CN109666606B - 一种异壁放线菌及其抗微生物和抗肿瘤活性物质的制备与应用 - Google Patents

一种异壁放线菌及其抗微生物和抗肿瘤活性物质的制备与应用 Download PDF

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Abstract

本发明涉及微生物和新型医药农药领域，具体为一种海洋异壁放线菌和以海洋异壁放线菌制备抗微生物和抗肿瘤化合物及其应用。异壁放线菌为Actinoalloteichus cyanogriseus 12A22，于2018年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018454。本发明所得的actinoalloamide A和2‑hydroxyethyl‑3‑methyl‑1,4‑naphthoquinone具有显著的抗细菌、抗真菌和细胞毒活性，它们可作为抗微生物和抗肿瘤的理想候选化合物。所述的化合物能通过微生物发酵生产，其制备方法简单、高效，所得产物纯度高。该发明具有良好的应用前景。

Description

一种异壁放线菌及其抗微生物和抗肿瘤活性物质的制备与 应用
技术领域
本发明涉及微生物和新型医药农药领域，具体为一种海洋异壁放线菌和以海洋异壁放线菌制备抗微生物和抗肿瘤化合物及其应用。
背景技术
异壁放线菌属(Actinoalloteichus)是2000年日本科学家Tomohiko Tamura发现的一个新属。迄今为止一共报道了6个新种，分别为 Actinoalloteichus cyanogriseus，Actinoalloteichus hymeniacidonis，Actinoalloteichus spitiensis，Actinoalloteichus nanshanensis，Actinoalloteichus hoggarensis和Actinoalloteichus fjordicus。虽然已经报道的异壁放线菌仍不太多,但其分布很广泛，如土壤、沙漠、海泥、植物根际或者海绵等。
异壁放线菌含有丰富的次生代谢产物基因簇，从其中已经发现了许多结构新颖的生物活性物质，如neomaclafungins A-I、cyanogrisides A-D、cyanogramide、heronamides衍生物BE-14106和一些新的环戊烯酮等。可见异壁放线菌是发掘创新先导药物的新资源。本发明提供了一个新的异壁放线菌株，具有非常强的抗微生物和抗肿瘤活性，且其能产生结构多样的抗真菌和抗肿瘤活性物质。
早在2003环四肽cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)由Mitova等人从分离自Ircinia muscarum海绵的假单胞菌中首次报道，迄今为止用异壁放线菌12A22制备该化合物是第二例发现。化合物 2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone于2000年从一株稀有放线菌Actinoplanes capillaceus K95-55617中首次报道，直到2014年 Jansen等人从一株新的粘细菌中又分离鉴定了该物质。就我们所知，在本发明专利中，申请者首次使用异壁放线菌制备上述化合物，并且首次发现2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone的抗肿瘤活性和对多种植物病原真菌的抑制作用。
Polycyclic tetramate macrolactam(PTM)是PKS-NRPS杂合的具有多环稠合的大环内酰胺类化合物。PTM类化合物的生物合成基因簇保守且广泛存在于多种细菌中，该家族的化合物具有多种生物活性，包括抗真菌、抗原虫、抗细菌、抗肿瘤、抗氧化等活性。目前分离鉴定该类型化合物已有不少，包括lysobacteramides、frontalamides、alteramide A、cylindramide、discodermide、ikarugamycin、aburatubolactam A、 geodin A、maltophilin及clifednamides等等。在本发明专利中，提供了1个新颖的PTM类抗生素actinoalloamide A，具有抗真菌和细胞毒活性，是新的候选药物。
发明内容
本发明目的在于提供一种海洋蓝灰异壁放线菌及其抗微生物和抗肿瘤活性物质的制备与应用。
为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：
一种异壁放线菌，异壁放线菌为Actinoalloteichus sp. 12A22，于2018年7月5日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号： CCTCC M 2018454。
一种蓝灰异壁放线菌12A22的应用：所述异壁放线菌12A22在制备actinoalloamide A，环四肽cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)或萘醌类化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone中的应用；所述的actinoalloamide A的结构如式(I)所示：
Figure RE-GDA0001969340370000021
Figure RE-GDA0001969340370000031
一种以海洋异壁放线菌12A22制备生物活性代谢产物的方法，包括以下步骤，
1)将海洋蓝灰异壁放线菌12A22用划线法接种于ISP3培养基上，于28℃恒温培养5d活化；然后采用挖块法接种于装有150mL无菌VM液体培养基的500mL三角瓶中，于28℃180rpm恒温摇床培养72h，作为种子液备用；
2)将海洋蓝灰异壁放线菌12A22种子液按体积比2-10％无菌接种至预先准备好装有无菌VM培养基的发酵罐中，液培养基装液量为罐体的 2/3，通气、搅拌，28℃±0.5℃发酵培养6-9d；
3)将发酵液和菌丝体固液分离，其中发酵上清液用大孔吸附树脂 HP20吸附，树脂与发酵液体积比为1:15-1:30；吸附1h-4h后，乙醇多次解吸得活性粗提物A；菌丝体经丙酮反复浸提，将浸泡液合并减压浓缩为活性粗提物B；
3)合并上述获得活性粗提物A和B，用甲醇溶解，溶解后与硅胶混合，而后经硅胶柱色谱分离，以体积比为0:100-100:0的甲醇-二氯甲烷***进行梯度洗脱分离，收集体积比为5:95-12:88的甲醇-二氯甲烷 (v/v)的洗脱组分，得流份F3；收集体积比为30:70-42:58的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到流份F6；
4)流份F3进一步使用ODS快速色谱分离，以体积比为1:100-100:0 的甲醇-水***梯度洗脱。收集体积比为15:85-25:75的甲醇-水(v/v) 的洗脱组分，得流份Fr-1；收集体积比为35:65-45:55的甲醇-水(v/v) 的洗脱组分，得流份Fr-3；
5)流份Fr-1利用sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，无水甲醇洗脱，收集2-5h中间流份Fr-1-B，而后再利用半制备型高效液相色谱纯化得到化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)；
6)流份Fr-3经凝胶sephadex LH20除杂后，采用正相硅胶薄层板，石油醚：丙酮为体积比1:1-3:1制备得到254nm有强紫外吸收，365nm 有黄色荧光的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone；
7)流份F6采用半制备HPLC进行分离，溶剂***MeOH：H2O为体积比20：80，流速为2.5ml/min，于保留时间14-20min获得化合物 actinoalloamide A。
所述的VM液体培养基，每升含有葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，甘油10mL，玉米浆粉5g，蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl 0.5g，CaCO3 3g，用蒸馏水配平至1L，pH 7.4。
所述化合物actinoalloamide A和2-hydroxyethyl-3- methyl-1,4-naphthoquinone可制备成医用、兽用或农用非治疗目的抗微生物剂或抗肿瘤剂中的应用。
所述化合物actinoalloamide A可作为抑制病原真菌立枯丝核菌、镰刀菌等，以及病原细菌大黄欧文菌或丁香假单胞菌的抑菌剂。
所述化合物actinoalloamide A作为抑制人乳腺癌细胞的抗肿瘤剂中的应用。
所述化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinon作为防治真菌病害番茄灰霉病、玉米大斑病或黄瓜枯萎病的杀真菌剂中的应用。
所述化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone作为抑制人乳腺癌细胞的抗肿瘤剂的应用。
本发明所具有的优点：经本发明提供了一种分离自深海的蓝灰异壁放线菌12A22具有较强的抗微生物和抗肿瘤作用，其能发酵产生新颖的 actinoalloamides类化合物(鉴定其中之一actinoalloamide A)，以及 cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)和2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4- naphthoquinone次级代谢产物。其中actinoalloamide A，以及 2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone具有显著的抗细菌、抗真菌和细胞毒活性，它们可作为医用、兽用或者农用的抗微生物和抗肿瘤制剂。所述的化合物能通过微生物发酵生产，其制备方法简单、高效，所得产物纯度高。该发明具有良好的应用前景。
附图说明
图1本发明实施例提供的Actinoalloteichus sp.12A22 菌落培养形态和孢子丝照片。
图2本发明实施例提供的Actinoalloteichus sp.12A22 基于其16S rRNA基因序列构建的进化树。
图3本发明实施例提供的化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr) 结构图。
图4本发明实施例提供的化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr) 1H NMR(Bruker AV 600，DMSO-d6)光谱图。
图5本发明实施例提供的化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr) 13C NMR(Bruker AV 150，DMSO-d6)光谱图。
图6本发明实施例提供的化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr) 的2D-NMR(Bruker AV 600，DMSO-d6)主要相关信息。
图7本发明实施例提供的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone结构图。
图8本发明实施例提供的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone的1H NMR(Bruker AV 600，DMSO-d6)光图谱。
图9本发明实施例提供的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone的13C NMR(Bruker AV 150，DMSO-d6)光图谱。
图10本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A 1H NMR (Bruker AV 600，Pyridine-d5)光谱图。
图11本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A 13C NMR (Bruker AV 150，Pyridine-d5)光谱图。
图12本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A的HSQC (Bruker AV 600，Pyridine-d5)光谱图。
图13本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A的HMBC (Bruker AV 600，Pyridine-d5)光谱图。
图14本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A的1H-1H COSY (Bruker AV600，Pyridine-d5)光谱图。
图15本发明实施例提供的化合物actinoalloamide A的NOESY (Bruker AV 600，Pyridine-d5)光谱图。
具体实施方式
为了更好的理解本发明的内容，下面结合具体实施例作进一步说明，但本专利的保护内容不仅限于此。
实施例1深海放线菌12A22的鉴定
放线菌12A22，分离自中国南海-2134m的深海沉积物(17°59.928'N, 111°36.160'E),于2018年7月5日保藏于中国典型微生物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018454。
细菌为革蓝氏阳性，在改良高氏一号、2.5％PSA和ISP3培养基上生长良好并形成直链的孢子丝，孢子大小约0.7-0.5×1.2-0.8μm，表面光滑(图1)。将菌株12A22液体培养72h后，提取总DNA，经纯化后采用通用引物进行16S rDNA基因序列的PCR扩增、纯化和测序，得到其16S rDNA序列。12A22的16S rRNA基因序列分析显示：12A22 16S rRNA基因与异壁放线菌属(Actinoalloteichus)的菌株高度同源，与Actinoalloteichus cyanogriseus IFO14455T的序列同源性高达100.0％。MEGA6.0构建进化树结果显示：12A22与Actinoalloteichus cyanogriseus聚在同一个进化分支上(图2)，说明与它们进化关系密切。因此鉴定12A22为蓝灰异壁放线菌。
>12A22 16S rRNA
GTACACGAGCGGCGAACGGGTGAGTAACACGTGGGCAACCTGCCCTGCACTCTGGGATAACC TCGGGAAACCGGGGCTAATACCGGATACGACCTTCCCCCGCATGGGGGTGGGTGGAAAGTTC CGGCGGTGCAGGATGGGCCCGCGGCCTATCAGCTTGTTGGTGGGGTAATGGCCTACCAAGGC GACGACGGGTAGCCGGCCTGAGAGGGCGACCGGCCACACTGGGACTGAGATACGGCCCAGAC TCCTACGGGAGGCAGCAGTGGGGAATATTGCGCAATGGGCGAAAGCCTGACGCAGCGACGCC GCGTGAGGGATGACGGCCTTCGGGTTGTAAACCTCTTTCAGCGCCGAAGAAGCGAAAGTGAC GGTAGGCGCAGAAGAAGCACCGGCTAACTACGTGCCAGCAGCCGCGGTAATACGTAGGGTGC GAGCGTTGTCCGGAATTATTGGGCGTAAAGAGCTCGTAGGCGGTTTGTCGCGTCGACTGTGA AAACCTACAGCTTAACTGTGGGCGTGCAGTCGATACGGGCAGACTTGAGTTCGGTAGGGGAG ACTGGAATTCCTGGTGTAGCGGTGGAATGCGCAGATATCAGGAGGAACACCGGTGGCGAAGG CGGGTCTCTGGGCCGATACTGACGCTGAGGAGCGAAAGCGTGGGGAGCGAACAGGATTAGAT ACCCTGGTAGTCCACGCCGTAAACGGTGGGCGCTAGGTGTGGGGGATTTCCACGTCCTCCGT GCCGTAGCTAACGCATTAAGCGCCCCGCCTGGGGAGTACGGCCGCAAGGCTAAAACTCAAAG GAATTGACGGGGGCCCGCACAAGCGGCGGAGCATGTGGATTAATTCGATGCAACGCGAAGAA CCTTACCTGGGTTTGACATGCACTGGATCGCCTCAGAGATGGGGTTTCCGTAAGGTCAGTGT GCAGGTGGTGCATGGCTGTCGTCAGCTCGTGTCGTGAGATGTTGGGTTAAGTCCCGCAACGA GCGCAACCCTTGTTCCATGTTGCCAGCACGTAATGGTGGGGACTCATGGGAGACTGCCGGGG TCAACTCGGAGGAAGGTGGGGATGAGGTCAAGTCATCATGCCCCTTATGTCCAGGGCTTCACACATGCTACAATGGCCGGTACAGAGGGCTGCGAAATCGCAAGGTGGAGCGAATCTCTTAAAG CCGGTCTCAGTTCGGATCGGGGTCTGCAACTCGACCCCGTGAAGTCGGAGTCGCTAGTAATC GCAGATCAGCAACGCTGCGGTGAATACGTTCCCGGGCCTTGTACACACCGCCCGTCACGTCA TGAAAGTCGGTAACACCCGAAGCCCGTGGCCCAACC
实施例2菌株12A22发酵制备生物活性类化合物
2.1菌种活化：将海洋蓝灰异壁放线菌12A22接种于ISP3培养基上，于28℃恒温培养5d将菌株12A22用划线法接种于ISP3活化菌种备用；
所述ISP3培养基为：将20.0g燕麦粉用1L水煮约30min，用四层纱布过滤获得滤液，并用水补足至1L，微量元素母液1mL，琼脂20g，蒸馏水1L，pH 7.2。微量元素母液(1000×)：MgSO4·7H2O 1.0g，ZnSO4·7H2O 1.0g，MnCl2·4H2O 1.0g，FeSO4·7H2O 1.0g，CoCl2·6H2O1.0g，CaCl2 1.0g， H3BO3 1.0g。
2.2种子液的制备：在上述ISP3平板上12A22菌株生长浓密处用打孔器取直径5mm菌块，采用挖块法接种于装有150mL VM液体培养基的500mL 三角瓶中，于28℃180rpm恒温摇床培养72h，作为种子液备用；
所述的VM液体培养基为：每升含有葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，甘油10mL，玉米浆粉5g，蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl 0.5g，CaCO3 3g，用蒸馏水配平至1L，pH 7.4；
2.3发酵罐发酵：将上述种子液按体积比5％无菌接种至预先准备好装有无菌VM液体培养基的50L发酵罐中，培养基装液量为罐体的2/3。发罐酵培养条件为：罐压0.05Mpa，通气量0.5-1.0V/V·min，转速250rpm，培养温度为28℃±0.5℃，发酵后期时发酵液粘稠，适当增加通气量，并将转速调至300rpm，共发酵培养7d。
2.4粗提物的获得：将发酵物于4000rpm离心20-30min，收集上清液，离心所得沉淀，待用；收集的上清液以每1000mL上清液中加入60mL湿HP20 大孔吸附树脂，在摇床上以180rpm处理2h，处理后再以清水洗涤HP20并弃去洗涤液，然后用10％乙醇洗脱并弃去溶媒，最后用90％乙醇洗涤数次并收集洗脱液，至大孔树脂接近初始颜色为止，将得到的洗脱液减压蒸馏、冷冻干燥，即得发酵液粗提物A(12.48g)。上述离心所得的菌体沉淀用丙酮超声提取3次，同样经减压蒸馏并冷冻干燥得到粗提物B (3.13g)。合并粗提物A和B，进一步经MeOH精制，经减压浓缩后获得活性提取物。
2.5快速硅胶柱色谱分离：
首先将上述活性提取物与硅胶质量比约为1:2的比例拌样，减压蒸馏至完全干燥。同时准备好500-600目柱层析硅胶柱。完成干法上样后，按照二氯甲烷/甲醇体系进行梯度洗脱分离(v/v 10:0-0:10)。收集体积比为6：94-10:90的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得流份F3；收集体积比为36:64-40:60的甲醇-二氯甲烷(v/v)的洗脱组分，得到流份F6；
2.6 Cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)的制备
将上述流分F3采用快速ODS色谱柱分离，样品2.6g，拌样ODS 5.0 g，空白ODS 25g。流动相为甲醇-水，起始比例为10％甲醇水溶液。收集体积比为20:80的甲醇-水(v/v)的洗脱组分，得流份Fr-1；收集体积比为40:60的甲醇-水(v/v)的洗脱组分，得流份Fr-3；
流份Fr-1利用sephadex LH-20凝胶柱色谱分离，无水甲醇洗脱，分成三个流份，2-5h收集的中间流份Fr-1-B利用半制备型高效液相色谱纯化得到化合物c yclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)；
2.7 2-Hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone的制备
流份Fr-3经凝胶sephadex LH20除杂后，采用正相硅胶薄层板，石油醚：丙酮为2:1制备得到254nm有强紫外吸收，365nm有黄色荧光的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone；
2.8 Actinoalloamide A的制备
流份F6采用半制备HPLC进行分离，溶剂***MeOH：H2O为20：80，流速为2.5ml/min，分别于保留时间15.6min获得化合物 actinoalloamide A；
实施例3 Cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)的结构解析
黄色粉末(甲醇)。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)(图4)给出2个酰胺上NH质子信号δH8.12(1H，brs)和7.86(1H，s)；结合连N碳上的质子信号δH 4.24(1H,m)，4.03(1H,m)，3.92(1H,m)提示该化合物为环肽类物质，且含有脯氨酸片段。2组对取代苯环AA'BB'偶合***质子信号δH 7.04(2H，d，J＝8.4Hz)，6.89(2H，d，J＝8.4Hz)， 6.66(2H，d，J＝8.4Hz)和6.63(2H，d，J＝8.4Hz)，提示该化合物可能包含两个酪氨酸残基。13C NMR(150MHz，DMSO-d6)(图5)给出 28个碳信号；δC 168.94，168.43，165.16和165.00为4个酰胺羰基碳信号以及4个连N的α位碳信号δC 58.43，58.19，57.23和56.05，提示该化合物为环四肽；δC 156.56，156.03，130.83(4×)，126.97，125.78， 115.18(2×)和114.86(2×)是两个酪氨酸残基苯环上的碳信号；δC38.66 和34.80推测为酪氨酸残基亚甲基碳信号；结合氢谱仅给出2个酰胺上 NH质子信号，因此推测含有2个脯氨酸残基，剩余6个碳信号δC44.61， 44.59，28.59，27.87，21.86，21.33也支持2个脯氨酸残基的存在。进一步通过2D NMR连接了其氨基酸顺序(图6)。因此鉴定其为cyclo (L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)(图3)，其光谱数据与文献报道基本一致(Zeitschrift fur Naturforschung,2003,58,740-745)。
实施例4 2-Hdroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone的结构解析
黄色结晶。1H NMR(600MHz，DMSO-d6)(图8)给出苯环上质子信号δH 7.98(2H，m)，7.82(2H，m)，提示存在一个邻二取代的苯环；1个连氧CH2的质子信号δH 3.53(2H，m)，1个活泼质子信号4.78(1H，brt，J ＝5.8Hz)，提示存在一个CH2OH基团；δH 2.13(3H，s)提示1个连接在不饱和碳上的甲基质子信号；δH 2.77(2H，t，J＝6.9Hz)提示存在1 个连接在不饱和碳上的亚甲基，且与CH2OH相连。13C NMR(150MHz，DMSO-d6) (图9)给出13碳信号，包括10个sp2杂化碳信号。2个α，β不饱和酮碳信号δC 184.64和184.18，结合其它8个芳(烯)碳信号δC144.40， 143.78，133.85，133.83，131.17(2×)，125.89和125.83，提示存在一个1，4萘醌母核。结合氢谱提示的结构片段，说明该化合物可能为2， 3位分别被甲基和羟乙基取代的萘醌。以上数据与文献中2-羟乙基-3-甲基-1，4-萘醌数据基本一致(J Antibiot,2000,53,1212-1214)，因此鉴定其为2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone(图7)。
实施例5 Actinoalloamide A的结构解析
白色粉末，高分辨质谱给出m/z 525.2697[M-H]－和m/z 527.2659 [M+H]+推断其分子式为C29H38N2O7。1H-NMR和13C-NMR(Pyridine-d5)(图 10-11)显示其含有5个羰基或烯醇信号，1个烯属季碳和1个连氧季碳信号，13个次甲基信号包括4个烯属次甲基信号，2个连氧/氮次甲基信号，7个亚甲基信号和2个甲基信号。这些提示该化合物与 lysobacteramideB和HSAF(heat-stable antifungal factor)具有相似的骨架(J Nat Prod，2015，78(8):1841-1847)。与HSAF的差异主要是，HSAF中的δC 73.1(C-14)羟基碳被氧化成酮羰基碳δC210.4(C-14)， C18位的次甲基δC 58.5被羟基化为连氧季碳δC 90.5，这些变化菌得到了通过HSQC、HMBC和1H-1H COSY得到确认(图12-14)。立体结构由 NOESY相关(图15)和比较核磁数据决定，由此该化合物被命名为 actinoalloamide A。具体NMR归属数据如下：
1H-NMR(600MHz，pyridine-d5)δH：7.54(1H，d，J＝15.6，H-18)， 6.88(dd，J＝15.6，10.4，H-17)，6.16(1H，dd，J＝11.3，2.0， H-2)，5.82(td，J＝11.3，2.0，H-3)，4.76(1H，m，H-25)，4.55 (1H，d，J＝1.4，H-23)，4.27(1H，m，H-4)，4.00(1H，m，H-27)， 3.15(1H，m，H-27)，2.70(1H，m，H-6)，2.45(1H，m，H-15)， 2.44(1H，m，H-16)，2.39(2H，m，H-4，H-26)，2.32(2H，m，H-8， H-15)，2.19(1H，d，J＝11，H-13)，2.12(1H，m，H-7)，2.03(1H， m，H-9)，1.89(1H，m，H-26)，1.73(1H，m，H-5)，1.72(1H，m， H-10)，1.51(1H，m，H-29)，1.15(1H，m，H-11)，1.18(3H，d， J＝6.8，H-31)，0.98(1H，m，H-29)，0.86(1H，m，H-7)，0.84(3H， t，J＝7.3，H-30)，0.61(1H，m，H-9)。
13C NMR(150MHz，pyridine-d56)δC：210.4(C-14)，194.4(C-24)，177.6(C-21)，174.5(C-19)，166.8(C-1)，147.0(C-17)，138.8(C-3)， 125.4(C-2)，123.1(C-18)，102.1(C-20)，90.5(C-12)，71.5(C-25)， 70.4(C-23)，65.4(C-13)，51.9(C-8)，51.1(C-10)，50.4(C-11)， 48.8(C-6)，47.7(C-16)，47.1(C-15)，44.2(C-5)，38.7(C-9)， 37.9(C-27)，37.1(C-7)，32.6(C-26)，28.32(C-4)，26.04(C-29)， 12.33(C-30)，11.86(C-31)。
实施例6制备化合物的生物活性和应用
采用纸-琼脂片扩散实验(paper-agar disk diffusion assay)测定了制备化合物的抗微生物活性。每个滤纸片(直径8mm)上样10μg。生物活性测试结果显示2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone对多种植物病原真菌有活性，其中对番茄灰霉病菌、玉米大斑病菌和黄瓜枯萎病菌的抑菌圈直径分别为16.8mm、12.7mm、11.0mm；对革兰氏阳性杆菌枯草芽孢杆菌的抑菌圈直径达21.9mm。化合物actinoalloamide A对番茄灰霉病菌、黄瓜枯萎病菌和立枯丝核菌均有显著的抑制活性，其中对立枯丝核菌抑制活性最强，抑菌圈直径达20.8mm。Actinoalloamide A 对植物病原细菌大黄欧文菌、丁香假单胞菌有较强抑制作用，抑菌圈直径均为10.0mm。
利用MTT法测定了制备化合物的抗肿瘤活性。测定结果显示，化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone和actinoalloamide A均具有良好的抗肿瘤活性，它们对对人乳腺癌细胞MDA-MB-435IC50分别为10.6±2.7和9.2±1.4μM。
序列表
<110> 中国科学院沈阳应用生态研究所
<120> 一种异壁放线菌及其抗微生物和抗肿瘤活性物质的制备与应用
<160> 1
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 1338
<212> DNA
<213> 异壁放线菌(Actinoalloteichus cyanogriseus 12A22)
<400> 1
gtacacgagc ggcgaacggg tgagtaacac gtgggcaacc tgccctgcac tctgggataa 60
cctcgggaaa ccggggctaa taccggatac gaccttcccc cgcatggggg tgggtggaaa 120
gttccggcgg tgcaggatgg gcccgcggcc tatcagcttg ttggtggggt aatggcctac 180
caaggcgacg acgggtagcc ggcctgagag ggcgaccggc cacactggga ctgagatacg 240
gcccagactc ctacgggagg cagcagtggg gaatattgcg caatgggcga aagcctgacg 300
cagcgacgcc gcgtgaggga tgacggcctt cgggttgtaa acctctttca gcgccgaaga 360
agcgaaagtg acggtaggcg cagaagaagc accggctaac tacgtgccag cagccgcggt 420
aatacgtagg gtgcgagcgt tgtccggaat tattgggcgt aaagagctcg taggcggttt 480
gtcgcgtcga ctgtgaaaac ctacagctta actgtgggcg tgcagtcgat acgggcagac 540
ttgagttcgg taggggagac tggaattcct ggtgtagcgg tggaatgcgc agatatcagg 600
aggaacaccg gtggcgaagg cgggtctctg ggccgatact gacgctgagg agcgaaagcg 660
tggggagcga acaggattag ataccctggt agtccacgcc gtaaacggtg ggcgctaggt 720
gtgggggatt tccacgtcct ccgtgccgta gctaacgcat taagcgcccc gcctggggag 780
tacggccgca aggctaaaac tcaaaggaat tgacgggggc ccgcacaagc ggcggagcat 840
gtggattaat tcgatgcaac gcgaagaacc ttacctgggt ttgacatgca ctggatcgcc 900
tcagagatgg ggtttccgta aggtcagtgt gcaggtggtg catggctgtc gtcagctcgt 960
gtcgtgagat gttgggttaa gtcccgcaac gagcgcaacc cttgttccat gttgccagca 1020
cgtaatggtg gggactcatg ggagactgcc ggggtcaact cggaggaagg tggggatgag 1080
gtcaagtcat catgcccctt atgtccaggg cttcacacat gctacaatgg ccggtacaga 1140
gggctgcgaa atcgcaaggt ggagcgaatc tcttaaagcc ggtctcagtt cggatcgggg 1200
tctgcaactc gaccccgtga agtcggagtc gctagtaatc gcagatcagc aacgctgcgg 1260
tgaatacgtt cccgggcctt gtacacaccg cccgtcacgt catgaaagtc ggtaacaccc 1320
gaagcccgtg gcccaacc 1338

Claims (9)

1.一种异壁放线菌，其特征在于：异壁放线菌为Actinoalloteichus sp.12A22，于2018年7 月5 日保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号：CCTCC M 2018454。
2.一种权利要求1 所述的异壁放线菌12A22 的应用，其特征在于：所述异壁放线菌12A22 在制备actinoalloamide A ，环四肽cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)或萘醌类化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4-naphthoquinone 中的应用；所述的actinoalloamide A 的结构如式(I)所示：
Figure 755398DEST_PATH_IMAGE001
3.一种以权利要求1 所述的异壁放线菌12A22 制备生物活性代谢产物的方法，包括以下步骤，其特征在于：
1) 将异壁放线菌 12A22 用划线法接种于 ISP3 培养基上，于28℃恒温培养 5d 活化；然后采用挖块法接种于装有150mL 无菌 VM 液体培养基的500mL 三角瓶中，于28℃180rpm 恒温摇床培养72h，作为种子液备用；
2) 将异壁放线菌12A22 种子液按体积比2-10%无菌接种至预先准备好装有无菌 VM培养基的发酵罐中，液培养基装液量为罐体的 2/3，通气、搅拌，28℃±0.5℃发酵培养6-9d；
3) 将发酵液和菌丝体固液分离，其中发酵上清液用大孔吸附树脂HP20吸附，树脂与发酵液体积比为1:15-1:30；吸附1h-4h 后，乙醇多次解吸得活性粗提物A；菌丝体经丙酮反复浸提，将浸泡液合并减压浓缩为活性粗提物B；
4) 合并上述获得活性粗提物A 和B，用甲醇溶解，溶解后与硅胶混合，而后经硅胶柱色谱分离，以体积比为0:100-100:0 的甲醇-二氯甲烷***进行梯度洗脱分离，收集体积比为5:95-12:88 的甲醇-二氯甲烷 (v/v)的洗脱组分，得流份F3；收集体积比为 30:70-42:58的甲醇-二氯甲烷 (v/v)的洗脱组分，得到流份F6；
5) 流份F3 进一步使用ODS 快速色谱分离，以体积比为1:100-100:0的甲醇-水***梯度洗脱；收集体积比为 15:85-25:75 的甲醇-水 (v/v)的洗脱组分，得流份Fr-1; 收集体积比为 35:65-45:55 的甲醇-水 (v/v)的洗脱组分，得流份Fr-3;
6) 流份Fr-1 利用sephadex LH-20 凝胶柱色谱分离，无水甲醇洗脱，收集2-5 h 中间流份Fr-1-B，而后再利用半制备型高效液相色谱纯化得到化合物cyclo-(L-Pro-D-Pro-L-Tyr-L-Tyr)；
7) 流份Fr-3 经凝胶sephadex LH20 除杂后，采用正相硅胶薄层板，石油醚：丙酮为体积比1:1-3:1 制备得到254 nm 有强紫外吸收，365 nm有黄色荧光的化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4- naphthoquinone；
8) 流份F6 采用半制备HPLC 进行分离，溶剂***MeOH：H2O 为体积比20：80 ，流速为2.5 ml/min，于保留时间14-20min 获得化合物
actinoalloamide A。
4.根据权利要求3 所述的制备方法，其特征在于，所述的VM 液体培养基，每升含有葡萄糖10g，可溶性淀粉10g，甘油10mL，玉米浆粉5g，蛋白胨2g，酵母粉1g，NaCl 0.5g，CaCO33g，用蒸馏水配平至1L，pH 7.4。
5.根据权利要求2 所述制备化合物的应用，其特征在于：所述化合物actinoalloamideA 和2-hydroxyethyl-3- methyl-1,4-naphthoquinone 可
制备成医用、兽用或农用非治疗目的抗微生物剂或抗肿瘤剂中的应用。
6.根据权利要求5 所述应用，其特征在于：所述化合物actinoalloamide A 可作为抑制病原真菌立枯丝核菌、镰刀菌，以及病原细菌大黄欧文菌或丁香假单胞菌的抑菌剂。
7.根据权利要求5 所述应用，其特征在于：所述化合物actinoalloamide A 作为抑制人乳腺癌细胞的抗肿瘤剂中的应用。
8.根据权利要求5 所述应用，其特征在于：所述化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4- naphthoquinon 作为防治真菌病害番茄灰霉病、玉米大斑病或黄瓜枯萎病的杀真菌剂中的应用。
9.根据权利要求5 所述应用，其特征在于：所述化合物2-hydroxyethyl-3-methyl-1,4- naphthoquinone 作为抑制人乳腺癌细胞的抗肿瘤剂的应用。
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