZ), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5; AQP5), E-카드헤린(E-Cadherin; E-CAD) 및 비멘틴(Vimentin; VIM) 단백질에 대한 항체를 사용하여 면역형광염색을 수행하였다.
그 결과, 도 4의 A 내지 C에서 볼 수 있듯이, 조직화학적 염색 결과를 통해서는 제조된 눈물샘 오가노이드는 인간 눈물샘 조직과 조직학적으로 매우 유사한 형태를 나타냄을 확인하였고(도 4의 A), TEM 이미지 결과를 통해서는 인간 눈물샘 조직에서 확인 가능한 세포 소기관들이 존재하며 샘꽈리 세포(acinar cell)의 특징으로 알려진 분비과립(secretory granule) 또한 다수 존재함을 확인하였고(도 4의 B), 면역형광염색 결과를 통해서는 리소좀(Lysozyme; LYZ), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5; AQP5), E-카드헤린(E-Cadherin; E-CAD) 및 비멘틴(Vimentin; VIM) 등의 눈물샘 조직에서 특이적으로 발현되는 단백질 마커의 발현 패턴이 인간 눈물샘 조직과 매우 유사함을 확인하였다(도 4의 C).
또한, 도 5의 A 및 B에서 볼 수 있듯이, 조직화학적 및 면역형광염색 결과를 통해, 제조된 정상 눈물샘 오가노이드와 쇼그렌 증후군 눈물샘 오가노이드는 각각 정상인과 쇼그렌 증후군 환자로부터 채취한 눈물샘 조직과 조직학적으로 매우 유사한 형태를 나타내며(도 5의 A), 리소좀(Lysozyme), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5), E-카드헤린(E-Cadherin) 및 비멘틴(Vimentin) 등의 눈물샘 특이 마커들의 발현패턴 또한 매우 유사함을 확인하였다(도 5의 B).
나아가, 도 6에서 볼 수 있듯이, 각각의 정상 또는 쇼그렌 오가노이드는 침샘, 눈물샘 등에 존재하는 막단백질로서 분비 기능을 수행한다고 알려진 AQP5 (aquaporin 5)의 단백질 발현량이 실제 눈물샘 조직과 매우 유사함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 인간 눈물샘 오가노이드는 실제 인간의 눈물샘과 조직학적으로 매우 유사하므로, 안구건조증 등의 인간 눈물샘 관련 질환의 치료에 사용될 수 있으며, 또한 치료 약물의 스크리닝에도 활용될 수 있음을 확인할 수 있었다.
실시예 3. 인간 눈물샘 오가노이드의 눈물 분비능
본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 인간 눈물샘 오가노이드가 실제 인간의 눈물샘 조직의 눈물 분비 기능을 제대로 모사할 수 있는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 따라 상기 실험군 5의 배지를 사용하여 제조한 인간 눈물샘 오가노이드와 실제 인간으로부터 채취한 눈물샘 조직에 안구건조증의 치료 물질로 사용되고 있는 필로카프린(pilocarpine) 1 ㎍/㎖을 처리하였다. 이후, Fluo-4 Calcium 이미징 키트(Thermo Fisher Scientific)로 Ca2+ 흡수 정도를 확인하여 눈물 분비를 유도능을 확인하였고, NAG (N-acetyl-β-glucosaminidase) 어세이 키트 (MilliporeSigma)를 이용하여 눈물샘에서 분비되는 눈물에 존재한다고 알려진 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase)의 발현량을 확인하였으며, TEM (Transmission electron microscopy) 이미지 분석을 통해 오가노이드를 구성하는 세포로부터 분비되는 단백질의 집합인 시크리톰(secretome)을 확인하였다. 세포 내부로의 Ca2+ 흡수 및 농도 증가는 눈물 분비를 유도하는데, 쇼그렌 증후군을 앓는 등의 안구건조증 환자는 세포막에 Ca2+ 채널이 존재하지 않기 때문에 Ca2+ 신호전달경로가 제대로 이루어지지 않는다(Imada T et al., Sci Rep. 2017, 7(1):6965; Garcia-Posadas L et al., Am J Pathol. 2020, 190(10):2067-2079.; Imada T et al., Sci Rep. 2017;7(1):6965.).
그 결과, 도 7의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 제조된 눈물샘 오가노이드는 필로카프린이 처리되는 경우 Ca2+ 흡수가 5초 이내의 빠른 시간 안에 이루어짐과 동시에 그 흡수량도 약 2배 이상 증가하며(도 7의 A 및 B), 베타-헥소사미니다아제는 시간이 지날수록 그 발현량이 증가하여 24시간 후에는 2시간일때의 발현량과 비교 시 약 1.5배 정도까지 증가함을 확인하였다(도 7의 C). 또한, 오가노이드를 구성하는 세포로부터 시크리톰이 분비되는데, 시크리톰이 분비되면 세포간극이 벌어지는 현상이 나타나며, 이로써 눈물의 분비가 정상적으로 수행될 수 있음을 확인하였다(도 7의 D).
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 인간 눈물샘 오가노이드는 실제 인간 눈물샘 조직의 분비 기능을 매우 유사한 정도로 수행할 수 있으며, 이에 따라 안구건조증 등의 인간 눈물샘 관련 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 4. 인간 눈물샘 오가노이드로부터 분비된 단백질 분석
본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 인간 눈물샘 오가노이드에서 분비되는 단백질의 종류를 분석함으로써 실제 인간 눈물샘과 동일한 기능을 하는지 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 따라 상기 실험군 5의 배지를 사용하여 제조한 인간 눈물샘 오가노이드와 실제 인간으로부터 채취한 눈물샘 조직에 대하여 건조증의 치료에 사용되고 있는 필로카프린(pilocarpine) 1 ㎍/㎖을 처리하였다. 이후, 눈물샘 오가노이드에서 분비된 시크리톰에 대하여 프로테오믹스 분석을 수행하였다.
그 결과, 도 8의 A 내지 D에서 볼 수 있듯이, 제조된 눈물샘 오가노이드는 필로카프린이 처리되는 경우, 분비되는 단백질의 양이 증가하고 그 종류도 다양해지는데(도 8의 A), 약 120개 정도의 단백질이 새로 합성되어 분비됨을 확인하였다(도 8의 B). 특히, 분비된 단백질의 대부분은 세포외 영역(extracellular region), 소낭(vesicle), 세포외 영역의 부분(extracellular region part), 세포외 공간(extracellular space), 세포외 소기관(extracellular organelle), 세포외 소낭(extracellular vesicle), 세포외 엑소좀(extracellular exosome) 등을 구성하는 단백질로서 눈물 생성을 위해 발현되는 것들임을 확인하였다(도 8의 C). 또한, 발현량이 20 이상 증가하는 단백질로는 RPS8, RPL5, RPL12, CTTN, CCT2, ADH5, CAPZB, ACLY, PGLS, HNRNPC, WDR1, CAPG, COL6A1, CTSB, RPSA, RAN, SET, HNRNPAB 등이며 이들은 엑소좀 또는 소낭에 속하는 것들임을 확인하였다(도 8의 D)
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 인간 눈물샘 오가노이드는 실제 인간 눈물샘 조직의 분비 기능을 매우 유사한 정도로 수행할 수 있으며, 이에 따라 안구건조증 등의 인간 눈물샘 관련 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.
실시예 5. 인간 눈물샘 오가노이드의 치료 효과
본 실시예에서는, 상기 실시예 1에서 제조한 인간 눈물샘 오가노이드의 눈물샘 손상에 대한 치료 효과를 확인하였다.
구체적으로, 상기 실시예 1에 따라 상기 실험군 5의 배지를 사용하여 제조한 인간 눈물샘 오가노이드를 마우스 안구건조증 모델에 이식하고 (1×104 세포/15 ㎕/눈물샘), 2주 뒤에 생착된 오가노이드의 조직에서 눈물샘 세포의 특이 마커인 AQP5의 발현 정도를 확인함으로써 손상된 눈물샘이 오가노이드에 의해 재생되는지 여부를 확인하였다. 이때, 상기 눈물샘 오가노이드는 마우스 생체 내에 이식된 이후에도 용이하게 추적하기 위하여 GFP-Tg 마우스로부터 채취한 눈물샘 유래 줄기세포를 사용하여 제조하였고, 안구건조증 마우스 모델은 콘카나발린 A(Concanavalin A)를 이용하여 제조하였다.
그 결과, 도 9에서 볼 수 있듯이, GFP를 발현하는 눈물샘 오가노이드는 이식 2주 뒤에도 눈물샘 조직에 잘 생착되어 있음을 확인하였다. 특히, 눈물샘 손상 조직에 비하여, 오가노이드가 이식된 조직에서는 눈물샘 세포의 특이적인 단백질 마커인 AQP5의 발현량이 약 3배 정도로 현저히 증가함을 확인하였다.
상기 결과를 통해, 본 발명에 따른 제조방법으로 제조된 인간 눈물샘 오가노이드는 손상된 눈물샘 조직의 재생을 효율적으로 유도할 수 있으므로, 이에 따라 안구건조증 등의 인간 눈물샘 관련 질환의 치료에 유용하게 활용될 수 있음을 확인하였다.

Claims (25)

  1. 하기 단계를 포함하는, 눈물샘 오가노이드의 제조방법:
    a) 개체에서 분리된 눈물샘 조직에서 세포를 분리하는 단계; 및
    b) 상기 단계 a)에서 분리한 세포를 Wnt, A83-01 및 노긴(Noggin)을 포함하며, FGF10을 포함하지 않는 배지로 배양하는 단계.
  2. 제1항에 있어서,
    상기 단계 a)의 세포는 눈물샘 조직을 절단 및 효소 분해함으로써 분리되는 것인, 제조방법.
  3. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b)의 배지는 배양 플레이트에 부착되어 돔 형태를 갖는 것인, 제조방법.
  4. 제1항에 있어서,
    상기 단계 b)의 배양은 1 내지 19 계대(passage) 수행되는 것인, 제조방법.
  5. 제4항에 있어서,
    상기 1 계대는 1 내지 20일 동안 수행되는 것인, 제조방법.
  6. 제1항에 있어서,
    상기 눈물샘 오가노이드는 리소좀(Lysozyme), α-SMA(Alpha-smooth muscle actin), 아쿠아포린 5(Aquaporin 5), E-카드헤린(E-Cadherin) 및 비멘틴(Vimentin)으로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상을 특이적으로 발현하는 것인, 제조방법.
  7. 제1항에 있어서,
    상기 눈물샘 오가노이드는 분비과립(secretory granule)을 포함하는 것인, 제조방법.
  8. 제1항에 있어서,
    상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료 물질 처리 시 Ca2+ 흡수량, 베타-헥소사미니다아제(β-hexosaminidase) 발현량 또는 시크리톰(secretome) 분비량이 증가하는 것인, 제조방법.
  9. 제8항에 있어서,
    상기 안구건조증의 예방 또는 치료 물질은 필로카프린(pilocarpine), 세비메린(cevimeline), 시클로스포린(ciclosporin) 및 레바미피드(rebamipid)로 이루어진 그룹에서 선택된 하나 이상인, 제조방법.
  10. 제1항에 있어서,
    상기 눈물샘 오가노이드는 안구건조증의 예방 또는 치료를 위한 것인, 제조방법.
  11. 제10항에 있어서,
    상기 안구건조증은 눈물샘 손상에 의한 안구건조증, 안구표면의 손상에 의한 안구건조증, 노화에 의한 안구건조증, 방사선 조사에 의한 안구건조증, 누선염, 누낭염, 눈물길 협착, 쇼그렌 증후군(Sjogren's syndrome), 무루증(alacrima), 건성각결막염(Keratoconjunctivitis sicca), 스티븐 존슨 증후군(Stevens Johnson syndrome) 및 이식편대숙주질환(Graft versus host disease)으로 이루어지는 그룹에서 선택되는 하나 이상인, 제조방법.
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