CN111019901A - 一种捕获肠癌循环肿瘤细胞的方法 - Google Patents

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Abstract

本申请公开了一种从生物体液富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，其包括如下步骤：1)任选地将所述生物体液，例如血液通过物理分离方法如尺寸分离过滤去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞和血浆蛋白；2)任选地通过与特异性结合一种或多种白细胞生物标记如CD45、CD16、CD66b的一种或多种结合剂接触去除白细胞；3)通过与特异性结合A33的结合剂接触形成A33结合剂与循环肿瘤细胞的复合物。本申请还公开了所述特异性结合A33的结合剂用于制备结直肠癌循环肿瘤细胞的富集、分离或检测试剂的用途，以及包含所述A33结合剂的试剂盒。

Description

一种捕获肠癌循环肿瘤细胞的方法
技术领域
本申请涉及肿瘤细胞的富集，更具体地，本申请涉及循环肿瘤细胞(CTC)的富集。
背景技术
结直肠癌(Colotectalcancer,CRC)是胃肠道恶性肿瘤中常见的恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率在消化***恶性肿瘤中仅次于胃癌、食管癌和原发性肝癌，分别居于第三位和第四位。当结直肠癌病变局限于肠壁时，通过外科手术切除病灶，约70％-80％的病人能够治愈，其5年生存率约为90％；但***转移的患者5年生存率则锐减到60％。目前由于结直肠癌的早期诊断依旧困难，相当一部分患者就诊时就已经发生转移，所以结直肠癌的早期诊断及治疗具有非常重要的临床意义。
随着“精准医疗”概念的提出，恶性肿瘤的诊断与治疗也逐步向个体化、精细化方向深入发展，循环肿瘤细胞(CTC)的研究是精准医疗的重要方向之一，而如何从恶性肿瘤患者血液中分离的CTCs中得到更多的诊断信息和治疗信息将是精准医疗的重要方面。传统的影像学与病理学不能及时的提供精确的预后信息，CTCs作为一种无创液体活检标志物，可弥补影像学与病理学的缺陷，对肿瘤预后评估、实时监测疗效、肿瘤复发监测等具有重要指导意义。
由于CTCs在外周血中每106-107个单核细胞中才发现1个CTC，因此对CTCs检测技术的灵敏度和特异度均提出了极高要求。
免疫磁性分离技术是目前最常用CTCs分离和富集技术。其原理是基于CTCs主要表达上皮源性表面标志，利用抗原抗体方法分离和富集CTCs，具体分为阳性富集方法和阴性富集方法。前者通过磁珠偶联上皮细胞黏附分子(Eepithelial Cell Adhesion Molucule,EpCAM)和细胞角蛋白(Cytokerins,CKS)等标志物直接富集外周血中上皮来源的稀有细胞。后者通过磁珠偶联CD45等白细胞标志物，去除外周血白细胞而间接富集稀有上皮细胞，但是此方法得到的循环肿瘤细胞纯度为17％-51％。
目前基于免疫磁性原理富集或同时检测CTCs的技术主要有CellSearch***、免疫磁性细胞分选仪(magnetric cell sorting，MACS)、AdnaTest癌细胞检测***和莱尔***等。CellSearch***是目前唯一获得美国食品与药品管理局(FDA)的批准用于临床监控乳腺癌、***癌和结直肠癌根治术后肿瘤复发的新技术。该***集免疫磁珠富集技术和免疫荧光技术于一体，通过包被有抗EpCAM的特异性抗体的纳米磁颗粒在磁性区域捕获CTCs，通过三重染色过程使CTCs区别于血细胞，包括用荧光素标记CD45的抗体来标记白细胞，用荧光素标记角蛋白(CK)的抗体来标记CTCs及用DAPI对细胞核进行染色，并将CD45呈阴性、CK呈阳性、EpCAM呈阳性的细胞定义为CTCs。CellSearch***的优点是细胞形态结构能够较好保存，即通过荧光显微镜看到荧光染色的结果，直接观察到肿瘤细胞的形态。
但CellSearch***也存在明显的技术缺陷：1.检测灵敏度低。血液中CTC含量过低，或者因上皮间质转换导致EpCAM抗原丢失，因此该检测存在假阴性率较高的问题。2.因EpCAM蛋白为上皮型细胞表面标志物，不具有组织特异性，因此无法判断CTC组织来源。3.没有对捕获的CTC进行深入分析，只能提供细胞数目技术，而没有进行如蛋白表达，基因表达变化和药敏实验等的应用技术。
目前普遍采用EpCAM(上皮细胞粘附分子)进行磁性标记来分离CTCs，称为阳性-磁性分离，但基于这一原理分离CTCs将低估其数量并丢失具有高转移及增殖潜力的CTCs亚群。而实际检测需要够分离出全部类型的CTCs。因此，为了更全面的检测分析，循环肿瘤细胞的全面富集一般仅采用负向去除手段，即采用尺寸分离、阴性富集去除白细胞，然而该方法获得的CTC细胞纯度低，成本高(抗体方式分离)、无法满足临床检测，尤其是分子分型检测的需要。如CTCs阴性-磁分离技术通过白细胞表面的CD45抗原(白细胞共同抗原)与CD45单克隆抗体-纳米磁珠复合物特异性结合，对白细胞进行磁性标记，并在磁场中去除白细胞，从而“无偏见”地富集出高表达、低表达以及不表达EpCAM抗原的CTCs。该技术弥补了基于上皮标志物EpCAM磁分离CTCs技术在方法上的不足，因而更加具有优越性。尽管这一技术已经有了商业化试剂盒，然而基于这一技术原理获得的CTCs纯度仅在0.1％～1％之间，甚至更低，难以满足CTCs进一步分子分型的要求，因而限制了CTCs的临床应用(残余的白细胞的绝对量仍然非常高，严重影响后续分子检测)。难以获得足够纯度的CTCs已经限制了其进一步的临床应用。因此，最佳的CTCs分离技术应当不仅能够分离出全部类型的CTCs，而且能获得足够纯度的CTCs。遗憾的是，目前还没有任何技术能够同时具备这两个优势。因此，本领域中需要克服上述缺陷的新的CTC分离技术。
发明内容
在本领域中，分离肠癌患者血液中的肿瘤细胞时，在去除白细胞后，血液中的细胞必然都是肠癌细胞而不会是其他组织来源的细胞，因此通常想到的做法是用EPCAM免疫磁分离这种成熟的公认的方法来分离，而不会想到其他靶标。本申请发明人首次提出使用A33替代本领域惯用的EPCAM，直接进一步的筛选特异肠癌细胞，发现其筛选得到的肠癌CTC纯度更高、特异性更高、效率更高，从而完成了本发明。
具体而言，本申请通过如下实施方案提出了本发明。
项目1.一种从生物体液富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，其包括如下步骤：
1)任选地将所述生物体液，例如血液通过物理分离方法如尺寸分离过滤去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞和血浆蛋白；
2)任选地通过与特异性结合一种或多种白细胞生物标记如CD45、CD16、CD66b的一种或多种结合剂接触去除白细胞；
3)通过与特异性结合A33的结合剂接触形成A33结合剂与循环肿瘤细胞的复合物。
项目2.项目1所述的方法，其中所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。
项目3.根据项目1-2任一项的方法，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
项目4.根据项目3的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
项目5.根据项目1的方法，其中所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。
项目6.根据项目1-2任一项的方法，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
项目7.根据项目1-6任一项的方法富集或分离的结直肠癌循环肿瘤细胞。
项目8.特异性结合A33的结合剂用于制备结直肠癌循环肿瘤细胞的富集、分离或检测试剂的用途。
项目9.项目8所述的用途，其中所述结合剂是选自由抗A33的抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是抗A33的单克隆抗体。
项目10.根据项目8-9任一项的用途，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
项目11.根据项目10的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
项目12.根据项目8-9任一项的用途，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
项目13.一种用于从生物体液中富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括特异性结合A33的结合剂，任选地还包括用于去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞的结合剂，优选地，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。
项目14.项目13所述的试剂盒，其中所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。
项目15.根据项目13-14任一项的试剂盒，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
项目16.根据项目15的试剂盒，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
项目17.根据项目13-16任一项的试剂盒，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
附图说明
图1是CTC捕获流程示意图。将血液样本经过滤等方法去除红细胞、血小板和白细胞，然后通过CD45等免疫磁珠结合白细胞并进行磁分离，丢弃磁珠，将反应液用A33免疫磁珠结合肿瘤细胞并进行磁分离，丢弃反应液，保留磁珠，得到分离的CTC。
图2是捕获后全孔细胞计数视野(4x)。
图3是捕获的肿瘤细胞对投入肿瘤细胞作用的线性拟合图。对结直肠癌细胞捕获效率，显示将肿瘤细胞投入健康人血液中捕获效率可达95％。
图4是柱状图，显示了不同血浆环境对结直肠癌肿瘤细胞系colo205捕获效率的影响。
具体实施方式
为使本发明的目的、技术方案和优点更加清楚明白，以下结合具体实施例，并参照附图，对本发明作进一步的详细说明。
本文所述的“A33”是指肠上皮细胞表面抗原A33,例如人肠上皮细胞表面抗原A33，其是免疫球蛋白超家族中一种跨膜糖蛋白，分子量43KD，其表达具有很高的组织特异性。A33抗原在90％以上的原发性或转移性结肠癌以及正常结肠上皮中表达。在始于结肠粘膜的癌症中，95％以上的病例有A33抗原的均匀表达。但是A33抗原未能在广泛多种其它正常组织中检测到，即它的表达倾向于器官特异性。目前国内外已对A33组织特异性表达机制进行了深入的研究，并已将A33抗原列为胃肠道肿瘤抗体靶向治疗主要靶点之一。A33抗原在大肠癌的生物治疗应用方面主要用于单克隆抗体导向的放射免疫治疗(radioimmuno-therapy,RIT)。A33以其在大肠癌组织的高度特异性表达模式，已经成为该恶性肿瘤放射免疫治疗的靶向位点之一。但现有技术未见有以表面抗原A33为靶标直接捕获肠癌特异细胞的报道。
本文所述的生物体液包括哺乳动物，特别是人的体液，包括例如，血液、血清、血浆、脑脊液(CSF)、尿、痰、腹水、滑液、***、***抽吸液、唾液、支气管肺泡灌洗液、泪液、口咽洗液、***物、腹水液、胸腔积液、汗液、眼泪、水样液、心包液、淋巴液、食物糜、乳糜、胆汁、稀便、羊膜液、乳汁、胰液、耳垢、考珀液、预***液、女性射出液、组织液、月经、黏膜分泌物、脓、皮脂、***分泌物或其任意组合。优选地，生物体液包括血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。
本文所述的结合剂包括能与特定细胞标志物特异性结合的结合剂。结合剂可以是DNA，RNA，单克隆抗体，多克隆抗体，Fabs，Fab′，单链抗体，合成抗体，拟肽，zDNA，肽核酸(PNA)，锁核酸(LNAs)，外源凝集素，合成或天然形成的化学化合物(包括但不限于药剂、标记试剂)，枝状物(如三维金/铜纳米枝状物、聚丙烯胺-辛胺枝状物)或它们的组合。优选地，结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。例如，特异性结合杂细胞的结合剂是结合选自CD45、CD16、CD66b的一种或多种的生物标记的结合剂，例如，抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，或单链抗体，优选单克隆抗体。特异性结合A33的结合剂为例如，特异性结合A33的抗体或其抗原结合片段，抗体包括但不限于多克隆抗体，单克隆抗体，双特异性抗体，合成抗体，人源化的抗体，嵌合抗体，单链抗体。抗体的抗原结合片段包括但不限于Fab片段和F(ab′)2片段，Fv或Fv′部分，由Fab表达文库产生的片段，抗独特型(抗-Id)抗体或者上文所述的任一种的抗原决定部位的结合片段。
本文所述的结合剂还可以与固体表面或基底直接或间接相连。固体表面或基底可以为结合剂可以与其直接或间接相连的、任何可物理分离的固体，包括但不限于通过微阵列和孔，颗粒(例如珠)，柱，光纤，手帕，玻璃和经修饰或官能化的玻璃，石英，云母，重氮化的膜(纸或尼龙)，聚甲醛，纤维素，醋酸纤维素，纸，陶瓷，金属，非金属，半导体材料，量子点，涂敷的珠或粒子，其他色谱材料，磁粒子所提供的表面；塑料(包括丙烯酸酯，聚苯乙烯，苯乙烯或其他材料的共聚物，聚丙烯，聚乙烯，聚丁烯，聚亚安酯，TEFLONTM等)，多糖，尼龙或硝化纤维，树脂，二氧化硅或基于二氧化硅的材料(包括硅和改性的硅)，碳，金属，无机玻璃，塑料，陶瓷，导电聚合物(包括诸如聚吡咯和聚吲哚之类的聚合物)所提供的表面；微结构或纳米结构的表面，例如核酸覆瓦式阵列，纳米管，纳米线或者纳米颗粒装饰的表面；或者多孔表面或凝胶，例如甲基丙烯酸酯，丙烯酰胺，糖聚合物，纤维素，硅酸酯或者其他纤维状或链状聚合物。此外，如本领域已知的，可以使用具有任何数量的材料(包括聚合物，如右旋糖苷、丙烯酰胺、凝胶或琼脂糖)的、被动式或化学衍生的涂料来涂敷基底。这种涂料可以有利于具有生物学样品的阵列的使用。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合。在一个实施方案中，结合剂通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用与固体表面或载体如磁珠间接相连。例如，结合剂如抗体是生物素化的抗体，磁珠连接亲和素或链霉亲和素，从而，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用，结合剂如抗体可以连接到磁珠，从而，通过磁力分离磁珠，可以实现杂细胞的负向分离或者实现CTC的正向富集和分离。
结合剂也可以用以下物质标记，包括但不限于磁性标记物，荧光部分，酶，化学发光探针，金属粒子，非金属胶状粒子，聚合物染料粒子，颜料分子，颜料粒子，电气化学活性物质，半导体纳米晶体或其他纳米粒子(包括量子点或金粒子)。所述的标记物可以为但不限于荧光团、量子点或放射性标记物。例如，所述的标记物可以为放射性同位素(放射性核)，例如3H，11C，14C，18F，32P，35S，64Cu，68Ga，86Y，99Tc，111In，123I，124I，125I，131I，133Xe，177Lu，211At或213Bi。所述的标记物可以为荧光标记物，例如稀土螯合物(铕螯合物)；荧光素类型，例如但不限于FITC、5-羧基荧光素、6-羧基荧光素；若丹明类型，例如但不限于TAMRA；丹黄酰类；丽丝胺；花青素；藻红蛋白；Texas红；以及它们的类似物。从而，结合剂如抗A33抗体与CTC表面A33标记的特异性结合可以通过所述标记显示出来。
本文所述的抗A33的抗体可以为抗动物，优选哺乳动物，更优选兔的A33的单克隆抗体。所述单克隆抗A33抗体可以通过本领域已知的方法制备或者可以通过商业途径得到。本文所述的单克隆抗A33抗体可以例如，通过生物技术方法从动物或微生物表达。优选地，所述单克隆抗A33抗体为单克隆抗人A33抗体。
本文所述的物理分离方法可以基于细胞的物理参数如尺寸或密度等通过物理方法如尺寸分离过滤等可以分离出杂细胞，如红细胞、白细胞、血小板。
在一个实施方案中，提供了一种从生物体液富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，其包括如下步骤：
1)任选地将所述生物体液，例如血液通过物理分离方法如尺寸分离过滤去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞；
2)任选地通过与特异性结合一种或多种白细胞生物标记如CD45、CD16、CD66b的一种或多种结合剂接触去除白细胞；
3)通过与特异性结合A33的结合剂接触形成A33结合剂与循环肿瘤细胞的复合物。
在一个实施方案中，所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。在进一步的实施方案中，所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。在一个实施方案中，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。在另一个实施方案中，所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
在一个实施方案中，本申请还涉及通过本发明的方法富集或分离的结直肠癌循环肿瘤细胞。
在一个实施方案中，本申请还涉及特异性结合A33的结合剂用于制备结直肠癌循环肿瘤细胞的富集、分离或检测试剂的用途。在一个实施方案中，所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。在一个实施方案中，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。在另一个实施方案中，所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
在一个实施方案中，本申请还涉及一种用于从生物体液中富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括特异性结合A33的结合剂，任选地还包括用于去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞的结合剂，优选地，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。在一个实施方案中，所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。在一个实施方案中，所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。在一个实施方案中，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。在另一个实施方案中，所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
实施例
实施例1结直肠癌循环肿瘤细胞的富集分离方法及其捕获效率验证
A、基于尺寸的(size-based)CTC分离,其包括如下步骤：
1.使用ACD抗凝采血管采集健康人血液样本约5ml/样本，共4个样本。
2.结直肠癌肿瘤细胞Colo205(购于中国科学院细胞库)经CellTrackerTM(GreenCMFDA)预染后进行细胞血球计数法计数。
3.分别吸取15、40、70、110个肿瘤细胞投入到上述健康人血液样本中。
4.加入红细胞裂解液(索莱宝，R1010)对血液样本进行裂红，裂红操作参照“红细胞裂解液使用说明书”，裂红结束后离心(700g，20min)去上清，保留细胞沉淀，并用1mlPBST溶液重悬细胞沉淀。
5.将重悬后的细胞悬液加入到过滤装置的上样筒中，调节蠕动泵方向和速度(2ml/min)，将样本缓慢进行正向过滤，根据滤膜孔径大小将肿瘤细胞截留于滤膜上，血细胞随溶液被抽滤到废液收集装置中。
6.调节蠕动泵方向和速度，进行反向冲洗，将反冲液经垫片将截留在滤膜上的肿瘤细胞和部分血细胞重悬于反冲液(PBST(0.1％BSA+0.01％Tween20))中。
7.重复上述步骤(5)(6)，收集包含肿瘤细胞的反冲液1.5ml，并转移至2ml离心管中。
B、磁珠负向富集
1.在上述2ml离心管中加入抗CD45(abcam)、CD16(Invitrogen)、CD19(abcam)、和CD66b(abcam)的生物素化抗体10μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h。
2.磁珠准备
(1)涡旋至少30s链霉亲和素磁珠(GE，30152105011150)原液，取16μl的磁珠悬液(2μl/样本)到新的离心管中；
(2)加入1ml磷酸盐缓冲液，重悬磁珠；
(3)离心管放置于磁力架上2min进行磁分离，吸除上清；
(4)重复(2)(3)步骤两次。
(5)将离心管移出磁力架，加入400μl磷酸盐缓冲液重悬磁珠，备用。
3.向步骤1离心管中加入清洗过的链霉亲和素磁珠，50μl/样本，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min。
4.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，将上清液转移至新的离心管中。
C、A33特异性正向捕获
1.向上述磁珠负向去除得到的上清液加入生物素化的A33兔单抗(义翘神州)1μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h；
2.加入上述备好的链霉亲和素磁珠，50μl/样本，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min；
3.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
4.加入1ml磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，重新置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
5.加入200μl磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，用于后续实验。
D、荧光显微镜下细胞计数
1.用移液器将上述特异捕获后的细胞悬液转移至384孔板中；
2.荧光显微镜FITC荧光通道下对全孔细胞进行计数。
结果显示，将结直肠癌细胞投入到健康人血液中平均捕获效率可达95％(如图3所示)，白细胞数目小于200个(如表1)。
表1
过滤后 免疫富集后
白细胞数目 10000+ 10-120
实施例2结直肠癌循环肿瘤细胞的富集分离方法及其捕获灵敏度验证。
A、基于尺寸的CTC分离
1.使用ACD抗凝采血管采集健康人血液样本约5ml/样本，共6个样本。
2.结直肠癌肿瘤细胞Colo205经CellTrackerTM(Green CMFDA)预染后进行细胞计数。
3.分别吸取2、4、4、5、6、8个肿瘤细胞投入到上述血液样本中。
4.加入红细胞裂解液(索莱宝，R1010)对血液样本进行裂红，裂红操作参照“红细胞裂解液使用说明书”，裂红结束后离心(700g，20min)去上清，保留细胞沉淀，并用1mlPBST溶液重悬细胞沉淀。
5.将重悬后的细胞悬液加入到过滤装置的上样筒中，调节蠕动泵方向和速度(2ml/min)，将样本缓慢进行正向过滤，根据滤膜孔径大小将肿瘤细胞截留于滤膜上，血细胞随溶液被抽滤到废液收集装置中。
6.调节蠕动泵方向和速度，进行反向冲洗，将反冲液经垫片将截留在滤膜上的肿瘤细胞和部分血细胞重悬于反冲液中。
7.重复上述步骤(5)(6)，收集包含肿瘤细胞的反冲液1.5ml，并转移至2ml离心管中。
B、磁珠负向富集
1.在上述2ml离心管中加入CD45、CD16、CD19、CD66b的生物素化抗体10μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h。
2.磁珠准备
(1)涡旋至少30s链霉亲和素磁珠原液，取24μl的磁珠悬液(2μl/样本)到新的离心管中；
(2)加入1ml磷酸盐缓冲液，重悬磁珠；
(3)离心管放置于磁力架上2min进行磁分离，吸除上清；
(4)重复(2)(3)步骤两次。
(5)将离心管移出磁力架，加入600μl磷酸盐缓冲液重悬磁珠，备用。
3.向步骤1离心管中加入清洗过的链霉亲和素磁珠，50μl/样本，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min。
4.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，将上清液转移至新的离心管中。
C、A33特异性正向捕获
1.向上述磁珠负向去除得到的上清液加入生物素化的A33兔单抗1μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h；
2.加入上述备好的链霉亲和素磁珠，50μl/样本，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min；
3.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
4.加入1ml磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，重新置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
5.加入200μl磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，用于后续实验。
D、荧光显微镜下细胞计数
1.用移液器将上述特异捕获后的细胞悬液转移至384孔板中；
2.荧光显微镜FITC荧光通道下对全孔细胞进行计数。
结果显示，将结直肠癌细胞投入到健康人血液中捕获灵敏度为4个细胞。如表2所示。
表2.对结直肠癌细胞捕获灵敏度，显示将肿瘤细胞投入健康人血液中的捕获灵敏度为4个细胞
Figure BDA0002329429140000121
Figure BDA0002329429140000131
实施例3不同血浆环境下，不经膜过滤和负向筛选，直接用A33抗体对结直肠癌细胞colo205进行捕获
包括以下步骤：
1.使用ACD抗凝采血管采集健康人血液样本约10ml，离心后取上层血浆。
2.用磷酸盐缓冲液稀释血浆，分别配制成0％，10％，20％，40％和80％的血浆稀释液，2ml/组。
3.结直肠癌肿瘤细胞Colo205经CellTrackerTM(Green CMFDA)预染后进行细胞计数。
4.吸取11个肿瘤细胞分别投入到上述稀释后的血浆样本中。
5.分别加入生物素化的A33兔单抗(义翘神州)1μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h。
6.磁珠准备
(1)涡旋至少30s链霉亲和素磁珠原液，取10μl的磁珠悬液(2μl/组)到新的离心管中；
(2)加入1ml磷酸盐缓冲液，重悬磁珠；
(3)离心管放置于磁力架上2min进行磁分离，吸除上清；
(4)重复(2)(3)步骤两次。
(5)将离心管移出磁力架，加入250μl磷酸盐缓冲液重悬磁珠，备用。
7.向抗体孵育完的反应液中加入上述备好的链霉亲和素磁珠，50μl/组，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min。
8.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液。
9.加入200μl磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，用于后续实验。
10.用移液器将上述特异捕获后的细胞悬液转移至384孔板中。
11.荧光显微镜FITC荧光通道下对全孔细胞进行计数。
结果显示，将结直肠癌细胞投入到不同浓度的血浆中，用A33抗体和磁珠直接进行捕获也可以捕获到肿瘤细胞，因受血浆环境的影响平均捕获效率达到79.2％，如图4所示。
实施例4基于尺寸的分离后直接用A33抗体对结直肠癌细胞colo205进行捕获以及捕获效率评价
包括以下步骤：
A、基于尺寸的CTC分离
1.使用ACD抗凝采血管采集健康人血液样本约5ml/样本，共6个样本。
2.结直肠癌肿瘤细胞Colo205经CellTrackerTM(Green CMFDA)预染后进行细胞计数。
3.分别吸取44个左右肿瘤细胞投入到上述健康人血液样本中。
4.4.加入红细胞裂解液(索莱宝，R1010)对血液样本进行裂红，裂红操作参照“红细胞裂解液使用说明书”，裂红结束后离心(700g，20min)去上清，保留细胞沉淀，并用1mlPBST溶液重悬细胞沉淀。
5.将重悬后的细胞悬液加入到过滤装置的上样筒中，调节蠕动泵方向和速度(2ml/min)，将样本缓慢进行正向过滤，根据滤膜孔径大小将肿瘤细胞截留于滤膜上，血细胞随溶液被抽滤到废液收集装置中。
6.调节蠕动泵方向和速度，进行反向冲洗，将反冲液经垫片将截留在滤膜上的肿瘤细胞和部分血细胞重悬于反冲液中。
7.重复上述步骤(5)(6)，收集包含肿瘤细胞的反冲液1.5ml，并转移至2ml离心管中。
B、A33特异性正向捕获
1.向上述尺寸分离后回收到的上清液加入生物素化的A33兔单抗1μg，2-8℃条件下，旋转孵育1h；
2.磁珠准备
(1)涡旋至少30s链霉亲和素磁珠原液，取12μl的磁珠悬液(2μl/样本)到新的离心管中；
(2)加入1ml磷酸盐缓冲液，重悬磁珠；
(3)离心管放置于磁力架上2min进行磁分离，吸除上清；
(4)重复(2)(3)步骤两次。
(5)将离心管移出磁力架，加入300μl磷酸盐缓冲液重悬磁珠，备用。
3.加入上述备好的链霉亲和素磁珠，50μl/样本，2-8℃条件下，旋转孵育15-30min；
4.将离心管置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
4.加入1ml磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，重新置于磁力架上进行磁分离2min，移除上清液；
5.加入200μl磷酸盐缓冲液重悬磁体细胞，用于后续实验。
C、荧光显微镜下细胞计数
1.用移液器将上述特异捕获后的细胞悬液转移至384孔板中；
2.荧光显微镜FITC荧光通道下对全孔细胞进行计数。
结果显示，尺寸分离后肿瘤细胞回收效率可达97.7％，A33抗体对回收后肿瘤细胞捕获效率为93.1％。(如表3所示)
将肿瘤细胞投入健康人血液中经基于尺寸的分离后，对肿瘤细胞回收效率为97.7％，回收后用A33抗体直接捕获效率为93.1％，结合实施例1方法捕获效率约为95％，说明负向筛选去除白细胞的步骤有助于目标肠癌CTC的特异捕获。
表3.过滤回收及进一步A33抗体捕获CTC结果
Figure BDA0002329429140000151
对比例
使用与实施例1相同的方法，只是在正向捕获步骤中用EpCAM单抗(abcam)代替A33单抗。结果如下表4。
表4
荧光计数 平均值 捕获效率
投入细胞数目 19/19/23 20
Anti-EpCAM 16/17/17 17 85％
以上所述的具体实施例，对本发明的目的、技术方案和有益效果进行了进一步详细说明，应理解的是，以上所述仅为本发明的具体实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所做的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

Claims (17)

1.一种从生物体液富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的方法，其包括如下步骤：
1)任选地将所述生物体液，例如血液通过物理分离方法如尺寸分离过滤去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞和血浆蛋白；
2)任选地通过与特异性结合一种或多种白细胞生物标记如CD45、CD16、CD66b的一种或多种结合剂接触去除白细胞；
3)通过与特异性结合A33的结合剂接触形成A33结合剂与循环肿瘤细胞的复合物。
2.权利要求1所述的方法，其中所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。
3.根据权利要求1-2任一项的方法，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
4.根据权利要求3的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
5.根据权利要求1的方法，其中所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。
6.根据权利要求1-2任一项的方法，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
7.根据权利要求1-6任一项的方法富集或分离的结直肠癌循环肿瘤细胞。
8.特异性结合A33的结合剂用于制备结直肠癌循环肿瘤细胞的富集、分离或检测试剂的用途。
9.权利要求8所述的用途，其中所述结合剂是选自由抗A33的抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是抗A33的单克隆抗体。
10.根据权利要求8-9任一项的用途，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
11.根据权利要求10的方法，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
12.根据权利要求8-9任一项的用途，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
13.一种用于从生物体液中富集或分离结直肠癌循环肿瘤细胞的试剂盒，其包括特异性结合A33的结合剂，任选地还包括用于去除杂细胞如红细胞、血小板和白细胞的结合剂，优选地，所述生物体液包括：血液、腹水、腹水液、胸腔积液、或其任意组合。
14.权利要求13所述的试剂盒，其中所述结合剂选自由抗体或其抗原结合片段，单克隆抗体或多克隆抗体，合成抗体，单链抗体组成的组，优选地，所述结合剂是单克隆抗体。
15.根据权利要求13-14任一项的试剂盒，其中所述结合剂与固体表面或载体直接或间接相连，优选地，通过生物素-链霉亲和素或生物素-亲和素相互作用间接相连。
16.根据权利要求15的试剂盒，其中所述固体表面或载体选自颗粒物、膜、柱、磁珠、树脂及其任意组合,优选地，所述载体是磁珠。
17.根据权利要求13-16任一项的试剂盒，其中所述结合剂用磁性、荧光或放射性标记进行标记。
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