CN110079542B - 一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用 - Google Patents

一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用 Download PDF

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Abstract

本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体公开了一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用，将Aglycin通过自剪切内含肽、连接肽与自组装肽进行连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，将重组表达载体在大肠杆菌体内表达，获得重组表达菌株；重组表达菌株加入诱导剂进行诱导表达，离心收集菌体，对菌体进行破碎离心后得到沉淀，经诱导剂切割并离心得到上清，然后对切割后上清进行纯化，获得高纯度Aglycin。本发明首次通过基因工程的方法实现了Aglycin的可溶性表达，并且多肽具有一定α‑葡萄糖苷酶抑制的降糖活性，可用于制备降糖多肽药物。

Description

一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用
技术领域
本发明属于基因工程和生物制药技术领域，具体涉及一种基于自组装肽和自剪切肽的降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用。
背景技术
迄今为止，糖尿病(diabetes mellitus，DM)已经成为威胁人类生命健康的隐性杀手之一，据国际糖尿病联盟(IDF)公开发布的报告显示，2017年全球超过4.25亿人患上糖尿病，其中我国患者数量占全球的25％以上，高达1.14亿(母义明,贾伟平.中国糖尿病研究进展专辑简介[J].中国科学:生命科学,2018,48(08):807-809)。糖尿病是由多种因素引起的代谢紊乱综合症，其中Ⅱ型糖尿病患者占糖尿病总人数的90％以上(Xu Y,Wang L M,He J,et al.Prevalence and control of diabetes in Chinese adults[J].JAMA,2013,310(9):948-958)。Ⅱ型糖尿病患者长时间的高血糖会引发各种慢性并发症，如脑血管病变、心脏病、肾功能衰竭、眼病、皮肤病、足部溃疡、性病等等。据统计，每年至少需要1000亿美元来对糖尿病及其相关并发症进行治疗(Jarald E,Joshi S B,Jain D C.Diabetes andherbal medicines[J].Iran J Pharmacol Ther,2008,7(1):97-106)。临床上使用的降糖药物的药效有限且存在毒副作用，长期服用容易导致皮肤过敏、肝肾功能损伤、胃肠道不适等，因此开发能调节糖代谢的生物活性肽成为国内外研究的热点。
Aglycin又称为胰安肽，是从大豆或豌豆种子中提取分离的、由37个氨基酸残基组成的新型生物活性肽，其含有三对分子内二硫键。经初步的生理功能研究，Aglycin有一定调节糖代谢与保护胰腺β细胞的能力。
目前，Aglycin主要通过大豆或豌豆种子的提取分离来制备，其提取分离的效率低下且过程十分繁琐，需要经过乙酸提取、海藻酸吸附、葡聚糖G-25凝胶过滤、离子交换层析、反相高效液相色谱制备等多个步骤。而用基因工程的生物方法来制备Aglycin并研究其应用，无疑具有重大的理论和现实意义。
大肠杆菌由于其遗传背景清晰、繁殖旺盛、表达量高、产物易纯化和成本低等优点，成为发展最早和迄今为止应用最广泛的原核表达***。Aglycin具有三对分子内二硫键且分子量较小，因此研究其在大肠杆菌原核体系的可溶性表达具有较高的理论意义和经济效益。
发明内容
本发明的目的在于提供一种真核生物多肽在原核生物大肠杆菌中的可溶性表达，第一次用基因工程的方法实现了Aglycin的重组表达，并且初步验证了重组Aglycin对α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性。
本发明通过分子生物学的方法和技术实现了Aglycin在大肠杆菌体内的功能性表达。一方面，基于自组装肽ELK16能在大肠杆菌细胞内进行自聚集的特性，将Aglycin通过一个内含肽Mxe GyrA与自组装肽连接，构建能在体外自剪切的高效表达载体。另一方面，通过内含肽在一定条件下的自剪切特性，大大减少了目的多肽的损失,使目的多肽达到高效表达的效果，最终纯化获得具有降糖活性的Aglycin。
本发明所采取的技术方案如下：
一种降糖肽Aglycin的重组表达方法，将Aglycin通过自剪切内含肽、连接肽与自组装肽进行连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，将重组表达载体在大肠杆菌体内表达，获得重组表达菌株；重组表达菌株加入诱导剂进行诱导表达，离心收集菌体，对菌体进行破碎离心后得到沉淀，经诱导剂切割并离心得到上清，然后对切割后上清进行纯化，获得高纯度Aglycin。
优选地，所述自剪切内含肽为Mxe GyrA、srtAc、DnaB或DnaE，所述自组装肽为ELK16、18A、NEW1或酵母朊蛋白sup35NM。
优选地，所述Aglycin的核苷酸序列为SEQ ID No.1；所述自剪切内含肽为MxeGyrA，其核苷酸序列为SEQ ID No.2；所述连接肽为PT linker，其核苷酸序列为SEQ IDNo.3；所述自组装肽为ELK16，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。
优选地，所述重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16的构建：以合成的含有Aglycin基因的质粒为模板，以Ag-F/R为引物对通过PCR技术扩增出Aglycin基因，并通过RF克隆将Aglycin和含Mxe-PT-ELK16蛋白序列的pET30a载体连接在一起，构建出重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16。
优选地，所述Ag-F/R的序列如下：
Ag-F5′-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTTGCAACGGTGTTTGCTCT-3′，其核苷酸序列为SEQ ID No.5。
Ag-R5′-GGCGTCGCCGGTGATGCACATACGCATACCAGACGGGTGACGGCAGTA-3′，其核苷酸序列为SEQ ID No.6。
一种降糖肽Aglycin的重组表达方法，其具体步骤如下：
(1)将构建的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16通过化学转化的方法转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取转化平板上单克隆接种至LB液体培养基中进行种子液培养；将种子液接种到LB液体培养基中，进行发酵培养，当OD600＝0.6～0.8时，添加IPTG(异丙基-β-D-硫代半乳糖苷)进行诱导表达；
(2)诱导表达结束后，离心收集菌体，用缓冲液重悬，高压破碎菌体后离心收集沉淀，用洗涤缓冲液重悬沉淀并经DTT切割，将切割后样品离心得到上清，然后纯化，获得高纯度的Aglycin。
优选地，所述种子液培养及发酵培养的条件为37℃，220rpm；所述种子液的接种量为1:100v/v。
优选地，所述诱导表达的条件为：16～37℃诱导表达5～24h；所述IPTG的浓度为0.2～1mM。
优选地，所述诱导表达的条件为：16℃诱导表达24h；所述IPTG的浓度为0.2mM。
优选地，所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，20～80mM切割4～16h。
优选地，所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，40mM切割12h。
优选地，步骤(2)所述纯化是经10kDa超滤管纯化，对纯化的Aglycin进行浓缩，用PBS缓冲液透析。所述的浓缩方式为聚乙二醇20000浓缩、蔗糖浓缩或者超滤管(10kDa)浓缩。
步骤(1)所述的大肠杆菌表达宿主菌，只要步骤(1)中所述的重组表达载体能在其体内表达即可，包括但不限于E.coli BL21(DE3)，E.coli BL21(DE3)/pLyS，E.coliBL21，E.coli BL21 Rosetta，E.coliMC4100。
两亲性自组装肽ELK16具有分子量小、结构简单、易于聚集和使蛋白易于分离和纯化等特点，将Aglycin通过一个内含肽MxeGyrA与自组装肽连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，该重组载体表达的融合蛋白以活性聚集体的形式存在于大肠杆菌胞内，细胞经过破碎后，无需纯化、透析等后期复杂程序，只需简单的离心即可获得具有生物活性的高纯度融合蛋白。另外，通过内含肽Mxe GyrA在一定条件下的自剪切特性，大大减少了目的多肽Aglycin的损失，从而高效获得高纯度的Aglycin。
与现有技术相比，本发明具有以下优点及效果：
目前Aglycin主要通过提取分离的方法来制备，本发明首次通过基因工程的方法实现了Aglycin的可溶性表达，并且重组蛋白具有一定的α-葡萄糖苷酶抑制的降糖活性，可用于制备降糖多肽药物。
附图说明
图1为pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16载体构建菌落PCR图。其中泳道M：DNAMarker；泳道1-6：阳性克隆。
图2为转化有pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16的E.coli BL21(DE3)重组表达菌株的小量表达及对诱导表达温度进行优化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；未：未诱导全液；W:诱导全液；S:诱导上清；P:诱导沉淀；16℃-24h、25℃-12h、37℃-5h；1mM IPTG的条件下，分别在16℃、25℃、37℃诱导表达24h、12h、5h。
图3为转化有pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16的E.coli BL21(DE3)重组表达菌株的小量表达及对IPTG诱导浓度进行优化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；W:破碎后的全液；S:破碎后的上清；P:破碎后的沉淀；未：未诱导；0.2、0.5、1mM为分别添加IPTG诱导浓度为0.2mM、0.5mM、1mM的诱导组。
图4为对Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白的DTT切割时间优化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；切前：DTT切割前样品；切后：DTT切割后样品；4、8、12、16h为DTT分别在4h、8h、12h、16h切割后的诱导切割组。
图5为对Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白的DTT切割浓度优化结果图。其中泳道M：蛋白Marker；切前：DTT切割前样品；切后：DTT切割后样品；20、40、60、80mM为分别添加DTT浓度为20mM、40mM、60mM、80mM的诱导切割组。
图6为Aglycin的Tricine-SDS-PAGE检测结果图。其中泳道M：蛋白Marker；切前：DTT切割前样品；切后：DTT切割后样品；W：切割后全液；S：切割后上清；P：切割后沉淀。
图7为Aglycin的纯化及浓缩结果图。其中图A为经超滤管纯化获得的Aglycin结果图；图B为浓缩后的Aglycin结果图；泳道M：蛋白Marker。
图8为Aglycin对α-葡萄糖苷酶的抑制活性。其中图A为阳性对照阿卡波糖和α-葡萄糖苷酶及PNPG反应后的A405结果图；图B为阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果图；图C为Aglycin和α-葡萄糖苷酶及PNPG反应后的A405结果图；图D为Aglycin对α-葡萄糖苷酶的抑制率结果图。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步详细的描述，但本发明的实施方式不限于此。下述实施例中有未注明具体条件的实验方法，则是按照常规的分子克隆手册所述的条件进行操作。
实施例1：重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16的构建
(1)根据Aglycin的基因序列，在基因合成公司(上海生工)合成其DNA序列Ag，设计如下引物(Ag-F/Ag-R)扩增Aglycin目的基因：
Figure BDA0002028603820000051
(2)以合成的含有Aglycin基因的质粒(pUC57-Ag)为模板，用上述扩增引物进行Aglycin目的基因的扩增，具体步骤如下：
a.PCR反应体系(50μL):
Figure BDA0002028603820000052
b.PCR扩增反应程序：
Figure BDA0002028603820000053
(3)PCR反应结束后，进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定，得到大小约为165bp的包含Aglycin的基因片段，对PCR产物进行纯化回收，得到含有Aglycin的基因片段，然后配制线性扩增反应体系，将回收的Aglycin目的基因***载体pET30a-Mxe-PT-ELK16中，具体反应体系如下：
a.PCR反应体系(50μL):
Figure BDA0002028603820000061
b.PCR扩增反应程序：
Figure BDA0002028603820000062
(4)PCR反应完后，将步骤(3)中得到的PCR产物进行DpnI酶切消化，具体操作如下：
a.酶切反应体系(20μL)：
Figure BDA0002028603820000063
b.置于37℃恒温PCR仪中反应1h。
(5)将酶切后产物转化到E.coli DH5α感受态细胞中，挑选平板上单克隆进行菌落PCR检验，体系如下：
Figure BDA0002028603820000064
Figure BDA0002028603820000071
(6)菌落PCR反应结束后，进行1％(w/v)琼脂糖凝胶电泳鉴定。对条带大小正确(约为980bp)的单克隆进行测序鉴定。筛选出正确携带Aglycin基因的重组质粒pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16，如图1所示。
实施例2：Aglycin-Mxe-PT-ELK16重组蛋白的表达及优化
(1)将实施例1中构建的重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16通过化学转化的方法转入大肠杆菌BL21(DE3)感受态细胞中，挑取转化平板上单克隆接种至6mL的LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。
a.Aglycin-Mxe-PT-ELK16表达的温度优化：将种子液按1:100(v/v)的比例接种到6支装有6mL新鲜LB液体培养基的试管中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD600＝0.6～0.8时，3支添加1mM IPTG进行诱导，另外3支不添加诱导剂IPTG作为对照，两两配对(1支诱导，1支未诱导)分别于16℃、25℃、37℃诱导表达24h、12h、5h。
b.Aglycin-Mxe-PT-ELK16表达的诱导剂浓度优化：将种子液按1:100(v/v)的比例接种到4支装有6mL新鲜LB液体培养基的试管中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD600＝0.6～0.8时，分别添加不同浓度的IPTG进行诱导，IPTG浓度如下：0.2、0.5、1mM。其中一支试管不添加诱导剂作为对照，然后将4支试管置于16℃(最优温度)的摇床中诱导表达24h。
(2)诱导表达结束后，对表达后的菌液测OD600值并进行收菌。按照每10OD加1mlPBSbuffer对上述收集的菌体完全悬浮，然后采用超声波破碎菌体。菌体破碎完毕后吸取80μL制备破碎后的全液样品，然后12000rpm离心2min获得破碎后的上清和沉淀，分别吸取80μL制备破碎后的上清和沉淀样品。
(3)将80μL样品和上样缓冲液混合后置于沸水浴中煮沸10min，12000rpm离心2min，跑SDS-PAGE电泳。
结果：
a.如图2所示，菌体经诱导后都有明显的目的蛋白条带(29.4kDa)，说明Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白成功在大肠杆菌胞内表达。且在不同温度条件(16℃-24h、25℃-12h、37℃-5h)下，Aglycin-Mxe-PT-ELK16重组蛋白绝大部分以沉淀形式(活性聚集体)进行表达。在16℃表达24h的条件下，Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白的表达量达到最高。因此Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白表达的最优温度为16℃。
b.如图3所示，当IPTG浓度添加到0.2mM时，Aglycin-Mxe-PT-ELK16融合蛋白的表达量达到最大值，因此Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白表达的最优诱导剂浓度为0.2mM IPTG。
实施例3：Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白的DTT切割条件优化
(1)将实施例2中单克隆接种至8mL的LB液体培养基中进行37℃，220rpm过夜培养作为种子液。将种子液按1:100(v/v)的比例接种到600mL新鲜LB液体培养基中，置于37℃，220rpm进行培养，当OD600＝0.6～0.8时，添加诱导剂IPTG至终浓度为0.2mM,然后置于16℃的摇床中诱导表达24h。
(2)表达结束后，9000rpm离心10min收集菌体，用LysisBuffer重悬，高压破碎菌体后离心收集沉淀，向沉淀加入洗涤缓冲液进行洗涤，得到沉淀样品。
a.分别向沉淀样品添加相应体积(20OD/mL)的含40mM DTT的切割液，悬浮均匀，置于4℃切割，然后在切割后4、8、12、16h进行取样，制样并跑SDS-PAGE检测。
b.分别向沉淀样品添加不同浓度(20、40、60、80mM)的DTT，悬浮均匀，放置于4℃切割12h；然后对其分别制样，进行SDS-PAGE检测。
结果：
a.如图4所示，当切割4h后，约有38.8％的Aglycin-Mxe-PT-ELK16聚集体发生切割；当切割反应达到12h，约有68.25％的重组蛋白发生切割并达到最大值。因此，DTT切割的最优时间为12h。
b.如图5所示，当添加40mM的DTT时，切割已经达到平衡(40mM-80mM：56.2％-72.3％)，且40mM DTT已足够对内含肽Mxe GyrA产生切割反应，因此DTT切割的最优浓度为40mM。
实施例4：Aglycin的Tricine-SDS-PAGE检测
(1)在4℃条件下，将Aglycin-Mxe-PT-ELK16蛋白(活性聚集体)用含40mM DTT的切割液进行12h的切割反应后，用移液器小心地把切割后样品混悬均匀，取80μL样品制样(切割后全液)。
(2)然后于4℃，14000×g条件下离心45min，得到上清和沉淀。将上清转移到新的容器中(50mL离心管)，取80μL样品制样(切割后上清)，其它上清样品放置于4℃冰箱备用。
(3)最后，用相应体积(20OD/mL)的Lysis Buffer把沉淀混悬完全，取80μL样品制样(切割后沉淀)，并将上述样品进行Tricine-SDS-PAGE的检测。
结果：如图6所示，发现Aglycin-Mxe-PT-ELK16聚集体切割后释放出的Aglycin多肽存在于上清中(5kDa左右的条带)，这有利于Aglycin多肽的下一步纯化。
实施例5：Aglycin的纯化及浓缩
(1)将Aglycin-Mxe-PT-ELK16聚集体切割后释放到上清的Aglycin多肽收集起来，用截流量为10kDa的超滤管(Millipore，美国)进行4℃离心超滤除杂。将超滤管离心后的透过液(含Aglycin多肽)进行收集，取80μL样品制样进行Tricine-SDS-PAGE的检测。
(2)将用超滤管纯化得到的Aglycin多肽进行浓缩并用PBS缓冲液完全透析过夜，放置于4℃作活性检测用。
结果：如图7所示，发现通过对Aglycin-Mxe-PT-ELK16聚集体的切割后上清进行超滤除杂后，可以获得纯度高达98.15％的Aglycin；经浓缩后的Aglycin多肽浓度可达45μmol/L。
实施例6：Aglycin的降糖活性检测
(1)吸取30μL不同浓度的样品(阳性对照阿卡波糖、PBS缓冲液、Aglycin多肽)于96孔板上(各设置3个平行)。
(2)向样品中各加入30μL0.1U/mL的α-葡萄糖苷酶(每个样品设置样品对照组，用0.1MPBS缓冲液代替酶液)，于37℃共同孵育10min。
(3)向样品中各加入30μL预热过的5mM PNPG底物，于37℃恒温反应20min。
(4)反应结束后迅速加入100μL 1M Na2CO3溶液终止反应。
(5)终止反应后，用酶标仪对反应液在405nm波长下的吸收值进行测定。
本实验共设置以下组别：
a:空白对照组(缓冲液+酶液+底物)
b:空白对照背景组(缓冲液+底物)
c:样品测定组(样品+酶液+底物)
d:样品背景组(样品+底物+缓冲液)酶活抑制率
Figure BDA0002028603820000101
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结果：如图8所示，阳性对照阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶有显著的抑制作用，说明本实验的试剂与方法适用于样品对α-葡萄糖苷酶抑制的降糖功能测定。通过SPSS软件进行拟合，得到相关方程式为y＝-21.95x2+79.54x+8.107，系数R2＝0.991，求得阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50大约为0.64mg/mL(990μmol/L)。而Aglycin随着浓度的提高，其和α-葡萄糖苷酶及底物PNPG反应后的A405逐步降低，对α-葡萄糖苷酶的抑制率逐步提高，通过SPSS软件进行拟合，得到相关方程式为y＝0.008x2+0.511x+20.717，系数R2＝0.979，求得Aglycin多肽对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50大约为36.48μmol/L。另外，与阿卡波糖对α-葡萄糖苷酶抑制的IC50(990μmol/L)相比，Aglycin比阿卡波糖的IC50低，说明Aglycin比阿卡波糖有更强的α-葡萄糖苷酶抑制活性，这进一步说明Aglycin多肽有开发为α-葡萄糖苷酶抑制剂的潜力，进而实现降糖的效果。
序列表
<110> 华南理工大学
<120> 一种降糖肽Aglycin的重组表达方法及其应用
<160> 6
<170> SIPOSequenceListing 1.0
<210> 1
<211> 111
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 1
gcttcttgca acggtgtttg ctctccgttc gaaatgccgc cgtgcggttc ttctgcttgc 60
cgttgcatcc cggttggtct ggttgttggt tactgccgtc acccgtctgg t 111
<210> 2
<211> 594
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 2
tgcatcaccg gcgacgcctt agtggcactg ccggaaggcg aaagcgtgcg tattgccgat 60
atcgttccgg gtgcacgccc taacagcgat aatgcaatcg acctgaaagt gttagatcgc 120
cacggcaatc ctgttctggc cgatcgcctg tttcacagtg gcgaacatcc ggtgtacaca 180
gtgcgcaccg tggaaggtct gcgcgtgacc ggcacagcaa atcacccgct gctgtgttta 240
gtggacgttg caggcgtgcc tacactgctg tggaagctga tcgatgaaat caagccgggt 300
gactacgcag tgattcagcg cagtgccttc agcgttgatt gcgccggttt tgcacgtggc 360
aaaccggaat ttgcaccgac cacctacacc gtgggtgtgc cgggcctggt tcgtttcctg 420
gaagcacacc atcgtgatcc ggacgcacag gccattgccg atgagctgac cgacggccgc 480
ttttactatg ccaaagttgc cagcgtgaca gatgcaggtg tgcagccggt ttacagttta 540
cgcgtggata ccgccgatca cgcattcatt accaacggct tcgttagcca tgcc 594
<210> 3
<211> 51
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 3
ccgaccccac cgaccacgcc aacgccacca accaccccaa ccccgacgcc g 51
<210> 4
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 4
ctggaactgg aactgaaact gaaactggaa ctggaactga aactgaaa 48
<210> 5
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 5
ctttaagaag gagatataca tatggcttct tgcaacggtg tttgctct 48
<210> 6
<211> 48
<212> DNA
<213> 人工序列(Artificial Sequence)
<400> 6
ggcgtcgccg gtgatgcaca tacgcatacc agacgggtga cggcagta 48

Claims (7)

1.一种降糖肽Aglycin的重组表达方法，其特征在于，将Aglycin通过自剪切内含肽、连接肽与自组装肽进行连接，构建能在体外自剪切的重组表达载体，将重组表达载体在大肠杆菌体内表达，获得重组表达菌株；重组表达菌株加入诱导剂进行诱导表达，离心收集菌体，对菌体进行破碎离心后得到沉淀，经诱导剂切割并离心得到上清，然后对切割后上清进行纯化，获得高纯度Aglycin；所述自剪切内含肽为MxeGyrA，其核苷酸序列为SEQ ID No.2；所述自组装肽为ELK16，其核苷酸序列为SEQ ID No.4。
2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，所述Aglycin的核苷酸序列为SEQ IDNo.1；所述连接肽为PT linker，其核苷酸序列为SEQ ID No.3。
3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述重组表达载体的构建：
以合成的含有Aglycin基因的质粒为模板，以Ag-F/R为引物对通过PCR技术扩增出Aglycin基因，并通过RF克隆将Aglycin和含自剪切内含肽-连接肽-自组装肽蛋白序列的pET30a载体连接在一起，构建出重组表达载体pET30a-Aglycin-Mxe-PT-ELK16；
所述Ag-F/R的序列如下：
Ag-F5′-CTTTAAGAAGGAGATATACATATGGCTTCTTGCAACGGTGTTTGCTCT-3′
Ag-R5′- GGCGTCGCCGGTGATGCACATACGCATACCAGACGGGTGACGGCAGTA-3′。
4.根据权利要求1~3任意一项所述的方法，其特征在于，具体步骤如下：
（1）将构建的重组表达载体通过化学转化的方法转入大肠杆菌感受态细胞中，挑取转化平板上单克隆接种至LB液体培养基中进行种子液培养；将种子液接种到LB液体培养基中，进行发酵培养，当OD600=0.6～0.8时，添加IPTG进行诱导表达；
（2）诱导表达结束后，离心收集菌体，用缓冲液重悬，高压破碎菌体后离心收集沉淀，用洗涤缓冲液重悬沉淀并经DTT诱导切割，将切割后样品离心得到上清，然后经超滤纯化，获得高纯度的Aglycin。
5.根据权利要求4所述的方法，其特征在于，所述种子液培养及发酵培养的条件为37℃，220rpm；所述种子液的接种量为1:100v/v。
6.根据权利要求5所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16~37℃诱导表达5~24h；所述IPTG的浓度为0.2~1Mm；所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，20~80mM切割4~16h。
7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，所述诱导表达的条件为：16℃诱导表达24h；所述IPTG的浓度为0.2mM；所述DTT诱导切割的条件为：在4℃条件下，40mM切割12h。
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Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058363A (zh) * 2017-03-14 2017-08-18 华南理工大学 基于淀粉样蛋白实现小分子肽类高效分泌表达的方法及其应用
CN107446941A (zh) * 2017-08-31 2017-12-08 华南理工大学 基于自聚集短肽诱导的天蚕素a抗菌肽及其制备方法

Patent Citations (2)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
CN107058363A (zh) * 2017-03-14 2017-08-18 华南理工大学 基于淀粉样蛋白实现小分子肽类高效分泌表达的方法及其应用
CN107446941A (zh) * 2017-08-31 2017-12-08 华南理工大学 基于自聚集短肽诱导的天蚕素a抗菌肽及其制备方法

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Activity of the plant peptide aglycin in mammalian systems;Xin-Peng Dun等;《FEBS J.》;20070228;第274卷(第3期);751-759 *
The soybean peptide aglycin regulates glucose homeostasis in type 2 diabetic mice via IR/IRS1 pathway;Jingli Lu等;《J. Nutr. Biochem.》;20120125;第23卷(第11期);1449-1457 *
新生物活性肽Aglycin的纯化鉴定及其对糖代谢的影响;顿新鹏;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(博士)医药卫生科技辑》;20090515;第2009年卷(第05期);E065-4 *
豆类胰岛素（PA1b）基因克隆、表达及融合蛋白纯化;杜雯;《中国优秀博硕士学位论文全文数据库(硕士)基础科学辑》;20050615;第2005年卷(第02期);A006-22 *

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