CN111826351B - 一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇 - Google Patents
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Abstract
本发明公开了一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇,属于生物医药技术领域。通过将红细胞与微米级别的磁性微球结合得到红细胞团簇型仿生材料,红细胞表面修饰了聚凝胺,从而消除了红细胞之间原本存在的静电斥力,进而可实现红细胞在微球表面的紧密满层覆盖。红细胞对微米级别的磁性微球的包裹能够避免白细胞在微球表面的非特异性吸附,同时红细胞团簇表面修饰的叶酸(FA)或可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体可直接靶向CTCs,最终可通过磁性分离的方式去除临床病人血液样本中的白细胞,高效率地获得高纯度的CTCs。
Description
技术领域
本发明属于生物医药技术领域,具体涉及一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇。
背景技术
肿瘤局部或区域的复发和远处转移,对于肿瘤的早期诊断以及肿瘤治愈提出了严峻的考验。近些年分子生物学及临床研究显示,循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)导致了肿瘤的侵袭和微转移过程的发生。CTCs是由原本的肿瘤细胞从原发肿瘤脱落,进入人体的血液***所形成的,CTCs经过外周血的循环、扩散,最终转移到人体的其他组织和器官,进而形成与原发部位肿瘤相同类型的继发肿瘤,即造成了肿瘤和癌症的转移和复发。通过捕获外周血中的循环肿瘤细胞,分析外周血中循环肿瘤细胞数量随时间的变化,可以更早预测肿瘤预后,为癌症用药的治疗反应检测和放化疗疗效分析提供一个简便易行的方法和手段。
由于外周血中的CTCs含量很低,每毫升血液中仅有几个至几十个CTCs,而背景血细胞含量则达到了109量级,对CTCs分离富集检测产生了极大的干扰,因此好的CTCs分离富集要求其具有高灵敏度和高选择性,同时还应能够保持CTCs的活性。目前已经开发了众多CTCs分离富集方法,包括基于物理性质不同(尺寸、密度、介电泳等)的分离方法的方法和修饰抗体的纳米结构特异性靶向CTCs的分离方法。由于CTCs与白细胞的物理性质有一定的重叠,很难从分离的CTCs中有效地去除白细胞,这就造成了只基于一种物理性质的分离方法难以同时获得高效率和高纯度。修饰抗体的纳米结构可以特异性靶向CTCs上的抗原,虽然抗原-抗体的结合具有高特异性,但由于纳米结构存在明显的非特异性吸附,因此也会对实际分离的CTCs纯度造成不良影响。
免疫磁性纳米颗粒是一种很有前景的修饰抗体的纳米结构,其靶向CTCs后可通过简单的磁性分离实现CTCs的高效富集,然而免疫磁性纳米粒子会在白细胞表面发生较强的非特异性吸附作用,极大地影响了CTCs的分离纯度。美国FDA已经批准的商业化CellSearch平台即将免疫磁性纳米颗粒用于CTCs的分离,然而其获得的CTCs中存在较高的白细胞背景,因而纯度较低,仅为0.1%~1.4%。为了尽量避免磁性纳米粒子的非特异性吸附,现有技术研究了包括包裹细胞膜、修饰DNA等仿生设计的方法,但这些都是在纳米尺度下的仿生设计。在现有磁性分离方法中,为了确保CTCs的高效磁性分离,商业化的免疫磁性分离平台已经建立了强磁场***来加速被磁性纳米颗粒靶向的CTCs的运动,比如CellSearch和MACS。另外,还有一种思路则是使用具有强超顺磁性的磁性颗粒,比如微米级的磁性微球。鉴于此,开发一种基于磁性微球的新型免疫磁性平台,尽可能地避免白细胞在磁性微球上的非特异性吸附,从而大大提高捕获的CTCs纯度是本领域亟待解决的技术问题。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题,本发明的目的是提供一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇。通过将红细胞与微米级别的磁性微球结合得到红细胞团簇型仿生材料,红细胞表面修饰了聚凝胺,从而消除了红细胞之间原本存在的静电斥力,进而可实现红细胞在微球表面的紧密满层覆盖。红细胞对微米级别的磁性微球的包裹能够避免白细胞在微球表面的非特异性吸附,同时红细胞团簇表面修饰的叶酸(FA)或可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体可直接靶向CTCs,最终可通过磁性分离的方式去除临床病人血液样本中的白细胞,高效率地获得高纯度的CTCs。
为了实现上述目的,本发明采用如下技术方案:
第一方面,提供一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇,由以下方法制备获得:
(1)、红细胞表面修饰上CTC靶向的叶酸或抗体
第一类:叶酸修饰,将10μL~50μL健康人新鲜红细胞与100μL~1000μL分子量3400~10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-FA的PBS溶液混合均匀,在4℃~25℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞;或者,
第二类:可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体修饰,将10μL~50μL健康人新鲜红细胞与100μL~1000μL分子量3400~10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-biotin的PBS溶液混合均匀,4℃~25℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞;将biotin修饰的红细胞与100μL~1000μL浓度为100μg/mL的SA溶液混合均匀,4℃~25℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰SA的红细胞;最后将SA修饰的红细胞与100μL~1000μL浓度为5μg/mL生物素化的CTCs靶向抗体溶液混合均匀,4℃~25℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰CTCs靶向抗体的红细胞;
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将10μL~50μL表面修饰上FA或CTC靶向的抗体的红细胞与100μL~500μL的浓度为1~100mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合,在4℃~25℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与FA或CTCs靶向抗体的红细胞,将其分散至PBS溶液中备用;
(3)磁性红细胞团簇的制备
将具有表面修饰基团的磁性微球用PBS洗涤三遍,再加入100倍以上微球计数个数的步骤(2)的红细胞,二者混合均匀后在离心机内以300g~600g的离心速度离心1min~30min,使得红细胞与磁性微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近,离心后将其置于4℃~25℃下静置孵育20min~2h,最后将离心管底部的混合物吹散后,用磁力架进行磁力分离,去除含有过量红细胞的上清液后,再用PBS分散清洗磁性红细胞团簇三遍,最后一次的上清液为无色透明,即获得了磁性红细胞团簇。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146中的任意一种。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146中的任意一种。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的DSPE-PEG-FA或者DSPE-PEG-biotin的分子量为5000。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法中步骤(1)-(3)所述修饰反应温度为4℃。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述磁性微球表面的修饰基团为羧基或者氨基。
优选地,上述磁性红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述表面修饰基团的磁性微球直径为5~6μm。
第二方面,提供上述磁性红细胞团簇在制备识别、捕获或富集循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用。
优选地,上述应用中磁性红细胞团簇用于富集CTCs的方法,主要包括以下步骤:1)用红细胞裂解液处理血液样本,以去除血液样本中的红细胞,避免样本中的红细胞对功能化磁性红细胞团簇捕获CTCs的干扰;2)在不含红细胞的血液样本中加入本发明的功能化磁性红细胞团簇,通过一段时间的4℃孵育使红细胞团簇与CTCs发生特异性结合;3)通过磁性分离的方式将步骤2)的样本进行分离,捕获了结合有CTCs的磁性红细胞团簇,即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集;4)将红细胞裂解液配置的浓度为4%的枸橼酸钠溶液加至步骤3)得到的捕获了CTCs的磁性红细胞团簇中,可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程;5)对步骤4)实现CTCs释放的溶液进行第二次磁性分离即可将非特异性吸附的白细胞连同核心磁性微球一同除去,上清液中则保留了CTCs。
优选地,上述应用中磁性红细胞团簇用于富集CTCs的方法,主要包括以下步骤:1)获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本,经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层;2)在淋巴细胞层加入本发明功能化磁性红细胞团簇4℃共孵育开展捕获;3)通过磁性分离的方式将步骤2)的样本进行分离,捕获了CTCs的磁性红细胞团簇,即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集;4)将红细胞裂解液配置的浓度为4%的枸橼酸钠溶液加至步骤3)得到的团簇捕获的CTCs中,可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程;5)对步骤4)实现CTCs释放的溶液进行第二次磁性分离即可将非特异性吸附的白细胞连同核心磁性微球一同除去,上清液中则保留了纯度较高的CTCs;6)对捕获到的细胞进行三荧光染色之后,通过流式定量分析其捕获CTCs数目,激光共聚焦分析其捕获情况。
本发明上述基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇的技术方案的原理如下(见图1):
1、红细胞修饰原理:
为了使磁性红细胞团簇能够靶向CTCs,需要对红细胞表面修饰CTCs靶向的叶酸或抗体,其原理分为以下两类:
第一类是在红细胞表面修饰上可特异性识别和结合CTCs表面叶酸受体(FAacceptor)的叶酸分子(FA)。叶酸的修饰是通过向红细胞膜内嵌入一种功能分子实现的,其一端为疏水性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),DSPE端通过疏水相互作用嵌入疏水性的红细胞膜内部,另一端为即为FA,DSPE与FA之间通过亲水性的聚乙二醇(PEG)相连接即形成了该功能分子DSPE-PEG-FA。
第二类是在红细胞表面修饰上可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体,具体方法为:首先,在红细胞膜表面嵌入功能分子,其一端为疏水性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE),DSPE端通过疏水相互作用嵌入疏水性的红细胞膜内部,另一端为可特异性结合链酶亲和素(streptavidin,简称SA)的生物素(biotin),DSPE与biotin之间通过亲水性的聚乙二醇(PEG)相连接即形成了该功能分子DSPE-PEG-biotin;然后,通过SA与biotin的特异性结合方式,在功能分子DSPE-PEG-biotin基础上继续修饰SA,作为修饰CTCs靶向的抗体的桥联分子;最后,通过SA与biotin的特异性结合方式在SA的基础上修饰生物素化的CTCs靶向的抗体,该抗体可特异性识别和结合CTCs表面的生物标记物。所描述的CTCs靶向的抗体包括但不限于上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146。以上抗体可特异性识别的CTCs表面生物标记物为CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146。
无论是修饰FA所用的DSPE-PEG-FA,还是修饰抗体第一步所用的DSPE-PEG-biotin,二者都选用分子量为5000的分子进行修饰。由于分子量对应的是PEG链段的长度,由此较大分子量的PEG链段修饰到红细胞表面后,PEG链段之间的静电排斥力较大,从而导致红细胞外形由原本的两面凸中央凹的圆饼状扩增成球形。形变后的红细胞刚性增强,可以使得形成的红细胞团簇表面难以形变,从而可以较好地排斥白细胞的吸附作用。
2、磁性红细胞团簇设计原理:
未修饰红细胞(4~8μm)与羧基聚苯乙烯磁性微球(5~6μm)可通过膜蛋白与磁性微球表面羧基或氨基之间的氢键作用发生相互吸附,而由于未修饰的红细胞之间存在静电斥力,因此难以在磁性微球表面形成满满表层吸附状态。通过对未修饰的红细胞表面静电吸附阳离子型聚合物聚凝胺分子,即可极大地减弱红细胞之间的静电斥力,从而实现磁性微球表面红细胞满层吸附。所获得的完整形状的红细胞团簇(13~22μm)可以避免核心磁性微球与白细胞发生非特异性吸附。制备磁性红细胞团簇时,应使用超量的红细胞,以确保羧基聚苯乙烯磁性微球尽可能分散,即可制备得到大量以单个磁性微球为核心的红细胞团簇。因此,通过控制加入的磁性微球量来实现定量制备磁性红细胞团簇。
通过聚凝胺的修饰可以让磁性聚苯乙烯微球表面吸附大量红细胞,那么加入解凝剂枸橼酸钠则可以中和聚凝胺的电荷,从而使聚凝胺失效,进而导致大量红细胞从磁性红细胞团簇上脱落。另外,同时加入红细胞裂解液之后,通过对红细胞的裂解作用,也可以进一步使红细胞从磁性聚苯乙烯微球表面脱落。因此,通过将磁性红细胞团簇加入至红细胞裂解液配置的枸橼酸钠溶液中可以实现团簇表面大部分红细胞的脱落。
3、磁性红细胞团簇富集分离CTCs的原理:
由于磁性红细胞团簇表面修饰了FA或CTCs靶向的抗体,因此可与含CTCs血液样本中的CTCs发生特异性结合,二者结合后即可通过磁性分离的方式将CTCs进行富集。磁性红细胞团簇捕获后的CTCs可以通过加入红细胞裂解液配置的枸橼酸钠溶液,使磁性红细胞团簇表面大部分红细胞脱落,从而使得捕获的CTCs得到释放。原理示意图如图1所示。
磁性红细胞团簇中存在很少一部分存在表面缺陷的团簇,其表面个别红细胞的缺失会导致核心磁性微球部分暴露于白细胞中,由于红细胞表面刚性较强,形变能力较差,而缺陷的位点尺寸较小,因此尺寸较大的白细胞难以在暴露的磁性微球表面发生非特异性吸附,仅有部分尺寸较小的白细胞才可能发生非特异性吸附。
在进行捕获CTCs之后加入红细胞裂解液配置的枸橼酸钠溶液后,CTCs被成功释放。由于非特异性吸附的白细胞直接吸附在核心磁性微球的表面,因此无法因为红细胞的脱落而发生白细胞脱落,因此CTCs被释放的同时非特异性吸附的白细胞无法释放,那么再经过第二次磁性分离即可将非特异性吸附的白细胞连同核心磁性微球一同除去,上清液中则保留了纯度较高的CTCs。原理示意图如图2所示。
本发明的有益效果在于:(1)本发明提供了一种高效高特异性识别捕获循环肿瘤细胞的功能化磁性红细胞团簇,可用于体外对模拟血液样本和临床病人血液样本中微量CTCs进行特异性识别和捕获,从而有望在癌症转移的预警和预防领域发挥重要作用;(2)本发明提供了一种高效高特异性识别捕获循环肿瘤细胞的功能化磁性红细胞团簇,所述功能化磁性红细胞团簇凭借其立体化表面结构,可以实现更牢固更高效地捕获循环肿瘤细胞,捕获效率最高达到了90%以上,并且由于红细胞团簇表面由红细胞组成,因而其能避免白细胞的非特异吸附,不被巨噬细胞吞噬,同时结合团簇解离特异性释放CTCs的实验方法,能在含有大量白细胞的模拟血液样本中实现80%以上的CTCs俘获纯度。
附图说明
图1为磁性红细胞团簇制备及富集CTCs原理图;
图2为磁性红细胞团簇解离进一步富集CTCs原理图;
图3(a)为磁性红细胞团簇明场照片;
图3(b)为用DiI染色的磁性红细胞团簇荧光照片;
图4(a)为实施例1中磁性红细胞团簇在PBS中靶向MCF-7细胞的明场照片;
图4(b)为实施例1中荧光磁性红细胞团簇在PBS中靶向MCF-7细胞的荧光照片;
图5(a)为实施例1中磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率统计;
图5(b)为实施例1中磁性红细胞团簇在白膜层细胞中捕获MCF-7细胞解离释放后MCF-7的纯度;
图6为对比例1中无表面修饰基团的磁性微球与修饰红细胞制备团簇后磁性分离得到的无团簇结果照片;
图7为对比例2中使用表面修饰羧基的5~6μm磁性微球和未修饰聚凝胺的叶酸红细胞制备的残缺磁性红细胞团簇结果照片;
图8(a)为对比例2中残缺磁性红细胞团簇捕获MCF-7细胞的效率统计;
图8(b)为对比例2中残缺磁性红细胞团簇在白膜层细胞中捕获MCF-7细胞解离释放得到的MCF-7细胞纯度统计;
图9为对比例3中磁性红细胞团簇制备过程中孵育温度均为37℃所制备的残缺磁性红细胞团簇结果照片;
图10(a)为对比例3中残缺磁性红细胞团簇捕获MCF-7细胞的效率统计;
图10(b)为对比例3中残缺磁性红细胞团簇在白膜层细胞中捕获MCF-7细胞解离释放得到的MCF-7细胞纯度统计;
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明,而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。【实施例1】使用表面修饰羧基的5~6μm磁性微球制备正常红细胞团簇
红细胞的修饰过程:将30μL健康人新鲜红细胞与100μL分子量5000的DSPE-PEG-FA(1mg/mL)的PBS溶液混合均匀,在4℃下静置孵育30min,用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞。再将表面修饰叶酸的红细胞与10mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合,在4℃下静置孵育30min,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞,将其分散至PBS溶液中备用。
磁性红细胞团簇的制备:将表面修饰羧基的5~6μm磁性微球用PBS洗涤三遍,再加入100倍以上微球计数个数的表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞,二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心3min,使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近,离心后将其置于4℃下静置孵育10min,最后将离心管底部的混合物吹散,在磁力架上对其进行磁性分离,去除溶液后,再加入PBS分散洗涤三遍,最终即可获得磁性红细胞团簇,在光学显微镜下拍摄的明场照片如图3(a)所示。
荧光磁性红细胞团簇的制备过程:先将30μL的健康人新鲜红细胞与1000μL的DiI(10μg/mL)的PBS溶液混合均匀,在37℃下静置孵育60min,用PBS离心洗涤三次即获得被DiI染色的红细胞,再将这一红细胞按照前面描述的步骤制备获得DiI染色的磁性红细胞团簇,在荧光显微镜下拍摄的荧光照片如图3(b)所示。【实施例2】磁性红细胞团簇或荧光磁性红细胞团簇捕获MCF-7细胞
1、磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞:取50μL的磁性红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL),加入10uL的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL),混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min,将孵育后离心管底部的混合物吹散,在光学显微镜下拍摄的明场照片如图4(a)所示。
2、荧光磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞:取50μL的荧光磁性红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL),加入用FDA预染色的10uL的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL),混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min,将孵育后离心管底部的混合物吹散,在荧光显微镜下拍摄的荧光照片如图4(b)所示。
3、磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估:总共进行三组实验,每组包含五个样品,每个样品均加入50μL的磁性红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL),每组五个样品分别加入10uL、20uL、30uL、40uL、50uL的预先用FDA染色的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL),即相当于加入了5000、10000、15000、20000、25000个MCF-7细胞,每组的样品混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min。孵育结束后,每个样品加入200μL的PBS溶液并吹悬均匀,取样滴在载玻片上,在荧光显微镜下观察,直接数出被磁性红细胞团簇靶向的MCF-7细胞与游离的MCF-7细胞之间的数量比值,即可换算得到磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近90%,结果如图5(a)所示。
4、磁性红细胞团簇在白膜层中捕获释放的MCF-7细胞纯度评估:总共进行三组实验,每组包含五个样品,每个样品均加入1000μL的磁性红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL)以及100μL的预先用FDA染色的白膜层细胞悬浮液(密度为2×106个/mL),每组五个样品分别加入10uL、20uL、30uL、40uL、50uL的预先用Hoechst染色的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL),即相当于加入了5000、10000、15000、20000、25000个MCF-7细胞,每组的样品混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min。孵育结束后,将离心管底部的混合物吹散,在磁力架上进行磁性分离后,去除上清液中游离状态的白细胞,再加入PBS分散洗涤两遍。最后加入1mL红细胞裂解液配置的浓度为4%的枸橼酸钠解凝剂,在室温下放置10min后,在磁力架上进行第二次磁性分离,收集上清液中的细胞,取样后在荧光显微镜下观察,直接数出其中Hoechst染色的MCF-7细胞数与FDA染色的白细胞数之间的比值,即可换算得到捕获释放后的MCF-7细胞纯度,整体结果接近80%以上,如图5(b)所示。红细胞裂解液从solarbio公司购买。
【对比例1】使用表面无修饰基团的5~6μm磁性微球制备的磁性红细胞团簇。
制备过程除了所用的磁性微球为表面无修饰基团以外,其他实验条件与实施例1完全相同,最终并未获得红细胞团簇,修饰红细胞无法吸附在无修饰基团的聚苯乙烯微球表面,通过磁力分离去除游离的红细胞后,只能得到单纯的磁性微球,如图6所示。
【对比例2】使用表面修饰羧基的5~6μm磁性微球和未修饰聚凝胺的叶酸红细胞制备的残缺磁性红细胞团簇
残缺磁性红细胞团簇的制备过程除了所用的叶酸红细胞未在表面修饰聚凝胺以外,其他实验条件与实施例1完全相同,最终获得的基本都是残缺磁性红细胞团簇。即核心微球表面仅仅吸附了很少量的红细胞,明显存在裸露的微球表面。除了残缺的红细胞团簇以外,还存在未吸附红细胞的完全裸露聚苯乙烯微球。具体如图7所示。
残缺磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估:实验过程与实施例2完全相同,最终获得的残缺磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近60%,结果如图8(a)所示。
残缺磁性红细胞团簇在白膜层中捕获释放MCF-7细胞的纯度评估。实验过程与实施例2完全相同,最终获得的残缺磁性红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度低于10%,结果如图8(b)所示。
【对比例3】磁性红细胞团簇制备过程中孵育温度均为37℃所制备的残缺磁性红细胞团簇
残缺磁性红细胞团簇的制备过程除了所用的孵育温度均为37℃以外,其他实验条件与实施例1完全相同,最终获得的也都是残缺磁性红细胞团。即核心微球表面仅仅吸附了很少量的红细胞,明显存在裸露的微球表面。除了残缺的红细胞团簇以外,还存在未吸附红细胞的完全裸露聚苯乙烯微球。具体如图9所示。
残缺磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估。实验过程与实施例2完全相同,最终获得的残缺磁性红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近70%,结果如图10(a)所示。
残缺磁性红细胞团簇在白膜层中捕获释放MCF-7细胞的纯度评估。实验过程与实施例2完全相同,最终获得的残缺磁性红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度低于10%,结果如图10(b)所示。
Claims (9)
1. 一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇,其特征在于,由以下方法制备获得:
(1)、红细胞表面修饰上CTC靶向的叶酸或抗体
第一类:叶酸修饰,将10μL~50μL健康人新鲜红细胞与100μL~1000μL分子量3400~10000的浓度为1mg/mL 的DSPE-PEG-FA的 PBS溶液混合均匀,在4℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞;或者,
第二类:可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体修饰,将10μL ~50μL健康人新鲜红细胞与100μL~1000μL分子量3400~10000的浓度为1mg/mL 的DSPE-PEG-biotin的PBS溶液混合均匀,4℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞;将biotin修饰的红细胞与100μL~1000μL 浓度为100μg/mL的SA溶液混合均匀,4℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰SA的红细胞;最后将SA修饰的红细胞与100μL~1000μL 浓度为5μg/mL生物素化的CTCs靶向抗体溶液混合均匀,4℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰CTCs靶向抗体的红细胞;
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将10μL~50μL表面修饰上FA或CTC靶向的抗体的红细胞与100μL~500μL 的浓度为1~100mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合,在4℃下静置孵育30min~2h,用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与FA或CTCs靶向抗体的红细胞,将其分散至PBS溶液中备用;
(3)磁性红细胞团簇的制备
将具有表面修饰基团的磁性微球用PBS洗涤三遍,再加入100倍以上微球计数个数的步骤(2)的红细胞,二者混合均匀后在离心机内以300g~600g的离心速度离心1min~30min,使得红细胞与磁性微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近,离心后将其置于4℃下静置孵育20min~2h,最后将离心管底部的混合物吹散后,用磁力架进行磁力分离,去除含有过量红细胞的上清液后,再用PBS分散清洗磁性红细胞团簇三遍,最后一次的上清液为无色透明,即获得了磁性红细胞团簇。
2.根据权利要求1所述的磁性红细胞团簇,其特征在于,所述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的磁性红细胞团簇,其特征在于,所述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的磁性红细胞团簇,其特征在于,所述磁性红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的DSPE-PEG-FA或者DSPE-PEG-biotin的分子量为5000。
5.根据权利要求1所述的磁性红细胞团簇,其特征在于,所述磁性红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述磁性微球表面的修饰基团为羧基或者氨基。
6.根据权利要求1所述的磁性红细胞团簇,其特征在于,所述磁性红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述表面修饰基团的磁性微球直径为5~6μm。
7.权利要求1-6任一项所述的磁性红细胞团簇在制备识别、捕获或富集循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用。
8. 根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用中磁性红细胞团簇用于富集CTCs的方法,主要包括以下步骤:1)用红细胞裂解液处理血液样本,以去除血液样本中的红细胞,避免样本中的红细胞对磁性红细胞团簇捕获CTCs的干扰;2)在不含红细胞的血液样本中加入权利要求1-6任一项所述的磁性红细胞团簇,通过一段时间的4℃孵育使红细胞团簇与CTCs发生特异性结合;3) 通过磁性分离的方式将步骤2)的样本进行分离,捕获了结合有CTCs的磁性红细胞团簇,即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集;4)将红细胞裂解液配置的浓度为4%的枸橼酸钠溶液加至步骤3)得到的捕获了CTCs的磁性红细胞团簇中,可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程;5)对步骤4)实现CTCs释放的溶液进行第二次磁性分离即可将非特异性吸附的白细胞连同核心磁性微球一同除去,上清液中则保留了CTCs。
9.根据权利要求7所述的应用,其特征在于,所述应用中磁性红细胞团簇用于富集CTCs的方法,主要包括以下步骤:1)获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本,经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层;2)在淋巴细胞层加入权利要求1-6任一项所述的磁性红细胞团簇4℃共孵育开展捕获;3)通过磁性分离的方式将步骤2)的样本进行分离,捕获了CTCs的磁性红细胞团簇,即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集;4)将红细胞裂解液配置的浓度为4%的枸橼酸钠溶液加至步骤3)得到的团簇捕获的CTCs中,可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程;5)对步骤4)实现CTCs释放的溶液进行第二次磁性分离即可将非特异性吸附的白细胞连同核心磁性微球一同除去,上清液中则保留了纯度较高的CTCs;6)对捕获到的细胞进行三荧光染色之后,通过流式定量分析其捕获CTCs数目,激光共聚焦分析其捕获情况。
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