CN116751772A - 一种差向异构酶突变体213p及其应用 - Google Patents
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Abstract
本发明涉及一种差向异构酶突变体213P及其应用，属于酶工程技术领域。本发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体，具体地，是将来源于根癌农杆菌的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase和来源于放射根瘤菌的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶DPEase2的第213位的丝氨酸突变为脯氨酸；本发明提供的D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体DPEase‑213P与原始酶DPEase相比，D‑阿洛酮糖转化率由32.9％提高至35.8％，D‑阿洛酮糖‑3‑差向异构酶突变体DPEase2‑213P与原始酶DPEase2相比，D‑阿洛酮糖转化率由31.4％提高至35.7％，转化能力显著提高。
Description
技术领域
本发明涉及一种差向异构酶突变体213P及其应用，属于酶工程技术领域。
背景技术
D-阿洛酮糖(D-psicose)是自然界中含量极少的一种六碳糖，D-阿洛酮糖是一种低能量、不消化的食糖替代品，其具有降低血糖的功效，目前被国外许多制药企业当做甜味添加剂使用。此外，因D-阿洛酮糖可以通过美拉德反应使得食物具有较好的持水性，在食品领域用处广泛。D-阿洛酮糖还具有：(1)降低血糖，可作为Ⅱ型糖尿病人的辅助治疗剂、膳食补充剂和甜味剂；(2)降低血脂，减少脂肪合成酶活性，抑制腹腔内脂肪堆积；(3)抗氧化活性，具有很强的活性氧(ROS)清除能力及谷胱甘肽还原能力；(4)神经保护和抗炎作用等。
D-阿洛酮糖是果糖的C-3位置的差向异构体，而D-阿洛酮糖-3-差向异构酶(D-allulose-3-epimerase,DAEase)是一类能将果糖进行C-3位置差向异构化生产D-阿洛酮糖的酶，目前大约有20多种DAEase。目前多数研究针对酶的单方面性能(如耐热或耐碱)的研究，而对转化率的研究很少。
中国专利文献CN 106148311 A(申请号：201610818847.X)公开一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，以来源于Burkholderia sp.MR1的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶为模板，至少为以下突变中的一个：第86位氨基酸残基从甘氨酸变成天冬氨酸，第164位的氨基酸残基从天冬氨酸变成谷氨酸，第262位氨基酸残基从色氨酸变成丝氨酸。本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，含有G86D、D164E、W262S突变位点中的一个或多个突变位点，催化活性得到显著提高，催化活性为野生型的1.4倍以上，大大降低了合成D-阿洛酮糖过程中的酶的用量，具有重要的工业应用价值。
中国专利文献CN 108239633 A(申请号：201611217802.3)公开了一种催化活性得到提高的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自于类芽孢杆菌(Paenibacillus senegalensis)，其突变包括以下至少3个位点发生突变：第73位天冬氨酸(D)、第111位酪氨酸(Y)、第188位天冬酰胺(N)、第250位甘氨酸(G)。本发明突变的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶具有非常高的催化活性，此外，本发明的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶还具有很高的催化效率(高达29.6％)。
中国专利文献CN 110438112 A(申请号：201910757830.1)公开了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的突变体，该D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来自集胞藻属(Synechocystis)，其突变体所发生突变的氨基酸的突变位点为第39位的I突变为A，可选的突变位点还包括如下任意一个：第158位的Q突变为S，第186位的L突变为V。具有上述突变位点的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶催化生产D-阿洛酮糖的效率大幅度提高。
针对不同来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶进行基因工程改造，以获得性质更加优良的突变体，仍然具有重大研究意义和实际应用价值。
发明内容
针对现有技术的不足，本发明提供了一种差向异构酶突变体213P及其应用。本发明通过对比来源于根癌农杆菌和放射根瘤菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的氨基酸序列，发现一段共有序列“205-LGHFHTGESNRRVPGKGRMPWHEIGLALR-233”，本发明对该共有序列中的位于D-阿洛酮糖-3-差向异构酶氨基酸序列第213位的丝氨酸(S)进行了NNK突变，筛选最佳突变体，得到改造后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P对D-阿洛酮糖转化能力显著提高。
本发明技术方案如下：
一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P，是在野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基础上，将氨基酸序列中第213位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)。
根据本发明优选的，所述野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于根癌农杆菌(Agrobacter ium tumefaciens)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
根据本发明优选的，所述野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于放射根瘤菌(Agrobacter ium fabrum)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因，其编码上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P。
本发明中，上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因是在SEQ IDNO.2或SEQ ID NO.4所示的核苷酸序列及其简并序列的基础上突变得到的。
根据本发明优选的，所述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6或SEQ ID NO.8所示。
一种含有上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因的重组表达载体。
根据本发明优选的，所述重组表达载体的载体质粒为pET-20b(+)。
一种含有上述重组表达载体或上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因的基因工程菌。
根据本发明优选的，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。
上述基因工程菌在制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P中的应用。
上述D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P或上述基因工程菌在生产D-阿洛酮糖中的应用。
有益效果:
本发明提供了一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体，具体地，是将来源于根癌农杆菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase和来源于放射根瘤菌的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase2的第213位的丝氨酸(S)突变为脯氨酸(P)；本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213P与原始酶DPEase相比，D-阿洛酮糖转化率由32.9％提高至35.8％，D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase2-213P与原始酶DPEase2相比，D-阿洛酮糖转化率由31.4％提高至35.7％，转化能力显著提高。本发明提供的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213P和DPEase2-213P，拓宽了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的应用范围，在食品、医药等领域具有广泛的应用前景。
附图说明
图1为D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase与DPEase2的氨基酸序列比对结果。
图2为原始酶DPEase与突变体DPEase-213P的D-阿洛酮糖转化率曲线图。
图3为原始酶DPEase2与突变体DPEase2-213P的D-阿洛酮糖转化率曲线图。
图4为原始酶DPEase与突变体DPEase-244NNK的D-阿洛酮糖转化率曲线图。
图5为原始酶DPEase与突变体DPEase-150NNK的D-阿洛酮糖转化率曲线图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明的技术方案做进一步阐述，但本发明所保护范围不限于此。实施例中未详加说明的均按本领域现有技术。
实施例中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的来源：
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase来源于根癌农杆菌(Agrobacteriumtumefaciens)，其NCBI检索号为WP_010974125，DPEase的氨基酸序列为SEQ ID NO.1，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.2。
D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase2来源于放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)，其NCBI检索号为WP_006311383，DPEase2的氨基酸序列为SEQ ID NO.3，其编码基因的核苷酸序列为SEQ ID NO.4。
将以上两种来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase和DPEase2的氨基酸序列进行比对，结果见图1，氨基酸序列“205-LGHFHTGESNRRVPGKGRMPWHEIGLALR-233”为其共有序列。
实施例1：含有突变体基因的重组质粒构建
以含有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase和DPEase2编码基因的重组质粒pET-20b(+)-DPEase和pET-20b(+)-DPEase2(由金斯瑞公司合成)为模板，进行反向PCR扩增，分别对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase和DPEase2的第213位氨基酸(S)对应的密码子进行NNK突变；
所述反向PCR扩增的引物序列如下：
DPEase-F1:5’-TTTCACACCGGCGAANNKAACCGCCGTGTTCCGGGTAAAGGTCGTA-3’；
DPEase-R1:5’-GGTGTGAAAGTGACCCAGCAGTGGGCCCGCC-3’；
DPEase2-F2:5’-GGTGAANNKAATCGCCGCGTACCGGGC-3’；
DPEase2-R2:5’-TTCACCGGTATGGAAGTGCC-3’。
所述反向PCR扩增的反应体系见表1：
表1.反向PCR扩增的反应体系
所述反向PCR扩增的程序如下：
95℃预变性5min；94℃变性30sec，55℃退火30sec，72℃延伸30sec，30个循环；72℃延伸10min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物，长度约为4500bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用；
将制得的胶回收产物进行纯化和消解，由于pET-20b(+)质粒来源于具有Dam甲基化修饰功能的大肠杆菌中，可以被DpnI酶切碎，而含有突变位点的质粒不具有甲基化所以不被DpnI酶切碎，经过DpnI酶消解处理后制得含有突变体基因的重组质粒库pET-20b(+)-DPEase-213NNK和pET-20b(+)-DPEase2-213NNK；
所述的消解体系见表2：
表2.胶回收产物的消解体系
所述的消解程序如下：
37℃反应120min，75℃15min，4℃保存；
琼脂糖凝胶电泳检验消解产物，长度约为4500bp，使用SanPrep柱式DNA胶回收试剂盒(上海生工)进行胶回收，回收产物-20℃保存，备用。
实施例2：制备大肠杆菌感受态细胞
(i)挑取大肠杆菌(Escherichia coli)BL21(DE3)单菌落接种至LB液体培养基中，200r/min、37℃培养过夜；
(ii)吸取0.1mL培养的菌液至10mL的LB液体培养基中，300r/min、37℃培养至OD600达0.6～0.8；
(iii)吸取1mL OD600达0.6～0.8的菌液至1.5mL无菌离心管中，12000r/min离心2min，彻底去除上清；
(iv)加入100μL冰预冷的SSCS(一步法快速制备感受态细胞试剂盒，上海生工生物工程公司产品)，轻悬菌体即制成大肠杆菌感受态细胞；
(v)将制备好的大肠杆菌感受态细胞分装100μL每管，-80℃保存，备用。
实施例3：重组大肠杆菌BL21(DE3)的制备
首先利用核酸超微量分光光度计测定质粒pET-20b(+)-DPEase-213NNK和pET-20b(+)-DPEase2-213NNK浓度，达到300μg/mL浓度后，采用化学转化法，分别转化到实施例2制备的大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，得到的细胞使用复苏培养基37℃复苏培养1h后，取100μL涂布在含50μg/mL氨苄青霉素的LB固体培养基上，在37℃过夜培养，筛选具有氨苄青霉素抗性的阳性重组菌落。
其中，复苏培养基每升组分如下：
蛋白胨10g、酵母粉5g、氯化钠10g，余量水。
阳性重组菌的培养及鉴定：
挑取上述阳性重组菌落，接种到含50μg/mL氨苄青霉素的液体LB培养基中，37℃培养过夜，培养完成后，交由上海生物工程有限公司进行测序验证。测序正确后，得到重组大肠杆菌。
经测序验证，将突变成功的菌株进行保存，保存的菌株包括213位点突变为另外19种氨基酸的菌株，进行后续转化率筛选，获得最佳突变体。
实施例4：突变体转化率测试
将实施例3制备的含有质粒pET-20b(+)-DPEase-213NNK或pET-20b(+)-DPEase2-213NNK的重组大肠杆菌接种至100mL液体LB培养基(蛋白胨10g/L，酵母膏5g/L，NaCl 10g/L，余量水)中，200r/min、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至发酵培养基(蛋白胨20g/L，酵母膏20g/L，糊精20g/L，余量水)中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入到pH8.0、终浓度为300g/L的果糖溶液中，在60℃条件下水浴反应，每4h取一次样，共取5次，通过高效液相色谱进行D-阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D-阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
结果见图2、图3。与原始酶DPEase(在温度为60℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％)相比，突变后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213P的转化率最高，最高转化率达到了35.8％，与原始酶DPEase相比提高了2.9％。与原始酶DPEase2(在温度为60℃、pH为8.0，最高转化率为31.4％)相比，突变后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase2-213P的转化率最高，最高转化率达到了35.7％，与原始酶DPEase2相比提高了4.3％。
同时筛选到的还有D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213D，其在60℃、pH为8.0下的D-阿洛酮糖转化率为23.5％，与原始酶DPEase相比降低了9.4％。
上述筛选到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213P的氨基酸序列如SEQID NO.5所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.6所示。
上述筛选到的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase2-213P的氨基酸序列如SEQ ID NO.7所示，其编码基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.8所示。
对比例1
对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase第244位氨基酸(E)对应的密码子进行NNK突变：
以重组质粒pET-20b(+)-DPEase为模板，进行反向PCR扩增，按照实施例1的方法，制备得到含有突变体基因的重组质粒库pET-20b(+)-DPEase-244NNK；
其中，所述反向PCR扩增的引物序列如下：
F1-1:5’-CGCAGTGATTATGNNKCCGTTTGTGAAGACTGGTGG-3’；
R1-1:5’-TAGTTAATATCACGCAGGGCCAGACCG-3’。
参照实施例3的方法，制备含有质粒pET-20b(+)-DPEase-244NNK的重组大肠杆菌，并参照实施例4的方法，将上述重组大肠菌接种至100mL液体LB培养基中，200rpm、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至发酵培养基中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入到pH8.0、终浓度为300g/L的果糖溶液中，在60℃条件下水浴反应，每4h取一次样共取5次，通过高效液相色谱进行D-阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D-阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
结果见图4。与原始酶DPEase(在温度为60℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％)相比，突变后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-244NNK的最高转化率达到了20％，低于原始酶DPEase。
对比例2
对D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase第150位氨基酸(E)对应的密码子进行NNK突变：
以重组质粒pET-20b(+)-DPEase为模板，进行反向PCR扩增，按照实施例1的方法，制备得到含有突变体基因的重组质粒库pET-20b(+)-DPEase-150NNK；
其中，所述反向PCR扩增的引物序列如下：
F1-2:5’-CAACCTGTGTATTNNKGTGCTCAATCGCTTCGAAAA-3’；
R1-2:5’-AGATCATTGGCGAAATCCG-3’。
参照实施例3的方法，制备含有质粒pET-20b(+)-DPEase-150NNK的重组大肠杆菌，并参照实施例4的方法，将上述重组大肠菌接种至100mL液体LB培养基中，200rpm、37℃下培养至OD600为0.7，按照2％(v/v)的接种比接种至发酵培养基中，30℃诱导48h。诱导完成后，将发酵液进行离心，取沉淀采用发酵液等体积的PBS缓冲液重悬，超声破碎后得粗酶液，将粗酶液加入到pH8.0、终浓度为300g/L的果糖溶液中，在60℃条件下水浴反应，每4h取一次样共取5次，通过高效液相色谱进行D-阿洛酮糖和果糖浓度检测，根据D-阿洛酮糖转化率筛选最佳突变体。
结果见图5。与原始酶DPEase(在温度为60℃、pH为8.0，最高转化率为32.9％)相比，突变后的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-150NNK的最高转化率达到了25％，低于原始酶DPEase。
综上，对比例1中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-244NNK与对比例2中D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-150NNK是分别选取了D-阿洛酮糖-3-差向异构酶DPEase的第244氨基酸和第150个氨基酸来进行NNK突变，但得到的突变体对于D-阿洛酮糖的转化率均低于原始酶DPEase。本发明所要求保护的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体DPEase-213P和DPEase2-213P是对原始酶DPEase和DPEase2的第213位氨基酸进行突变，由原始的丝氨酸(S)突变成脯氨酸(P)。结果表明，对两种来源的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶酶分别进行上述突变，都会提高对D-阿洛酮糖的转化率，分别由32.9％提高至35.8％和由31.4％提高至35.7％，转化能力显著提高。
Claims (10)
1.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P，其特征在于，是在野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶的基础上，将氨基酸序列中第213位的丝氨酸突变为脯氨酸。
2.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P，其特征在于，所述野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。
3.如权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P，其特征在于，所述野生型D-阿洛酮糖-3-差向异构酶来源于放射根瘤菌(Agrobacterium fabrum)，其氨基酸序列如SE Q ID NO.3所示。
4.一种D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因，其特征在于，其编码权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P。
5.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述编码基因是在SEQ ID NO.2或SEQID NO.4所示的核苷酸序列及其简并序列的基础上突变得到的。
6.如权利要求4所述的编码基因，其特征在于，所述的编码基因的核苷酸序列如SEQ IDNO.6或SEQ ID NO.8所示。
7.一种含有权利要求4所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因的重组表达载体；
优选的，所述重组表达载体的载体质粒为pET-20b(+)。
8.一种含有权利要求7所述的重组表达载体或权利要求4所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P的编码基因的基因工程菌；
优选的，所述基因工程菌的宿主菌为大肠杆菌。
9.权利要求8所述的基因工程菌在制备D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P中的应用。
10.权利要求1所述的D-阿洛酮糖-3-差向异构酶突变体213P或权利要求8所述的基因工程菌在生产D-阿洛酮糖中的应用。
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