CN112075416A - 一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法 - Google Patents

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Abstract

本发明公开了一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶；(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块；(13)制备脐带间充质干细胞；(14)将脐带间充质干细胞加入至冻存液中进行冻存处理。复苏方法包括以下操作步骤：(21)将冻存管温水浴解冻；(22)离心得到脐带间充质干细胞；(23)向脐带间充质干细胞中加入完全培养基，进行培养。本发明提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，直接对脐带间充质干细胞组织进行冻存处理，操作步骤简单，能有效的提升医治效率。

Description

一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法
技术领域
本发明属于临床输注的脐带间充质干细胞冻存和复苏技术领域，具体涉及一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法。
背景技术
间充质干细胞是干细胞家族的重要成员，是一种低免疫原性的干细胞，具有支持造血和促进干细胞植入、调控免疫等特点，是用于衰老和病变引起的组织器官损伤修复的理想种子细胞。人脐带华通氏胶中可分离出脐带间充质干细胞(huMSCs)，并且因其来源广泛，易获得，且具有间充质干细胞的所有特性，因此成为目前比较理想的干细胞来源。
目前，脐带间充质干细胞组织的冻存方法多采用传统的细胞冻存方法，即先从华通氏胶中分离培养出脐带间充质干细胞组织，然后将干细胞进行冻存，从脐带获取到细胞冻存涉及华通氏胶分离，细胞换液、传代、收获、冻存等多个步骤。针对传统细胞冻存周期长，成本高的特点，直接冻存脐带组织，待临床需要时再进一步复苏培养的组织冻存方式表现出周期短，成本低的优势，然而目前没有一种行之有效的从华通氏胶中分离出的脐带间充质干细胞组织的直接冻存方法。
发明内容
为了解决现有技术的缺陷，本发明提供一种低炼耗、高效率、并适合工业化生产的脐带组织的冻存方法。
本发明是通过以下技术方案实现的。
一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：
(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm3小块，生理盐水洗涤3-5遍；
(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8-10的质量比制成；
(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3-5℃的环境中平衡处理13-16min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；
(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入深低温冰箱内，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1-3份二甲基亚砜，0.8-1.2份低分子右旋糖酐-40，15-20份基础液；
上述基础液包括85-95份基础培养基、8-12份血清替代物、0.8-1.5份谷氨酰胺；
所述复苏方法包括以下操作步骤：
(21)将冻存管温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；
(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，离心处理，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾1-8份、水90-100份、甲醇25-35份；
(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm2培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到78-82％时，复苏完成。
具体地，上述所有步骤中的离心操作，离心的转速均为1400-1600rpm，离心的时间均为4-6min。
具体地，上述脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3-5cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平。
具体地，上述基础培养基为MS培养基、B5培养基、NT培养基中的任意一种。
具体地，上述深低温冰箱内的温度为零下80℃，初步冻存处理的时间为3-5小时。
具体地，上述步骤(21)中，水浴解冻的温度为37℃。
具体地，所述完全培养基为由α-MEM培养基和胎牛血清按照8-9:1的体积比混合后，向其中加入抗生素后制成，其中抗生素的浓度为50-200U/mL。
具体地，上述步骤(23)中，脐带间充质干细胞组织培养过程中的温度为36-38℃，二氧化碳的体积浓度为4-6％。
由以上的技术方案可知，本发明的有益效果是：
1、本发明提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，直接对脐带间充质干细胞进行冻存处理，操作步骤简单，能有效的提升医治效率；
2、本发明提供的脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，可有效的提升复苏后脐带间充质干细胞的活性，细胞增值能力强，生长良好，向成骨、成脂、成软骨方向分化的潜力强；
3、本发明提供的洗涤液，能有效的除去脐带间充质干细胞表面的冻存液，防止冻存液对脐带间充质干细胞组织的复苏产生不利的影响；
4、本发明提供的冻存液，对细胞损伤小，冻存效果好，能够为临床提供质量高的脐带间充质干细胞组织。
附图说明
图1为复苏后脐带间充质干细胞组织的细胞生长曲线示意图。
图2为脐带间充质干细胞复苏后的成骨成脂成软骨染色图。
图3为脐带间充质干细胞复苏后细胞表型流式检测结果图。
图4为脐带间充质干细胞复苏后培养过程中形态结构示意图。
具体实施方式
下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明的保护范围。
实施例1
一种脐带间充质干细胞组织的冻存方法，所述冻存方法包括以下操作步骤：
(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1mm3小块，生理盐水洗涤3遍，其中脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平；
(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8的质量比制成；
(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3℃的环境中平衡处理13min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；
(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入零下80℃的深低温冰箱内初步冻存处理的3小时，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1份二甲基亚砜，0.8份低分子右旋糖酐-40，15份基础液；
上述基础液包括85份MS培养基、8份血清替代物、0.8份谷氨酰胺。
上述离心的转速均为1500rpm，离心的时间均为5min。
实施例2
实施例1中脐带间充质干细胞组织的冻存后的复苏方法包括以下操作步骤：
(21)将冻存管37℃温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；
(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，1500rpm离心处理5min，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾5份、水95份、甲醇30份；
(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm2培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到80％时，复苏完成，脐带间充质干细胞组织培养过程中的温度为37℃，二氧化碳的体积浓度为5％。其中完全培养基为由α-MEM培养基和胎牛血清按照8:1的体积比混合后，向其中加入抗生素后制成，其中抗生素的浓度为150U/mL。
试验：
试验1
生长曲线测定：细胞融合度达90％后，胰酶消化，新鲜培养基重悬后计数，根据细胞计数结果按5×104/孔进行接种，24孔板接种15孔。每隔24h计数一次，每次取3孔细胞，分别进行计数，计算平均值，连续计数5d，根据细胞计数结果，以细胞数为纵坐标，以时间为横坐标绘制生长曲线，如图1所示，生长曲线显示细胞增值能力强，生长良好。
试验2
成骨、成脂、成软骨分化：P3代细胞以1X104的密度接种于6孔板中，无血清培养基培养于37℃，5％二氧化碳培养箱中，24h后使用预热的分化培养基换液继续培养，每隔72小时或96小时换一次液，试剂盒要求的培养时间过后，使用染液染色观察，如图2所示，细胞具有向成骨、成脂、成软骨方向分化的潜力。
试验3
细胞表型流式检测：细胞融合度达90％后，胰酶消化，生理盐水重悬后计数。调节细胞悬液浓度后取150uL细胞悬液，分别加入抗体5uL避光孵育15分钟；抗体分别为小鼠抗人CD34-PE、CD44-FITC、CD45-FITC、CD73-PE、CD90-PE、HLA-DR-PE、CD105-PE；孵育结束后，加入200uL流式鞘液中，用流式细胞仪检测，如图3所示，细胞符合脐带间充质干细胞的特征。
试验4
细胞生长及形态学特征：培养过程中，发现这种脐带间充质干细胞组织形态相对均一，增殖速度快，贴壁速度快，易被胰酶消化，传代至5-15代，如图4所示，其形态及生长特点亦无明显改变。
以上所描述的实施例是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。本发明的实施例的详细描述并非旨在限制要求保护的本发明的范围，而是仅仅表示本发明的选定实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有作出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。

Claims (8)

1.一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，
所述冻存方法包括以下操作步骤：
(11)脐带展平后，将血管及羊膜从脐带中剥离，制备得脐带华通氏胶，再将其剪至1-2mm3小块，生理盐水洗涤3-5遍；
(12)将洗涤后的脐带华通氏胶小块离心处理，离心后去除上清液体得到组织块，向组织块中加入平衡液至完全浸没组织块后停止加入平衡液，所述平衡液由二甲基亚砜和基础液按照1:8-10的质量比制成；
(13)将浸泡在平衡液中的组织块放置在3-5℃的环境中平衡处理13-16min，然后离心弃上清，得到脐带间充质干细胞组织；
(14)将脐带间充质干细胞组织加入至冻存管中后，再向其中加入冻存液后制得冻存品，将冻存品放入程序降温盒中，将程序降温盒放入深低温冰箱内，初步冻存处理后再放入液氮中冻存处理，所述冻存液由以下重量份的组分制成：1-3份二甲基亚砜，0.8-1.2份低分子右旋糖酐-40，15-20份基础液；
上述基础液包括85-95份基础培养基、8-12份血清替代物、0.8-1.5份谷氨酰胺；
所述复苏方法包括以下操作步骤：
(21)将冻存管温水浴解冻，直至轻轻摇动至管内无明显冰状物时解冻完成；
(22)将冻存管转移到超净台中，颠倒混匀后倒入到洗涤液中，离心处理，得到脐带间充质干细胞组织，所述洗涤液由以下重量份的组分制成：乙酰磺胺酸钾1-8份、水90-100份、甲醇25-35份；
(23)向脐带间充质干细胞组织中加入完全培养基，转入T75cm2培养瓶中，培养7天后进行第一次半量换液，之后每隔3天进行半量换液一次，原代细胞融合度达到78-82％时，复苏完成。
2.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述所有步骤中的离心操作，离心的转速均为1400-1600rpm，离心的时间均为4-6min。
3.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述脐带展平的具体操作为：用75％酒精将脐带充分杀菌洗涤1次，用组织剪将脐带两端剪去，再用生理盐水清洗5次，每次20ml，洗净脐带，用尖头剪将脐带剪成3-5cm长度，将脐带沿静脉血管平行方向剪开小口，将脐带展平。
4.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述基础培养基为MS培养基、B5培养基、NT培养基中的任意一种。
5.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述深低温冰箱内的温度为零下80℃，初步冻存处理的时间为3-5小时。
6.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述步骤(21)中，水浴解冻的温度为37℃。
7.根据权利要求1所述一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，所述完全培养基为由α-MEM培养基和胎牛血清按照8-9:1的体积比混合后，向其中加入抗生素后制成，其中抗生素的浓度为50-200U/mL。
8.根据权利要求1所述的一种脐带间充质干细胞组织的冻存及复苏方法，其特征在于，上述步骤(23)中，脐带间充质干细胞培养过程中的温度为36-38℃，二氧化碳的体积浓度为4-6％。
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