CN111826349B - 一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇 - Google Patents

一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇 Download PDF

Info

Publication number
CN111826349B
CN111826349B CN202010867920.9A CN202010867920A CN111826349B CN 111826349 B CN111826349 B CN 111826349B CN 202010867920 A CN202010867920 A CN 202010867920A CN 111826349 B CN111826349 B CN 111826349B
Authority
CN
China
Prior art keywords
red blood
ctcs
antibody
clusters
erythrocyte
Prior art date
Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
Active
Application number
CN202010867920.9A
Other languages
English (en)
Other versions
CN111826349A (zh
Inventor
刘威
彭伟
Current Assignee (The listed assignees may be inaccurate. Google has not performed a legal analysis and makes no representation or warranty as to the accuracy of the list.)
Shenzhen Research Institute of Wuhan University
Original Assignee
Shenzhen Research Institute of Wuhan University
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by Shenzhen Research Institute of Wuhan University filed Critical Shenzhen Research Institute of Wuhan University
Publication of CN111826349A publication Critical patent/CN111826349A/zh
Application granted granted Critical
Publication of CN111826349B publication Critical patent/CN111826349B/zh
Active legal-status Critical Current
Anticipated expiration legal-status Critical

Links

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
    • C12N—MICROORGANISMS OR ENZYMES; COMPOSITIONS THEREOF; PROPAGATING, PRESERVING, OR MAINTAINING MICROORGANISMS; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING; CULTURE MEDIA
    • C12N5/00—Undifferentiated human, animal or plant cells, e.g. cell lines; Tissues; Cultivation or maintenance thereof; Culture media therefor
    • C12N5/06—Animal cells or tissues; Human cells or tissues
    • C12N5/0602—Vertebrate cells
    • C12N5/0634—Cells from the blood or the immune system
    • C12N5/0641—Erythrocytes
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/569—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor for microorganisms, e.g. protozoa, bacteria, viruses
    • G01N33/56966—Animal cells

Landscapes

  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • Zoology (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Wood Science & Technology (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Virology (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Engineering & Computer Science (AREA)
  • Tropical Medicine & Parasitology (AREA)
  • Micro-Organisms Or Cultivation Processes Thereof (AREA)
  • Investigating Or Analysing Biological Materials (AREA)

Abstract

本发明公开了一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇，属于生物医药技术领域。通过设计一个微米级别的靶向CTCs仿生材料，即将红细胞与微米球结合得到红细胞团簇型仿生材料，红细胞表面修饰了聚凝胺，从而消除了红细胞之间原本存在的静电斥力，进而可实现红细胞在微球表面的紧密满层覆盖。红细胞对微米球的包裹能够避免白细胞在微球表面的非特异性吸附，同时红细胞团簇表面修饰的叶酸(FA)或可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体可直接靶向CTCs，实现对CTCs尺寸的增加，从而最终可通过过滤的方式去除临床病人血液样本中的白细胞，高效率地获得高纯度的CTCs。

Description

一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，主要涉及一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇。
背景技术
肿瘤局部或区域的复发和远处转移,对于肿瘤的早期诊断以及肿瘤治愈提出了严峻的考验。近些年分子生物学及临床研究显示，循环肿瘤细胞(circulating tumor cells,CTCs)导致了肿瘤的侵袭和微转移过程的发生。CTCs是由原本的肿瘤细胞从原发肿瘤脱落，进入人体的血液***所形成的，CTCs经过外周血的循环、扩散，最终转移到人体的其他组织和器官，进而形成与原发部位肿瘤相同类型的继发肿瘤，即造成了肿瘤和癌症的转移和复发。通过捕获外周血中的循环肿瘤细胞，分析外周血中循环肿瘤细胞数量随时间的变化，可以更早预测肿瘤预后，为癌症用药的治疗反应检测和放化疗疗效分析提供一个简便易行的方法和手段。
由于外周血中的CTCs含量很低，每毫升血液中仅有几个至几十个CTCs，而背景血细胞含量则达到了109量级，对CTCs分离富集检测产生了极大的干扰，因此好的CTCs分离富集要求其具有高灵敏度和高选择性，同时还应能够保持CTCs的活性。目前已经开发了众多CTCs分离富集方法，其中一类重要的分离方法是基于CTCs与血细胞的物理性质不同的分选方法。红细胞(4～8μm)、白细胞(6～19μm)以及CTCs(13～22μm)在尺寸上存在明显的区别，基于三者之间的尺寸差异可以过滤获得CTCs。然而，由于白细胞与CTCs的尺寸存在重叠，因此难以通过简单的过滤法在保证高效率获得CTCs同时又保证CTCs的高纯度。为了解决这一矛盾的常见的做法是，通过表面修饰抗体的免疫微球对CTCs的靶向作用，实现对CTCs尺寸的扩大，从而与WBCs的尺寸范围错开，那么即可高效率高纯度地过滤获得CTCs。
在实际操作中，免疫微球与白细胞之间存在一定程度的非特异性吸附，即会对分离的CTCs纯度造成不利影响。为降低材料与白细胞之间的非特异性吸附作用，常见思路是对材料表面进行仿生设计，比如在纳米材料表面包裹上单层厚度为9nm的细胞膜，或者修饰上DNA分子，仿生设计后的纳米材料对白细胞的非特异性吸附作用大大降低。但这些都是在纳米尺度下的仿生设计，还无法拉大白细胞与CTCs的尺寸的差异，由此导致过滤获得CTCs的纯度有待提高。
发明内容
为了解决现有技术中存在的问题，本发明的目的是提供一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇。通过设计一个微米级别的靶向CTCs仿生材料，即将红细胞与微米球结合得到红细胞团簇型仿生材料，红细胞表面修饰了聚凝胺，从而消除了红细胞之间原本存在的静电斥力，进而可实现红细胞在微球表面的紧密满层覆盖。红细胞对微米球的包裹能够避免白细胞在微球表面的非特异性吸附，同时红细胞团簇表面修饰的叶酸(FA)或可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体可直接靶向CTCs，实现对CTCs尺寸的增加，从而最终可通过过滤的方式去除白细胞，高效率地获得高纯度的CTCs。
为了实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
第一方面，提供一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇，由以下方法制备获得：
(1)红细胞表面修饰上CTC靶向的叶酸或抗体
第一类：叶酸修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-FA的PBS溶液混合均匀，在4℃～25℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞；或者，
第二类：可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-biotin的PBS溶液混合均匀，4℃～25℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞；将biotin修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为100ug/mL的SA溶液混合均匀，4℃～25℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰SA的红细胞；最后将SA修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为5ug/mL的生物素化的CTCs靶向抗体溶液混合均匀，4℃～25℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰CTCs靶向抗体的红细胞；
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将10μL～50μL表面修饰上FA或CTC靶向的抗体的红细胞与100μL～500μL的浓度为1～100mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合，在4℃～25℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与FA或CTCs靶向抗体的红细胞，将其分散至PBS溶液中备用；
(3)红细胞团簇的制备
将具有表面修饰基团的微球用PBS洗涤三遍，再加入100倍以上微球计数个数的步骤(2)的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以300g～600g的离心速度离心1min～30min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃～25℃下静置孵育20min～2h，最后将离心管底部的混合物吹散后，用孔径为10μm的生物相容性微孔膜过滤悬液；过量的游离红细胞、未形成红细胞团簇的微球和小于10μm的缺陷红细胞团簇可以通过过滤去除；最后从膜上收集到尺寸超过10μm的红细胞团簇。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146中的任意一种。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146中的任意一种。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的DSPE-PEG-FA或者DSPE-PEG-biotin的分子量为5000。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法中步骤(1)-(3)所述修饰反应温度为4℃。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述微球表面的修饰基团为羧基或者氨基。
优选地，上述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述表面修饰基团的微球直径为5～6μm。
第二方面，提供上述红细胞团簇在制备识别、捕获或富集循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用。
优选地，上述应用中红细胞团簇用于富集CTCs的方法，主要包括以下步骤：1)用红细胞裂解液处理血液样本，以去除血液样本中的红细胞，避免样本中的红细胞对功能化红细胞团簇捕获CTCs的干扰；2)在不含红细胞的血液样本中加入本发明功能化红细胞团簇，通过一段时间的4℃孵育使红细胞团簇与CTCs发生特异性结合；3)通过20μm多孔滤膜过滤的方式将步骤2)的样本进行分离，即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集；4)将红细胞裂解液配置的浓度为4％的枸橼酸钠溶液加入至步骤3)过滤得到的捕获了CTCs的红细胞团簇中，可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程。
优选地，上述应用中红细胞团簇用于富集CTCs的方法，主要包括以下步骤：1)获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本，经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层；2)在淋巴细胞层加入本发明功能化红细胞团簇4℃共孵育开展捕获；3)通过20μm多孔滤膜过滤的方式将步骤2)的样本进行分离，即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集；4)将红细胞裂解液配置的浓度为4％的枸橼酸钠溶液加至步骤3)过滤得到的捕获了CTCs的红细胞团簇中，可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程；5)对捕获到的细胞进行三荧光染色之后，通过流式定量分析其捕获CTCs数目，激光共聚焦分析其捕获情况。
本发明上述基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇的技术方案的原理如下(见图1)：
1、红细胞修饰原理：
为了使红细胞团簇能够靶向CTCs，需要对红细胞表面修饰CTCs靶向的叶酸或抗体，其原理分为以下两类：
第一类是在红细胞表面修饰上可特异性识别和结合CTCs表面叶酸受体(FAacceptor)的叶酸分子(FA)。叶酸的修饰是通过向红细胞膜内嵌入一种功能分子实现的，其一端为疏水性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，DSPE端通过疏水相互作用嵌入疏水性的红细胞膜内部，另一端为即为FA，DSPE与FA之间通过亲水性的聚乙二醇(PEG)相连接即形成了该功能分子DSPE-PEG-FA。
第二类是在红细胞表面修饰上可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体，具体方法为：首先，在红细胞膜表面嵌入功能分子，其一端为疏水性的二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(DSPE)，DSPE端通过疏水相互作用嵌入疏水性的红细胞膜内部，另一端为可特异性结合链酶亲和素(streptavidin，简称SA)的生物素(biotin)，DSPE与biotin之间通过亲水性的聚乙二醇(PEG)相连接即形成了该功能分子DSPE-PEG-biotin；然后，通过SA与biotin的特异性结合方式，在功能分子DSPE-PEG-biotin基础上继续修饰SA，作为修饰CTCs靶向的抗体的桥联分子；最后，通过SA与biotin的特异性结合方式在SA的基础上修饰生物素化的CTCs靶向的抗体，该抗体可特异性识别和结合CTCs表面的生物标记物。所描述的CTCs靶向的抗体包括但不限于上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146。以上抗体可特异性识别的CTCs表面生物标记物为CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146。
无论是修饰FA所用的DSPE-PEG-FA，还是修饰抗体第一步所用的DSPE-PEG-biotin，二者都选用分子量为5000的分子进行修饰。由于分子量对应的是PEG链段的长度，由此较大分子量的PEG链段修饰到红细胞表面后，PEG链段之间的静电排斥力较大，从而导致红细胞外形由原本的两面凸中央凹的圆饼状扩增成球形。形变后的红细胞刚性增强，可以使得形成的红细胞团簇表面难以形变，从而可以较好地排斥白细胞的吸附作用。
2、红细胞团簇设计原理：
未修饰红细胞(4～8μm)与羧基聚苯乙烯微球(5～6μm)可通过膜蛋白与微球表面羧基或氨基之间的氢键作用发生相互吸附，而由于未修饰的红细胞之间存在静电斥力，因此难以在微球表面形成满满表层吸附状态。通过对未修饰的红细胞表面静电吸附阳离子型聚合物聚凝胺分子，即可大大减弱红细胞之间的静电斥力，从而实现微球表面红细胞满层吸附。所获得的完整形状的红细胞团簇(13～22μm)可以避免核心微球与白细胞发生非特异性吸附。制备红细胞团簇时，应使用超量的红细胞，以确保羧基聚苯乙烯微球尽可能分散，即可制备得到大量以单个微球为核心的红细胞团簇。因此，通过控制加入的微球量来实现定量制备红细胞团簇。
通过聚凝胺的修饰可以让聚苯乙烯微球表面吸附大量红细胞，那么加入解凝剂枸橼酸钠则可以中和聚凝胺的电荷，从而使聚凝胺失效，进而导致大量红细胞从红细胞团簇上脱落。另外，同时加入红细胞裂解液之后，通过对红细胞的裂解作用，也可以进一步使红细胞从聚苯乙烯微球表面脱落。因此，通过将红细胞团簇加入至红细胞裂解液配置的枸橼酸钠溶液中可以实现团簇表面大部分红细胞的脱落。
3、红细胞团簇富集分离CTCs的原理：
由于红细胞团簇(13～22μm)表面修饰了FA或CTCs靶向的抗体，因此可与含CTCs血液样本中的CTCs(13～22μm)发生特异性结合，二者结合后的整体尺寸大于20μm(如图3所示)，该尺寸范围已经超过了白细胞的尺寸范围(6～19μm)。
红细胞团簇中存在很少一部分存在表面缺陷的团簇，其表面个别红细胞的缺失会导致核心微球部分暴露于白细胞中，由于红细胞表面刚性较强，形变能力较差，而缺陷的位点尺寸较小，因此尺寸较大的白细胞难以在暴露的微球表面发生非特异性吸附，尺寸较小的白细胞发生非特异性吸附后，对缺陷型红细胞团簇的整体尺寸影响不大，均小于20μm(如图4所示)。
因此，通过20μm多孔过滤膜的过滤，可以将靶向CTCs后的混合样本中过量的红细胞团簇、游离的白细胞以及非特异性吸附白细胞的缺陷型红细胞团簇一并过滤除去，如图5所示。将红细胞裂解液配置的浓度为4％的枸橼酸钠溶液加入至过滤得到的团簇捕获的CTCs中，可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程。红细胞裂解液从solarbio公司购买。
本发明的有益效果在于：(1)本发明提供了一种高效高特异性识别捕获循环肿瘤细胞的功能化红细胞团簇，可用于体外对模拟血液样本和临床病人血液样本中微量CTCs进行特异性识别和捕获，从而有望在癌症转移的预警和预防领域发挥重要作用；(2)本发明提供了一种高效高特异性识别捕获循环肿瘤细胞的功能化红细胞团簇，所述功能化红细胞团簇凭借其立体化表面结构，可以实现更牢固更高效地捕获循环肿瘤细胞，捕获效率最高达到了90％以上，并且由于红细胞团簇表面由红细胞组成，因而其能避免白细胞的非特异吸附，不被巨噬细胞吞噬，同时结合尺寸过滤的实验方法，能在含有大量白细胞的模拟血液样本或者临床病人血液样本中，实现80％以上的CTCs俘获纯度。
附图说明
图1为尺寸过滤方法原理图；
图2(a)为修饰了FA和聚凝胺的红细胞与5-6μm羧基聚苯乙烯微球形成的红细胞团簇的明场照片；
图2(b)为用DiI染色的红细胞团簇荧光照片；
图3(a)为红细胞团簇在PBS中靶向MCF-7后的明场照片；
图3(b)为荧光红细胞团簇在PBS中靶向MCF-7后的荧光照片；
图4为缺陷型红细胞团簇非特异性吸附白细胞后的尺寸示意图；
图5为过滤除去非特异性吸附白细胞的原理图；
图6(a)为红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7的效率统计；
图6(b)为红细胞团簇在白膜层细胞中捕获MCF-7的纯度统计；
图7为对比例2使用表面修饰羧基的5～6μm聚苯乙烯微球和未修饰聚凝胺的叶酸红细胞制备的残缺红细胞团簇结果照片；
图8(a)为对比例2的红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7的效率统计；
图8(b)为在模拟血液样本中捕获MCF-7的纯度统计；
图9为对比例3中红细胞团簇制备过程中孵育温度均为37℃所制备的残缺红细胞团簇结果照片；
图10(a)为对比例3的红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7的效率统计；
图10(b)在模拟血液样本中捕获MCF-7的纯度统计。
具体实施方式
通过以下详细说明结合附图可以进一步理解本发明的特点和优点。所提供的实施例仅是对本发明方法的说明，而不以任何方式限制本发明揭示的其余内容。
【实施例1】使用表面修饰羧基的5～6μm聚苯乙烯微球制备正常红细胞团簇
红细胞的修饰过程：将30μL健康人新鲜红细胞与100μL分子量5000的DSPE-PEG-FA(1mg/mL)的PBS溶液混合均匀，在4℃下静置孵育30min，用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞。再将表面修饰叶酸的红细胞与浓度为10mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合，在4℃下静置孵育30min，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞，将其分散至PBS溶液中备用。
红细胞团簇的制备：将表面修饰羧基的5～6μm聚苯乙烯微球用PBS洗涤三遍，再加入100倍以上微球计数个数的表面修饰聚凝胺与叶酸的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以400g的离心速度离心3min，使得红细胞与聚苯乙烯微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育10min，最后将离心管底部的混合物吹散，通过10μm孔径的PDMS多孔滤膜过滤，将过量的红细胞、严重残缺的红细胞团簇过滤去除，即可获得花型红细胞团簇，在光学显微镜下拍摄的明场照片如图2(a)所示。
荧光红细胞团簇的制备过程：先将30μL的健康人新鲜红细胞与1000μL的DiI(10μg/mL)的PBS溶液混合均匀，在37℃下静置孵育60min，用PBS离心洗涤三次即获得被DiI染色的红细胞，再将这一红细胞按照前面描述的步骤制备获得DiI染色的红细胞团簇，在荧光显微镜下拍摄的荧光照片如图2(b)所示。
【实施例2】红细胞团簇或荧光红细胞团簇捕获MCF-7细胞
1、红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞：取50μL的红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL)，加入10uL的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL)，混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min，将孵育后离心管底部的混合物吹散，通过20μm孔径的PDMS多孔滤膜过滤，将过量的红细胞团簇过滤去除，即可以得到由红细胞团簇捕获的MCF-7细胞，在光学显微镜下拍摄的明场照片如图3(a)所示。
2、荧光红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞：取50μL的实施例1制备的荧光红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL)，加入用FDA预染色的10μL的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL)，混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min，将孵育后离心管底部的混合物吹散，通过20μm孔径的多孔滤膜过滤，将过量的红细胞团簇过滤去除，即可以得到由荧光红细胞团簇捕获的荧光MCF-7细胞，在荧光显微镜下拍摄的荧光照片如图3(b)所示。
3、红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估：总共进行三组实验，每组包含五个样品，每个样品均加入50μL的红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL)，每组五个样品分别加入10uL、20uL、30uL、40uL、50uL的预先用FDA染色的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL)，即相当于加入了5000、10000、15000、20000、25000个MCF-7细胞，每组的样品混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min。孵育结束后，每个样品加入200μL的PBS溶液并吹悬均匀，取样滴在载玻片上，在荧光显微镜下观察，直接数出被红细胞团簇靶向的MCF-7细胞与游离的MCF-7细胞之间的数量比值，即可换算得到红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近90％，结果如图6(a)所示。
4、红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度评估：总共进行三组实验，每组包含五个样品，每个样品均加入1000μL的红细胞团簇悬浮液(密度为1.2×107个/mL)以及100μL的预先用FDA染色的白膜层细胞悬浮液(密度为2×106个/mL)，每组五个样品分别加入10uL、20uL、30uL、40uL、50uL的预先用Hoechst染色的MCF-7细胞悬液(密度为5×105个/mL)，即相当于加入了5000、10000、15000、20000、25000个MCF-7细胞，每组的样品混合均匀后将其置于4℃下静置孵育120min。孵育结束后，将离心管底部的混合物吹散，通过20μm孔径的多孔滤膜过滤，将过量的红细胞团簇、游离的白细胞以及非特异性吸附了白细胞的缺陷型红细胞团簇过滤去除，将过滤膜直接放在荧光显微镜下观察，直接数出滤膜表面Hoechst染色的MCF-7细胞数与FDA染色的白细胞数之间的比值，即可换算得到红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度，整体结果接近80％以上，如图6(b)所示。
【对比例1】使用表面无修饰基团的5～6μm聚苯乙烯微球制备红细胞团簇
制备过程除了所用的聚苯乙烯微球为表面无修饰基团以外，其他实验条件与实施例1完全相同，最终并未获得红细胞团簇，修饰红细胞无法吸附在无修饰基团的聚苯乙烯微球表面，因此10μm膜过滤后无法获得红细胞团簇。
【对比例2】使用表面修饰羧基的5～6μm聚苯乙烯微球和未修饰聚凝胺的叶酸红细胞制备的残缺红细胞团簇
残缺红细胞团簇的制备过程除了所用的叶酸红细胞未在表面修饰聚凝胺以外，其他实验条件与实施例1完全相同，最终获得的基本都是残缺红细胞团簇，即核心微球表面仅仅吸附了很少量的红细胞，明显存在裸露的微球表面。除了残缺的红细胞团簇以外，还存在未吸附红细胞的完全裸露聚苯乙烯微球。具体如图7所示。
残缺红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估：实验过程与实施例2完全相同，最终获得的残缺红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近80％，结果如图8(a)所示。
残缺红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度评估：实验过程与实施例2完全相同，最终获得的残缺红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度低于10％，结果如图8(b)所示。
【对比例3】红细胞团簇制备过程中孵育温度均为37℃所制备的残缺红细胞团簇
红细胞团簇的制备过程除了所用的孵育温度均为37℃以外，其他实验条件与实施例1完全相同，最终获得的基本都是残缺红细胞团簇。即核心微球表面仅仅吸附了很少量的红细胞，明显存在裸露的微球表面。除了残缺的红细胞团簇以外，还存在未吸附红细胞的完全裸露聚苯乙烯微球。具体如图9所示。
残缺红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率评估。实验过程与实施例2完全相同，最终获得的残缺红细胞团簇在PBS中捕获MCF-7细胞的效率接近70％，结果如图10(a)所示。
残缺红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度评估。实验过程与实施例2完全相同，最终获得的残缺红细胞团簇在白膜层中捕获MCF-7细胞的纯度低于10％，结果如图10(b)所示。

Claims (9)

1.一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇，其特征在于，由以下方法制备获得：
(1)红细胞表面修饰上CTC靶向的叶酸或抗体
第一类：叶酸修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-FA的PBS溶液混合均匀，在4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即可获得叶酸修饰的红细胞；或者，
第二类：可特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体修饰，将10μL～50μL健康人新鲜红细胞与100μL～1000μL分子量3400～10000的浓度为1mg/mL的DSPE-PEG-biotin的PBS溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰biotin的红细胞；将biotin修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为100ug/mL的SA溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰SA的红细胞；最后将SA修饰的红细胞与100μL～1000μL浓度为5ug/mL的生物素化的CTCs靶向抗体溶液混合均匀，4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰CTCs靶向抗体的红细胞；
(2)红细胞表面聚凝胺的修饰
将10μL～50μL表面修饰上FA或CTC靶向的抗体的红细胞与100μL～500μL的浓度为1～100mg/mL的聚凝胺PBS溶液混合，在4℃下静置孵育30min～2h，用PBS离心洗涤三次即获得表面修饰聚凝胺与FA或CTCs靶向抗体的红细胞，将其分散至PBS溶液中备用；
(3)红细胞团簇的制备
将具有表面修饰基团的微球用PBS洗涤三遍，再加入100倍以上微球计数个数的步骤(2)的红细胞，二者混合均匀后在离心机内以300g～600g的离心速度离心1min～30min，使得红细胞与微球离心至离心管底部以保证二者之间相互贴近，离心后将其置于4℃下静置孵育20min～2h，最后将离心管底部的混合物吹散后，用孔径为10μm的生物相容性微孔膜过滤悬液；过量的游离红细胞、未形成红细胞团簇的微球和小于10μm的缺陷红细胞团簇可以通过过滤去除；最后从膜上收集到尺寸超过10μm的红细胞团簇。
2.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的CTCs的表面生物标记物为上皮标记物细胞角蛋白、上皮细胞粘附分子、肿瘤胚胎抗原、人类表皮生长因子受体2、静脉内皮细胞分子、附膜蛋白、唾液酸化的路易斯寡糖-X、乙醛脱氢酶1、波形蛋白、尿激酶受体、乙酰肝素酶、***特异性膜抗原、CD44、CK18、CD133、CD90、CD45或CD146中的任意一种。
3.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的特异性识别和结合CTCs表面生物标记物的抗体包括上皮标记物细胞角蛋白抗体、上皮细胞粘附分子抗体、肿瘤胚胎抗体、人类表皮生长因子受体2抗体、静脉内皮细胞分子抗体、附膜蛋白抗体、唾液酸化的路易斯寡糖-X抗体、乙醛脱氢酶1抗体、波形蛋白抗体、尿激酶受体抗体、乙酰肝素酶抗体、***特异性膜抗体、anti-CD44、anti-CK18、anti-CD133、anti-CD90、anti-CD45或anti-CD146中的任意一种。
4.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法的步骤(1)所述的DSPE-PEG-FA或者DSPE-PEG-biotin的分子量为5000。
5.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述微球表面的修饰基团为羧基或者氨基。
6.根据权利要求1所述的红细胞团簇，其特征在于，所述红细胞团簇的制备方法中步骤(3)所述表面修饰基团的微球的直径为5～6μm。
7.权利要求1-6任一项所述的红细胞团簇在制备识别、捕获或富集循环肿瘤细胞的试剂盒中的应用。
8.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中红细胞团簇用于富集循环肿瘤细胞的方法，主要包括以下步骤：1)用红细胞裂解液处理血液样本，以去除血液样本中的红细胞，避免样本中的红细胞对红细胞团簇捕获CTCs的干扰；2)在不含红细胞的血液样本中加入权利要求1-6任一项所述的红细胞团簇，通过一段时间的4℃孵育使红细胞团簇与CTCs发生特异性结合；3)通过20μm多孔滤膜过滤的方式将步骤2)的样本进行分离，即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集；4)将红细胞裂解液配置的浓度为4％的枸橼酸钠溶液加入至步骤3)过滤得到的捕获了CTCs的红细胞团簇中，可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程。
9.根据权利要求7所述的应用，其特征在于，所述应用中红细胞团簇用于富集CTCs的方法，主要包括以下步骤：1)获取术后或化疗后肿瘤病人的血液样本，经percoll细胞分离液获取淋巴细胞层；2)在淋巴细胞层加入权利要求1-6任一项所述的红细胞团簇4℃共孵育开展捕获；3)通过20μm多孔滤膜过滤的方式将步骤2)的样本进行分离，即实现了对循环肿瘤细胞的高纯度富集；4)将红细胞裂解液配置的浓度为4％的枸橼酸钠溶液加至步骤3)过滤得到的捕获了CTCs的红细胞团簇中，可在团簇表面大部分红细胞脱落的基础上实现CTCs的释放过程；5)对捕获到的细胞进行三荧光染色之后，通过流式定量分析其捕获CTCs数目，激光共聚焦分析其捕获情况。
CN202010867920.9A 2020-03-13 2020-08-26 一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇 Active CN111826349B (zh)

Applications Claiming Priority (2)

Application Number Priority Date Filing Date Title
CN2020101754891 2020-03-13
CN202010175489 2020-03-13

Publications (2)

Publication Number Publication Date
CN111826349A CN111826349A (zh) 2020-10-27
CN111826349B true CN111826349B (zh) 2023-08-15

Family

ID=72917923

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
CN202010867920.9A Active CN111826349B (zh) 2020-03-13 2020-08-26 一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇

Country Status (1)

Country Link
CN (1) CN111826349B (zh)

Families Citing this family (3)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN112011434B (zh) * 2020-08-26 2022-01-04 武汉大学 一种用于富集循环肿瘤细胞的红细胞仿生涂层
CN113151176B (zh) * 2021-04-13 2022-07-05 武汉大学 一种基于二乙胺基乙基琼脂糖微球和球形红细胞的循环肿瘤细胞富集方法
CN113201493B (zh) * 2021-04-13 2022-07-05 武汉大学 一种具有理想形貌的红细胞团簇的制备方法

Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2406654A1 (en) * 2000-04-20 2001-11-01 The University Of British Columbia Methods of enhancing splp-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
CN101469323A (zh) * 2007-12-28 2009-07-01 英科新创(厦门)科技有限公司 从全血中分离红细胞的方法
CN104178454A (zh) * 2013-05-24 2014-12-03 益善生物技术股份有限公司 一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法
CN108588018A (zh) * 2018-01-09 2018-09-28 段莉 一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞

Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CA2406654A1 (en) * 2000-04-20 2001-11-01 The University Of British Columbia Methods of enhancing splp-mediated transfection using endosomal membrane destabilizers
CN101469323A (zh) * 2007-12-28 2009-07-01 英科新创(厦门)科技有限公司 从全血中分离红细胞的方法
CN104178454A (zh) * 2013-05-24 2014-12-03 益善生物技术股份有限公司 一种循环肿瘤细胞的富集、分析方法
CN108588018A (zh) * 2018-01-09 2018-09-28 段莉 一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Taoye Zhang 等."Ultradense Erythrocyte Bionic Layer Used to Capture Circulating Tumor Cells and Plasma-Assisted High-Purity Release".《ACS Appl. Mater. Interfaces》.2021,第13卷第24543−24552页. *

Also Published As

Publication number Publication date
CN111826349A (zh) 2020-10-27

Similar Documents

Publication Publication Date Title
CN111826351B (zh) 一种基于磁性分离法富集循环肿瘤细胞的磁性红细胞团簇
CN111826349B (zh) 一种基于尺寸过滤法富集循环肿瘤细胞的红细胞团簇
WO2022041644A1 (zh) 一种用于富集循环肿瘤细胞的红细胞仿生涂层
Franquesa et al. Update on controls for isolation and quantification methodology of extracellular vesicles derived from adipose tissue mesenchymal stem cells
CN109507418B (zh) 具有仿细胞结构的磁性纳米粒子、免疫磁性纳米粒子及其制备方法与应用
US20140315295A1 (en) Polymer microfilters, devices comprising the same, methods of manufacturing the same, and uses thereof
US20200009563A1 (en) Methods and Systems for Circulating Tumor Cell Capture
Cui et al. ZnO nanowire-integrated bio-microchips for specific capture and non-destructive release of circulating tumor cells
WO2009140876A1 (zh) 从生物体液样本中富集与检测稀有细胞的整合方法
JP2016154532A (ja) マルチソート細胞分離法
CN110036111A (zh) 用于细胞外分离的基于脂质的探针
CN105087493B (zh) 联用三种单克隆抗体偶联免疫磁珠在肿瘤细胞分选中应用
CN107287107A (zh) 一种循环肿瘤细胞分离设备、***及方法
CN106701684A (zh) 一种高效率循环肿瘤细胞富集方法
CN108588018A (zh) 一种靶向循环肿瘤细胞CTCs的功能红细胞
CN109161530B (zh) 一种基于苯硼酸的循环肿瘤细胞的分离方法
Jørgensen et al. A melt-electrowritten filter for capture and culture of circulating colon cancer cells
CN106635769B (zh) 细胞分离装置以及细胞分离方法
CN114958743A (zh) 一种中性粒细胞外泌体的分离检测方法和应用
CN110054696B (zh) 一种贻贝仿生多肽复合磁珠及其制备方法与应用
Wu et al. Positively charged magnetic nanoparticles for capture of circulating tumor cells from clinical blood samples
US11860157B2 (en) Polymer microfilters, devices comprising the same, methods of manufacturing the same, and uses thereof
CN112718027B (zh) 微流控芯片和温敏材料复合***及其制备方法和应用
CN116064225A (zh) 一种用于检测循环肿瘤细胞的微流控芯片及其制备方法与应用
CN108548920A (zh) 一种利用免疫磁珠负向吸附联合流式细胞法检测循环肿瘤细胞的试剂盒的检测方法

Legal Events

Date Code Title Description
PB01 Publication
PB01 Publication
SE01 Entry into force of request for substantive examination
SE01 Entry into force of request for substantive examination
GR01 Patent grant
GR01 Patent grant