CN111727961B - 一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法 - Google Patents
一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法 Download PDFInfo
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Abstract
本发明属于生物医药领域，涉及一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法。所述干细胞冻存液包含基础冻存液，并添加有白藜芦醇，所述白藜芦醇在所述干细胞冻存液体中的浓度为0.1‑10μM，所述基础冻存液包含5 v/v％~10v/v％的DMSO和90 v/v％‑95v/v%的FBS，所述干细胞为牙髓干细胞。用所述冻存液冻存的牙髓干细胞复苏后，其增殖能力得到显著地提升，可以极大地提升牙髓干细胞分离培养的效率。能够更好地使得牙髓干细胞适用于临床应用。具有很好的现实意义。
Description
技术领域
本发明属于生物医药领域，涉及一种牙髓干细胞冻存液及其冻存方法。
背景技术
据报道，牙髓干细胞在牙周炎治疗中可起到很好的修复作用，作用机制为：通过植入局部并分化为缺损细胞，分泌细胞因子，趋化干细胞到局部，抑制局部炎症，促进局部血管新生。
在牙髓干细胞的临床应用中涉及到牙髓干细胞的冻存、复苏技术，细胞冻存是将37℃生长培养的细胞，添加营养成分及防冻保护剂DMSO，通过逐渐降温的方式将细胞长期超低温冻存于液氮中的过程。
冻存过程会显著改变细胞的热力学、化学和物理环境，有伴随造成生物性损伤的危险。温度的变化主要取决于降温或升温方法所引起的热传导的边界条件，也受细胞复融过程中潜热效应的影响。为了将冻融过程中细胞的损伤降至最低，必须进一步优化化学和温度操作过程。但需要在降温前加入一种或两种低温保护剂，在溶解后又将其去除。
目前，细胞的冻存除了采用二甲基亚砜(DMSO)对干细胞进行冻存，还会采用普通商品化的培养基或血清进行细胞冻存。
牙髓干细胞在制备过程中不仅极易污染，导致细胞数量较少，生长缓慢。并且，还常因为牙髓间充质干细胞不易贴壁造成细胞损失。目前的这些冻存液在细胞的冻存过程中还是会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增殖率较低，影响干细胞的临床利用。
发明内容
一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞冻存液，能够促进冻存后细胞增殖。
一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞冻存液，能够明显促进冻存后的牙髓干细胞增殖。一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞冻存液，所述干细胞冻存液含有白藜芦醇。
一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞冻存液，所述干细胞冻存液包含基础冻存液，并添加有白藜芦醇，所述白藜芦醇在所述干细胞冻存液体中的浓度为0.1-10 μM，所述基础冻存液包含5 v/v％~10v/v％的DMSO和90 v/v％-95v/v% 的FBS，所述干细胞为牙髓干细胞。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包含以下成分：DMSO 5 v/v％~10v/v％，FBS90 v/v％-95v/v%，所述干细胞冻存液还含有白藜芦醇0.1-10 μM，所述干细胞为牙髓干细胞。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.1-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有的异硫氰酸苯乙酯与白藜芦醇的摩尔比为0.02～10：1。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有的异硫氰酸苯乙酯与白藜芦醇的摩尔比为0.2～2：1。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括以下成分：异硫氰酸苯乙酯0.1-10 μM，DMSO 5 v/v％~15v/v％，FBS 90 v/v％-95v/v%；所述干细胞为牙髓干细胞。发明人发现，用所述冻存液冻存牙髓细胞后进行复苏，细胞的增殖能力与普通的冻存液相比，增殖能力得到显著地提升。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.01-30 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.05-20 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.1-20 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.5-20 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.5-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯1-15 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯1-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯5-15 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯5-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液含有异硫氰酸苯乙酯0.1 μM、0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液还包括白藜芦醇0.01-30 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.1-30 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.1-20 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.1-15 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.1-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.5-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇1-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇5-10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液包括白藜芦醇0.1 μM、0.2 μM、0.3 μM、0.4 μM、0.5 μM、1 μM、2 μM、3 μM、4 μM、5 μM、6 μM、7 μM、8 μM、9 μM、10 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液同时含有异硫氰酸苯乙酯1-10 μM，白藜芦醇5-10 μM。
目前牙髓干细胞制备方法常用的有酶联消化法、组织块培养法和组织块酶消化法等方法，各种方法虽均能获得牙髓干细胞，但由于口腔中细胞种类繁杂，牙髓干细胞在制备及培养中极易污染，且分离提取出来的牙髓干细胞较少，细胞生长缓慢，并且，还常因为牙髓间充质干细胞不易贴壁造成细胞损失，导致牙髓干细胞制备困难。并且，目前的细胞冻存液在牙髓干细胞冻存过程中还会无法避免地对牙髓干细胞造成一定的损伤，无法保证干细胞的活力，细胞增殖率较低。以上种种因素，都严重影响了牙髓干细胞的临床利用。而发明人通过研究发现，在普通冻存液中加入异硫氰酸苯乙酯或白藜芦醇，或同时加入两者，用其冻存过的牙髓干细胞复苏后，其增殖能力得到显著地提升，可以极大地提升牙髓干细胞分离培养的效率。能够更好地使得牙髓干细胞适用于临床应用。这无疑是非常有现实意义的。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液中含有异硫氰酸苯乙酯的浓度为10 μM；所述白藜芦醇的浓度为5 μM。
一些实施方案中，所述干细胞冻存液中含有的DMSO的浓度为10 v/v％，所述的FBS的浓度为90 v/v％。
一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞的冻存方法，用上述的干细胞冻存液冻存牙髓干细胞。
一些实施方案中，所述冻存方法包括以下步骤（1）将牙髓干细胞与所述的干细胞冻存液混合；和（2）进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
一些实施方案中，所述冻存方法包括以下步骤：（1）干细胞冻存液的制备：制备所述的干细胞冻存液；（2）细胞悬液的制备：将牙髓干细胞离心洗涤，收集到的牙髓干细胞与所述干细胞冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；（3）冷冻：将所述冻存管进行程序降温至-75℃～-85℃，然后转移至液氮中冷冻保存；（4）细胞复苏：取出冻存管快速置于37-40℃水浴1-3分钟，振荡直至细胞悬液完全融化，离心，以PBS洗涤去除冻存液，即得复苏的细胞。
一些实施方案中，本发明提供了一种上述干细胞冻存液在牙髓干细胞冻存复苏中的应用。
一些实施方案中，本发明提供了一种干细胞的冻存试剂盒，包含所述的干细胞冻存液，所述干细胞为牙髓干细胞。
附图说明
图1 为MTT法检测各组细胞冻存液冻存的细胞复苏后的细胞增殖情况。
图2为EdU法检测各组的细胞增殖情况。
图3为EdU法检测显示各组DPSC的增殖能力，*:p<0.05。
图4为MTT法检测对比例3中的两组细胞冻存液冻存的细胞复苏后的细胞增殖情况。
具体实施方式
以下通过具体的实施例进一步说明本发明的技术方案，具体实施例不代表对本发明保护范围的限制。其他人根据本发明理念所做出的一些非本质的修改和调整仍属于本发明的保护范围。
本文中，PEITC（Phenethyl isothiocyanate ）指的是异硫氰酸苯乙酯。
本文中，Resveratrol指的是白藜芦醇。
本文中，DPSC指的是牙髓干细胞。
本文中，t-Buty指的是叔丁基氢醌（t-Butylhydroquinone）。
实施例1 牙髓干细胞的分离培养
将牙髓组织用含有抗生素（Penicillin-Streptomycin）的磷酸盐缓冲液（Phosphate Buffered Saline，PBS）清洗后， 用眼科剪将牙髓组织块剪碎成 ，加入3 mL胶原酶与分散酶的混合物（Collagenase/Dispase ）37℃水浴，消化 45 min-1 h后，加入完全培养液（含有10%FBS、100 U /mL的青霉素、100 μg/mL的链霉素、2 mM的L-谷氨酰胺和10 mM的维生素C磷酸酯）终止消化，1000 rpm 离心5 min，弃上清，所得沉淀及组织用含10%胎牛血清的α-MEM 培养液重悬后接种于细胞培养瓶，于 37 ℃、5% CO2 恒温孵箱内培养，72 h换液，以后按照一周换一次液，待细胞迁移出来后，每三天换液一次。待细胞长至80%以上融合度时，将细胞消化传代。使用P6代细胞，用于本次实验。
试验例1
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 0.1 μM，于4℃保存备用。
试验例2
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 0.5 μM，于4℃保存备用。
试验例3
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇1 μM，于4℃保存备用。
试验例4
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇5 μM，于4℃保存备用。
试验例5 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 10 μM。
实施例2 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入PEITC 0.1 μM，于4℃保存备用。
实施例3 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入PEITC 0.5 μM，于4℃保存备用。
实施例4 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 5 μM，PEITC 0.1 μM，于4℃保存备用。
实施例5 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 5 μM，PEITC 0.5 μM，于4℃保存备用。
实施例6牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 5 μM，PEITC 1 μM，于4℃保存备用。
实施例7牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 5 μM，PEITC 5 μM，于4℃保存备用。
实施例8 牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 5 μM，PEITC 10 μM，于4℃保存备用。
实施例9牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 0.1 μM，PEITC 1 μM，于4℃保存备用。
实施例10牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇 0.5 μM，PEITC 1 μM，于4℃保存备用。
实施例11牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇1 μM，PEITC 1 μM，于4℃保存备用。
实施例12牙髓干细胞冻存液的配方与制备方法
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入白藜芦醇10 μM，PEITC 1 μM，于4℃保存备用。
对比例1
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，于4℃保存备用。
对比例2
取DMSO和FBS混合，使得混合液中DMSO的含量为10 v/v％，FBS的含量为90 v/v％，再向其中加入叔丁基氢醌（t-Butylhydroquinone）1 μM，于4℃保存备用。
实施例13 牙髓干细胞的冻存
（1）取实施例1所述的P6代牙髓干细胞，当细胞融合度达到80%~90%后，弃去旧培养基，用PBS清洗培养皿后，添加含有EDTA的胰酶混合液进行消化1~2分钟，加入完全培养液终止消化后，将细胞吹打成单细胞悬液，获得P6代牙髓干细胞。
（2）取少量细胞悬液进行细胞计数，其余悬液1200 rpm/min离心5 min收集细胞。根据计数结果，分别加入实施例2-实施例12、试验例1-5和对比例1-2的细胞冻存液重悬细胞，调整细胞密度为1×106个/mL，分装于冻存管中，每管加入1.5 mL。
（3）将冻存管放进程序降温仪的盒中，经过常规的程序降温后，再转移到液氮中冻存。
以上冻存程序为常规流程。
试验例6 冻存液冻存效果评价
1、细胞复苏后的细胞存活率
取实施例13冻存的各组牙髓干细胞进行复苏，复苏后进行细胞离心、PBS冲洗去除冻存液。进行计数，测定细胞存活率。结果如表1所示。
表1
| 冻存液 | 细胞数量 | 细胞存活率 |
| 实施例2冻存液 | 1.026×10<sup>6</sup> | 66.9% |
| 实施例3冻存液 | 0.957×10<sup>6</sup> | 68.5% |
| 实施例4冻存液 | 0.986×10<sup>6</sup> | 69.6% |
| 实施例5冻存液 | 0.990×10<sup>6</sup> | 71.3% |
| 实施例6冻存液 | 0.977×10<sup>6</sup> | 79.6% |
| 实施例7冻存液 | 1.032×10<sup>6</sup> | 82.2% |
| 实施例8冻存液 | 0.993×10<sup>6</sup> | 82.5% |
| 实施例9冻存液 | 0.975×10<sup>6</sup> | 73.4% |
| 实施例10冻存液 | 0.988×10<sup>6</sup> | 74.7% |
| 实施例11冻存液 | 0.949×10<sup>6</sup> | 75.6% |
| 实施例12冻存液 | 0.945×10<sup>6</sup> | 81.2% |
| 试验例1 | 0.953×10<sup>6</sup> | 66.2% |
| 试验例2 | 0.979×10<sup>6</sup> | 65.9% |
| 试验例3 | 1.035×10<sup>6</sup> | 67.2% |
| 试验例4 | 0.979×10<sup>6</sup> | 67.1% |
| 试验例5 | 1.105×10<sup>6</sup> | 68.1% |
| 对比例1 | 0.986×10<sup>6</sup> | 65.2% |
| 对比例2 | 0.991×10<sup>6</sup> | 67.4% |
2、细胞复苏后的细胞增殖情况
（1）取实施例13冻存的各组牙髓干细胞进行复苏，复苏后进行细胞离心、PBS冲洗去除冻存液。
（2）重悬后按照1×103 个/每孔的的密度接种于96孔板，培养基液为含10%胎牛血清的α-MEM 培养液，使其贴壁生长24小时。
（3）加入MTT（sigma）试剂3小时，按照厂家说明书加入试剂终止反应。
（4）检测吸光度值。
实施例2-12、试验例1-5和对比例1的结果如表2，图1所示。
表2
结果显示，用含有白藜芦醇的冻存液冻存牙髓干细胞，能够明显促进复苏后的牙髓干细胞的增殖能力。同时含有PEITC和白藜芦醇的冻存液对细胞增殖具有协同增效的效果。
另外，试验例4、对比例1和对比例2的细胞冻存液的比较结果如图2和图3所示。
其中图2的检测方法为EdU法，包括以下步骤：
1） 细胞培养：取对数生长期细胞，以每孔1×103细胞接种于96孔板中，使其贴壁生长至大约60-70%细胞融合时阶段；
2） 加入EdU试剂标记：用细胞培养基按1000：1的比例稀释EdU溶液 (试剂A)，制备适量50μM EdU培养基；按照试剂盒厂家（Abcam）说明书操作，染色并计数。
对比例3
MTT法检测含有异硫氰酸苯乙酯（1μM）和叔丁基氢醌（5μM）的冻存液冻存细胞的效果，其他条件与实施例6冻存液检测条件一样。细胞增殖情况如表3所示和图4所示。
另外两组细胞的存活情况如表3所示。从表3可以看出，异硫氰酸苯乙酯（1μM）+叔丁基氢醌（5μM）的效果不如实施例6的组合物。
表3
Claims (8)
1.一种干细胞冻存液，其特征在于，所述干细胞冻存液包含基础冻存液，并添加有白藜芦醇，所述白藜芦醇在所述干细胞冻存液中的浓度为0.1-10 μM，所述基础冻存液包含5 v/v％~10v/v％的DMSO和90 v/v％-95v/v% 的FBS，所述干细胞为牙髓干细胞；
所述干细胞冻存液还含有异硫氰酸苯乙酯0.1-10 μM；所述异硫氰酸苯乙酯与白藜芦醇的摩尔比为0.2～2：1。
2.如权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述异硫氰酸苯乙酯的浓度为1-10μM，所述白藜芦醇的浓度为5-10 μM。
3.如权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述异硫氰酸苯乙酯的浓度为10 μM；所述白藜芦醇的浓度为5 μM。
4.如权利要求1所述的干细胞冻存液，其特征在于，所述DMSO的浓度为10 v/v％，所述的FBS的浓度为90 v/v％。
5.一种干细胞的冻存方法，其特征在于，用权利要求1-4任一所述的干细胞冻存液冻存牙髓干细胞。
6.如权利要求5所述的干细胞的冻存方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）将干细胞与所述冻存液混合；和
（2）进行程序降温至-80℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
7.如权利要求5所述的干细胞的冻存方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
（1）冻存液的制备：制备权利要求1-4任一所述的干细胞冻存液；
（2）细胞悬液的制备：将干细胞离心洗涤，收集到的干细胞与所述冻存液混合得到细胞悬液，置于无菌的冻存管中；
（3）冷冻：将所述冻存管进行程序降温至-75℃～-85℃，然后转移至液氮中冷冻保存。
8.一种干细胞的冻存试剂盒，其特征在于，包含权利要求1-4任一所述的干细胞冻存液。
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