CN111778172B - 一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用，生产抗菌活性化合物的链霉菌命名为链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2020年1月7日，保藏编号为CCTCC M 2020020，地址为：中国武汉市武汉大学。该新型链霉菌能够生产化合物rishirilide A，产量达到相当可观的12mg/L；且本发明还发现化合物rishirilide A具有抗生素活性，具备被开发成高效抗感染候选药物的特点。

Description

一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用
技术领域
本发明属于生物医药技术领域，具体涉及一种链霉菌及其分离方法和应用，尤其涉及一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用。
背景技术
面对日益肆虐的细菌性耐药问题，不久的将来人类将面临无药可用的境遇，因此开发新型的抗生素迫在眉睫。微生物来源的抗菌活性化合物是高效抗生素的重要来源之一，以微生物代谢产物研制开发的抗生素是抗感染药物的重要组成部分。
链霉菌是最高等的放线菌，有发育良好的分枝菌丝，菌丝无横隔，分化为营养菌丝、气生菌丝、孢子丝。孢子丝再形成分生孢子，孢子丝和孢子的形态、颜色因种而异，是分种的主要识别性状之一。已报道的链霉菌有千余种，主要分布于土壤中。以链霉菌为来源分离抗菌活性化合物的报道已有一些。
CN103965275A公开了一种链霉菌发酵代谢产物新奥霉素的分离提取方法，方法包括：首先将发酵液先加热升温至60℃，杀灭发酵液中的链霉菌活菌体，通过滤布或陶瓷微滤膜除去新奥霉素发酵液中培养基固形物和菌体杂质后，除去固形物的发酵液经大孔吸附树脂吸附处理，然后用阳离子交换树脂吸附富集大孔吸附树脂流出液中的新奥霉素，最后，采用0.5-5.0％氨水进行解析、浓缩，制成新奥霉素母液，这是一种新的低成本制备新型生物农药新奥霉素母药或制剂的方法。
CN105010399A公开了一种利迪链霉菌发酵液中抗真菌活性物质的分离纯化方法，步骤为：(1)将利迪链霉菌S.lydicus E9保藏号为CGMCC No.3075的发酵液离心，上清加絮凝剂，抽滤得滤液；(2)滤液经大孔树脂层析柱，用甲醇水溶液冲洗，再用乙醇水溶液洗脱活性成分；(3)合并活性洗脱液并浓缩得浓缩液；(4)浓缩液经葡聚糖凝胶层析柱进行分子筛层析，用乙醇水溶液洗脱，收集抗真菌活性组分。
但现有技术中关于以链霉菌为来源分离抗菌活性化合物的报道还很有限，分离得到的活性化合物的类型也很有限，因此开发出一种能生产新型抗菌活性化合物的新型链霉菌是非常有意义的。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种链霉菌及其分离方法和应用，尤其提供一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用。
为达到此发明目的，本发明采用以下技术方案：
一方面，本发明提供一种生产抗菌活性化合物的链霉菌，所述生产抗菌活性化合物的链霉菌命名为链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2020年1月7日，保藏编号为CCTCC M 2020020，地址为：中国武汉市武汉大学。
本发明首次发现了一种新型链霉菌，其能够生产化合物rishirilide A，其产量达到相当可观的12mg/L；且本发明还首次发现化合物rishirilide A具有抗生素活性，具备被开发成高效的抗感染候选药物的特点。
优选地，所述链霉菌从土壤中分离得到。
本发明所涉及的链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株是从江西省宜春市高安市田南镇陈村大城自然村土壤中分离得到的。
优选地，所述分离使用的培养基为M2固体培养基，其配方为：每升培养基中含有葡萄糖4.0g，酵母膏4.0g，麦芽膏10.0g，琼脂15.0g，碳酸钙2g，蒸馏水1000mL，pH 7.2。
优选地，所述分离的培养温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间为7-13天，例如7天、8天、10天、12天或13天等，范围内的其他点值均可选择，在此便不再一一赘述。
本发明所涉及的链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株为革兰氏阳性菌株，好氧放线菌，在TSB固体培养基上生长有可溶性色素产生。在对该链霉菌的鉴定试验中涉及到的基因组DNA的提取、16S rDNA的PCR的扩增、序列比对和***进化树的构建以及生理学、化学和形态学的初步鉴定等均参考文献(Pan H.-Q.,Zhang D.-F.,Li L.,Jiang Z.,Cheng J.,Zhang Y.-G.,Wang H.-F.,Hu J.-C.,Li W.-J.,Nocardiopsis oceani sp.nov.andNocardiopsis nanhaiensis sp.nov.,two novel actinomycete isolated from marinesediment of South China Sea.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2015,65:3384-3391.)中的方法进行。
第二方面，本发明提供一种如上所述的链霉菌在制备化合物rishirilide A中的应用。
我们首次发现该菌株是稀有的可以生产化合物rishirilide A的生产菌株，并且产率很好，有利于降低该化合物的生产成本，有利于后期对该活性化合物的开发利用，这为化合物rishirilide A的制备工艺提供了一种新的策略。
第三方面，本发明提供一种化合物rishirilide A的制备方法，所述制备方法为从如上所述的链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株的发酵培养物中制备分离得到。
优选地，所述制备方法的具体流程如图1所示，具体包括如下步骤：
(1)制备链霉菌ZSYNo2的发酵培养物；
(2)将步骤(1)得到的发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，分别萃取、浓缩后，得到浸膏，即发酵培养物的粗提物；
(3)将步骤(2)得到的粗提物进行固相萃取，甲醇/水梯度洗脱，收集洗脱馏分；
(4)将步骤(3)得到的洗脱馏分进行硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇梯度洗脱，收集洗脱馏分；
(5)将步骤(4)得到的洗脱馏分进行液相层析，乙腈/水梯度洗脱，得到所述化合物rishirilide A。
优选地，步骤(1)所述发酵培养物的制备方法具体包括：
(a)将活化的链霉菌ZSYNo2接入种子培养基中，培养得到种子液；
(b)将种子液接入到发酵培养基中，培养制得发酵培养物；
优选地，步骤(a)所述培养的温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间为70-75h，例如70h、71h、72h、73h、74h或75h等，振荡速度为150-250rpm，例如150rpm、180rpm、200rpm、220rpm或250rpm等。上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(b)所述种子液接种量为5-15％，具体是指种子液在发酵培养基中的体积占比为5-15％，例如5％、8％、9％、10％、12％、14％或15％等，范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
优选地，步骤(b)所述培养的温度为25-30℃，例如25℃、26℃、27℃、28℃、29℃或30℃等，时间为6-8天，例如6天、7天或8天等，振荡速度为150-250rpm，例如150rpm、180rpm、200rpm、220rpm或250rpm等。上述范围内的具体点值均可选择，在此便不再一一赘述。
上述涉及的种子培养基和发酵培养的配方为：按质量分数100％计，包括葡萄糖20％，大豆蛋白胨10％，缬氨酸2.34％，CaCO3 2％，CoCl2溶液(1mg/mL)1mL，pH 7.2，按上述组分和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min。
优选地，步骤(2)所述发酵液使用乙酸乙酯进行萃取；
优选地，步骤(2)所述菌丝体先使用丙酮进行萃取得到提取液，然后将提取液用乙酸乙酯进行萃取。
步骤(2)的具体操作示例性地可以为：将发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯的萃取液浓缩得到浸膏A；发酵物的菌丝体部分先用等体积的丙酮萃取，合并提取液，回收之后用等体积的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩之后得到浸膏B，将浸膏A和B合并，得到完整的链霉菌Streptomyces sp.ZSYNo2的发酵培养物的粗提物。
优选地，步骤(3)所述洗脱馏分为甲醇体积占比为60％时洗脱下来的馏分。
优选地，步骤(4)所述洗脱馏分为乙酸乙酯体积占比为100％时洗脱下来的馏分。
步骤(3)-(5)的具体操作示例性地可以为：粗提物经甲醇溶解，过固相萃取柱子，用梯度浓度的甲醇水溶液进行洗脱(30％，60％，80％，100％)，收集洗脱液，旋蒸浓缩获得相应的馏分(A1，A2，A3，A4)，其中60％洗脱馏分再次经过硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇洗脱***(1:0，2:1，1:1，0:1)，收集乙酸乙酯/甲醇体积比1:0洗脱馏分，得到馏分(B1，B2，B3，B4)。将得到的馏分B1进行制备液相层析，乙腈/水***梯度洗脱(30％-90％乙腈，20min，2mL/min流速)，在保留时间15min，得到化合物rishirilide A。
作为本发明的优选技术方案，所述化合物rishirilide A的制备方法具体包括如下步骤：
(1)将活化的链霉菌ZSYNo2接入种子培养基中，25-30℃，150-250rpm，培养70-75h制得种子液，将种子液以体积比5-15％的接种量接入到发酵培养基中，25-30℃，150-250rpm，振荡培养6-8天，制备链霉菌ZSYN02的发酵培养物；
(2)将步骤(1)得到的发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯的萃取液浓缩得到浸膏A；发酵物的菌丝体先用丙酮萃取，合并提取液，回收之后用乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩之后得到浸膏B，将浸膏A和B合并，得到完整的链霉菌ZSYN02的发酵培养物的粗提物；
(3)将步骤(2)得到的粗提物经甲醇溶解，过固相萃取柱子，梯度浓度的甲醇洗脱(30％,60％,80％,100％)，收集洗脱液，旋蒸浓缩获得相应的馏分(A1，A2，A3，A4)，其中60％洗脱馏分再次经过硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇洗脱***(1:0，2:1，1:1，0:1)，收集乙酸乙酯/甲醇体积比1:0洗脱馏分，得到馏分(B1，B2，B3，B4)；将得到的馏分B1进行制备液相层析，乙腈/水***梯度洗脱(30％-90％乙腈，20min，2mL/min流速)，在保留时间15min，得到单体化合物rishirilide A。
第四方面，本发明提供一种如上所述的制备方法制备得到的化合物rishirilideA。
第五方面，本发明提供化合物rishirilide A在制备抗菌药物中的应用。
优选地，所述抗菌药物为抗***药物。
本发明首次发现化合物rishirilide A对包括粪肠球菌(Enterococcus faecalisATCC 29212)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213，Staphylococcusaureus ATCC 25923，Staphylococcus aureus ATCC 100910)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC14579)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis ATCC 19433)，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)，黄色微球菌(Micrococcus flavus)在内的多种革兰氏阳性致病菌均有很好的抗菌活性。其对耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300)的MIC低至16ug/mL，比阳性对照所使用的抗生素氨苄青霉素(ampicillin)具有更强的抑菌活性。同时显示化合物rishirilide A对革兰氏阴性菌的大肠杆菌，铜绿假单胞菌等均没有抑制作用。由此可见化合物rishirilide A具有很好的选择性抑制***活性，有望成为抗菌新药。
相对于现有技术，本发明具有以下有益效果：
本发明首次分离得到一种新型链霉菌，其能够生产化合物rishirilide A，其产量达到相当可观的12mg/L；且该化合物rishirilide A具有显著的抗生素活性，具备被开发成高效的抗感染化合物的候选药物的特点。
附图说明
图1是本发明所涉及的化合物rishirilide A的制备方法的流程示意图；
图2是实施例1分离得到的链霉菌的菌落形态图；该链霉菌命名为链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心(CCTCC)，保藏时间为2020年1月7日，保藏编号为CCTCC M 2020020，地址为：中国武汉市武汉大学；
图3是链霉菌ZSYNo2基于16s rDNA序列的邻接法重建的与之亲缘关系最为接近的种之间关系的***发育树示意图；
图4是化合物Rishirilide A的1H NMR图谱；
图5是化合物Rishirilide A的13C NMR图谱；
图6是化合物Rishirilide A的HSQC图谱；
图7是化合物Rishirilide A的HMBC图谱；
图8是化合物Rishirilide A的ROESY图谱；
图9是化合物Rishirilide A的高分辨质谱图；
图10是化合物Rishirilide A的紫外吸收谱图；
图11是化合物Rishirilide A的结构式及NMR信号示意图。
具体实施方式
下面通过具体实施方式来进一步说明本发明的技术方案。本领域技术人员应该明了，所述实施例仅仅是帮助理解本发明，不应视为对本发明的具体限制。
实施例1
本实施例对链霉菌(Streptomyces sp.)ZSYNo2菌株进行分离。详细分离方法如下：
(1)以江西省宜春市高安市田南镇大城自然村土壤为分离源，以S型取样方法进行取样，然后混合均匀，装入灭菌自封袋，放4℃冰箱冷藏备用。
(2)实验前先将靶标土壤在60℃烘箱中烘4h，然后用锡箔纸称取土壤0.5g，取6支灭菌试管，将土壤放入装有5mL灭菌蒸馏水的试管中，用枪反复推打或晃动试管得到土壤悬液，然后取500μL至第二支试管反复推吸，依次进行梯度稀释。
(3)将六支试管的土壤悬液用灭菌棉签涂于M2固体培养基平板上(M2配方：葡萄糖4g，酵母膏4g，麦芽膏10g，琼脂15g，碳酸钙2g，1L单蒸馏水)，然后将平板倒置于恒温培养箱中，28℃下避光培养7天。
(4)观察平板，根据平板上菌落周围培养基有凹陷，菌落坚硬的现象筛选出目标菌落，并进一步划板纯化，得到所述链霉菌。
实施例2
本实施例对实施例1分离得到的链霉菌进行形态学特征和生理生化分析以及分子生物学鉴定。
该菌株为革兰氏阳性菌株，好氧放线菌，图2为菌株在TSB固体培养基上的菌落形态图，该菌株带有泥腥味，菌落外观形态为：从平板上链霉菌形态来看，菌丝坚实、干燥、多皱，呈螺纹状。菌丝体陷入培养基内，菌落与培养基结合较紧，不易挑起，表面布满亮白色孢子，其在TSB固体培养基上生长有可溶性色素产生。根据以上菌落形态特征，将ZSYNo2归为链霉菌属。
实施例3
本实施例对实施例1分离得到的链霉菌参考文献(Pan H.-Q.,Zhang D.-F.,LiL.,Jiang Z.,Cheng J.,Zhang Y.-G.,Wang H.-F.,Hu J.-C.,Li W.-J.,Nocardiopsisoceani sp.nov.and Nocardiopsis nanhaiensis sp.nov.,two novel actinomyceteisolated from marine sediment of South China Sea.Int.J.Syst.Evol.Microbiol.2015,65:3384-3391.)中的方法进行基因组DNA的提取、PCR扩增16S rDNA并测定，获得1428个碱基，序列如下所示。将序列提交到了Genbank中，对16S rDNA核苷酸序列进行了BLAST分析比对，并进行了***发育树分析，***发育树如图3所示。由此该菌株被鉴定为链霉菌Streptomyces sp.，命名为ZSYNo2：
GGCGTGCTTAACACATGCAAGTCGAACGATGAAGCCCTTCGGGGTGGATTAGTGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAATCTGCCCTTCACTCTGGGACAAGCCCTGGAAACGGGGTCTAATACCGGATACCACTCCTGCCTGCATGGGCGGGGGTTGAAAGCTCCGGCGGTGAAGGATGAGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCCACCAAGGCGACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGACACGGCCCAGACTCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCACAATGGGCGAAAGCCTGATGCAGCGACGCCGCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCAGGGAAGAAGCGAAAGTGACGGTACCTGCAGAAGAAGCGCCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGCGCAAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGCTTGTCACGTCGGATGTGAAAGCCCGAGGCTTAACCTCGGGTCTGCATTCGATACGGGCTAGCTAGAGTGTGGTAGGGGAGATCGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGAAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGGCGGATCTCTGGGCCATTACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGATACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGTTGGGAACTAGGTGTTGGCGACATTCCACGTCGTCGGTGCCGCAGCTAACGCATTAAGTTCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAGGAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGCTTAATTCGACGCAACGCGAAGAACCTTACCAAGGCTTGACATATACCGGAAAGCATTAGAGATAGTGCCCCCCTTGTGGTCGGTATACAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGAGCGCAACCCTTGTCCTGTGTTGCCAGCATGCCCTTCGGGGTGATGGGGACTCACAGGAGACCGCCGGGGTCAACTCGGAGGAAGGTGGGGACGACGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCTTGGGCTGCACACGTGCTACAATGGCCGGTACAATGAGCTGCGATACCGTGAGGTGGAGCGAATCTCAAAAAGCCGGTCTCAGTTCGGATTGGGGTCTGCAACTCGACCCCATGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATCGCAGATCAGCATTGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCACGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCGGTGGCCCAACCCGTAAGGGAGGGAGCTGTCGAAGGTGGGACTGGCGATG。
实施例4
本实施例提供一种rishirilide A的制备方法，具体操作为：
(1)将活化的链霉菌ZSYNo2接入种子培养基中，25-30℃，150-250rpm，培养70-75h制得种子液，将种子液以体积比5-15％的接种量接入到发酵培养基中，25-30℃，150-250rpm，振荡培养6-8天，制备链霉菌ZSYN02的发酵培养物；所述种子培养基和发酵培养的配方为：按质量分数100％计，包括葡萄糖20％，大豆蛋白胨10％，缬氨酸2.34％，CaCO32％，CoCl2溶液(1mg/mL)1mL，pH 7.2，按上述组分和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30min；
(2)将步骤(1)得到的发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯的萃取液浓缩得到浸膏A；发酵物的菌丝体先用等体积的丙酮萃取，合并提取液，回收之后用等体积的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩之后得到浸膏B，将浸膏A和B合并，得到完整的链霉菌ZSYNo2的发酵培养物的粗提物；
(3)将步骤(2)得到的粗提物经甲醇溶解，过固相萃取柱子，梯度浓度的甲醇洗脱(30％,60％,80％,100％)，收集洗脱液，旋蒸浓缩获得相应的馏分(A1，A2，A3，A4)，其中馏分A2再次经过硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇洗脱***(1:0，2:1，1:1，0:1)，收集乙酸乙酯/甲醇体积比1:0洗脱馏分，得到馏分(B1，B2，B3，B4)；将得到的馏分B1进行制备液相层析，乙腈/水***梯度洗脱(30％-90％乙腈，20min，2mL/min流速)，在保留时间15min，得到单体化合物，为黄色固体粉末。计算得到每升发酵液可以获得12mg产物，即产量为12mg/L。
实施例5
本实施例对实施例4制得的化合物进行化学结构鉴定。
(1)1H-NMR图谱测定，如图4所示，数据如表1所示，存在如下信号：4个芳环次甲基质子信号(δH 7.01，7.25，6.99，7.59)，3个次甲基质子信号(δH2.77，5.51,1.39)，两组亚甲基质子信号(δH 1.49-1.70，2.54)以及3个甲基质子信号(δH 0.89，0.87，1.22)。
(2)13C-NMR图谱测定，如图5所示，数据如表1所示，存在如下信号：2个羰基碳(δC199.4，177.5)，1个酚羟基碳(δC 156.7)，7个sp2杂化的次甲基碳(δC 120.7，131.1，123.8，131.8，139.6，123.2，131.9)，3个连氧碳(δC82.1，85.3，81.8)，1个连氧叔碳(δC 64.5)，以及其他7个sp3杂化的亚甲基或者甲基碳(δC 50.7，32.6，30.9，29.9，23.1，22.7，12.6)。
(3)HSQC图谱测定，如图6所示。
(4)HMBC图谱测定，如图7所示，数据如表1所示。
(5)ROESY图谱测定，如图8所示，数据如表1所示。
表1
Figure BDA0002431220870000121
Figure BDA0002431220870000131
表1中，1H-NMR数据于500MHz测定，13C-NMR数据于125MHz测定，样品溶于MeOD检测；括号中为耦合常数(Hz)。
(6)高分辨质谱分析，m/z C21H24O7(实测值[M-H]-387.1453，计算值为387.1449)，不饱和度为10，图谱如图9所示。
(7)紫外吸收光谱分析，λmax(logε):208(1.7),222(1.3),325(1.6)nm，图谱如图10所示，紫外吸收光谱UV在208nm和325nm处分别有最大吸收波长，表明该化合物中有芳香环等官能团。
由以上数据结果可知：化合物rishirilide A的碳谱氢谱数据与文献报道的rishirilide A的数据基本一致，基本可以确定该化合物的化学结构为rishirilide A，如图11所示，参考文献(Iwaki,H.,Nakayama,Y.,Takahashi,M.,Uetsuki,S.,Kido,M.,&Fukuyama,Y.Structures of rishirilides A and B,α2-macroglobulin inhibitorsproduced by Streptomyces rishiriensis OFR-1056.The Journal of antibiotics,1984,37(9),1091-1093)。
实施例6
本实施例对实施例4制得的化合物进行抗菌活性鉴定。
测定了化合物rishirilide A对于粪肠球菌(Enterococcus faecalisATCC29212)，Pseudomonas aeruginosa ATCC 27853，金黄色葡萄球菌(Staphylococcusaureus ATCC 29213，Staphylococcus aureus ATCC 25923，Staphylococcus aureus ATCC100910)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureusATCC 43300)，大肠杆菌Escherichia coli ATCC 25922，表皮葡萄球菌(Staphylococcusepidermidis ATCC 35984)，霍氏肠杆菌(Enterobacter hormaechei ATCC 700323)，鼠伤寒沙门氏菌(Salmonella typhimurium ATCC 13311，Salmonella typhimurium SL7207)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC 14579)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis ATCC19433)，酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae CEN.PK2-1c)，萜烯诺卡氏菌(Nocardiaterpenica)，植物腐生病原真菌Sarocladium kiliense，单核细胞增生利斯特菌(Listeriamonocytogenes ATCC19115)，鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii)，黄色微球菌(Micrococcus flavus)的最小抑菌浓度(minimal inhibition concentration,MIC)，实验方法参考文献报道(Engelhardt,K.,Degnes,K.F.,Kemmler,M.,Bredholt,H.,
Figure BDA0002431220870000142
E.,Klinkenberg,G.,Sletta,H.,Ellingsen,T.E.and Zotchev,S.B.,Production of a newthiopeptide antibiotic,TP-1161,by a marine Nocardiopsisspecies.Appl.Environ.Microbiol.,2010,76(15),4969-4976)中的方法进行。结果如表2所示。
表2
Figure BDA0002431220870000141
Figure BDA0002431220870000151
由表2数据可知，化合物rishirilide A对包括粪肠球菌(Enterococcus faecalisATCC 29212)，金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus ATCC 29213，Staphylococcusaureus ATCC 25923，Staphylococcus aureus ATCC 100910)，耐甲氧西林金黄色葡萄球菌(Methicillin-resistant Staphylococcus aureus ATCC 43300)，表皮葡萄球菌(Staphylococcus epidermidis ATCC 35984)，蜡样芽胞杆菌(Bacillus cereus ATCC14579)，粪肠球菌(Enterococcus faecalis ATCC 19433)，单核细胞增生利斯特菌(Listeria monocytogenes ATCC 19115)，黄色微球菌(Micrococcus flavus)在内的多种革兰氏阳性致病菌均有很好的抗菌活性。综合数据表明，化合物rishirilide A能够被用于制备革兰氏阳性菌的药物。
申请人声明，本发明通过上述实施例来说明本发明的一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用，但本发明并不局限于上述实施例，即不意味着本发明必须依赖上述实施例才能实施。所属技术领域的技术人员应该明了，对本发明的任何改进，对本发明产品各原料的等效替换及辅助成分的添加、具体方式的选择等，均落在本发明的保护范围和公开范围之内。
以上详细描述了本发明的优选实施方式，但是，本发明并不限于上述实施方式中的具体细节，在本发明的技术构思范围内，可以对本发明的技术方案进行多种简单变型，这些简单变型均属于本发明的保护范围。
另外需要说明的是，在上述具体实施方式中所描述的各个具体技术特征，在不矛盾的情况下，可以通过任何合适的方式进行组合，为了避免不必要的重复，本发明对各种可能的组合方式不再另行说明。
SEQUENCE LISTING
<110> 中国科学院深圳先进技术研究院
<120> 一种生产抗菌活性化合物的链霉菌及其分离方法和应用
<130> 2020
<160> 1
<170> PatentIn version 3.3
<210> 1
<211> 1428
<212> DNA
<213> 链霉菌ZSYNo2菌株
<400> 1
ggcgtgctta acacatgcaa gtcgaacgat gaagcccttc ggggtggatt agtggcgaac 60
gggtgagtaa cacgtgggca atctgccctt cactctggga caagccctgg aaacggggtc 120
taataccgga taccactcct gcctgcatgg gcgggggttg aaagctccgg cggtgaagga 180
tgagcccgcg gcctatcagc ttgttggtgg ggtaatggcc caccaaggcg acgacgggta 240
gccggcctga gagggcgacc ggccacactg ggactgagac acggcccaga ctcctacggg 300
aggcagcagt ggggaatatt gcacaatggg cgaaagcctg atgcagcgac gccgcgtgag 360
ggatgacggc cttcgggttg taaacctctt tcagcaggga agaagcgaaa gtgacggtac 420
ctgcagaaga agcgccggct aactacgtgc cagcagccgc ggtaatacgt agggcgcaag 480
cgttgtccgg aattattggg cgtaaagagc tcgtaggcgg cttgtcacgt cggatgtgaa 540
agcccgaggc ttaacctcgg gtctgcattc gatacgggct agctagagtg tggtagggga 600
gatcggaatt cctggtgtag cggtgaaatg cgcagatatc aggaggaaca ccggtggcga 660
aggcggatct ctgggccatt actgacgctg aggagcgaaa gcgtggggag cgaacaggat 720
tagataccct ggtagtccac gccgtaaacg ttgggaacta ggtgttggcg acattccacg 780
tcgtcggtgc cgcagctaac gcattaagtt ccccgcctgg ggagtacggc cgcaaggcta 840
aaactcaaag gaattgacgg gggcccgcac aagcggcgga gcatgtggct taattcgacg 900
caacgcgaag aaccttacca aggcttgaca tataccggaa agcattagag atagtgcccc 960
ccttgtggtc ggtatacagg tggtgcatgg ctgtcgtcag ctcgtgtcgt gagatgttgg 1020
gttaagtccc gcaacgagcg caacccttgt cctgtgttgc cagcatgccc ttcggggtga 1080
tggggactca caggagaccg ccggggtcaa ctcggaggaa ggtggggacg acgtcaagtc 1140
atcatgcccc ttatgtcttg ggctgcacac gtgctacaat ggccggtaca atgagctgcg 1200
ataccgtgag gtggagcgaa tctcaaaaag ccggtctcag ttcggattgg ggtctgcaac 1260
tcgaccccat gaagtcggag tcgctagtaa tcgcagatca gcattgctgc ggtgaatacg 1320
ttcccgggcc ttgtacacac cgcccgtcac gtcacgaaag tcggtaacac ccgaagccgg 1380
tggcccaacc cgtaagggag ggagctgtcg aaggtgggac tggcgatg 1428

Claims (3)

1.一种生产抗菌活性化合物的链霉菌在制备化合物rishirilide A中的应用，其特征在于，所述生产抗菌活性化合物的链霉菌命名为链霉菌（Streptomyces sp.）ZSYNo2菌株，保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年1月7日，保藏编号为CCTCC M2020020，地址为：中国武汉市武汉大学。
2.一种化合物rishirilide A的制备方法，其特征在于，所述制备方法为从链霉菌（Streptomyces sp.）ZSYNo2菌株的发酵培养物中制备分离得到，所述链霉菌（Streptomyces sp.）ZSYNo2菌株的保藏单位为中国典型培养物保藏中心，保藏时间为2020年1月7日，保藏编号为CCTCC M 2020020，地址为：中国武汉市武汉大学。
3.如权利要求2所述的制备方法，其特征在于，所述制备方法具体包括如下步骤：
（1）将活化的链霉菌ZSYNo2接入种子培养基中，25-30℃，150-250 rpm，培养70-75 h制得种子液，将种子液以体积比5-15%的接种量接入到发酵培养基中，25-30℃，150-250 rpm，振荡培养6-8天，制备链霉菌ZSYNo2的发酵培养物；所述种子培养基和发酵培养基的配方为：按质量分数100%计，包括葡萄糖20%、大豆蛋白胨10%、缬氨酸2.34%、CaCO3 2%和CoCl2溶液1mL，CoCl2溶液中CoCl2的浓度为1 mg/mL，种子培养基和发酵培养基的pH为7.2，按上述组分和含量混合均匀，然后121℃，灭菌30 min；
（2）将步骤（1）得到的发酵培养物的发酵液和菌丝体分离，发酵液用2倍体积的乙酸乙酯萃取，合并乙酸乙酯的萃取液浓缩得到浸膏A；发酵物的菌丝体先用等体积的丙酮萃取，合并提取液，回收之后用等体积的乙酸乙酯萃取，乙酸乙酯萃取液浓缩之后得到浸膏B，将浸膏A和B合并，得到完整的链霉菌ZSYNo2的发酵培养物的粗提物；
（3）将步骤（2）得到的粗提物经甲醇溶解，过固相萃取柱子，梯度浓度的甲醇洗脱，甲醇的梯度浓度为30%、60%、80%和100%，收集洗脱液，旋蒸浓缩获得相应的馏分A1、A2、A3和A4，其中馏分A2再次经过硅胶柱层析，乙酸乙酯/甲醇洗脱***中，乙酸乙酯与甲醇的体积比为1:0、2:1、1:1和0:1，得到馏分B1、B2、B3和B4，将得到的馏分B1进行制备液相层析，乙腈/水***梯度洗脱中，乙腈浓度为30%-90%，洗脱时间为20 min，流速为2 mL/min，在保留时间15min处，得到化合物rishirilide A。
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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CN114874916B (zh) * 2022-03-28 2023-05-26 中国地质大学（武汉） 帚枝霉属真菌（Sarocladium kiliense）ZJ-1及其应用

Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
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* Cited by examiner, † Cited by third party
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Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN103642723A (zh) * 2013-12-02 2014-03-19 江西师范大学 一种链霉菌及利用其制备两种抗生素的方法

Non-Patent Citations (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
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HIDEYUKI I WAKI.Structures of rishirilides A and B, alpha 2-macroglobulin inhibitors produced by Streptomyces rishiriensis OFR-1056.《THE JOURNAL OF ANTIBIOTICS》.1984,第7卷(第9期),第1091-1093页. *

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