CN116426499B - 一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用 - Google Patents
一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用 Download PDFInfo
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Abstract
本发明提供了一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用,涉及变异或遗传工程领域。具体的,本发明提供了一种甲基转移酶突变体,该突变体蛋白质包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变:第58位、第203位,其中各氨基酸位置编号由参比序列定义,参比序列如SEQ ID No.1所示。本发明以耻垢分枝杆菌来源的EgtD酶为初始菌株,利用酶的晶体结构分析,从活性中心位点中筛选出相关位点,共构建16株突变株,最后筛选获得了EgtD酶活提高的关键氨基酸位点和能够高效合成麦角硫因的工程菌,该突变能够使EgtD酶活性提高39%,将麦角硫因产量提高10%。
Description
技术领域
本申请涉及变异或遗传工程领域,尤其涉及一种甲基转移酶突变体、生物材料和应用。
背景技术
甲基转移酶(EgtD)是麦角硫因合成的关键酶。2010年,Seebeck. F P将来源于耻垢分枝杆菌(Mycobacterium smegmatis)的egtABCDE等酶的基因在大肠杆菌中重组表达,实现了大肠杆菌体内合成麦角硫因(Florian P.Seebeck,JACS,2010,132,6632-6633)。EgtD酶负责将S-腺苷甲硫氨酸的甲基转移至组氨酸,生成组氨酸甜菜碱,是麦角硫因合成的第一步。2015年,Vit等对EgtD进行表征,该酶对底物组氨酸的转化数只有0.58 s-1(Misson, Laetitia, Chembiochem: A European journal of chemical biology,2015.),是代谢通路中活性最高的EgtE酶活性的2.3%。因此,EgtD是麦角硫因合成的关键限速步骤。2015年,Vit等将来源于耻垢分枝杆菌的麦角硫因合成的关键酶EgtD进行结构解析(PDB 4PIN)(Misson, Laetitia, Chembiochem: A European journal of chemicalbiology, 2015.),获得EgtD及其底物的结构复合物,对EgtD酶活性中心进行改造,突变体E285A,E252A/E285A,但这些突变体均未提高组氨酸甲基转移酶活性。
目前为止,还没有通过改变氨基酸提高EgtD酶活的案例。因此,亟需一种高酶活的EgtD,以解决甲基转移酶酶活较低,不符合工业化生产要求的问题。
发明内容
麦角硫因的合成反应的第一步为组氨酸在甲基转移酶的催化下合成组氨酸甜菜碱,该步骤是麦角硫因合成步骤中的重要限速步骤。由于目前文献和专利中报道的甲基转移酶酶活较低,均不符合工业化生产的要求。
因此,本发明通过对甲基转移酶进行定点突变并进行体外酶活测定,经筛选后首次获得了一种酶活提高的甲基转移酶突变位点及酶突变体,有效提高了甲基转移酶酶活和麦角硫因产量,为麦角硫因工业化生产提供一种新的甲基转移酶突变体及工程菌。
一方面,本申请提供了一种甲基转移酶突变体,所述甲基转移酶突变体包括下述A1)-A3)中任一种:
A1) 包含相对于参比序列以下位点的一个或多个突变的蛋白质:第58位、第203位,其中各氨基酸位置编号由参比序列定义,所述参比序列如SEQ ID No.1所示;
A2)为由A1)所述蛋白质的氨基酸序列经过氨基酸残基的取代和/或缺失和/或添加得到的与A1)所述蛋白质具有90%以上同一性且具有相同功能的蛋白质;
A3)为在A1)或A2)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
优选的,A2)的蛋白质与A1)中限定的氨基酸序列具有至少90%、91%、92%、93%、94%、95%、96%、97%、98%、99%以上序列同一性。
本领域技术人员可以理解的是,本申请中蛋白质编码规则遵循常用规则,以第58位为例,所述第58位突变即指自参比序列N端开始向C端方向顺序计数第58个氨基酸位点。
进一步的,所述第58位脯氨酸残基突变为亮氨酸残基;和/或,所述第203位缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基。
进一步的,所述甲基转移酶突变体包括如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列和/或如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列。
另一方面,本申请还提供了生物材料,所述生物材料包括下述B1)-B6)中任一种:
B1)核酸分子,所述核酸分子编码上述甲基转移酶突变体;
B2)表达盒,所述表达盒含有B1)所述核酸分子;
B3)重组载体,所述重组载体含有B1)所述核酸分子和/或B2)所述表达盒;
B4)重组微生物,所述重组微生物含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、和/或B3)所述重组载体;
B5)重组细胞,所述重组细胞含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、和/或B3)所述重组载体;
B6)全细胞催化剂,所述全细胞催化剂含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、B3)所述重组载体、B4)所述重组微生物、和/或B5)所述重组细胞。
本文所述表达盒中还可包含启动子、终止子、标记基因等功能性元件,本领域技术人员可根据实际情况进行常规选择,只要能够完成B1)所述核酸分子的表达即可,此处不再对表达盒的结构及组成进行过多限制。
本文所述载体是指能够把外源DNA或目的基因运载进入宿主细胞进行扩增和表达的载体,所述载体可以是克隆载体也可以是表达载体,包括但不限于:质粒、噬菌体(如λ噬菌体或M13丝状噬菌体等)、黏粒(即柯斯质粒)或病毒载体。具体可为载体pET30a和/或pACYC-PSC101-Ptac质粒。
本文所述微生物可为酵母、细菌、藻或真菌。其中,细菌可来自埃希氏菌属(Escherichia sp.)、欧文氏菌属(Erwinia sp.)、土壤杆菌属(Agrobacterium sp.)、黄杆菌属(Flavobacterium sp.)、产碱菌属(Alcaligenes sp.)、假单胞菌属(Pseudomonas sp.)、芽胞杆菌属(Bacillus sp.)、短杆菌属(Brevibacterium sp.)、棒状杆菌属(Corynebacterium sp.)、气杆菌属(Aerobacter sp.)、肠杆菌属(Enterobacteria sp.)、微球菌属(Micrococcus sp.)、沙雷氏菌属(Serratia sp.)、沙门氏菌属(Salmonella sp.)、链霉菌属(Streptomyces sp.)、普罗维登斯菌属(Providencia sp.)等但不限于此。
本文所述细胞可为植物细胞或动物细胞,所述细胞可为任何可以合成目的麦角硫因的生物细胞。
可以理解的是,本领域技术人员可以根据实际情况选择适合的基因编辑***和基因编辑方法完成所述突变改造。
进一步的,B1)所述的核酸分子包括下述C1)-C5)中任一种:
C1)编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子;
C2)编码SEQ ID No.3或SEQ ID No.5氨基酸序列的核酸分子;
C3)核苷酸序列如SEQ ID No.4或SEQ ID No.6所示的核酸分子;
C4)与C1)-C3)中任一所述核酸分子具有98%或98%以上同一性,且编码上述甲基转移酶突变体的核酸分子;
C5)在严格条件下与C1)-C3)中任一所述核酸分子杂交,且编码上述甲基转移酶突变体的基因组DNA分子。
优选的,C4)的核酸分子与C1)-C3)中任一所述核酸分子具有至少98%、99%、99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%或99.9%以上的同一性。
进一步的,所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母中的一种或多种。
在一种优选的实施方式中,所述重组微生物(宿主)为EGT33和BL21(DE3)。
另一方面,本申请还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在提高甲基转移酶酶活性中的应用。
本申请中首次获得了两个EgtD酶活提高的关键氨基酸位点,分别为耻垢分枝杆菌来源的EgtD酶的第58位活性位点和第203位活性位点,具体为将其58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸,及第203位活性位点由缬氨酸残基突变为天冬酰胺残基,以上两处关键氨基酸位点经过突变后均能够有效提高EgtD酶活性,相比未突变的EgtD酶,突变后EgtD酶活性分别提高了39%和17%,为该酶的后续酶活进一步提升提供了关键靶点。
另一方面,本申请还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在下述D1)-D3)任一中的应用:
D1)构建用于生产麦角硫因的重组微生物;
D2)制备麦角硫因;
D3)调控重组微生物生产麦角硫因的产量。
本申请中以大肠杆菌表达***为例,获得了包含上述突变的工程菌,并将工程菌应用于麦角硫因生产中。发现该突变能够有效提高麦角硫因产量,相比未突变的工程菌,突变后的工程菌能够将麦角硫因产量提高10%,麦角硫因最大产量可达228.28±11.53 mg/L。本申请所述突变有效提高了麦角硫因的合成效率,为麦角硫因的生产提供了一种新的合成途径和工程菌。
另一方面,本申请还提供了如上述的甲基转移酶突变体或如上述的生物材料在制备含麦角硫因的药品或化妆品中的应用。
可选的,所述药品或化妆品的剂型包括但不限于粉剂、片剂、胶囊剂、凝胶剂,或例如化妆水、乳液、面霜、面膜等的外用涂擦剂,或例如洗发水、护发素、发膜等的日用品。
另一方面,本申请还提供了一种麦角硫因的生产方法,所述方法包括如下步骤:
步骤一、构建得到如上述的全细胞催化剂;
步骤二、培养所述全细胞催化剂,得到麦角硫因。
在一种优选的实施方式中,所述全细胞催化剂包括重组微生物。
麦角硫因的生产方法包括如下步骤:将所述重组微生物在37℃,200 rpm的条件下LB培养基过夜获得种子液,以接种量为10%转接至抗性发酵培养基,37 ℃、200 rpm的条件下培养0.5 h,加入终浓度为0.2 mM IPTG,37 ℃条件下诱导培养10-12 h,生产麦角硫因。
本发明具有如下有益效果:
1、本发明采用高效的大肠杆菌表达***,以目前报道的活性最高的耻垢分枝杆菌来源的EgtD酶为初始菌株,利用酶的晶体结构分析,从活性中心位点中筛选出相关位点,共构建16株突变株,最后筛选获得了一种能够高效合成麦角硫因的工程菌;
2、本发明中首次获得EgtD酶活提高的关键氨基酸位点,以耻垢分枝杆菌来源的EgtD酶为初始序列,将其58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸,能够有效提高EgtD酶活性,相比未突变的EgtD酶,突变后EgtD酶能够使EgtD酶活性提高39%,为该酶的后续酶活进一步提升提供了关键靶点;
3、本发明中获得的工程菌和高酶活性EgtD酶能够用于麦角硫因生产过程中,相比未突变的工程菌,突变后的工程菌能够将麦角硫因产量提高10%,麦角硫因最大产量可达228.28±11.53 mg/L。
附图说明
此处所说明的附图用来提供对本申请的进一步理解,构成本申请的一部分,本申请的示意性实施例及其说明用于解释本申请,并不构成对本申请的不当限定。在附图中:
图1为pET30a-E0载体构建图谱;
图2为酶偶联分析SAH标准曲线。
具体实施方式
技术术语:
表达:术语“表达”包括涉及甲基转移酶或其突变体产生的任何步骤。
同一性:是指在分子进化研究中,两种核酸分子的核苷酸序列之间或两种蛋白质分子的氨基酸序列之间的相似程度。
重组:广义上讲,任何造成基因型变化的基因交流过程,都叫做重组。
表达盒:表达盒是指由启动子、靶基因和报道基因等组成,能在特定组织中表达并易于检测的一组DNA序列。
重组载体:重组载体就是在克隆载体基本骨架的基础上转入目的基因,进而使目的基因能够表达的载体。
全细胞催化剂:全细胞生物催化是指利用完整的生物有机体(即全细胞、组织甚至个体)作为催化剂进行化学转化的过程,相应的参与该催化过程的完整的生物有机体即为全细胞催化剂。
工程菌株(重组微生物):用基因工程的方法,使外源基因得到高效表达的菌类细胞株系。
重组细胞:术语“重组细胞”意指易于用包含本发明的多核苷酸的核酸构建体或表达载体进行转化、转染、转导等的任何细胞类型。术语“重组细胞”涵盖由于复制期间出现的突变而与亲本细胞不完全相同的任何亲本细胞子代。
酶活性:也称酶活力,是指酶催化一定化学反应的能力。酶活力的大小可以用在一定条件下,它所催化的某一化学反应的转化速率来表示。
为了更清楚的阐释本申请的整体构思,下面以实施例的方式进行详细说明。在下文的描述中,给出了大量具体的细节以便提供对本发明更为彻底的理解。然而,对于本领域技术人员来说显而易见的是,本发明可以无需一个或多个这些细节而得以实施。在其他的例子中,为了避免与本发明发生混淆,对于本领域公知的一些技术特征未进行描述。
实施例中未注明具体条件者,按照常规条件或制造商建议的条件进行。
如未特殊说明,在以下实施方式中,所用试剂或仪器未注明生产厂商者,均为可以通过市售购买获得的常规产品。
以下实例中所使用的质粒,内切酶,PCR酶,柱式DNA抽提试剂盒和DNA凝胶回收试剂盒等采用商用产品,具体操作按照试剂盒说明书进行。
除非另外说明,本发明中所公开的实验方法、检测方法、制备方法均采用本技术领域常规的分子生物学、生物化学、染色质结构和分析、分析化学、细胞培养、重组DNA技术及相关领域的常规技术,具体可根据Molecular Cloning:A Laboratory Manual(FourthEdition)进行。
大肠杆菌EGT33的构建方法包括如下步骤:
大肠杆菌EGT33的构建方法已在申请号为202211546541.5的专利文件中公开。所述基因工程菌以大肠杆菌为宿主,异源过表达Microcoleus sp.PCC 7113来源的egtD基因,Methylobacterium pseudosasicola来源的egtB基因,Neurospora crassa来源的egt2基因,Corynebacterium glutamicum的ATP转磷酸核糖基酶突变体编码基因hisG*;并且过表达hisDBCHAFI基因簇,丝氨酸转乙酰酶突变体CysE(M201R)编码基因,磷酸甘油酸脱氢酶酶突变体SerA(H344A/N364A)编码基因,腺苷蛋氨酸合酶突变体MetK(I303V)编码基因;并且不表达色氨酸酶基因tnaA。该菌株对麦角硫因合成模块、前体物组氨酸、半胱氨酸和腺苷蛋氨酸合成模块进行了***性改造,实现大肠杆菌中麦角硫因的高效、稳定生产。
实施例1突变体的构建
本申请发明人通过UniProt数据库中得到耻垢分枝杆菌来源的EgtD基因的蛋白晶体结构(PDB:4PIN),进而分析活性中心相关位点,并构建了16株突变体。
构建方法为:选取耻垢分枝杆菌来源的EgtD基因(氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示),去除基因碱基序列中的酶切位点(NdeⅠ、XhoⅠ),在基因的N端***NdeⅠ位点,C端连接6×His标签、终止密码子和Xho Ⅰ位点,连入载体pET30a,获得重组质粒pET30a-E0,重组质粒构建图谱如图1所示。之后将质粒转入大肠杆菌E. coliBL21(DE3)(擎科)宿主,获得基因工程菌株E. coliBL21(DE3)/pET30a-E0(D0菌株)。
使用Phanta Max Super-Fidelity DNA Polymerase(购自vazyme)作为扩增酶,以质粒pET30a-E0作为模板,分别使用下表1所列引物,进行扩增,扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将目的条带从琼脂糖凝胶上切下,并使用胶回收试剂盒(Omega)对其进行DNA纯化回收。将回收的片段转入大肠杆菌E. coliDH5α中,挑取单菌落测序验证正确后,使用质粒提取试剂盒(Omega)进行质粒提取,获得各突变体质粒,转入大肠杆菌E. coliBL21(DE3),获得突变株D1-D16,具体工程菌株信息如表2所示。
表1 PCR扩增用引物
注:以突变位点“P58L”为例,“P58L”即指自参比序列SEQ ID NO.1的N端开始向C端方向顺序计数第58个氨基酸位点由脯氨酸(P)残基突变为亮氨酸(L)残基。
表2 工程菌株信息
实施例2高通量酶活性检测
本实施例中采用实施例1中野生型(D0)和16株突变株(D1-D16)进行酶活性检测,高通量酶活性检测按文献所述甲基转移酶活性测定方法进行(参考文献:谷劲松,2012,高等学校化学学报,3,512-525)。
具体为:合成S-腺苷-L-高半胱氨酸核苷酶SAHN(EC 3.2.2.9)和S-核糖基高半光氨酸酶SRHH(EC 4.4.1.21)基因,SAHN基因的N端***1个六组氨酸标签,SRHH基因的C端***1个六组氨酸标签,获得重组质粒pET30-SAHN和pET30-SRHH,将质粒转入E. coliBL21(DE3)宿主,获得基因工程菌株E. coliBL21(DE3)/ pET30-SAHN和E. coliBL21(DE3)/pET30-SRHH。
从平板上分别挑取E. coliBL21(DE3)/pET30-SAHN和E. coliBL21(DE3)/pET30-SRHH单菌落接种于5 mL的LB培养基(含50 μg/mL Kan)37℃,220 rpm过夜培养。取上述培养液1:100转接于50 mL的LB培养基(含50 μg/mL Kan),37℃,220 rpm培养,OD600达到0.6-0.8时,加入0.2 mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),16℃,220 rpm培养16 h。收集120 OD600菌体,用1 mL缓冲液(100 mM Tris-HCl,pH=8.0)悬浮,然后超声波破碎菌体细胞,12000 rpm/min离心60 min去除沉淀,取上清进行酶蛋白纯化,上清样加入Ni2+琼脂糖亲和层析柱,用含Binding buffer(50 mmol/L Tris-HCl、50 mmol/L NaCl和5 mmol/L咪唑,pH=8.0)洗3-4个柱体积,最后用Elution buffer (50mmol/L Tris-HCl、150mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑,pH=8.0)溶液洗脱,最终获得纯酶蛋白,采用Nanodrop进行蛋白浓度测定,SAHN酶溶液稀释100倍备用。
酶偶联分析检测方法:以S-腺苷-L-高半胱氨酸(AdoHcy)作为标准品, 标准品的浓度范围为0-200 μmol/L,加入酶反应混合液(0.1 μmol/L SAHN,10 μmol/L SRHH和100mmol/L的Hepes缓冲液(pH=8.0)),于37℃反应30 min后,加入4倍体积的5,5’-联硫-2,2’-双硝基苯甲酸(DTNB)(133 μmol/L)-盐酸胍(8 mol/L)溶液终止反应,于412 nm比色测定生成的TNB量。空白对照采用不加SAHN的酶反应体系与4倍体积的DTNB-盐酸胍混合液。测得标准曲线如图2所示。
从平板上分别挑取野生型(D0)和16株突变株(D1-D16)单菌落接种于5 mL的LB培养基(含50 μg/mL Kan)37℃,220 rpm过夜培养。取上述培养液1:100转接于50 mL的LB培养基(含50 μg/mL Kan),37℃,220 rpm培养,OD600达到0.6-0.8时,加入0.2 mM的异丙基硫代半乳糖苷(IPTG),16℃,220 rpm培养20 h。收集120 OD600的菌体,用1 mL缓冲液(100 mMTris-HCl, pH=8.0)悬浮,然后超声波破碎菌体细胞,12000 rpm/min离心60 min去除沉淀,取上清进行酶蛋白纯化,上清样于Ni2+琼脂糖亲和层析柱,用含Binding buffer(50 mmol/LTris-HCl、50 mmol/L NaCl和5 mmol/L咪唑,pH=8.0)洗3-4个柱体积,最后用含Elutionbuffer(50 mmol/L Tris-HCl、150 mmol/L NaCl和250 mmol/L咪唑,pH=8.0)溶液洗脱,最终获得纯酶蛋白,采用Nanodrop进行蛋白浓度测定,将酶溶液稀释50倍备用。
酶活性检测体系及方法:为保证酶活性检测准确,酶活性检测最终体系为200 μL,其中L-组氨酸和S-腺苷甲硫氨酸终浓度为400 μmol/L,按酶活性检测方法加入0.1 μmol/LSAHN,10 μmol/L SRHH,甲基转移酶(egtD)添加量统一为5 μg/mL,Hepes缓冲液(pH=8.0)补齐体系,于37℃反应30 min后,加入4倍体积的DTNB-盐酸胍溶液终止反应,于412 nm比色测定生成的TNB量,通过标准曲线计算相对酶活,以D0为对照,对比酶活性的变化,具体结果如表3所示。
表3实施案例1中构建突变体编号、突变位点及相对活性对比
由表3所示,成功筛选到甲基转移酶酶活性提高的EgtD突变菌株D4和D12,D12中的甲基转移酶突变体为58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸,氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示,D4中的甲基转移酶突变体为第203位活性位点由缬氨酸突变为天冬酰胺,氨基酸序列如SEQ ID NO.5所示,核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。其中,D12中的甲基转移酶突变体相对活性最高,可达139%,最终酶活性提高了39%。
实施例3工程菌株在生产麦角硫因中的应用
麦角硫因基因工程菌的构建
使用PrimeSTAR®Max DNA Polymerase(购自takara,R045A)作为扩增酶,分别以实施例1记载质粒pET30a-E0、pET30a-E12(P58L)作为模板,进行目的基因MsEgtD及其P58L突变基因的扩增,PCR扩增Ms-F和Ms-R使用的引物如下表4所示。
表4 PCR扩增用引物
引物名称 | 核苷酸序列 |
Ms-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCATGACGCTCTCACTGGCCAAC |
Ms-R | CGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGACCAGAAGACCGCACCGCCAGCGACAAC |
Ms1-F | CTTTAAGAAGGAGATATACCATGGGCTTGATCGCACGCGAGACAC |
Ms1-R | CGGTTTCTTTACCAGACTCGAGTTTTCAGGGCGCCTCACGC |
扩增完成之后进行琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物。将目的条带从琼脂糖凝胶上切下,并使用胶回收试剂盒(Omega,D2500-02)对其进行DNA纯化回收。将回收的片段用NcoI-HF(购自NEB,R3193S)和XhoI(购自NEB,R0146V)进行双酶切,连入载体pACYC-PSC101-Ptac(构建方法为在质粒pACYCDuet-1(优宝生物)中的T7-1启动子更换为Ptac启动子,将复制子更换为PSC101,得到质粒pACYC-PSC101-Ptac),获得质粒pACYC-PSC101-Ptac-E0、pACYC-PSC101-Ptac-E12待测序正确后,转入产麦角硫因的大肠杆菌EGT33,获得工程菌株F0、F12。
以耻垢分枝杆菌(购自CGMCC,编号1.562)基因组作为模板,使用引物将质粒Ms1-F和Ms1-R扩增的MsEgtBCDE基因簇,连入载体pETDuet-1(购自优宝生物,VT1237,Amp抗性)的NcoI和XhoI位点,获得质粒pETDuet-MsEgtBCDE,将质粒pETDuet-MsEgtBCDE,分别和质粒pET-30a-E0、pET-30a-E12转入BL21(DE3)宿主,获得工程菌株G0和G12,具体如表5所示。
表5 工程菌信息
工程菌摇瓶培养及麦角硫因产量
将工程菌株F0、F12在含有30 μg/mL Cm抗性的LB平板上进行划线,G0、G12在含有100 μg/mL Amp抗性和50 μg/mL Kan抗性的LB平板上进行划线,于37℃培养箱过夜培养。每个工程菌分别挑取3个单克隆接种到4 mL含对应抗生素的LB培养基中,37 ℃、200 rpm条件下过夜培养。分别取上述种子液3 mL加入到装有30 mL含对应抗性发酵培养基(具体培养基配方如表6所示)的500 mL三角瓶中,于37 ℃、200 rpm的条件下培养0.5 h后,加入终浓度0.2 mM的诱导剂异丙基-β-D-硫代半乳糖苷(IPTG),在37℃条件下诱导,合成目标产物麦角硫因。培养过程中,使用氨水调控pH ,使pH维持在7.0左右。摇瓶培养10-12 h结束,12000rpm离心2 min收集发酵上清液,测定生物量OD600和麦角硫因的产量,测试结果如表7所示。具体的,采用高效液相色谱的方法检测发酵液中的麦角硫因浓度。
检测条件:色谱柱为Kromasil C18(250 mm×4.60 mm,5 μm);流动相为乙腈:水=2:98(体积比);流速为0.7 mL/min;柱温30 ℃;紫外检测波长257 nm。
表6 发酵培养基配方
表7 工程菌株麦角硫因的产量
由表7结果可见,耻垢分枝杆菌来源的甲基转移酶第58位活性位点由脯氨酸突变成亮氨酸后能够有效提高工程菌活性和麦角硫因产量。具体的,F12菌株麦角硫因最大产量可达228.28±11.53 mg/L,与F0菌株相比,F12菌株麦角硫因产量提高10%。在BL21(DE3)宿主中,G12菌株产量达到23.45±1.02 mg/L,比对照G0菌株提高23%。
Claims (8)
1.一种甲基转移酶突变体,其特征在于,所述甲基转移酶突变体包括下述A1)或A2):
A1) 如SEQ ID NO.3所示氨基酸序列或如SEQ ID NO.5所示氨基酸序列;
A2)为在A1)的N端和/或C端连接标签得到的具有相同功能的融合蛋白质。
2.生物材料,其特征在于,所述生物材料包括下述B1)-B6)中任一种:
B1)核酸分子,所述核酸分子编码权利要求1所述甲基转移酶突变体;
B2)表达盒,所述表达盒含有B1)所述核酸分子;
B3)重组载体,所述重组载体含有B1)所述核酸分子和/或B2)所述表达盒;
B4)重组微生物,所述重组微生物含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、和/或B3)所述重组载体;
B5)重组细胞,所述重组细胞含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、和/或B3)所述重组载体;
B6)全细胞催化剂,所述全细胞催化剂含有B1)所述核酸分子、B2)所述表达盒、B3)所述重组载体、B4)所述重组微生物、和/或B5)所述重组细胞。
3.如权利要求2所述的生物材料,其特征在于,B1)所述的核酸分子为核苷酸序列如SEQID No.4或SEQ ID No.6所示的核酸分子。
4.根据权利要求2所述的生物材料,其特征在于,所述重组微生物为谷氨酸棒杆菌、枯草芽孢杆菌、大肠杆菌、酿酒酵母中的一种或多种。
5.如权利要求1所述的甲基转移酶突变体或如权利要求2-4任一所述的生物材料在提高甲基转移酶酶活性中的应用。
6.如权利要求1所述的甲基转移酶突变体或如权利要求2-4任一所述的生物材料在下述D1)-D3)任一中的应用:
D1)构建用于生产麦角硫因的重组微生物;
D2)制备麦角硫因;
D3)调控重组微生物生产麦角硫因的产量。
7.如权利要求1所述的甲基转移酶突变体或如权利要求2-4任一所述的生物材料在制备含麦角硫因的药品或化妆品中的应用。
8.一种麦角硫因的生产方法,其特征在于,所述方法包括如下步骤:
步骤一、构建得到如权利要求2所述生物材料,其中,所述生物材料为重组微生物或重组细胞;
步骤二、培养所述重组微生物或重组细胞,得到麦角硫因。
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WO2022095591A1 (zh) * | 2020-11-03 | 2022-05-12 | 深圳瑞德林生物技术有限公司 | 复合酶及其在制备麦角硫因中的应用 |
CN116121161A (zh) * | 2022-11-25 | 2023-05-16 | 天津科技大学 | 一种生产麦角硫因的基因工程菌及其构建方法与应用 |
CN115851655A (zh) * | 2022-12-30 | 2023-03-28 | 华熙生物科技股份有限公司 | 酶、基因工程菌及其催化生产麦角硫因的方法 |
Non-Patent Citations (3)
Title |
---|
Engineering Methyltransferase and Sulfoxide Synthase for High-Yield Production of Ergothioneine;Luwen Zhang等;《Journal of Agricultural and Food Chemistry》;第71卷(第1期);第671-679页 * |
中华人民共和国国家卫生和计划生育委员会.《GB2760-2014食品安全国家标准食品添加剂使用标准》.中华人民共和国国家卫生健康委员会,2014,第1-218页. * |
麦角硫因生物合成研究的新进展;刘琦等;《生物工程学报》;第38卷(第4期);第1408-1420页 * |
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