CN111825675B - Rock抑制剂及其制备方法和用途 - Google Patents

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Abstract

下式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、氮氧化物、溶剂化物、多晶型物、代谢产物、酯、药学上可接受的盐或前药。式I所示的化合物具有优异的ROCK抑制活性。此外，式I所示的化合物具有较好的安全性和代谢稳定性。进一步地，式I所示的化合物潜在心脏毒性风险小。最后式I所示的化合物制备方法简单、易于提纯，因此具有良好的应用前景。

Description

ROCK抑制剂及其制备方法和用途
技术领域
本发明涉及药物领域，具体涉及可抑制ROCK活性的化合物及其制备方法和用途。
背景技术
特发性肺间质纤维化(Idiopathic interstitial pulmonary fibrosis，IPF)，是一种原因不明的以普通间质性肺炎为改变的慢性、弥漫性肺间质疾病，其组织病理学及影像学多显示为普通间质性肺炎的表现。因其发病机制复杂，病情呈不可逆性进展，早期诊断困难；确诊后患者生存率随时间推移显著下降，其3年生存率为50％，5年生存率仅为20％，比多数癌症(例如：白血病、乳腺癌、结肠癌、子宫瘤、肾癌等)的生存率都低，被称为“不是癌症的癌症”。目前，IPF尚无肯定显著有效的治疗药物。根据近年来的随机对照临床试验的结果，结合我国临床实际情况，可以酌情使用的药物如吡非尼酮、尼达尼布，仅推荐轻到中度肺功能障碍的IPF患者应用尼达尼布治疗，而重度肺功能障碍的IPF患者服用尼达尼布治疗能否获益，以及药物服用疗程尚需进一步探讨。
Rho GTP酶(Rho GTPase)于1985年被发现，属于Ras超家族，与Ras有25％的同源性。目前发现的分布在哺乳动物组织细胞中的Rho GTP酶成员主要有Rho(A、B、C)、Rac(1、2、3)、Cdc42(Cdc42Hs/G25K、TC10、Tcl)、Rho D、Rho G、Chp(1、2)、Rnd(Rho E/Rnd3、Rnd1/Rho6、Rnd2/Rho7)、Rho H/TTF、Rif、Wrch1和Rho BTB(1、2)，其中Rho(A、B、C)是Rho GTP酶最主要的成员之一。ROCK(Rho-associated protein kinase)又称Rho激酶(Rho-associatedkinase)，属于丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶，分子质量大约160kD，是目前功能研究最为详细的Rho下游靶效应分子。ROCK包括ROCK1(ROKβ，p160-ROCK)和ROCK2(ROKα)亚型。两种亚型的氨基酸序列一致性为65％，在激酶结构域有高度相似性(92％一致)。ROCK分布于全身组织，相比较而言，ROCK1在非神经组织(血液、小肠、胸腺等)中有更高表达，而ROCK2在脑、心脏和结肠中有更高表达。
ROCK参与多种心脑血管疾病，包括高血压、动脉粥样硬化、缺血性脑卒中、心脏病、糖尿病肾病、眼疾病、肿瘤、神经损伤性疾病、辐射损伤以及自身免疫性疾病等的发生。例如，Rho/ROCK信号通路参与NAD(P)H氧化酶激活，诱导氧化应激，诱发心脏微血管损伤和C反应蛋白诱导的动脉粥样硬化血栓；高糖可以激活Rho/ROCK通路，诱导内脏脂肪素和I型前胶原在成心肌细胞的表达，使成心肌细胞过增殖而诱发糖尿病心肌病；Rho/ROCK信号通路激活可以调节NF-κB信号通路，上调炎症基因并诱导糖尿病肾病的发生；Rho/ROCK信号通路改变生物膜通透性影响癌细胞的转移；脊髓损伤时，Rho活化，从而诱发生长锥萎缩导致轴突再生障碍，同时诱发硫酸软骨素蛋白聚糖对神经元生长的抑制作用。
另外，Rho/ROCK信号通路还参与了纤维化疾病的发生与发展。Rho/ROCK信号通路激活可以增加局部缺血心肌纤维化水平，且急性心肌纤维化大鼠心脏组织的Rho和ROCK表达明显增高。Rho/ROCK信号通路激活可以诱导肌动蛋白磷酸化，引发细胞纤维化。体内和体外实验结果均证明，暴露于辐射一段时间后造成的心肺生理和病理损伤与Rho/ROCK通路参与诱导的纤维化有关。电离辐射导致的内皮黏附纤连蛋白和焦点黏着形成、内皮细胞迁移减少、内皮功能障碍与Rho/ROCK信号通路激活诱导的肌动蛋白骨架重组和应力纤维形成有关。
IPF的肺损伤主要以肺泡上皮细胞(ACEs)为靶点，ACEs死亡触发创伤愈合反应，包括天然免疫激活、血管渗漏和血管外凝血、成纤维细胞募集、增殖和活化、细胞外基质合成和交联、肺泡塌陷和上皮细胞再生。ROCK信号可从根本上调节这些参与愈合反应的细胞的活动，尤其是上皮细胞、内皮细胞和成纤维细胞。而ROCK在这些反应中的关键作用，进一步提示了ROCK抑制剂治疗肺纤维化的潜力。
目前尚无ROCK抑制途径治疗包括纤维化在内的众多病症的药物上市。新药剂的发展要求将先导化合物的化学及生物学特性仔细地进行最佳化。进一步地，所述化合物必须具有所希望的药代动力学以及药效动力学特征。该艰巨的开发过程通常要求广泛的试验。在许多情况下，确定所述最佳化合物的过程常常需要制备数以千计的结构上相似的化合物。因此，改善ROCK激酶抑制剂，开发出具有ROCK1和/或ROCK2激酶抑制作用的新骨架化合物，对于上述疾病的治疗具有积极意义。
发明内容
为改善现有技术中存在的问题，本发明提供下式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、同位素标记物、氮氧化物、溶剂化物、多晶型物、代谢产物、酯、药学上可接受的盐或前药：
其中，X1、X2、X3相同或不同，彼此独立地选自CR1、O、S、N或NH；所述R1相同或不同，彼此独立地选自H、CN、卤素、OH、NR10R11、COOH、NO2，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Ra取代的如下基团：C1-40烷基、C2-40烯基、C2-40炔基、C1-40烷氧基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、COOR10、COR10、CONHR10或CONR10R11；
A选自如下基团：
其中R2相同或不同，彼此独立地选自H、C1-40烷基、C1-40烷氧基、-X-R12、-O-(CH2)y-CO2R12、C6-20芳基、5-20元杂芳基、-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C6-20芳基、-O-(CH2)y-5-20元杂芳基、-O-(CH2)y-C3-20环烷基、-O-(CH2)y-3-20元杂环基、-O-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-O-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)R15、-O-(CH2)y-R15、-O-(CH2)y-S(＝O)2NR13R14、-O-(CH2)y-S(＝O)2R15、-NH-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-NH-(CH2)y-NR13R14、-N-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-NH-C(＝O)-X-R15或-NH-C(＝O)-(CH2)y-R15；
每一个R3相同或不同，彼此独立地选自H、卤素、OH、NR13R14、CN，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rb取代的如下基团：C1-40烷基、C1-40烷氧基、卤代C1-40烷基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、-C(＝O)-C1-40烷基或-C(＝O)-卤代C1-40烷基；
m选自0-4的整数；n选自0-2的整数；y选自0-6的整数；
Y选自NR4、O、S或CR4；
B选自如下基团：
其中，R5选自H、C1-40烷基、卤代C1-40烷基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、C2-40烯基、C2-40炔基、-(CH2)x-C(＝O)-NR13R14、-C(＝O)-(CH2)x-NR13R14、-C(＝O)-X-R15、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-40烷基-C3-20环烷基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-40烷基-3-20元杂环基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-40烷基-C6-20芳基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-40烷基-5-20元杂芳基或-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-40烷基-O-C1-40烷基；
x选自0～6的整数；
X选自共价键、O、NR4或C1-40烷基；
每一个R4相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rc取代的如下基团：C1-40烷基、卤代C1-40烷基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、C2-40烯基、C2-40炔基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-40烷基-C3-20环烷基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-40烷基-3-20元杂环基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-40烷基-C6-20芳基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-40烷基-5-20元杂芳基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-40烷基-O-C1-40烷基、或-(CH2)z-NR13R14；z选自0～6的整数；
R12选自无取代或任选被一个、两个或更多个Rd取代的如下基团：C1-40烷基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、C6-20芳基、-C1-40烷基-C6-20芳基、5-20元杂芳基或-C1-40烷基-5-20元杂芳基；
R10、R11、R13、R14相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：C1-40烷基、C2-40烯基、C2-40炔基、C1-40烷氧基、C3-20环烷基、3-20元杂环基、C6-20芳基、-C1-40烷基-C6-20芳基、-C1-40烷基-5-20元杂芳基或5-20元杂芳基；或者，R10、R11或R13、R14与其相连的N构成无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：3-20元杂环基或5-20元杂芳基；
R15相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rf取代的如下基团：C1-40烷基、C2-40烯基、C2-40炔基、C1-40烷氧基、C6-20芳基、5-20元杂芳基、C3-20环烷基或3-20元杂环基；
每一个Ra相同或不同，彼此独立地选自CN、卤素、OH、NR16R17、COOH、NO2、C1-40烷基、卤代C1-40烷基或C1-40烷氧基；
每一个Rb、Rc、Rd、Re、Rf相同或不同，彼此独立地选自卤素、OH、CN、NH2、C1-40烷基、C1-40烷氧基、-C1-40烷基-O-C1-40烷基、卤代C1-40烷基、-C(＝O)-NR16R17、-C(＝O)-C1-40烷基或C(＝O)-卤代C1-40烷基；
R16、R17相同或不同，彼此独立地选自C1-40烷基或卤代C1-40烷基；
处表示连接位点；
表示存在或者不存共轭环；当不存在时，即形成杂环。
根据本发明的实施方案，X1、X2、X3相同或不同，彼此独立地选自CR1、N或NH；所述R1相同或不同，彼此独立地选自H、CN、卤素、OH、NR10R11、COOH、NO2，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Ra取代的如下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C1-10烷氧基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、COOR10；
A选自如下基团：
其中R2相同或不同，彼此独立地选自H、C1-10烷基、C1-10烷氧基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、-X-R12、-O-(CH2)y-CO2R12、-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C6-14芳基、-O-(CH2)y-5-14元杂芳基、-O-(CH2)y-C3-10环烷基、-O-(CH2)y-3-10元杂环基、-O-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-O-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)R15、-O-(CH2)y-R15、-O-(CH2)y-S(＝O)2NR13R14、-O-(CH2)y-S(＝O)2R15、-NH-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-NH-(CH2)y-NR13R14、-N-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-NH-C(＝O)-X-R15或-NH-C(＝O)-(CH2)y-R15；
每一个R3相同或不同，彼此独立地选自H、卤素、OH、NH2、CN，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rb取代的如下基团：C1-10烷基、C1-10烷氧基、卤代C1-10烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、-C(＝O)-C1-10烷基或-C(＝O)-卤代C1-10烷基；
m选自0-3的整数；n选自0-2的整数；y选自0-4的整数；
Y选自NR4，O，S或CR4；
B选自如下基团：
其中，R5选自H、C1-10烷基、卤代C1-10烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、C2-10烯基、C2-10炔基、-(CH2)x-C(＝O)-NR13R14、-C(＝O)-(CH2)x-NR13R14、-C(＝O)-X-R15、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-10烷基-C3-10环烷基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-10烷基-3-10元杂环基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-10烷基-C6-14芳基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-10烷基-5-14元杂芳基或-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-10烷基-O-C1-10烷基；x选自0～4的整数；
X选自共价键、O、NR4或C1-10烷基；
每一个R4相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rc取代的如下基团：C1-10烷基、卤代C1-10烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、C2-10烯基、C2-10炔基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-10烷基-C3-10环烷基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-10烷基-3-10元杂环基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-10烷基-C6-14芳基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-10烷基-5-14元杂芳基或-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-10烷基-O-C1-10烷基；z选自0～4的整数；
R12选自无取代或任选被一个、两个或更多个Rd取代的如下基团：C1-10烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、C6-14芳基、-C1-10烷基-C6-14芳基、-C1-10烷基-5-14元杂芳基或5-14元杂芳基；
R10、R11、R13、R14相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C1-10烷氧基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、C6-14芳基、-C1-10烷基-C6-14芳基、-C1-10烷基-5-14元杂芳基或5-14元杂芳基；或者，R10、R11或R13、R14与其相连的N构成无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：3-10元杂环基或5-14元杂芳基；
R15相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rf取代的如下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C1-10烷氧基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、C3-10环烷基或3-10元杂环基；
每一个Ra相同或不同，彼此独立地选自CN、卤素、OH、NR16R17、COOH、NO2、C1-10烷基、卤代C1-10烷基或C1-10烷氧基；
每一个Rb、Rc、Rd、Re、Rf相同或不同，彼此独立地选自卤素、OH、CN、NH2、C1-10烷基、C1-10烷氧基、-C1-10烷基-O-C1-10烷基、卤代C1-10烷基、-C(＝O)-NR16R17、-C(＝O)-C1-10烷基或-C(＝O)-卤代C1-10烷基；每一个R16、R17相同或不同，彼此独立地选自C1-10烷基或卤代C1-10烷基。
根据本发明优选的实施方案，其中，X1、X2、X3相同或不同，彼此独立地选自CR1或N；所述R1相同或不同，彼此独立地选自H、卤素、CN、OH、NR10R11、COOH、NO2、或者无取代或任选被一个、两个或更多个Ra取代的如下基团：C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基或COOR10；
A选自如下基团：
其中R2相同或不同，彼此独立地选自H、C1-6烷基、C1-6烷氧基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、-X-R12、-O-(CH2)y-CO2R12、-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C6-14芳基、-O-(CH2)y-5-14元杂芳基、-O-(CH2)y-C3-10环烷基、-O-(CH2)y-3-10元杂环基、-O-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-O-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-C(＝O)R15、-O-(CH2)y-R15、-O-(CH2)y-S(＝O)2NR13R14、-O-(CH2)y-S(＝O)2R15、-NH-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、-NH-(CH2)y-NR13R14、-N-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-NH-C(＝O)-X-R15或-NH-C(＝O)(CH2)y-R15；
每一个R3相同或不同，彼此独立地选自H、卤素、OH、NH2、CN，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rb取代的如下基团：C1-6烷基、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、-C(＝O)-C1-6烷基或-C(＝O)-卤代C1-6烷基；
m、y相同或不同，彼此独立地选自0、1、2或3；n选自0或1；
Y选自NR4、O、S，或CR4；其中所述R4相同或不同，彼此独立地选自H、C1-6烷基、卤代C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-6烷基-C3-10环烷基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-6烷基-3-10元杂环基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-6烷基-C6-14芳基、-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-6烷基-5-14元杂芳基或-(CH2)z-C(＝O)-NH-C1-6烷基-O-C1-6烷基；z选自0、1、2或3；R4优选自H或C1-6烷基；
B选自如下基团：
其中，R5选自选自H、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、卤代C1-6烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、-(CH2)x-C(＝O)-NR13R14、-C(＝O)-(CH2)x-NR13R14、-C(＝O)-X-R15、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-6烷基-C3-10环烷基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-6烷基-3-10元杂环基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-6烷基-C6-14芳基、-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-6烷基-5-14元杂芳基或-(CH2)x-C(＝O)-NH-C1-6烷基-O-C1-6烷基；
X选自O或C1-6烷基；x选自0、1、2或3；R12选自无取代或任选被一个、两个或更多个Rd取代的如下基团：C1-6烷基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、C6-14芳基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-5-14元杂芳基或5-14元杂芳基；
R10、R11、R13、R14相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个卤素、CN、NH2取代的如下基团：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、3-10元杂环基、卤代C1-6烷基、C6-14芳基、C1-6烷基-C6-14芳基、C1-6烷基-5-14元杂芳基或5-14元杂芳基；或者，R10、R11或R13、R14与其相连的N构成3-10元杂环基或5-14元杂芳基；
R15相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个卤素、OH、CN、NH2、C1-6烷氧基、卤代C1-6烷基、-C1-6烷基-O-C1-6烷基、-C(＝O)-C1-6烷基、C(＝O)-卤代C1-6烷基取代的如下基团：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C1-6烷氧基、C6-14芳基、5-14元杂芳基、C3-10环烷基、3-10元杂环基；
每一个Ra相同或不同，彼此独立地选自CN、卤素、OH、NR16R17、COOH、NO2、C1-6烷基、卤代C1-6烷基或C1-6烷氧基；
每一个Rb、Rd相同或不同，彼此独立地选自卤素、OH、CN、NH2、C1-6烷基、C1-6烷氧基、-C1-6烷基-O-C1-6烷基、卤代C1-6烷基、-C(＝O)-NR16R17、-C(＝O)-C1-6烷基或-C(＝O)-卤代C1-6烷基；R16、R17相同或不同，彼此独立地选自C1-6烷基或卤代C1-6烷基。
根据本发明的实施方案，所述化合物I选自如下结构：
其中，各基团如上文所定义。
在本发明优选的实施方案中，所述化合物I选自如下结构：
其中，各基团如上文所定义。
作为实例，式I化合物选自下列示例性的化合物及其药学上可接受的盐：
本发明还提供式I所示化合物的制备方法，包括如下方案中的至少一种：
方案1’：
a1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；
a2’)化合物II-3’与化合物II-4’经Suzuki偶联反应得到化合物II-5’；
a3’)化合物II-5’脱保护基得到化合物I-A；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y、具有如上所述定义，L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案2’：
b1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；
b2’)化合物II-3’与化合物II-6’经Suzuki偶联反应得到化合物II-7’；
b3’)化合物II-7’与化合物L-R2在碱性条件下反应得到化合物II-5’；
b4’)化合物II-5’脱保护基得到化合物I-A；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y、具有如上所述定义，L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案3’：
c1’)化合物II-1’与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2’；
c2’)化合物IV-2’与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4’；
c3’)化合物IV-4’与化合物IV-5’经Suzuki偶联反应得到化合物I-C；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y、具有如上所述定义，X5、L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案4’：
d1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；
d2’)化合物II-3’与化合物III-1’在碱性条件下反应得到化合物III-2’；
d3’)化合物III-2’脱保护基得到化合物I-B；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、n、Y、具有如上所述定义；PG为氨基保护基；
或者方案5’：
e1’)化合物II-1’与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2’；
e2’)化合物IV-2’与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4’；
e3’)化合物IV-4’与化合物III-1’在碱性条件下反应得到化合物I-D；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、n、Y、具有如上所述定义，X5、L选自离去基团；PG为氨基保护基。
根据本发明的制备方法，所述离去基团和氨基保护基可为本领域常用基团，例如离去基团可选自卤素(例如I或Cl)、等。上述方案中可任选进行基团保护或者脱保护步骤，所述步骤可为本领域常规的操作和条件。
根据本发明的制备方法，步骤a1’)、b1’)、b3’)、c1’)、d1’)、d2’)、e1’)或e3’)使用的碱为无机碱或有机碱。
根据本发明的制备方法，b3’)还可在催化剂存在下进行，所述催化剂选自碘化钠，溴化钠中的至少一种。
根据本发明的制备方法，步骤a2’)、b2’)、c2’)、c3’)或e2’)中所述偶联反应在催化剂和碱存在下进行，使用的催化剂选自Pd(OAc)2和配体XPhos，四三苯基膦钯、或Pd(dppf)Cl2等中的至少一种。
根据本发明的制备方法，步骤a3’)或b4’)中脱保护基步骤可为本领域常规的操作和条件，例如采用酸脱保护基。
根据本发明优选的实施方案，式I化合物采用如下方法制备：
方案1：
a1)化合物II-1与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3；
a2)化合物II-3与化合物II-4经Suzuki偶联反应得到化合物II-5；
a3)化合物II-5脱保护基得到化合物II；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y具有如上所述定义，L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案2：
b1)化合物II-1与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3；
b2)化合物II-3与化合物II-6经Suzuki偶联反应得到化合物II-7；
b3)化合物II-7与化合物L-R2在碱性条件下反应得到化合物II-5；
b4)化合物II-5脱保护基得到化合物II；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y具有如上所述定义，L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案3：
c1)化合物II-1与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2；
c2)化合物IV-2与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4；
c3)化合物IV-4与化合物IV-5经Suzuki偶联反应得到化合物IV；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、Y具有如上所述定义，X5、L选自离去基团；PG为氨基保护基；
或者方案4：
d1)化合物II-1与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3；
d2)化合物II-3与化合物III-1在碱性条件下反应得到化合物III-2；
d3)化合物III-2脱保护基得到化合物III；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、n、Y具有如上所述定义；PG为氨基保护基；
或者方案5：
e1)化合物II-1与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2；
e2)化合物IV-2与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4；
e3)化合物IV-4与化合物III-1在碱性条件下反应得到化合物V；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、n、Y具有如上所述定义，X5、L选自离去基团；PG为氨基保护基。
根据本发明的实施方案，所述离去基团和氨基保护基可为本领域常用基团，例如离去基团可选自卤素(例如I或Cl)、等。上述方案中可任选进行基团保护或者脱保护步骤，所述步骤可为本领域常规的操作和条件。
根据本发明的实施方案，步骤a1)、b1)、b3)、c1)、d1)、d2)、e1)或e3)可为本领域常规的操作和条件，其中使用的碱为无机碱或有机碱，例如选自三乙胺(TEA)、碳酸钾、异丙胺、二异丙基乙二胺(DIEA)、二乙胺(DEA)中的至少一种。
根据本发明的实施方案，b3)还可在催化剂存在下进行，所述催化剂可为本领域常规的催化剂，例如碘化钠，溴化钠中的至少一种。
根据本发明的实施方案，步骤a2)、b2)、c2)、c3)或e2)中所述偶联反应可为本领域常规的操作和条件，在催化剂和碱存在下进行，广泛使用的催化剂如Pd(OAc)2和配体XPhos，四三苯基膦钯、或Pd(dppf)Cl2等中的至少一种。例如在K3PO4，Pd(OAc)2和XPhos的存在下进行。
根据本发明的实施方案，步骤a3)或b4)中脱保护基步骤可为本领域常规的操作和条件，例如酸脱保护基，优选使用TFA、HCl溶液，例如使用HCl二氧六环溶液、HCl乙酸乙酯溶液。
本领域技术人员应当理解，式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物可以作为原料或中间体，制备式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物的前药或药学上可接受的盐。为此，本发明还提供式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物在制备式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物的前药或药学上可接受的盐中的用途。
本发明还提供式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、代谢产物、酯、药学上可接受的盐或前药中的至少一种在制备药物中用途，所述药物为蛋白质激酶的抑制剂。
特别地，所述的药物具有调节Rho-激酶的功能。所述药物可用于预防或治疗一种或多种ROCK的高表达或ROCK的过度激活导致的疾病，如心脑血管疾病、神经***疾病、纤维化疾病、眼疾病、肿瘤、动脉血栓形成病症、辐射损伤、呼吸***疾病、以及自身免疫性疾病等，包括动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、高血压、脑血管痉挛、脑缺血、缺血性脑卒中、再狭窄、心脏病、心脏衰竭、心肌肥厚、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病、糖尿病肾病、癌症、神经元变性(外周的或中枢的)、神经损伤性疾病、脊髓损伤、***功能障碍、血小板凝聚、白细胞聚集、青光眼、眼部高血压、哮喘、骨质疏松症、肺纤维化(如特发性肺纤维化)、肝纤维化、肾脏纤维化、COPD、肾透析(上皮稳定性)、肾小球硬化症以及神经元变性炎症等。
本发明还提供一种药物组合物，其包含治疗有效量的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、氮氧化物、同位素标记物、溶剂化物、多晶型物、代谢产物、酯、药学上可接受的盐或前药中的至少一种。
优选地，所述药物组合物还可任选包含药学上可接受的辅料，例如载体、赋形剂。作为实例，所述辅料可以为选自下列中的至少一种：崩解剂、助流剂、润滑剂、稀释剂或填充剂、粘合剂、着色剂。
本发明的药物组合物具有调节Rho-激酶的功能。所述药物组合物可用于预防或治疗一种或多种ROCK的高表达或ROCK的过度激活导致的疾病，如心脑血管疾病、神经***疾病、纤维化疾病、眼疾病、肿瘤、动脉血栓形成病症、辐射损伤、呼吸***疾病、以及自身免疫性等疾病，包括动脉粥样硬化、急性冠脉综合征、高血压、脑血管痉挛、脑缺血、缺血性脑卒中、再狭窄、心脏病、心脏衰竭、心肌肥厚、心肌缺血再灌注损伤、糖尿病、糖尿病肾病、癌症、神经元变性(外周的或中枢的)、神经损伤性疾病、脊髓损伤、***功能障碍、血小板凝聚、白细胞聚集、青光眼、眼部高血压、哮喘、骨质疏松症、肺纤维化(如特发性肺纤维化)、肝纤维化、肾脏纤维化、COPD、肾透析(上皮稳定性)、肾小球硬化症以及神经元变性炎症等。
本发明还提供一种调节Rho-激酶功能的方法，包括向有此需要的个体给予有效量的上述药物组合物。
术语定义和说明
除非另有说明，本申请说明书和权利要求书中记载的基团和术语定义，包括其作为实例的定义、示例性的定义、优选的定义、表格中记载的定义、实施例中具体化合物的定义等，可以彼此之间任意组合和结合。这样的组合和结合后的基团定义及化合物结构，应当属于本申请说明书记载的范围内。
本申请说明书和权利要求书记载的数值范围，当该数值范围被定义为“整数”时，应当理解为记载了该范围的两个端点以及该范围内的每一个整数。例如，“0～6的整数”应当理解为记载了0、1、2、3、4、5和6的每一个整数。“更多个”表示三个或三个以上。
术语“卤素”指F、Cl、Br和I。换言之，F、Cl、Br和I在本说明书中可描述为“卤素”。
术语“C1-40烷基”应理解为表示具有1～40个碳原子的直链或支链饱和一价烃基，优选为C1-10烷基。“C1-10烷基”应理解为优选表示具有1、2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子的直链或支链饱和一价烃基。所述烷基是例如甲基、乙基、丙基、丁基、戊基、己基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基、异戊基、2-甲基丁基、1-甲基丁基、1-乙基丙基、1,2-二甲基丙基、新戊基、1,1-二甲基丙基、4-甲基戊基、3-甲基戊基、2-甲基戊基、1-甲基戊基、2-乙基丁基、1-乙基丁基、3,3-二甲基丁基、2,2-二甲基丁基、1,1-二甲基丁基、2,3-二甲基丁基、1,3-二甲基丁基或1,2-二甲基丁基等或它们的异构体。特别地，所述基团具有1、2、3、4、5、6、个碳原子(“C1-6烷基”)，例如甲基、乙基、丙基、丁基、异丙基、异丁基、仲丁基、叔丁基，更特别地，所述基团具有1、2或3个碳原子(“C1-3烷基”)，例如甲基、乙基、正丙基或异丙基。
术语“C2-40烯基”应理解为表示直链或支链的一价烃基，其包含一个、两个或多个双键并且具有2～40个碳原子，优选“C2-10烯基”。“C2-10烯基”应理解为优选表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个双键并且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，例如C2-6烯基、C2-3烯基，应理解，在所述烯基包含多于一个双键的情况下，所述双键可相互分离或者共轭。所述烯基是例如乙烯基、烯丙基、(E)-2-甲基乙烯基、(Z)-2-甲基乙烯基、(E)-丁-2-烯基、(Z)-丁-2-烯基、(E)-丁-1-烯基、(Z)-丁-1-烯基、戊-4-烯基、(E)-戊-3-烯基、(Z)-戊-3-烯基、(E)-戊-2-烯基、(Z)-戊-2-烯基、(E)-戊-1-烯基、(Z)-戊-1-烯基、己-5-烯基、(E)-己-4-烯基、(Z)-己-4-烯基、(E)-己-3-烯基、(Z)-己-3-烯基、(E)-己-2-烯基、(Z)-己-2-烯基、(E)-己-1-烯基、(Z)-己-1-烯基、异丙烯基、2-甲基丙-2-烯基、1-甲基丙-2-烯基、2-甲基丙-1-烯基、(E)-1-甲基丙-1-烯基、(Z)-1-甲基丙-1-烯基、3-甲基丁-3-烯基、2-甲基丁-3-烯基、1-甲基丁-3-烯基、3-甲基丁-2-烯基、(E)-2-甲基丁-2-烯基、(Z)-2-甲基丁-2-烯基、(E)-1-甲基丁-2-烯基、(Z)-1-甲基丁-2-烯基、(E)-3-甲基丁-1-烯基、(Z)-3-甲基丁-1-烯基、(E)-2-甲基丁-1-烯基、(Z)-2-甲基丁-1-烯基、(E)-1-甲基丁-1-烯基、(Z)-1-甲基丁-1-烯基、1,1-二甲基丙-2-烯基、1-乙基丙-1-烯基、1-丙基乙烯基、1-异丙基乙烯基。
术语“C2-40炔基”应理解为表示直链或支链的一价烃基，其包含一个、两个或多个三键并且具有2～40个碳原子，优选“C2-10炔基”。术语“C2-10炔基”应理解为优选表示直链或支链的一价烃基，其包含一个或多个三键并且具有2、3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子，例如C2-3炔基、C2-6炔基。所述炔基是例如乙炔基、丙-1-炔基、丙-2-炔基、丁-1-炔基、丁-2-炔基、丁-3-炔基、戊-1-炔基、戊-2-炔基、戊-3-炔基、戊-4-炔基、己-1-炔基、己-2-炔基、己-3-炔基、己-4-炔基、己-5-炔基、1-甲基丙-2-炔基、2-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-3-炔基、1-甲基丁-2-炔基、3-甲基丁-1-炔基、1-乙基丙-2-炔基、3-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-4-炔基、1-甲基戊-4-炔基、2-甲基戊-3-炔基、1-甲基戊-3-炔基、4-甲基戊-2-炔基、1-甲基戊-2-炔基、4-甲基戊-1-炔基、3-甲基戊-1-炔基、2-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-3-炔基、1-乙基丁-2-炔基、1-丙基丙-2-炔基、1-异丙基丙-2-炔基、2,2-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-3-炔基、1,1-二甲基丁-2-炔基或3,3-二甲基丁-1-炔基。特别地，所述炔基是乙炔基、丙-1-炔基或丙-2-炔基。
术语“C3-20环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3～20个碳原子，优选“C3-10环烷基”。术语“C3-10环烷基”应理解为表示饱和的一价单环或双环烃环，其具有3、4、5、6、7、8、9或10个碳原子。所述C3-10环烷基可以是单环烃基，如环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、环辛基、环壬基或环癸基，或者是双环烃基如十氢化萘环。
术语“3-20元杂环基”意指饱和的一价单环或双环烃环，其包含1-5个独立选自N、O和S的杂原子，优选“3-10元杂环基”。术语“3-10元杂环基”意指饱和的一价单环或双环烃环，其包含1-5个，优选1-3个选自N、O和S的杂原子。所述杂环基可以通过所述碳原子中的任一个或氮原子(如果存在的话)与分子的其余部分连接。特别地，所述杂环基可以包括但不限于：4元环，如氮杂环丁烷基、氧杂环丁烷基；5元环，如四氢呋喃基、二氧杂环戊烯基、吡咯烷基、咪唑烷基、吡唑烷基、吡咯啉基；或6元环，如四氢吡喃基、哌啶基、吗啉基、二噻烷基、硫代吗啉基、哌嗪基或三噻烷基；或7元环，如二氮杂环庚烷基。任选地，所述杂环基可以是苯并稠合的。所述杂环基可以是双环的，例如但不限于5,5元环，如六氢环戊并[c]吡咯-2(1H)-基环，或者5,6元双环，如六氢吡咯并[1,2-a]吡嗪-2(1H)-基环。含氮原子的环可以是部分不饱和的，即它可以包含一个或多个双键，例如但不限于2,5-二氢-1H-吡咯基、4H-[1,3,4]噻二嗪基、4,5-二氢噁唑基或4H-[1,4]噻嗪基，或者，它可以是苯并稠合的，例如但不限于二氢异喹啉基。根据本发明，所述杂环基是无芳香性的。
术语“C6-20芳基”应理解为表示具有6～20个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环，优选“C6-14芳基”。术语“C6-14芳基”应理解为优选表示具有6、7、8、9、10、11、12、13或14个碳原子的一价芳香性或部分芳香性的单环、双环或三环烃环(“C6-14芳基”)，特别是具有6个碳原子的环(“C6芳基”)，例如苯基；或联苯基，或者是具有9个碳原子的环(“C9芳基”)，例如茚满基或茚基，或者是具有10个碳原子的环(“C10芳基”)，例如四氢化萘基、二氢萘基或萘基，或者是具有13个碳原子的环(“C13芳基”)，例如芴基，或者是具有14个碳原子的环(“C14芳基”)，例如蒽基。
术语“5-20元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5～20个环原子且包含1-5个独立选自N、O和S的杂原子，例如“5-14元杂芳基”。术语“5-14元杂芳基”应理解为包括这样的一价单环、双环或三环芳族环系：其具有5、6、7、8、9、10、11、12、13或14个环原子，特别是5或6或9或10个碳原子，且其包含1-5个，优选1-3各独立选自N、O和S的杂原子并且，另外在每一种情况下可为苯并稠合的。特别地，杂芳基选自噻吩基、呋喃基、吡咯基、噁唑基、噻唑基、咪唑基、吡唑基、异噁唑基、异噻唑基、噁二唑基、***基、噻二唑基、噻-4H-吡唑基等以及它们的苯并衍生物，例如苯并呋喃基、苯并噻吩基、苯并噁唑基、苯并异噁唑基、苯并咪唑基、苯并***基、吲唑基、吲哚基、异吲哚基等；或吡啶基、哒嗪基、嘧啶基、吡嗪基、三嗪基等，以及它们的苯并衍生物，例如喹啉基、喹唑啉基、异喹啉基等；或吖辛因基、吲嗪基、嘌呤基等以及它们的苯并衍生物；或噌啉基、酞嗪基、喹唑啉基、喹喔啉基、萘啶基、蝶啶基、咔唑基、吖啶基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基等。
除非另有说明，杂环基、杂芳基或亚杂芳基包括其所有可能的异构形式，例如其位置异构体。因此，对于一些说明性的非限制性实例，吡啶基或亚吡啶基包括吡啶-2-基、亚吡啶-2-基、吡啶-3-基、亚吡啶-3-基、吡啶-4-基和亚吡啶-4-基；噻吩基或亚噻吩基包括噻吩-2-基、亚噻吩-2-基、噻吩-3-基和亚噻吩-3-基。
除非另外指明，否则本文所用的术语“离去基团”应意指在取代或置换反应过程中脱离的带电或不带电的原子或基团。合适的例子包括但不限于H、F、Br、Cl、I、甲磺酸酯基、甲苯磺酸酯基等。
在任何用于制备本发明化合物的方法中，可能必需和/或期望保护任何有关分子上的敏感或反应性基团。这可通过常规的保护基来实现，如本领域教科书或工具书描述的保护基。可使用本领域已知的方法在方便的后续阶段移除保护基团。本领域技术人员将认识到，取决于具体的保护基团，可将其他试剂用于该去保护步骤，包括但不限于Pd/C、Pd(OH)2、PdCl2、Pd(OAc)2/Et3SiH、兰尼镍、适当选择的酸、适当选择的碱、氟化物等等。
可以根据已知的方法，例如通过萃取、过滤或柱层析来分离目标化合物。
根据其分子结构，本发明的化合物可以是手性的，因此可能存在各种对映异构体形式。因而这些化合物可以以消旋体形式或光学活性形式存在。本发明的化合物或其中间体可以通过本领域技术人员公知的化学或物理方法分离为对映异构体化合物，或者以此形式用于合成。在外消旋的胺的情况中，通过与光学活性的拆分试剂反应，从混合物制得非对映异构体。适当的拆分试剂的示例是光学活性的酸，例如R和S形式的酒石酸、二乙酰酒石酸、二苯甲酰酒石酸、扁桃酸、苹果酸、乳酸、适当的N-保护的氨基酸(例如N-苯甲酰脯氨酸或N-苯磺酰基脯氨酸)或各种光学活性的樟脑磺酸。借助光学活性的拆分试剂(例如固定在硅胶上的二硝基苯甲酰基苯基甘氨酸、三乙酸纤维素或其它碳水化合物的衍生物或手性衍生化的异丁烯酸酯聚合物)，也可有利地进行色谱对映体拆分。用于此目的的适当的洗脱剂是含水或含醇的溶剂混合物，例如，己烷/异丙醇/乙腈。
本领域技术人员将理解，由于氮需要具有可用的孤对电子用于被氧化为氧化物，因此并非所有的含氮杂环都可以形成N-氧化物；本领域技术人员将识别能够形成N-氧化物的含氮杂环。本领域技术人员还将认识到叔胺能够形成N-氧化物。制备杂环和叔胺的N-氧化物的合成方法对于本领域技术人员而言是熟知的，所述合成方法包括用过氧酸如过氧乙酸和间氯过氧苯甲酸(MCPBA)、过氧化氢、烷基氢过氧化物如叔丁基氢过氧化物、过硼酸钠和双环氧乙烷(dioxirane)如二甲基双环氧乙烷氧化杂环和叔胺。这些制备N-氧化物的方法已在文献中广泛地描述和综述。
药学上可接受的盐可以是例如在链或环中具有氮原子的具有足够碱性的本发明的化合物的酸加成盐，例如与如下无机酸形成的酸加成盐：例如盐酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸，或硫酸氢盐、或者与如下有机酸形成的酸加成盐：例如甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。
另外，具有足够酸性的本发明的化合物的另一种适合的药学上可接受的盐是碱金属盐(例如钠盐或钾盐)、碱土金属盐(例如钙盐或镁盐)、铵盐，或与提供生理学可接受的阳离子的有机碱形成的盐，例如与如下物质形成的盐：钠离子、钾离子、N-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、葡甲胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、1-氨基-2,3,4-丁三醇。作为实例，所述药学上可接受的盐包括基团-COOH与如下物质形成的盐：钠离子、钾离子、钙离子、镁离子、N-甲基葡糖胺、二甲基葡糖胺、乙基葡糖胺、赖氨酸、二环己基胺、1,6-己二胺、乙醇胺、葡糖胺、葡甲胺、肌氨酸、丝氨醇、三羟基甲基氨基甲烷、氨基丙二醇、1-氨基-2,3,4-丁三醇。
另外，碱性含氮基团可用如下试剂季铵化：低级烷基卤化物，例如甲基、乙基、丙基和丁基氯化物、溴化物和碘化物；硫酸二烷基酯，例如硫酸二甲酯、硫酸二乙酯、硫酸二丁酯和硫酸二戊酯；长链卤化物，例如癸基、月桂基、肉豆蔻基和硬脂基氯化物、溴化物和碘化物；芳烷基卤化物如苄基和苯乙基溴化物等。作为实例，药学上可接受的盐包括盐酸盐、硫酸盐、硝酸盐、硫酸氢盐、氢溴酸盐、醋酸盐、草酸盐、柠檬酸盐、甲磺酸盐、甲酸盐或葡甲胺盐等。
由于本发明的化合物可存在多个成盐位点，所述“药学上可接受的盐”不仅包括本发明化合物其中1个成盐位点上形成的盐，而且还包括其中2、3或全部成盐位点上形成的盐。为此，所述“药学上可接受的盐”中式(I)化合物与成盐所需的酸的根离子(阴离子)或碱的阳离子摩尔比可以在较大的范围内变化，例如可以是4:1～1:4，如3:1、2:1、1:1、1:2、1:3等。
根据本发明，药学上可接受的阴离子包括选自由无机酸或有机酸电离生成的阴离子。所述“无机酸”包括但不限于盐酸、氢氟酸、氢溴酸、氢碘酸、硫酸、焦硫酸、磷酸或硝酸。所述“有机酸”包括但不限于甲酸、乙酸、乙酰乙酸、丙酮酸、三氟乙酸、丙酸、丁酸、己酸、庚酸、十一烷酸、月桂酸、苯甲酸、水杨酸、2-(4-羟基苯甲酰基)苯甲酸、樟脑酸、肉桂酸、环戊烷丙酸、二葡糖酸、3-羟基-2-萘甲酸、烟酸、扑酸、果胶酯酸、过硫酸、3-苯基丙酸、苦味酸、特戊酸、2-羟基乙磺酸、衣康酸、氨基磺酸、三氟甲磺酸、十二烷基硫酸、乙磺酸、苯磺酸、对甲苯磺酸、甲磺酸、2-萘磺酸、萘二磺酸、樟脑磺酸、柠檬酸、酒石酸、硬脂酸、乳酸、草酸、丙二酸、琥珀酸、苹果酸、己二酸、藻酸、马来酸、富马酸、D-葡糖酸、扁桃酸、抗坏血酸、葡庚酸、甘油磷酸、天冬氨酸、磺基水杨酸、半硫酸或硫氰酸。
术语“互变异构体”是指因分子中某一原子在两个位置迅速移动而产生的官能团异构体。本发明化合物可表现出互变异构现象。互变异构的化合物可以存在两种或多种可相互转化的种类。质子移变互变异构体来自两个原子之间共价键合的氢原子的迁移。互变异构体一般以平衡形式存在，尝试分离单一互变异构体时通常产生一种混合物，其理化性质与化合物的混合物是一致的。平衡的位置取决于分子内的化学特性。例如，在很多脂族醛和酮如乙醛中，酮型占优势；而在酚中，烯醇型占优势。本发明包含化合物的所有互变异构形式。
术语“有效量”或者“治疗有效量”是指足以实现预期应用(包括但不限于如下定义的疾病治疗)的本发明所述化合物的量。治疗有效量可以取决于以下因素而改变：预期应用(体外或者体内)，或者所治疗的受试者和疾病病症如受试者的重量和年龄、疾病病症的严重性和给药方式等，其可以由本领域普通技术人员容易地确定。具体剂量将取决于以下因素而改变：所选择的特定化合物、所依据的给药方案、是否与其它化合物组合给药、给药的时间安排、所给药的组织和所承载的物理递送***。
术语“辅料”是指可药用惰性成分。赋形剂种类的实例非限制性地包括粘合剂、崩解剂、润滑剂、助流剂、稳定剂、填充剂和稀释剂等。赋形剂能增强药物制剂的操作特性，即通过增加流动性和/或粘着性使制剂更适于直接压缩。适用于上述制剂的典型的药学上可接受的载体的实例为：糖类，例如乳糖、蔗糖、甘露醇和山梨醇；淀粉类，例如玉米淀粉、木薯淀粉和土豆淀粉；纤维素及其衍生物，例如羧甲基纤维素钠，乙基纤维素和甲基纤维素；磷酸钙类，例如磷酸二钙和磷酸三钙；硫酸钠；硫酸钙；聚乙烯吡咯烷酮；聚乙烯醇；硬脂酸；硬脂酸碱土金属盐，例如硬脂酸镁和硬脂酸钙；硬脂酸；植物油类，例如花生油、棉籽油、芝麻油、橄榄油和玉米油；非离子、阳离子和负离子表面活性剂；乙二醇聚合物；脂肪醇类；和谷物水解固形物以及其它无毒的可相容的填充剂、粘合剂、崩解剂、缓冲剂、防腐剂、抗氧剂、润滑剂、着色剂等在药物制剂中常用到的辅料。
本发明的有益效果包括：
本发明提供的化合物具有优异的ROCK抑制活性。此外，本发明化合物具有较好的安全性和代谢稳定性。进一步地，本发明的化合物潜在心脏毒性风险小。最后本发明的化合物制备方法简单、易于提纯，因此具有良好的应用前景。
具体实施方式
下文将结合具体实施例对本发明的通式化合物及其制备方法和应用做更进一步的详细说明。下列实施例仅为示例性地说明和解释本发明，而不应被解释为对本发明保护范围的限制。凡基于本发明上述内容所实现的技术均涵盖在本发明旨在保护的范围内。
除非另有说明，以下实施例中使用的原料和试剂均为市售商品，或者可以通过已知方法制备。
<制备实施例>
实施例1、化合物(QR001)的制备
1.1化合物(QR001-SM1)的制备
冰浴下向异丙胺(5g,84mmol)的二氯甲烷(20mL)溶液中加入碳酸钾(18g,126mmol)，然后缓慢滴加氯乙酰氯(12g,100.8mmol)，滴毕，室温过夜反应。加水，用乙酸乙酯萃取，有机相干燥减压浓缩得白色固体9g。
1H NMR(DMSO-d6,400MHz):δ8.04(s,1H),3.98(s,2H),3.85-3.80(m,1H),1.07(d,J＝6.4Hz,6H)。
1.2化合物(QR001-3)的制备
室温下向化合物QR001-SM1(3g,13.6mmol)的DMF(30mL)溶液中加入碳酸钾(2.8g,20.4mmol)和3-羟基苯硼酸频哪醇酯(2.8g,20.4mmol，CAS：214360-76-6)，加毕，80℃反应16小时。加水(50mL)，用乙酸乙酯萃取，有机相干燥，减压浓缩后用硅胶柱层析纯化得白色固体3.9g。LC-MS:[M+H]+＝320.1。
1.3化合物(QR001-2)的制备
将2,4-二氯吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪(290mg，1.5mmol，CAS:918538-05-3)和1-BOC-5-氨基吲唑(300mg，1.28mmol，CAS：129488-10-4)溶解在乙醇(10mL)溶液内，滴加DIEA(497mg，3.85mmol)，室温搅拌过夜。反应结束后，加入水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，减压浓缩后得到粗产品500mg，为黄色固体。
LC-MS:[M+1]+＝385.1。
1.4化合物(QR001-4)的制备
化合物QR001-2(200mg，0.52mmol)，硼酸酯QR001-3(248mg，0.78mmol，CAS:1595290-47-3)，Pd(OAc)2(11.7mg，0.052mmol)，XPhos(25mg，0.052mmol)和K3PO4(330mg，1.56mmol)分散在二氧六环(10mL)和水(2mL)中。氮气保护下，加热到110℃回流16小时。反应结束后，冷却到室温，加入水和乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，无水硫酸钠干燥，浓缩并通过柱层析纯化得到白色固体100mg。LC-MS:[M+1]+＝542.1。
1.5化合物(QR001)的制备
化合物QR001-4(100mg,0.185mmol)溶解在DCM(4mL)和TFA(2mL)中,在室温下搅拌2小时，反应液减压浓缩后，用制备高效液相色谱(NH4CO3方法)纯化，冷冻干燥后得白色固体30mg。
HNMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.11(br,1H),9.99(s,1H),8.38(s,1H),8.15(s,1H),7.92(d,J＝8.0Hz,1H),7.86-7.84(m,2H),7.82-7.79(m,2H),7.63(d,J＝8.8Hz,1H),7.42(t,J＝8.4Hz,1H),7.19(s,1H),7.09-7.06(m,1H),6.78-6.76(m,1H),4.52(s,2H),4.01-3.94(m,1H),1.10(d,J＝6.4Hz,6H)。LC-MS:[M+H]+＝442.1。
实施例2、化合物(QR003)和(QR004)的制备
2.1化合物(QR003-2)和(QR003-2A)的制备
2,4-二氯吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪(1.2g,6.4mmol)溶解在乙腈(40mL)中，在室温下分批加入1-氯甲基-4-氟-1,4-重氮化二环2.2.2辛烷双(四氟硼酸)盐(Selectfluor)(CAS:140681-55-6)(2.5g,7.06mmol)氟代试剂，加完室温下搅拌2小时后加热到80℃，继续反应16小时。冷却浓缩后，用硅胶柱层析纯化，得到氟代产物980mg，为黄色固体，核磁鉴定为QR003-2和QR003-2A的混合物。
2.2化合物(QR003-SM2)的制备
5-硝基吲唑(1.63g，10mmol，CAS:5401-94-5)溶解在100mL无水二氯甲烷中，在0℃下加入TEA(5mL)和2-(三甲基硅烷基)乙氧甲基氯(SEM-Cl)(1.67g，10mmol，CAS:76513-69-4)，加完室温搅拌2小时。浓缩后，用硅胶柱层析纯化，得到QR003-SM1约2.6g。
QR003-SM1(500mg，1.7mmol)溶解在20mL甲醇中，加入钯碳(200mg)，在加氢环境下室温搅拌3小时，反应完全后，过滤，浓缩后，用硅胶柱层析纯化，得到QR003-SM2约402mg。
2.3化合物(QR003-3)和(QR003-3A)的制备
化合物(QR003-2)和(QR003-2A)的混合物(560mg,2.73mmol)与化合物QR003-SM2(718mg,2.73mmol)溶解在25mL四氢呋喃中，搅拌下滴加二异丙基乙二胺(1.07g,8.19mmol)。加毕，室温下反应12小时。反应液浓缩后，用制备硅胶板纯化，分离得到产物QR003-3A 260mg，为淡黄色固体。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.29(d,J＝1.2Hz,1H),8.11(s,1H),7.68-7.59(m,2H),7.50-7.48(m,1H),7.42-7.40(m,1H),5.80(s,2H),3.61(t,J＝8.0Hz,2H),0.95(t,J＝8.0Hz,2H),0.05(s,9H)。LC-MS:[M+H]+＝433.0。
并且还分离得到产物QR003-3，进一步用制备高效液相色谱纯化，冻干后得到白色固体300mg。
1H NMR(400MHz,CDCl3):δ8.12(s,1H),8.06(s,1H),7.71-7.68(m,1H),7.57-7.55(m,1H),7.51(s,1H),6.14(s,1H),5.82(s,2H),3.63(t,J＝8.0Hz,2H),0.95(t,J＝8.0Hz,2H),0.05(s,9H)。LC-MS:[M+H]+＝433.1。
2.4化合物(QR003-4)和(QR003-4A)的制备
化合物QR003-3(300mg,0.693mmol)，硼酸酯QR001-3(331mg，1.04mmol),Pd(OAc)2(16mg,0.07mmol)，XPhos(33mg,0.07mmol)和磷酸钾(441mg,2.08mmol)加入到二氧六环(20mL)和水(3mL)中，反应体系氮气保护下，加热到100℃反应16小时。冷却浓缩后用制备硅胶板纯化，得到QR003-4为黄色固体180mg。LC-MS:[M+H]+＝590.3。
参考上述制备方法，化合物QR003-3A(260mg,0.6mmol),硼酸酯QR001-3(287mg，0.9mmol)，Pd(OAc)(14mg,0.06mmol),XPhos(29mg,0.06mmol)和磷酸钾(382mg,1.8mmol)加入到二氧六环(20mL)和水(3mL)中，反应体系氮气保护下，加热到100℃反应16小时。冷却浓缩后用制备硅胶板纯化，得到QR003-4A黄色固体120mg。LC-MS:[M+H]+＝590.3.
2.5化合物(QR003)和(QR004)的制备
化合物QR003-4(150mg,0.254mmol)溶解在三氟乙酸(2mL)和二氯甲烷(4mL)中，室温搅拌4小时。反应液减压浓缩后，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得QR003白色固体35mg。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ13.10(br,1H),10.13(s,1H),8.34(s,1H),8.16(s,1H),7.94-7.92(m,1H),7.85-7.83(m,2H),7.77-7.76(m,1H),7.64(d,J＝8.8Hz,1H),7.42(t,J＝8.0Hz,1H),7.14(br,1H),7.10-7.07(m,1H),6.49-6.47(m,1H),4.51(s,2H),4.00-3.95(m,1H),1.10(d,J＝6.4Hz,6H)。LC-MS:[M+H]+＝460.1。
参考上述制备方法，化合物QR003-4A(120mg,0.2mmol)溶解在三氟乙酸(2mL)和二氯甲烷(2mL)中，室温搅拌1小时。反应液减压浓缩后，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得QR004白色固体33mg。
1H NMR(400MHz,DMSO-d6):δ13.10(br,1H),9.32(s,1H),8.19(s,1H),8.13(s,1H),7.91-7.89(m,1H),7.75-7.70(m,4H),7.60(d,J＝4.8Hz,1H),7.37(t,J＝8.0Hz,1H),7.05-7.03(m,1H),6.68(s,1H),4.48(s,2H),3.99-3.94(m,1H),1.09(d,J＝6.8Hz,6H)。LC-MS:[M+H]+＝460.1。
实施例3、化合物(QR005)的制备
3.1化合物(QR005-2)的制备
化合物QR001-2(500mg,1.299mmol)，3-羟基苯硼酸(213mg,1.55mmol，CAS：87199-18-6)，K3PO4(550mg，2.59mmol)，Pd(OAc)2(30mg,0.132mmol)和XPhos(61mg，0.128mmol)加入到二氧六环(20mL)和水(3mL)中，100℃下搅拌过夜。反应结束后，反应液减压浓缩，通过柱层析纯化得到黄色固体200mg。
LC-MS:[M+1]+＝343.1。
3.2化合物(QR005-3)的制备
化合物QR005-2(180mg，0.52mmol)和二甲氨基吡啶(6mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷中(20mL),冰浴下加入Boc酸酐(170mg,0.78mmol)。在室温下搅拌4小时，反应结束。加入水和DCM萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩后柱层析纯化得到黄色的固体250mg。LC-MS:[M+1]+＝443.3。
3.3化合物(QR005-4)的制备
将化合物QR005-3(230mg，0.519mmol)，2-氯-1-吗啉乙酮(126mg，0.779mmol，CAS：1440-61-5)，碳酸钾(142mg，1.03mmol)和碘化钠(43mg，0.26mmol)分散在DMF(20mL)中，室温下搅拌反应14小时。反应结束后，加入水和乙酸乙酯萃取，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体200mg。
LC-MS:[M+1]+＝570.3。
3.4化合物(QR005)的制备
将化合物QR005-4(30mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(1mL)中，室温下搅拌2h。反应结束后浓缩，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得白色固体3mg。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.26(s,1H),8.00(s,1H),7.84-7.81(m,2H),7.76(d,J＝8.4Hz,1H),7.58(s,1H),7.51(d,J＝8.8Hz,1H),7.28(t,J＝8.4Hz,1H),6.98-6.93(m,2H),6.65-6.63(m,1H),4.73(s,2H),3.55-3.52(m,4H),3.49-3.41(m,4H)。LC-MS:[M+H]+＝470.1。
实施例4、化合物(QR006)的制备
4.1化合物(QR006-2)的制备
2,4-二氯吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪(1.5g，7.57mmol)，对碘苯胺(1.66g,7.57mmol)和三乙胺(3.22mL,22.71mmol)分散在50mL四氢呋喃中，氮气保护下于回流反应24小时。冷却到室温，减压浓缩，用硅胶柱层析纯化得到产品2.3g，为黄色固体。LC-MS:[M+H]+＝370.9。
4.2化合物(QR006-3)的制备
化合物QR006-2(775mg,2.094mmol),1-BOC-吡唑-4-硼酸频哪醇酯(739mg,2.513mmol，CAS：552846-17-0),Pd(dppf)Cl2(77mg,0.1mmol)和碳酸钾(873mg,6.282mmol)加入到四氢呋喃(40mL)和水(8mL)中，氮气保护下加热到85℃反应12小时。减压浓缩，用柱层析纯化得到产品318mg，为黄色固体。在长时间加热条件下，保护基Boc会脱除。LC-MS:[M+H]+＝311.3。
4.3化合物(QR006)的制备
化合物QR006-3(143mg,0.46mmol)，硼酸酯QR001-3(220mg,0.69mmol),Pd(dppf)Cl2(40mg,0.046mmol)和碳酸钾(320mg,2.3mmol)加入到二氧六环(30mL)和水(4mL)中，反应体系氮气保护下加热到100℃反应16小时。反应液减压浓缩后，先用制备硅胶板分离纯化,再用制备高效液相色谱(NH4CO3方法)进一步纯化，冷冻干燥后得产品5.8mg，为黄色固体。
1H NMR(400MHz,CD3OD):δ13.80(br,1H)，8.68(s,2H),8.60(s,1H)，7.90(d,J＝8.0Hz,2H),7.84-7.80(m,2H),7.79-7.77(m,2H),7.66(d,J＝8.8Hz,1H),7.48(t,J＝8.4Hz,1H),7.17(s,1H),7.09-7.06(m,1H),6.79-6.77(m,1H),4.53(s,2H),4.05-3.96(m,1H),1.10(d,J＝6.4Hz,6H)。LC-MS:[M+H]+＝468.1。
实施例5、化合物(QR007)的制备
5.1化合物(QR007-2)的制备
将化合物QR005-3(230mg，0.519mmol)，N-(2-氯乙基)丙烷-2-胺盐酸盐(123mg，0.779mmol，CAS：6306-61-2)，碳酸钾(142mg，1.03mmol)和碘化钠(43mg，0.26mmol)分散在DMF(20mL)中，室温下搅拌反应14小时。反应结束后加入水和乙酸乙酯萃取，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体158mg。LC-MS:[M+1]+＝528.3。
5.2化合物(QR007)的制备
将化合物QR007-2(26mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(1mL)中，室温下搅拌2h。反应结束后浓缩，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得白色固体3mg。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.31(s,1H),8.02(s,1H),7.85-7.83(m,2H),7.78(d,J＝8.3Hz,1H),7.57(s,1H),7.50(d,J＝8.6Hz,1H),7.29(t,J＝8.3Hz,1H),6.98-6.93(m,2H),6.66-6.64(m,1H),4.13(t,J＝7.1Hz,1H),2.97(t,J＝7.1Hz,1H),2.83(m,1H),1.06(d,J＝6.8Hz,6H)。LC-MS:[M+H]+＝428.1。
实施例6、化合物(QR008)的制备
6.1化合物(QR008-2)的制备
将化合物QR005-3(230mg，0.519mmol)，2-氯-N-环丙基乙酰胺(104mg，0.779mmol，CAS：19047-31-5)，碳酸钾(142mg，1.03mmol)和碘化钠(43mg，0.26mmol)分散在DMF(20mL)中，室温下搅拌反应14小时。反应结束后加入水和乙酸乙酯萃取，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体167mg。
LC-MS:[M+1]+＝540.3。
6.2化合物(QR008)的制备
将化合物QR008-2(27mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(1mL)中，室温下搅拌2h。反应结束后浓缩，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得白色固体3mg。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.31(s,1H),8.05(s,1H),7.87-7.83(m,2H),7.72(d,J＝8.4Hz,1H),7.56(s,1H),7.54(d,J＝8.8Hz,1H),7.26(t,J＝8.4Hz,1H),6.99-6.95(m,2H),6.64-6.62(m,1H),4.42(s,2H),2.69(m,1H),0.82(m,2H)，0.57(m,2H)。[M+H]+＝440.3.
实施例7、化合物(QR027)的制备
7.1化合物(QR027-2)的制备
在室温搅拌下，向化合物N-BOC-5-溴异二氢吲哚(1.0g，3.35mmol，CAS：201940-08-1)的DMSO(20mL)溶液加双联频那醇硼酸酯(1.02g，4.02mmol)，碳酸钾(0.656g，6.7mmol)和四三苯基膦钯(0.30g,0.26mmol)。反应体系氮气保护下加热到90℃反应16小时。冷却室温，加入水，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压浓缩后，用硅胶柱层析纯化，得到白色固体800mg。LC-MS:[M-55]+＝290.1.
7.2化合物(QR027-3)的制备
在冰浴搅拌下，向化合物QR027-2(0.8g，2.30mmol)的水(20mL)溶液加30％的双氧水(1mL)和氢氧化钠(1N,1mL)。室温搅拌3小时后，反应结束。加入乙酸乙酯稀释后过滤，有机相用碳酸氢钠溶液洗涤，低温减压浓缩，硅胶柱层析纯化得到白色固体500mg。LC-MS:[M-55]+＝180.1。
7.3化合物(QR027-4)的制备
在室温搅拌下，向化合物QR027-3(700mg，2.97mmol)的DMF(10mL)溶液中加碘甲烷(845mg，5.95mmol)和碳酸钾(822mg，5.95mmol)。室温搅拌5小时后，反应结束。加入水，乙酸乙酯萃取，有机相用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压浓缩后，硅胶柱层析纯化得到白色固体600mg。LC-MS:[M-55]+＝194.1.
7.4化合物(QR027-5)的制备
在室温搅拌下，向化合物QR027-4(600mg，2.40mmol)的甲醇(10mL)溶液中加HCl的1,4二氧六环溶液(5mL，2M)。室温搅拌5小时后，反应结束。减压浓缩后得到300mg产品盐酸盐，为白色固体。LC-MS:[M+H]+＝150.1。
7.5化合物(QR027-6)的制备
在室温搅拌下，向化合物QR027-5(38mg，0.253mmol)的DMF(3mL)溶液加入化合物QR001-2(98mg，0.253mmol)和DIEA(65mg，0.506mmol)。加完，反应液加热到100℃反应16小时。冷却后加入水，乙酸乙酯萃取。有机相合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥。减压浓缩后，硅胶柱层析得到白色固体70mg。LC-MS:[M-100]+＝498.1。
7.6化合物(QR027)的制备
在室温搅拌下，向化合物QR027-6(58mg，0.117mmol)的甲醇(10mL)溶液加HCl的1,4-二氧六环溶液(3mL，4M)，室温搅拌2小时后，反应结束。用制备高效液相色谱(NH4CO3方法)纯化，冷冻干燥后得得到白色固体7mg。
1H NMR(400MHz，DMSO-d6)δ13.00(s,1H),8.59(d,J＝5.3Hz,1H),8.15(s,1H),7.88-7.85(m,1H),7.63-7.58(m,2H),7.43(d,J＝8.4Hz,1H),7.33(d,J＝6.8Hz,1H),7.20-7.17(m,1H),7.03(s,1H),6.89-6.86(m,1H),4.84-4.80(m,4H),3.77(s,3H)。LC-MS:[M+H]+＝398.1.
实施例8、化合物(QR029)的制备
8.1化合物(QR029-2)的制备
将化合物QR005-3(230mg，0.519mmol)，2-氯-N-(2,2,2-三氟乙基)乙酰胺(137mg，0.779mmol，CAS：170655-44-4)，碳酸钾(142mg，1.03mmol)和碘化钠(43mg，0.26mmol)分散在DMF(20mL)中，室温下搅拌反应14小时。反应结束后加入水和乙酸乙酯萃取，有机相合并后用饱和食盐水洗涤，用无水硫酸钠干燥，减压浓缩得到黄色固体181mg。LC-MS:[M+1]+＝582.4。
8.2化合物(QR029)的制备
将化合物QR029-2(30mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(1mL)中，室温下搅拌2h。反应结束后浓缩，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得白色固体3mg。
1H NMR(400MHz，CD3OD)：δ8.32(s,1H),8.07(s,1H),7.87-7.83(m,2H),7.76(d,J＝8.3Hz,1H),7.59(s,1H),7.55(d,J＝8.4Hz,1H),7.27(t,J＝8.2Hz,1H),6.98-6.93(m,2H),6.65-6.63(m,1H),4.41(s,2H),3.72(m,2H)。LC-MS:[M+H]+＝482.1.
实施例9、化合物(QR031)的制备
9.1化合物(QR031-2)的制备
化合物2,4-二氯吡咯[2,1-f][1,2,4]三嗪(1.52g,8.19mmol)和化合物QR003-SM2(2.15g,8.19mmol)溶解在75mL四氢呋喃中，搅拌下滴加二异丙基乙二胺(3.21g,24.57mmol)。加毕，室温下反应12小时。反应液浓缩后，用硅胶柱层析纯化，分离得到产物QR031-2 678mg,为淡黄色固体。LC-MS:[M+H]+＝415.1。
9.2化合物(QR031-3)的制备
化合物QR031-2(538mg,1.299mmol)，3-氨基苯硼酸盐(239mg,1.55mmol，CAS：206658-89-1)，K3PO4(550mg，2.59mmol)，Pd(OAc)2(30mg,0.132mmol)和XPhos(61mg，0.128mmol)加入到二氧六环(20mL)和水(3mL)中，100℃下搅拌过夜。反应结束后，反应液减压浓缩，通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体245mg。LC-MS:[M+1]+＝472.1。
9.3化合物(QR031-4)的制备
化合物QR031-3(200mg,0.43mmol)加入到5mL无水二氯甲烷中，然后加入(二甲基氨基)乙酰氯(56mg，0.47mmol，CAS：51552-16-0)，滴加TEA(130mg，1.29mmol)，室温反应1小时，反应完全后，水淬灭，二氯甲烷萃取，通过硅胶柱层析纯化得到黄色固体143mg。LC-MS:[M+1]+＝457.3。
9.4化合物(QR031)的制备
将化合物QR031-4(23mg，0.05mmol)溶解在二氯甲烷(2mL)和三氟乙酸(1mL)中，室温下搅拌2h。反应结束后浓缩，用制备高效液相色谱纯化，冷冻干燥后得白色固体7mg。
H NMR(400MHz，DMSO-d6)：δ13.08(br,1H),9.93(s,1H),8.23(s,1H),8.11(s,1H),7.82(d,J＝8.2Hz,1H),7.86-7.84(m,2H),7.85-7.82(m,2H),7.68(d,J＝8.1Hz,1H),7.47(t,J＝8.1Hz,1H),7.15(s,1H),7.09-7.06(m,1H),6.77-6.74(m,1H),4.15(s,2H),2.88(s,6H)。LC-MS:[M+H]+＝427.4。
实施例10
参考上述实施例的制备方法，制备得到如下化合物：
化合物编号 LC-MS:[M+H]+ 化合物编号 LC-MS:[M+H]+
QR002 443.2 QR021 456.2
QR009 486.3 QR022 471.2
QR010 456.1 QR023 467.1
QR011 467.4 QR024 486.2
QR012 472.2 QR025 510.6
QR013 467.3 QR026 478.1
QR014 510.4 QR028 470.4
QR015 456.1 QR030 466.1
QR016 472.2 QR032 414.5
QR017 467.4 QR033 469.3
QR018 456.4 QR034 413.3
QR019 459.2 QR035 453.1
QR020 510.3 QR036 549.2
。
<生物学活性测试试验>
1.体外激酶活性评价
ROCK2活性筛选。用96孔(Cisbio)时间分辨荧光测定法来检测ROCK2活性。ROCK2测定是在以下测定缓冲液中运行：5mM MgCl2(Sigma)，1mM DTT(Sigma)和1X激酶缓冲液。采用激酶缓冲液稀释，先加入3μL的0.4ng/μLROCK2激酶(Invitrogen，PV3759)于96微孔板，再加入适当稀释的4μL的待测化合物，DMSO含量2.5％(体积分数)，室温下孵育0.5h。为了启动反应，使用激酶缓冲液，将6.739μM ATP(阿拉丁)和1μM底物STK-底物2-生物素一起混合后，加入3μL混合液于微孔板，继续室温孵育2h。使用5mL检测缓冲液与STK抗体-Cryptate进行混合，然后取适当体积与链霉亲和素-XL665等体积混合，向微孔板中加入10μL该混合物来终止反应。继续孵育约1h后，在Molecular Devices Spectra Max i3x多功能酶标仪上读板。其中，激酶缓冲液、STK-底物2-生物素、检测缓冲液、STK抗体-Cryptate、链霉亲和素-XL665均来自HTRF KinEASE-STK kit(Cisbio，1000tests，61GSTXLA)。
2.体外ROCK1激酶选择性评价
用96孔(Cisbio)时间分辨荧光测定法来检测ROCK1活性。ROCK1测定是在以下测定缓冲液中运行：5mM MgCl2(Sigma)，1mM DTT(Sigma)和1X激酶缓冲液。采用激酶缓冲液稀释，先加入3μL的0.4ng/μL ROCK1激酶(Invitrogen)于96微孔板，再加入适当稀释的4μL的待测化合物，DMSO含量2.5％，室温下孵育0.5h。为了启动反应，也使用激酶缓冲液，将3.528μM ATP(阿拉丁)和1μM底物STK-底物2-生物素一起混合后，加入3μL混合液于微孔板，继续室温孵育2h。使用5mL检测缓冲液与STK抗体-Cryptate进行混合，然后取适当体积与链霉亲和素-XL665等体积混合，加入10μL混合物来终止反应。继续孵育约1h后，在MolecularDevices SpectraMax i3x多功能酶标仪上读板。其中，激酶缓冲液、STK-底物2-生物素、检测缓冲液、STK抗体-Cryptate、链霉亲和素-XL665均来自HTRF KinEASE-STK kit(Cisbio，1000tests，61GSTXLA)。
实施例11
下表1中各化合物都在ROCK2生物化学试验中通过细胞测定法进行了测试，发现其均具有活性，在试验中，所有化合物的IC50都低于10μM，其中有些化合物的IC50≤100nM(活性水平A)，有些的IC50＞100nM且≤400nM(活性水平B)，有些的IC50＞400nM且≤800nM(活性水平C)，其它的IC50＞800nM且≤10μM(活性水平D)。确定各种化合物对ROCK2的抑制，IC50值报告于表1中。
表1化合物对ROCK2的抑制
化合物编号 IC50 化合物编号 IC50
QR001 B QR019 C
QR002 B QR020 B
QR003 B QR021 C
QR004 B QR022 C
QR005 B QR023 C
QR006 C QR024 C
QR007 B QR025 C
QR008 B QR026 B
QR009 B QR027 C
QR010 B QR028 B
QR011 B QR029 B
QR012 B QR030 B
QR013 B QR031 B
QR014 B QR032 B
QR015 B QR033 B
QR016 B QR034 C
QR017 B QR035 C
QR018 B QR036 B
表1可以确定本发明的化合物对ROCK2激酶均具有较好的抑制活性，表明本发明母核片段作为ROCK2抑制剂的可能性。对于数个化合物还观察到对ROCK1及ROCK2的差别抑制，如表2所示。以下表2显示基于本发明化合物母核结构不同位点进行了修饰的化合物对ROCK1及ROCK2的选择性抑制。每个化合物的IC50值(以nM计)显示对于抑制ROCK2的选择性。
表2：本发明化合物对ROCK1及ROCK2的抑制
实施例12本发明化合物的体外细胞毒性测试
对本发明中化合物的体外细胞毒性测试在HepG2细胞中利用CCK-8法进行测定。收集对数期的HepG2细胞(北纳生物)，调整细胞悬液浓度，以50000cells/well在96孔细胞培养板中铺板，将细胞置于5％，37℃的细胞培养箱中孵育过夜，待板中细胞融合度达到80-90％后，换液加入各浓度梯度的待测化合物或溶媒(DMSO)，在5％，37℃的细胞培养箱中孵育48小时。处理结束后，弃去板内培养基，用PBS洗涤2遍，每孔加入100μL CCK-8工作液(碧云天生物技术)，37℃避光孵育1.5小时，酶标仪上检测OD450nm处各孔的吸光值，分析计算各化合物的CC50。使用上述方法获得的CC50示于表3中。
表3.各化合物所获得的CC50
化合物 HepG2 CC50(μM)
QR001 >200
QR003 >200
QR004 >200
QR005 >200
QR015 >200
针对本发明的其他实施例化合物也进行了上述实验，发现本发明的化合物均具有较好的安全性，CC50范围均>10μM，优选CC50>30μM，更优选CC50>50μM。
实施例13本发明化合物的体外代谢稳定性试验
对本发明中化合物的体外代谢稳定性利用各种属肝微粒体温孵法进行测定。在肝微粒体反应体系中(1mg/mL肝微粒体蛋白，25U/mL6-磷酸葡萄糖脱氢酶，1mM NADP，6mM D-6-磷酸葡萄糖，5mM MgCl2)加入适量供试化合物，放入37℃水浴锅温孵启动反应，于各时间点取100μL反应液加入至含400μL0℃预冷的内标工作液(含200ng/mL***、双氯酚酸、甲苯磺丁脲、拉贝洛尔的乙腈溶液)离心管中，终止反应，4℃离心机10000g离心10min，取上清液进LC-MS进行分析检测，获得供试化合物在各种属肝微粒体中的体外代谢半衰期。使用上述方法获得的T1/2示于表4中。
表4.各化合物在肝微粒体蛋白中代谢半衰期
针对本发明的实施例化合物进行了上述实验，发现本发明的化合物在人、大鼠、小鼠中均具有较好的代谢稳定性，优选在人肝微粒体中T1/2>30min，更优选在人肝微粒体中T1/2>90min。发明人还对进入临床阶段的ROCK抑制剂KD-025进行了对比实验，发现本发明优选化合物体外稳定性优于KD-025。
实施例14本发明化合物对hERG电流影响检测试验
对本发明中化合物对hERG的影响利用手动膜片钳检测化合物对HEK293细胞稳定表达的hERG通道电流法进行测定。hERG钾通道稳定表达的HEK293细胞系在含有10％胎牛血清及0.8mg/mL G418的DMEM培养基中培养，培养温度为37℃，二氧化碳浓度为5％。以每个细胞培养皿2.5×105cells的密度接种于6厘米细胞培养皿。为维持细胞的电生理活性，细胞融合度不超过80％。膜片钳检测前，用细胞解离酶TrypLETM Express将细胞分离，将3*103细胞铺到盖玻片上，在24孔板中培养(最终体积：500μL)，18个小时后，进行实验检测。将形成全细胞封接后细胞膜电压钳制于-80mV，并逐渐由-80mV除极至+30mV维持2.5秒，然后迅速保持在-50mV维持4秒，以此可以激发出hERG通道的尾电流。每隔10秒重复采集数据，观察药物对hERG尾电流的作用。以-50mV为漏电流检测。实验数据由EPC-10放大器(HEKA)进行采集并储存于PatchMaster(HEKA)软件中。
当全细胞记录的hERG电流稳定后开始给药，每个药物浓度作用5分钟(或者电流至稳定)。将铺有细胞的盖玻片置于倒置显微中的记录浴槽中，测试化合物以及不含化合物的外液利用重力灌流的方法从低浓度到高浓度依次流经记录小室从而作用于细胞，在记录中利用真空泵进行液体交换。每一个细胞在不含化合物的外液中检测到的电流作为自己的对照组。独立重复检测多个细胞。所有电生理实验在室温下进行。使用上述方法获得化合物10μM时对hERG电流的影响，表示于表5中。
表5各化合物浓度为10μM时对hERG的单点抑制率
化合物 hERG单点抑制率(10μM)
QR001 23.36±0.54％
QR003 29.4±3.83％
QR004 38.67±0.28％
QR005 8.68±0.28％
QR015 19.34±0.3％
KD-025 74.31±0.36％
针对本发明的其他实施例化合物也进行了上述实验，发现本发明的化合物具有非常小的心脏毒性风险，优选hERG单点抑制率(10μM)<50％，更优选hERG单点抑制率(10μM)<30％，本发明化合物的潜在心脏毒性风险小于KD-025。
在本说明书的描述中，参考术语“一个实施例”、“一些实施例”、“示例”、“具体示例”、或“一些示例”等的描述意指结合该实施例或示例描述的具体特征、结构、材料或者特点包含于本发明的至少一个实施例或示例中。在本说明书中，对上述术语的示意性表述不必须针对的是相同的实施例或示例。而且，描述的具体特征、结构、材料或者特点可以在任一个或多个实施例或示例中以合适的方式结合。此外，在不相互矛盾的情况下，本领域的技术人员可以将本说明书中描述的不同实施例或示例以及不同实施例或示例的特征进行结合和组合。
尽管上面已经示出和描述了本发明的实施例，可以理解的是，上述实施例是示例性的，不能理解为对本发明的限制，本领域的普通技术人员在本发明的范围内可以对上述实施例进行变化、修改、替换和变型。

Claims (14)

1.式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐：
其中，X1、X2、X3相同或不同，彼此独立地选自CR1、N或NH；所述R1相同或不同，彼此独立地选自H、CN、卤素、OH、NH2、COOH、NO2，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Ra取代的如下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C1-10烷氧基；
A选自如下基团：
当A选自时，R2选自-O-(CH2)y-C(＝O)NR13R14、-O-(CH2)y-NR13R14、-O-(CH2)y-S(＝O)2NR13R14、-NH-C(＝O)-(CH2)y-NR13R14、或-NH-C(＝O)-(CH2)y-R15；每一个R3相同或不同，彼此独立地选自H、卤素，或者如下基团：C1-10烷基或卤代C1-10烷基；
当A选自时，R2选自C1-10烷基或C1-10烷氧基，每一个R3相同或不同，彼此独立地选自H、卤素，或者如下基团：C1-10烷基或卤代C1-10烷基；
m选自1或2；n选自0或1；y选自0-6的整数；
Y选自NR4、O或S；
B选自如下基团：
其中，R5选自H、C1-10烷基或卤代C1-10烷基；
每一个R4相同或不同，彼此独立地选自H，或者如下基团：C1-10烷基或卤代C1-10烷基；
R13、R14相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：C1-10烷基、C2-10烯基、C2-10炔基、C3-10环烷基、3-10元杂环基；或者，R13、R14与其相连的N构成无取代或任选被一个、两个或更多个Re取代的如下基团：3-10元杂环基；
R15选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个Rf取代的如下基团：C1-10烷基、C1-10烷氧基或3-20元杂环基；
每一个Ra相同或不同，彼此独立地选自CN、卤素、OH、COOH、NO2；
每一个Re、Rf相同或不同，彼此独立地选自卤素、OH、CN、NH2、C1-10烷基、卤代C1-10烷基、-C(＝O)-C1-10烷基或C(＝O)-卤代C1-10烷基；
处表示连接位点；
选自共轭环。
2.根据权利要求1所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，
y选自0-4的整数。
3.根据权利要求1或2所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，其中，X1、X2、X3相同或不同，彼此独立地选自CR1或N；所述R1相同或不同，彼此独立地选自H、卤素、CN、OH、NH2、COOH、NO2、或者无取代或任选被一个、两个或更多个Ra取代的如下基团：C1-6烷基、C1-6烷氧基；
m选自1或2；n选自0或1；y选自0、1、2或3；
Y选自NR4、O或S；其中所述R4相同或不同，彼此独立地选自H、C1-6烷基或卤代C1-6烷基；
R5选自选自H、C1-6烷基或卤代C1-6烷基；
R13、R14相同或不同，彼此独立地选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个卤素、CN、NH2取代的如下基团：C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、3-10元杂环基；或者，R13、R14与其相连的N构成3-10元杂环基；
R15选自H，或者无取代或任选被一个、两个或更多个卤素、OH、CN、NH2、卤代C1-6烷基、-C(＝O)-C1-6烷基、C(＝O)-卤代C1-6烷基取代的如下基团：C1-6烷基、C1-6烷氧基或3-10元杂环基。
4.根据权利要求1或2所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I所示的化合物选自如下结构：
其中，各基团具有如权利要求1或2所述的定义。
5.根据权利要求1或2所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I所示的化合物选自如下结构：
其中，各基团具有权利要求1或2所述的定义。
6.根据权利要求1或2所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐，其特征在于，所述式I所示的化合物选自下列结构：
7.根据权利要求1-6任一项所述的式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐的制备方法，其特征在于，包括如下方案中的至少一种：
方案1’：
a1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；
a2’)化合物II-3’与化合物II-4’经Suzuki偶联反应得到化合物II-5’；
a3’)化合物II-5’脱保护基得到化合物I-A；
或者方案2’：
b1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；
b2’)化合物II-3’与化合物II-6’经Suzuki偶联反应得到化合物II-7’；
b3’)化合物II-7’与化合物L-R2在碱性条件下反应得到化合物II-5’；
b4’)化合物II-5’脱保护基得到化合物I-A；
或者方案3’：
c1’)化合物II-1’与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2’；c2’)化合物IV-2’与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4’；c3’)化合物IV-4’与化合物IV-5’经Suzuki偶联反应得到化合物I-C；或者方案4’：
d1’)化合物II-1’与化合物II-2’在碱性条件下反应得到化合物II-3’；d2’)化合物II-3’与化合物III-1’在碱性条件下反应得到化合物III-2’；d3’)化合物III-2’脱保护基得到化合物I-B；
或者方案5’：
e1’)化合物II-1’与化合物IV-1’在碱性条件下反应得到化合物IV-2’；
e2’)化合物IV-2’与化合物IV-3经Suzuki偶联反应得到化合物IV-4’；
e3’)化合物IV-4’与化合物III-1’在碱性条件下反应得到化合物I-D；
其中，X1、X2、X3、R2、R3、m、n、Y、具有权利要求1～6任一项所述的定义，X5、L选自离去基团；PG为氨基保护基。
8.权利要求1～6任一项所述式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体或其药学上可接受的盐中的至少一种在制备药物中的用途，所述药物用于预防或治疗一种或多种ROCK的高表达或ROCK的过度激活导致的疾病。
9.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病选自心脑血管疾病、神经***疾病、纤维化疾病、眼疾病、肿瘤、辐射损伤、呼吸***疾病、以及自身免疫性疾病。
10.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病选自动脉粥样硬化、动脉血栓形成病症、急性冠脉综合征、高血压、脑血管痉挛、脑缺血、再狭窄、心脏病、糖尿病、糖尿病肾病、癌症、神经元变性、神经损伤性疾病、脊髓损伤、***功能障碍、血小板凝聚、白细胞聚集、青光眼、眼部高血压、哮喘、骨质疏松症、肺纤维化、肝纤维化、肾脏纤维化、COPD、肾透析、肾小球硬化症。
11.根据权利要求8所述的用途，其特征在于，所述疾病选自特发性肺纤维化、缺血性脑卒中、心脏衰竭、心肌肥厚、心肌缺血再灌注损伤以及神经元变性炎症。
12.一种药物组合物，其特征在于，包含治疗有效量的权利要求1～6任一项所述式I所示的化合物、其消旋体、立体异构体、互变异构体、或药学上可接受的盐中的至少一种。
13.根据权利要求12所述的药物组合物，其特征在于，所述药物组合物还包含药学上可接受的辅料。
14.根据权利要求13所述的药物组合物，其特征在于，所述辅料选自下列中的至少一种：崩解剂、助流剂、润滑剂、稀释剂、填充剂、粘合剂或着色剂。
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