KR101562366B1 - 메타크릴레이트화된 젤라틴을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 - Google Patents
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Abstract
본 발명은 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 및 이를 이용한 심근세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 세포 지지체의 제조방법에 관한 것이다. 또한, 본 발명은 상기 심근세포부화 유도용 세포 지지체를 포함하는 심근세포 분화 유도용 패치 또는 세포 배양용 플레이트에 관한 것이다.
본 발명에 따른 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는 세포 지지체는, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 매우 효과적이고, 실직적으로 환자에 쓰일 가능성이 가장 높은 젤라틴과 같은 천연생체고분자를 기반으로 만든 세포지지체 위에 심장전구세포를 배양해서 최외에서 심근세포를 대량으로 분화시키는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 2차원 뿐만 아니라 3차원 세포 지지체로의 확장이 가능하며, 이에는 전기방사와 3차원 프린팅 방식 등의 다양한 방식의 활용이 가능하다.
본 발명에 따른 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는 세포 지지체는, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 매우 효과적이고, 실직적으로 환자에 쓰일 가능성이 가장 높은 젤라틴과 같은 천연생체고분자를 기반으로 만든 세포지지체 위에 심장전구세포를 배양해서 최외에서 심근세포를 대량으로 분화시키는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 2차원 뿐만 아니라 3차원 세포 지지체로의 확장이 가능하며, 이에는 전기방사와 3차원 프린팅 방식 등의 다양한 방식의 활용이 가능하다.
Description
본 발명은 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 및 이를 이용한 심근세포의 분화 유도 방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 세포 지지체의 제조방법에 관한 것이다.
또한, 본 발명은 상기 심근세포부화 유도용 세포 지지체를 포함하는 심근세포 분화 유도용 패치 또는 세포 배양용 플레이트에 관한 것이다.
일반적으로, 심근세포는 출생 전에는 자율 박동하면서 활발하게 세포 분열을 하지만, 출생 직후부터 분열 기능을 상실하게 되므로, 심근경색이나 심근염 등의 각종 스트레스에 노출되어 심근세포가 사멸하더라도 소실된 심근세포는 보충되지 않는다. 그 결과, 남아있는 심근세포는 대상성 비대에 의해 심장 기능을 유지하려고 하지만, 각종 스트레스가 지속되어 그 허용 범위를 넘어서게 되면 새로운 심근세포의 쇠퇴 및 사멸을 유발하여 심근 기능이 저하된다.
심장병은, 세계적으로 사망 원인의 2위를 차지하며, 그 예후도 지극히 나빠, 심장 질환자의 5년 생존율은 50% 정도에 불과하다. 따라서, 치료 효과가 높은 심부전 치료법의 개발이 의료복지의 큰 전진 및 의료 경제의 개선으로 이어진다고 생각할 수 있다. 심부전의 치료제로, 종래에는 심근의 수축력을 증가시키는 디기탈리스 제제나 크산틴 제제등의 강심제가 사용되어 왔으나, 이들 약제를 장기간 투여하는 경우 심근 에너지의 과잉 소비로 인해 병의 용태를 악화시키는 것으로 알려져 있다. 또한, 최근에는 교감신경계나 레닌-안지오텐신계의 항진에 의한 과잉 심부하를 경감시키는 β 차단제나 ACE 저해제에 의한 치료가 주를 이루고 있지만, 이는 대증적 치료법에 불과하며, 상해를 입은 심조직 자체를 회복시키는 방법은 아니다. 이러한 방법들에 비해, 심장이식은 중증 심부전에 대한 근본적인 치료법이지만, 장기 제공자의 부족, 의료 윤리, 환자의 육체적, 경제적 부담 등의 문제가 있어, 심장이식 방법을 일반적인 치료법으로 자주 사용하기 어려운 실정이다.
이로 인하여, 쇠퇴 또는 상실된 심근세포를 보충적으로 이식하는 방법이 심부전 치료에 매우 유용한 것으로 여겨지고 있다. 실제, 동물 실험에서 태아로부터 미성숙 심근세포를 취하여, 이를 성체 심조직에 이식하면 이식된 세포는 심근세포로서 유효하게 기능하는 것으로 확인된바 있다. 그러나, 상기 방법으로는 심근세포를 대량으로 취득하기 어렵고, 윤리적인 관점에서도 임상 의료로의 적용이 곤란하다.
따라서, 미분화된 줄기세포로부터 심근세포의 분화를 유도하고, 이것을 이식용 세포로서 이용하는 방법이 최근에 특히 주목을 받고 있다. 현재, 성체 심장조직에서 심근세포를 생산할 수 있는 전구 세포 또는 줄기세포로 명확히 동정할 수 있는 세포 집락이 발견되고 있지 않기 때문에, 상기 방법을 실시하기 위해서는 보다 미분화되고 다양한 분화 기능성을 가지고 있는 다능성 줄기세포의 사용을 고려할 수 있다.
본 발명자들은 심근세포의 다량 생산을 위하여 세포 지지체를 개발하기 위하여 예의 노력한 결과, 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA)을 포함하는 세포 지지체가 심근세포 유도에 매우 효과적임을 확인하고 본 발명을 완성하기에 이르렀다.
본 발명의 일 양상은 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 및 이를 이용한 심근세포의 분화 유도 방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 세포 지지체의 제조방법을 제공하는 것이다.
또한, 본 발명의 일 양상은 상기 심근세포부화 유도용 세포 지지체를 포함하는 심근세포 분화 유도용 패치 또는 세포 배양용 플레이트를 제공하는 것이다.
본 발명의 일 양상은 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체 및 이를 이용한 심근세포의 분화 유도 방법을 제공한다.
이하 본 발명에 대하여 상세히 설명한다.
본 발명에서 “세포 지지체”는 세포의 체외 배양 및 체내 이식이 가능하도록 만들어진 물리적 지지체이다.
지지체는 물리 화학적 특성은 세포를 부착하고 전달할 수 있으며, 세포성장을 유도분화하고 촉진시킬 수 있으며, 생체적합성이며 생분해성인 것이 바람직하며, 용이한 제조과정과 원하는 형태로 자유자재로 만들수 있는 것이 바람직하다.
본 발명에 따른 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는 세포 지지체는, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 매우 효과적이고, 실직적으로 환자에 쓰일 가능성이 가장 높은 젤라틴과 같은 천연생체고분자를 기반으로 만든 세포지지체 위에 심장전구세포를 배양해서 최외에서 심근세포를 대량으로 분화시키는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 2차원뿐만 아니라 3차원 세포 지지체로의 확장이 가능하며, 이에는 전기방사와 3차원 프린팅 방식 등의 다양한 방식의 활용이 가능하다.
본 발명에서 “젤라틴”이란 동물의 뼈 · 가죽 · 힘줄 · 연골 등을 구성하는 천연 고분자 단백질인 콜라겐(교원질)을 가수분해하여 얻어지는 유도 단백질이다. 젤라틴의 일반적 구성성분은 약 단백질(protein) : 84 ~ 90 %, 수분(water) : 8 ~ 12 % 및 무기염류(mineral salts) : 2 ~ 4%로 구성될 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 A type 또는 B type일 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 다양한 젤 강도(gel strength), 점도(viscosity)를 가질 수 있다. 본 발명에서 젤라틴은 천연물질로부터 분리 또는 합성될 수 있으며, 그 원료의 종류는 한정되지 않으나, 예를 들면 포유동물 또는 어류 등의 가죽, 뼈 껍질 등으로부터 분리된 콜라겐을 가수분해하여 생산할 수 있다.
본 발명은 메타크릴레이트화된 젤라틴을 이용하여 심근세포분화를 유도하는 것을 발명의 특징으로 한다.
본 발명의 심근세포는 줄기세포 또는 전구세포로부터 분화 유도된 것이다. 본 명세서에서 사용된 용어 “줄기세포 (stem cell)” 또는 “전구세포 (progenitor cell, precursor cell)”은 다양한 신체 조직으로 분화할수 있는 능력을 갖는 미분화 세포로서, 이는 만능 줄기 세포(totipotent stem cell), 전분화능 줄기세포 (pluripotent stem cell), 다분화능 줄기세포(multipotent stem cell)로 분류될 수 있다.
상기 줄기세포는 성체줄기세포, 배아줄기세포, 중간엽줄기세포, 지방줄기세포, 조혈모세포, 제대혈줄기세포 및 역분화줄기세포를 포함할 수 있으며 동종 또는 자가 줄기세포일 수 있다.
본 발명에서, 상기 성체줄기세포는 모든 조직으로부터 유래될 수 있으며, 예를 들면 골수 유래, 제대혈 유래, 혈액 유래, 간장 유래, 피부 유래, 위장관 유래, 태반 유래, 신경 유래, 부신 유래, 상피 유래 또는 자궁 유래 줄기세포를 포함하며, 이에 제한되지 않는다. 본 발명의 줄기세포는 바람직하게는 심장 줄기세포 또는 심장 전구세포이다.
본 발명에서 "분화(differentiation)"란, 일반적으로 비교적 단순한 계가 둘 이상의 질적으로 다른 부분계로 분리되는 현상을 의미하는데, 구체적으로 세포가 분열 증식하여 성장하는 동안에 서로 구조나 기능이 특수화하는 현상, 즉 생물의 세포, 조직 등이 각각에게 주어진 일을 수행하기 위하여 형태나 기능이 변해가는 현상을 의미한다. 상대적으로, "미분화"란 상술한 분화가 일어나지 않은 아직 줄기세포로써의 특징을 함유하고 있는 상태를 의미한다. 본 발명에서, 줄기세포 또는 전구세포들은 메타크릴레이트화된 젤라틴을 이용한 세포 지지체로써 심근세포로 효과적으로 분화된다. 본 발명에서 바람직하게는 상기 메타크릴레이트화된 젤라틴은 세포 지지체의 단일 성분일 수 있다.
본 발명에 있어서, "심근세포"는 장래에 기능적인 심근세포가 될 수 있는 능력을 가진 심근 전구 세포, 또는 태아형 심근세포, 성체 심근세포의 모든 분화 단계의 세포를 포함하여, 이하에 기재된 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 방법에 의해, 적어도 하나, 바람직하게는 복수의 마커나 기준을 확인할 수 있는 세포로 정의된다.
"심근세포"의 특징을 가지는 세포로, 예를 들면, GATA-4, TEF-1, Tbx-5, MEF2 및 MLC-2v 등의 심근 특이 전사 인자의 유전자 발현이나, 심근 특이 마커인 근육원섬유마디(sarcomere)·미오신, 트로포닌 I, α-액티닌, ANP 등의 단백질의 발현을 확인할 수 있다.
심근세포 특이적인 각종 마커의 발현은, 종래의 생화학적 또는 면역화학적 방법으로 검출한다. 이러한 방법은 특별히 한정되지 않으나, 바람직하게는, 면역조직 화학적 염색법이나 면역 전기영동법과 같은, 면역화학적 방법을 사용한다. 이러한 방법에서, 심근 전구 세포 또는 심근세포에 결합하는 마커 특이적인 다클론성 항체 또는 단일 클론 항체를 사용할 수 있다.
개개의 특이적 마커를 표적으로 하는 항체가 시판되고 있어, 용이하게 사용할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커의 예로는 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c 등을 들 수 있다.
또는, 심근 전구 세포 또는 심근세포 특이적 마커의 발현은, 특정한 방법에 한정되지 않으며, 역전사 효소 매개 중합효소 연쇄 반응(RT-PCR)이나 혼성화 분석인, 임의의 마커 단백질을 코딩하는 mRNA를 증폭, 검출, 해석하기 위한 종래에 흔히 사용되는 분자생물학적 방법으로 확인할 수 있다. 심근 전구 세포 또는 심근세포에 특이적인 마커(예, 미오신 중쇄/경쇄, α-엑티닌, 트로포닌 I, ANP, GATA-4, Nkx2.5, MEF-2c) 단백질을 코딩하는 핵산 서열은 이미 공지되어 있어 유전자은행(GenBank)과 같은 공공 데이터베이스로부터 이용가능하며, 프라이머 또는 프로브로 사용하기 위하여 필요한 마커 특이적 서열을 용이하게 결정할 수 있다.
또한, 본 발명에 따른 심근세포로의의 분화 유도방법은, 일반적으로 자주 사용되는 부유 응집 배양법뿐만 아니라, 현적(hanging drop) 배양법, 및 공급자 세포(feeder)를 이용한 공배양법 등이 다양하게 이용될 수 있으며, 그 종류를 제한하지 않는다.
본 발명은 또한, 상기에 의하여 분화가 유도된 심근세포를 포함하는 세포 치료제를 제공한다.
본 발명의 용어 "세포치료제(cellular therapeutic agent)"란, 인간으로부터 분리, 배양 및 특수한 조작을 통해 제조된 세포 및 조직으로 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품(미국 FDA규정)으로서, 세포 혹은 조직의 기능을 복원시키기 위하여 살아있는 자가, 동종, 또는 이종세포를 체외에서 증식 선별하거나 다른 방법으로 세포의 생물학적 특성을 변화시키는 등의 일련의 행위를 통하여 이러한 세포가 질병의 치료, 진단 및 예방의 목적으로 사용되는 의약품을 의미한다.
상기 세포 치료제는 심장질환의 치료에 사용될 수 있다. 심장 관련 질환은 선척적 또는 후천적으로 심장에 이상이 생기거나 변성이 생겨 발생한 질환이면 제한 없이 포함될 수 있으나, 그 예로 심근경색, 허혈성 심질환, 울혈성 심부전, 비대성 심근증, 확장형 심근증, 심근염, 만성 심부전 등이 있다. 상기 세포 치료제 또는 심장 관련 질환 치료용 조성물은 본 발명에 의해 제조된 심근세포를 높은 순도로 포함하는 것이면, 세포를 배지 등의 수성 담체에 부유시킨 것, 세포를 생체 분해성 기질 등의 지지체에 내포시킨 것, 또는 단층 또는 다층의 심근세포 시트 (Shimizu 등, Circ. Res. 90: e40, 2002)로 가공한 것 등, 다양한 형태로 사용할 수 있다.
또한, 본 발명은 하기의 단계를 포함하는 세포 지지체 제조 방법을 제공한다:
(1) TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)가 코팅된 제 1 플레이트 상에 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 및 광개시제를 첨가하는 단계; (2) 상기 단계 (1)의 제1 플레이트 상에 첨가된 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 및 광개시제 위에 제 2 플레이트를 위치시키는 단계; (3) 상기 단계 (2)의 샌드위치된 플레이트에 UV를 조사하는 단계; (4) 제 2 플레이트를 제거하는 단계. 상기 방법은 및 (5) 상기 단계 (4)의 제 2 플레이트가 제거된 제 1 플레이트를 동결건조하는 단계를 추가로 포함할 수 있다.
본 발명에 따른 심근세포분화 유도용 세포 지지체는 심근세포 분화 유도용 패치에 이용될 수 있다. 이러한 패치는 심장 관련 질환 치료제로서 활용될 수 있으며, 상기 치료제는 개흉한 뒤 주사기를 이용하여 직접 심장에 주입하는 방법, 심장의 일부를 외과적으로 절개하여 이식하는 방법, 또는 카테터를 이용한 경혈관적 방법에 의해 이식하는 방법 등으로 장해 부위에 수송할 수 있지만, 이로 한정되는 것은 아니다.
또한, 본 발명에 따른 심근세포분화 유도용 세포 지지체는 체외에서 심근세포의 대량 생산을 위한 세포 배양용 플레이트로 활용될 수 있다.
본 발명에 따른 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 을 포함하는 세포 지지체는, 줄기세포의 부착능이 우수하며, 줄기세포로부터 심근세포로의 분화가 매우 효과적이고, 실직적으로 환자에 쓰일 가능성이 가장 높은 젤라틴과 같은 천연생체고분자를 기반으로 만든 세포지지체 위에 심장전구세포를 배양해서 최외에서 심근세포를 대량으로 분화시키는 것이 가능하다. 또한, 본 발명은 2차원뿐 만 아니라 3차원 세포 지지체로의 확장이 가능하며, 이에는 전기방사와 3차원 프린팅 방식 등의 다양한 방식의 활용이 가능하다.
도 1은 GelMA (methacrylated gelatin)의 제조방법에 관한 것이다. 1차 아미노기를 포함하는 젤라틴 마크로머 (macromer)를 MAA (methacrylic anhydride)와 반응시켜 GelMA (methacrylated gelatin)를 제조한다.
도 2는 GelMA (methacrylated gelatin) 박막을 제조하는 과정 및 GelMA의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. 하이드로겔 네트워크를 제조하기 위하여, TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)가 코팅된 커버슬라이드를 광개시제의 존재 하에서 UV 조사하여 크로스링킹 시켰다.
도 3a는 5만개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 글라스 (diameter 12 mm)에 시딩 한 후 1일 뒤, 액틴 필라멘트와 핵을 염색함으로써, GelMA 박막 및 글라스 (대조군)에서의 c-kit 심장 전구세포의 부착능을 비교한 도이다.
도 3b는 5만개의 세포 시딩 후 1일 뒤, EZ cytox viability test kit 을 이용한 세포 생존율 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 5천개의 세포 시딩 후 7일 뒤, EZ cytox viability test kit를 이용한 세포의 증식 실험을 한 결과이다.
도 4는 세포 얼라인먼트를 비교한 결과이다. GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 유리 (diameter 12 mm)에 5000개의 세포를 시딩한 후 세포 핵, 및 세포 골격 액틴을 염색하여, 심근세포의 얼라인먼트에서의 GelMA 박막 및 유리 (대조군)dml 효과를 비교한 것이다.
도 5는 세포 분화를 나타낸 도이다. 5천개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 글래스 (대조군, diameter 12 mm)에 시딩한 후, 세포 핵, α-sacromeric actin (초기 심근세포 특이적 마커) 및 Troponin I (후기 심근세포 특이적 마커)을 염색하여, c-kit 심장 전구세포의 심근세포로의 분화에 대한 GelMA 박막 및 유리의 효과를 비교한 것이다.
도 2는 GelMA (methacrylated gelatin) 박막을 제조하는 과정 및 GelMA의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. 하이드로겔 네트워크를 제조하기 위하여, TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)가 코팅된 커버슬라이드를 광개시제의 존재 하에서 UV 조사하여 크로스링킹 시켰다.
도 3a는 5만개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 글라스 (diameter 12 mm)에 시딩 한 후 1일 뒤, 액틴 필라멘트와 핵을 염색함으로써, GelMA 박막 및 글라스 (대조군)에서의 c-kit 심장 전구세포의 부착능을 비교한 도이다.
도 3b는 5만개의 세포 시딩 후 1일 뒤, EZ cytox viability test kit 을 이용한 세포 생존율 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3c는 5천개의 세포 시딩 후 7일 뒤, EZ cytox viability test kit를 이용한 세포의 증식 실험을 한 결과이다.
도 4는 세포 얼라인먼트를 비교한 결과이다. GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 유리 (diameter 12 mm)에 5000개의 세포를 시딩한 후 세포 핵, 및 세포 골격 액틴을 염색하여, 심근세포의 얼라인먼트에서의 GelMA 박막 및 유리 (대조군)dml 효과를 비교한 것이다.
도 5는 세포 분화를 나타낸 도이다. 5천개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 글래스 (대조군, diameter 12 mm)에 시딩한 후, 세포 핵, α-sacromeric actin (초기 심근세포 특이적 마커) 및 Troponin I (후기 심근세포 특이적 마커)을 염색하여, c-kit 심장 전구세포의 심근세포로의 분화에 대한 GelMA 박막 및 유리의 효과를 비교한 것이다.
이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.
실시예 1. GelMA의 준비
1.1. 시료
~300의 Bloom Index의, 돼지 피부로부터 수득된 Type A 세포 배양-시험된 젤라틴, MAA (Methacrylic anhydride), TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate), 광개시제, 및 2-hydroxy-4'-(2-hydroxyethoxy)-2-methylpropiophenone는 모두 Sigma-Aldrich로부터 구매하였다. MSCs (Microscope glass coverslides, 직경 12 mm)는 Pual Marienfeld GmbH & Co. KG, Germany사로부터 구매하였다. 사용된 UV 광 원천 (InnoCure 5000)은 LICHTZEN, Korea에서 제작하였다.
1.2. 변형된 젤라틴의 합성 및 특성
GelMA (methacrylated gelatin)는 하기와 같은 방법으로 합성하였다 (도 1).
간략하게, type A 돼지 젤라틴을 50 ℃에서 10% (w/v)로 PBS에 녹이고 완전히 용해될 때까지 교반하였다. 젤라틴내 아미노기를 개시 반응 혼합물에 존재하는 MAA로 변형시켰다. 0.8 ml의 MAA를 50 ℃에서 10 ml의 젤라틴 용액에 첨가하였다. 50 ℃에서 교반 조건하에서 젤라틴 용액으로 0.5mL/min의 속도로 표적 부피에 도달하게 하였으며, 2 시간 동안 반응하도록 하였다. 그 뒤 반응을 종결하기 위하여 따뜻한 (40 ℃)의 PBS로 5배의 희석하였으며, 염 및 메타크릴산을 제거하기 위하여 1주일동안, 12-14kDa 분자량 컷오프 투석 튜브 (dialyses tubing)를 이용하여 증류수에 대하여 투석하였다. 용액을 1주일동안 동결시키고 지방용해 (lypolyzed)하여 백색의 다공성 폼을 제조하였으며, 이후 사용을 위하여 - 80℃에서 저장하였다. 메타크릴화 (methacrylation)의 정도는 종래 기술된 방법을 이용하여 메타크릴레이트 변형된 콜라겐을 정량화 하였다.
1.3. 하이드로겐의 제조
동결 건조된 GelMA 마크로머 (macromere)를 광개시제인 0.5% (w/v) 2-hydroxy-1-(4-(hydroxyethoxy)phenyl)-2-methyl-1-propanone를 포함하는 PBS에 80 ℃에서 혼합하고 용해시켜, UV의 조사를 위한 5% GelMA (w/v) 용액을 제조하였다. 10 ㎕의 프리폴리머 (prepolymer)를 2개의 유리 커버슬라이드 사이에 피펫팅 하고, 240 초 동안, 7.0 mW/cm2 UV light (360-480 nm)에 노출시켰다.
도 2는 GelMA (methacrylated gelatin) 박막을 제조하는 과정 및 GelMA의 SEM 이미지를 나타낸 도이다. 하이드로겔 네트워크를 제조하기 위하여, TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)가 코팅된 커버슬라이드를 광개시제의 존재 하에서 UV 조사하여 크로스링킹 시켰다.
1.4. SEM 이미징
GelMA 박막을 액화질소에서 동결시키고, 2일간 동결건조 한 후 SUPRA25 전자 현미경 (Carl Zeiss, Germany)을 이용하여 10 kV의 가속전압 (accelerated voltage)에서 분석하였다. 샘플을 카본 테이프 (3M, USA)를 이용하여 실리콘 웨이퍼에 부착하였으며, SEM 이미지 분석을 위해 금으로 스퍼터 코팅하였다 (도 2).
실시예 2. 세포 배양
2.1. 세포 동정
심장 줄기/전구 세포를 외과적 시술 후 유아-유래 심장 조직으로부터 분리하였으며, c-kit 항체 (human cardiac-derived c-kit positive progenitor cells; hCPCc-kit+)를 이용하여 분류하였다; 세포를 내피세포, 평활근세포, 및 심근세포로 분화시켰다. hCPCc-kit+는 10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U 인간 에리스로포이에틴 (R&D systems, USA), 5 μg 인간 재조합 basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, USA), 및 0.2 mM 글루타티온 (Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 Ham's F12 media에 37 ℃ 하에서 5% CO2 인큐베이터에서 확장시켰다. hCPCc-kit+ (Passage 5 또는 6)를 세포 부착 및 세포 분화 연구를 위하여 제조하였다.
2.2. 세포 배양을 위한 샘플의 선처리
GelMA 박막을 2시간 동안 PBS에 적신 후, 현미경 커버슬라이드를 UV로 12시간 동안 처리 한 후, 세포배양액 속에 세포 배양 실험 전 2시간 동안 적셔놓았다.
hCPCc-kit+을 심근세포로 분화시키는 것에 대한 GelMA (methacrylated gelatin) 박막의 영향을 특정하기 위하여, 모든 hCPCc-kit+ (Passage 5 또는 6)가 세포 부착 및 세포 분화 실험에 사용되었다. 37 ℃ 하에서 5% CO2 인큐베이터에서, 10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U 인간 에리스로포이에틴 (R&D systems, MN, US), 5 μg 인간 재조합 basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, NJ), 및 0.2 mM 글루타티온 (Sigma-Aldrich, CA)를 포함하는 Ham's F12 media에서 hCPCc-kit+를 현미경 커버슬라이드 (대조군), GelMA 박막에서 배양하였다.
2.3. 세포 부착 실험
10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U human erythropoietin (R&D systems, USA), 5 μg human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, USA), 및 0.2 mM glutathione (Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 Ham's F12 media 중에서, 37 ℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 24 시간 동안, hCPCc-kit+의 5 x 104 세포를 현미경 커버슬라이드 (직경, 12mm) 및 GelMA 박막 (직경 12 mm)에서 배양하였다. 또한, 글라스 또는 GelMA 박막 상의 세포를 4 %의 포름알데히드를 이용하여 고정하였으며, 세포 핵에 대하여 2ml DAPI (30 nmol)를 이용하여, 세포골격 액틴 (cytoskeletal actin)을 위하여 Alexa Fluor 594 phalloidin (0.661M, Invitrogen, USA)를 이용하여 염색하였다. 그 결과를 도 3a에 나타내었다.
도 3a는 5만개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 글라스 (diameter 12 mm)에 시딩 한 후 1일 뒤, 액틴 필라멘트와 핵을 염색함으로써, GelMA 박막 및 글라스 (대조군)에서의 c-kit 심장 전구세포의 부착능력을 비교한 도이다.
도 3a에 나타난 바와 같이 세포 시딩 1일후 c-kit 심장전구세포는 글라스 (대조군)와 GelMA박막위에서 구내지 타원에 가까운 형태(actin, 홍색)로 부착되어 있다. 허나 글라스 (대조군)과 비교할 때 젤라틴 위의 핵 (nuclei, 청색)의 수가 월등이 많다. 이것은 유리표면에 비해 GelMA가 c-kit 심장전구세포의 흡착능력이 높음을 보여주고 있다.
2.4. 세포 생존율 실험
세포 생존율은 EZ-Cytox 세포 생존율 어세이 키트 (iTSBiO, Seoul, Korea)을 이용하여 결정하였다. 세포 시딩 후 하루 뒤, 글라스 및 GelMA 박막 상의 세포를 0.25 % trypsin-EDTA (Welgene, Korea) 로 분리하였으며, 100 μL/well 배지를 최종 부피로 96-well 플레이트에 위치키시고, 10 ㎕의 EZ-Cytox Kit 시약을 표준 배양 조건 하에서 각 웰에 2시간 동안 첨가하였다. 상온 (ambience)에서 로커 (rocker) 상에서 5초간, 96-well 플레이트를 조심스럽게 완전히 교반하였다. 처리 또는 비처리된 샘플의 450 nm에서의 흡광도를 Sunrise multi-well microplate reader (Tecan, Switzerland)로 측정하였다. 빈 웰에 키트 시약과 동일한 부피의 Ham? F12 media를 보충하여 blank로 사용하였다. 세포 생존율을 대조군과 비교하여 퍼센트값으로 나타내었다. 그 결과를 도 3b에 나타내었다.
도 3b는 5만개의 세포 시딩 후 1일 뒤, EZ cytox viability test kit 을 이용한 세포 생존율 실험 결과를 나타낸 도이다.
도 3b에 나타난 바와 같이, GelMA를 기본으로 한 박막 gelatin (GelMA)의 경우 글라스 (대조군) 에 비해 세포 생존율이 높음을 보여주고 있다.
2.5. 세포 증식 실험
세포 생존율 실험과 유사하게, 세포 증식 실험 역시, 현미경 커버슬라이드 (diameter, 12mm) 및 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 상에서 hCPCc-kit+의 5 x 103 세포를 배양한 후, EZ-cytox 세포 생존율 어세이 키트를 이용하여 확인하였다. 세포는 10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U human erythropoietin (R&D systems, USA), 5 μg human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, USA), 및 0.2 mM glutathione (Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 Ham's F12 media에서, 37 ℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 7일간 배양하였다.
그 결과를 도 3c에 나타내었다.
도 3c는 5천개의 세포 시딩 후 7일 뒤, EZ cytox viability test kit를 이용한 세포의 증식 실험을 한 결과이다.
도 3c에 나타난 바와 같이 동일한, 글라스 (대조군), GelMA 박막에서 7일차 세포 증식 실험을 한 결과 GelMA 박막위의 상대적 흡광도가 글라스 보다 월등히 낮음을 보여주고 있다. 즉 세포시딩 후 7일차에 c-kit 심장전구세포의 세포증식이 글라스 (대조군)에 비해 GelMA박막 위에서 낮음을 보여주고 있다.
2.6. 세포 얼라인먼트 (alignment)
10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U human erythropoietin (R&D systems, USA), 5 μg human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, USA), and 0.2 mM glutathione (Sigma-Aldrich, USA)을 포함하는 Ham's F12 media 내에서, 37 ℃에서 5% CO2 인큐베이터 내에서 28일간, 현미경 커버슬라이드 (diameter, 12mm) 및 GelMA 박막 (diameter, 12mm) 상에서 5 x 103 세포의 hCPCc-kit+ 를 배양한 후, 세포 핵에 대하여 2ml DAPI (30 nmol)로, 세포골격 액틴 (cytoskeletal actin)을 위하여 Alexa Fluor 594 phalloidin (0.661M, Invitrogen, USA)를 이용하여 면역형광 염색을 수행하였다 (도 4)
도 4는 세포 얼라인먼트를 비교한 결과이다. GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 유리 (diameter 12 mm)에 5000개의 세포를 시딩한 후 세포 핵, 및 세포 골격 액틴을 염색하여, 심근세포의 얼라인먼트에서의 GelMA 박막 및 유리 (대조군)의 효과를 비교한 것이다.
도 4에 나타난 바와 같이, GelMA위의 심근세포의 경우 spindle-shaped cells의 형태로 ?향성을 가지고 한 방향으로 얼라인먼트가 되어 있음을 보여주고 있다. 그러나 글래스 (대조군)위의 심근세포의 경우 세포의 형태가 무정형이고 방향성 또한 없음을 보여주고 있다. GelMA박막위에서 배양된 c-kit 심장전구세포의 그 모양과 방향성이 심근세포의 그것과 유사하다.
2.7. 세포 분화 실험
37 °C 하에서 5% CO2 인큐베이터내에서 28일간, 10% FBS, 1× penicillin/streptomycin, 2.5 U human erythropoietin (R&D systems, USA), 5 μg human recombinant basic fibroblast growth factor (bFGF, Peprotech, USA), 및 0.2 mM glutathione (Sigma-Aldrich, USA)를 포함하는 Ham's F12 media 내에서, 현미경 커버슬라이드 (diameter, 12mm) 및 GelMA 박막 (diameter, 12mm) 상에서 5 x 103 세포의 hCPCc-kit+를 배양하였다. 배지는 2일마다 교환하였다. 28일 후, 분화된 세포를 초기 및 후기 심근-특이적 마커로서, 블로킹 버퍼 내 α-sarcomeric actin (α-SA, 1:500, Sigma-Aldrich, USA)로 상온(ambient)에서 2시간, 및 블로킹 버퍼 내의 Troponin I (1:200, Santa Cruz, USA)로 4 ℃에서 24시간 면역형광염색하여 분석하였다. 이 샘플을 염소 혈청 중 2차 항체 (1:200 dilution)으로 40분간 처리하였다. PBS로 세척 후, 이 샘플을 상온 (ambient)에서 15분간 PBS 중 DAPI (1:10000)로, 실온에서 40분간 DPBS로 대비염색하였다. 그 결과를 도 5에 나타내었다.
도 5는 세포 분화를 나타낸 도이다. 5천개의 세포를 GelMA 박막 (diameter 12 mm) 및 유리 (diameter 12 mm)에 시딩하고 28일 후, 세포 핵, α-sacromeric actin (초기 심근세포 특이적 마커) 및 Troponin I (후기 심근세포 특이적 마커)을 염색하여, c-kit 심장 전구세포의 심근세포로의 분화에 대한 GelMA 박막 및 유리의 효과를 비교한 것이다.
도 5에 나타난 바와 같이 대조군 위에서 자란 c-kit 심장전구세포의 경우에 Troponin I (후기 심근세포 특이적 마커)가 발현되지 않았다. 허나 GelMA 박막위에서 성장 분화된 c-kit 심장전구세포의 경우 Troponin I가 발현되었음을 보여주고 있다. 또한 α-sacromeric actin (전기 심근세포 특이적 마커)가 발현된 것을 확인하였다. 그러므로 글라스 (대조군)위에서 자란 c-kit 심장전구세포의 경우 α-sacromeric actin과 Troponin I 의 발현을 관찰할 수 없었다. 그러므로 GelMA 박막의 경우 dexamethsone과 같이 분화를 야기하는 화학물질 없이 c-kit 심장전구세포의 초기 또는 후기 심근세포로의 분화를 촉진시킬 수 있음을 보이고 있다.
2.8. 공초점 이미징
세포의 형태는 Olympus FV1000 Confocal Microscope (Olympus, Japan)을 이용하여 시각화하였으며, FV10-ASW software (Olympus, Japan)를 이용하여 분석하였다.
Claims (13)
- 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA)을 단일성분으로 포함하는, 심근세포분화 유도용 배지 조성물로서, 상기 심근세포분화는 심장전구세포로부터 심근세포의 분화를 유도하는 것인, 배지 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 배지는 2차원 또는 3차원 배지인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
- 청구항 1에 있어서, 상기 메타크릴레이트화된 젤라틴은 UV 조사에 의하여 상호 교차결합 (cross-linking)된 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
- 삭제
- 청구항 1에 있어서, 상기 젤라틴은 타입 A 또는 타입 B인 것을 특징으로 하는, 배지 조성물.
- 삭제
- 청구항 1 내지 3 및 5 중 어느 한 항의 배지 조성물에 심장 전구세포를 배양하는 단계를 포함하는, 심장 전구세포로부터 심근세포의 분화 유도 방법.
- 청구항 7에 의하여 분화가 유도된 심근세포를 포함하는 세포 치료제.
- (1) TMSPMA (3-(trimethoxysilyl)propyl methacrylate)가 코팅된 제 1 플레이트 상에 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 및 광개시제를 첨가하는 단계;
(2) 상기 단계 (1)의 제1 플레이트 상에 첨가된 메타크릴레이트화된 젤라틴 (methacrylated gelatin, GelMA) 및 광개시제 위에 제 2 플레이트를 위치시키는 단계;
(3) 상기 단계 (2)의 샌드위치된 플레이트에 UV를 조사하는 단계; 및
(4) 제 2 플레이트를 제거하는 단계를 포함하는, 청구항 1의 심근세포분화 유도용 배지 조성물의 제조 방법. - 청구항 9에 있어서,
(5) 상기 단계 (4)의 제 2 플레이트가 제거된 제 1 플레이트를 동결건조하는 단계를 추가로 포함하는, 심근세포분화 유도용 배지 조성물의 제조 방법. - 청구항 1 내지 3 및 5 중 어느 한 항의 심근세포분화 유도용 배지 조성물을 포함하는, 심근세포분화 유도용 세포 지지체.
- 청구항 1 내지 3 및 5 중 어느 한 항의 심근세포분화 유도용 배지 조성물을 포함하는, 심근세포 분화 유도용 패치.
- 청구항 1 내지 3 및 5 중 어느 한 항의 심근세포분화 유도용 배지 조성물을 포함하는, 심근세포 분화 유도용 플레이트.
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