CN109843304A - 使用自然杀伤细胞治疗急性髓性白血病和多发性骨髓瘤的方法 - Google Patents

使用自然杀伤细胞治疗急性髓性白血病和多发性骨髓瘤的方法 Download PDF

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Abstract

本文提供了通过给予有效量的包含自然杀伤细胞的细胞群体来治疗急性髓性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)的方法，其中所述包含自然杀伤细胞的细胞群体通过包括在包含干细胞动员因子的培养基中培养造血干细胞或祖细胞的群体的三阶段方法产生，例如，在包含干细胞动员因子的培养基中从来自胎盘细胞例如来自胎盘灌洗液(例如，人胎盘灌洗液)或其他组织例如脐带血或外周血的造血干细胞或祖细胞开始产生NK细胞的三阶段方法。本文还提供了使用通过本文提供的三阶段方法产生的NK细胞来抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法。在某些实施方案中，将通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞与IL‑2组合使用。

Description

使用自然杀伤细胞治疗急性髓性白血病和多发性骨髓瘤的 方法
本申请要求2016年5月7日提交的美国临时申请号62/333,186、2016年5月7日提交的美国临时申请号62/333,187、2016年11月1日提交的美国临时申请号62/415,918和2016年11月1日提交的美国临时申请号62/415,954的权益，这些临时申请中的每一个以全文引用方式并入本文。
1.技术领域
本文提供了通过给予有效量的包含自然杀伤细胞的细胞群体来治疗急性髓性白血病(AML)和多发性骨髓瘤(MM)的方法，其中所述包含自然杀伤细胞的细胞群体通过包括在包含干细胞动员因子的培养基中培养造血干细胞群体或祖细胞群体的三阶段方法产生，例如，在包含干细胞动员因子的培养基中从来自胎盘例如来自胎盘灌洗液(例如，人胎盘灌洗液)或其他组织(例如脐带血或外周血)的细胞的造血干细胞或祖细胞开始产生NK细胞的三阶段方法。本文还提供了使用通过本文提供的三阶段方法产生的NK细胞来抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法。在某些实施方案中，将通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞与IL-2组合使用。
2.背景技术
自然杀伤(NK)细胞是构成先天免疫***的主要组分的细胞毒性淋巴细胞。
NK细胞响应于干扰素或巨噬细胞来源的细胞因子而被激活。NK细胞的细胞毒性活性主要受到可被视为“激活受体”或“抑制受体”的两种类型的表面受体调节，虽然一些受体，例如CD94和2B4(CD244)，可根据配体相互作用以任一方式发挥作用。
就其他活性而言，NK细胞在肿瘤的宿主排斥中起作用并且已证实能够杀死被病毒感染的细胞。自然杀伤细胞可由缺乏或显示降低水平的主要组织相容性复合体(MHC)蛋白的细胞激活。具有改变的或降低的自身I类MHC表达水平的癌细胞导致NK细胞敏感性的诱导。来自外周血的激活和扩增的NK细胞以及在一些情况下LAK细胞已被用于患晚期癌症的患者的离体疗法和体内治疗中，并且对骨髓相关疾病如白血病、乳腺癌和某些类型的淋巴瘤取得了一定的成功。
尽管NK细胞在杀死肿瘤细胞和病毒感染细胞方面具有有利的性质，但它们仍然难以应用于免疫疗法，这主要是由于在培养和扩增期间难以维持其肿瘤靶向和杀肿瘤能力。因此，本领域需要开发一种产生和扩增保留杀肿瘤功能的自然杀伤细胞的有效方法。
3.发明内容
本文提供了使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，治疗患有急性髓性白血病的个体的方法。本文提供的治疗方法可以是包括IL-2的施用的抗癌疗法方案的部分。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。
本文还提供了抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，其还包括使IL-2与NK细胞和/或急性髓性白血病细胞接近，例如，使NK细胞和/或急性髓性白血病细胞与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
本文提供了使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法。本文提供的治疗方法可以是包括IL-2的施用的抗癌疗法方案的部分。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。
本文还提供了抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，所述方法还包括使IL-2与NK细胞和/或多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使NK细胞和/或多发性骨髓瘤细胞与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
本文提供了扩增和分化细胞例如造血细胞、如造血干细胞、例如CD34+造血干细胞以产生自然杀伤(NK)细胞的方法。
在一个方面，本文提供了产生NK细胞群体的方法，所述方法包括如本文描述的三个阶段(并且在本文中称为“三阶段方法”)。通过本文提供的三阶段方法产生的自然杀伤细胞在本文中称为“通过三阶段方法产生的NK细胞”。在某些实施方案中，所述方法不包括其中细胞被接触(或培养)的任何第四或中间步骤。
在一个方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，其包括在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如CD34+干细胞或祖细胞，以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，随后在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和低分子量肝素(LMWH)的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-的自然杀伤细胞，并且其中至少70％(例如80％)的自然杀伤细胞是存活的。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD16-的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+或CD16+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94-或CD16-的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+和CD16+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94-和CD16-的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，所述第一培养基、第二培养基和第三培养基中的至少一种、两种或全部三种不是培养基在某些实施方案中，第三培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。在某些实施方案中，第三培养基没有去硫糖胺聚糖。
在某些实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为哺乳动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为人细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为灵长类动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为犬科动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为啮齿动物细胞。
在某些方面，在第一培养基中培养的造血干细胞或祖细胞为CD34+干细胞或祖细胞。在某些方面，造血干细胞或祖细胞为胎盘造血干细胞或祖细胞。在某些方面，胎盘造血干细胞或祖细胞获自或可获自胎盘灌洗液(例如，获自或可获自从胎盘灌洗液分离的有核细胞)。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞获自或可获自脐带血。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞为胎儿肝细胞。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞为动员的外周血细胞。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞为骨髓细胞。
在某些方面，三阶段方法中使用的所述第一培养基包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含低分子量肝素(LMWH)、Flt-3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、IL-6、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。在某些方面，所述第一培养基不包含外加的LMWH。在某些方面，所述第一培养基不包含外加的去硫糖胺聚糖。在某些方面，所述第一培养基不包含LMWH。在某些方面，所述第一培养基不包含去硫糖胺聚糖。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述Tpo以1ng/mL至100ng/mL、1ng/mL至50ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、或约25ng/mL的浓度存在于第一培养基中。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第一培养基不为
在某些方面，三阶段方法中使用的所述第二培养基包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，第二培养基不包含外加的LMWH。在某些方面，第二培养基不包含外加的去硫糖胺聚糖。在某些方面，第二培养基不包含LMWH。在某些方面，第二培养基不包含去硫糖胺聚糖。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL、10ng/mL至30ng/mL、或约20ng/mL的浓度存在于所述第二培养基中。在某些方面，在所述第二培养基中，LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于第二培养基中；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于第二培养基中；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第二培养基不为
在某些方面，存在于所述第一培养基、所述第二培养基或所述第一和第二培养基中的干细胞动员因子为芳基烃受体抑制剂，例如芳基烃受体拮抗剂。在某些方面，所述芳基烃受体抑制剂为白藜芦醇。在某些方面，所述芳基烃受体抑制剂为下式的化合物或其盐
其中：
G1选自N和CR3；
G2、G3和G4独立地选自CH和N；条件是G3和G4中的至少一个为N；条件是G1和G2不都为N；
L选自--NR5a(CH2)0-3--、--NR5aCH(C(O)OCH3)CH2--、--NR5a(CH2)2NR5b--、--NR5a(CH2)2S--、--NR5aCH2CH(CH3)CH2--、--NR5aCH2CH(OH)--和--NR5aCH(CH3)CH2--；其中R5a和R5b独立地选自氢和C1-4烷基；
R1选自氢、苯基、噻吩基、呋喃基、1H-苯并咪唑基、异喹啉基、1H-咪唑并吡啶基、苯并噻吩基、嘧啶基、1H-吡唑基、吡啶基、1H-咪唑基、吡咯烷基、吡嗪基、哒嗪基、1H-吡咯基和噻唑基；其中R1的所述苯基、噻吩基、呋喃基、1H-苯并咪唑基、异喹啉基、1H-咪唑并吡啶基、苯并噻吩基、嘧啶基、1H-吡唑基、吡啶基、1H-咪唑基、吡咯烷基、吡嗪基、哒嗪基、1H-吡咯基或噻唑基可任选被1至3个独立地选自氰基、羟基、C1-4烷基、C1-4烷氧基、卤素、卤素取代-C1-4烷基、卤素取代-C1-4烷氧基、羟基、氨基、--C(O)R8a、--S(O)0-2R8a、--C(O)OR8a和--C(O)NR8aR8b的基团所取代；其中R8a和R8b独立地选自氢和C1-4烷基；条件是R1和R3不都为氢；
R2选自--S(O)2NR6aR6b、--NR9aC(O)R9b、--NR6aC(O)NR6bR6c、苯基、1H-吡咯并吡啶-3-基、1H-吲哚基、噻吩基、吡啶基、1H-1,2,4-***基、2-氧代咪唑烷基、1H-吡唑基、2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑基和1H-吲唑基；其中R6a、R6b和R6c独立地选自氢和C1-4烷基；其中R2的所述苯基、1H-吡咯并吡啶-3-基、1H-吲哚基、噻吩基、吡啶基、1H-1,2,4-***基、2-氧代咪唑烷基、1H-吡唑基、2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑基或1H-吲唑基任选被1至3个独立地选自羟基、卤素、甲基、甲氧基、氨基、--O(CH2)nNR7aR7b、--S(O)2NR7aR7b、--OS(O)2NR7aR7b和--NR7aS(O)2R7b的基团所取代；其中R7a和R7b独立地选自氢和C1-4烷基；
R3选自氢、C1-4烷基和联苯基；和
R4选自C1-10烷基、丙-1-烯-2-基、环己基、环丙基、2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙基、氧杂环丁烷-3-基、二苯甲基、四氢-2H-吡喃-3-基、四氢-2H-吡喃-4-基、苯基、四氢呋喃-3-基、苄基、(4-戊基苯基)(苯基)甲基和1-(1-(2-氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-***-4-基)乙基；其中所述烷基、环丙基、环己基、2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙基、氧杂环丁烷-3-基、氧杂环丁烷-2-基、二苯甲基、四氢-2H-吡喃-2-基、四氢-2H-吡喃-3-基、四氢-2H-吡喃-4-基、苯基、四氢呋喃-3-基、四氢呋喃-2-基、苄基、(4-戊基苯基)(苯基)甲基或1-(1-(2-氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-***-4-基)乙基可任选被1至3个独立地选自羟基、C1-4烷基和卤素取代-C1-4烷基的基团所取代。
在某些方面，所述芳基烃受体抑制剂为StemRegenin-1(SR-1)(4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚)。在某些方面，所述芳基烃受体抑制剂为化合物CH223191(1-甲基-N-[2-甲基-4-[2-(2-甲基苯基)二氮烯基]苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺]。
在某些方面，存在于所述第一培养基、所述第二培养基或所述第一和第二培养基中的干细胞动员因子为嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物。在某些方面，所述嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物为以下中的一种或多种：
或它们的盐或前药，其中：
Z为
1)-P(O)(OR<1>)(OR<1>)，
2)-C(0)OR<1>，
3)-C(0)NHR<1>，
4)-C(0)N(R)R<1>，
5)-C(0)R<1>，
6)-CN，
7)-SR，
8)-S(0)2NH2，
9)-S(0)2NHR<1>，
10)-S(0)2N(R)R<1>，
11)-S(0)R<1>，
12)-S(0)2R<1>，
13)-L，
14)任选被1、2或3个R<A>或R<1>取代基所取代的-苄基，
15)任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂芳基，
16)任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂环基，
17)任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-芳基，
18)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-杂芳基，或
19)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-芳基，
并且其中每一个取代基任选连接到L基团(如果它不是已经存在的话)，并且其中当(R<1>)和R<1>连接到氮原子时，任选地它们与该氮原子连接在一起形成3至7-元环，所述环任选包含一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，任选所述环被一个或多个R<1>或R<A>所取代；
W为
1)-H，
2)-卤素，
3)-OR<1>，
4)-L-OH，
5)-L-OR<1>，
6)-SR<1>，
7)-CN，
8)-P(0)(OR<1>)(OR<1>)，
9)-NHR<1>，
10)-N(R<1>)R<1>，
11)-L-NH2，
12)-L-NHR<1>，
13)-L-N(R<1>)R<1>，
14)-L-SR<1>，
15)-L-S(0)R<1>，
16)-L-S(0)2R<1>，
17)-L-P(0)(OR<1>)(OR<1>
18)-C(0)OR<1>，
19)-C(0)NH2，
20)-C(0)NHR<1>，
21)-C(0)N(R<1>)R<1>，
22)-NHC(0)R<1>，
23)-NR1C(0)R<1>，-NHC(0)0R<1>，
-NR1C(0)0R<1>，
-0C(0)NH2，
-0C(0)NHR<1>，
-0C(0)N(R)R<1>，
-0C(0)R<1>，
-C(0)R<1>，
-NHC(0)NH2，
-NHC(0)NHR<1>，
-NHC(0)N(R)R<1>，
-NRC(0)NH2，
-NRC(0)NHR<1>，
-NRC(0)N(R)R<1>，
-NHS(0)2R<1>，
-NRS(0)2R<1>，
-S(0)2NH2，
-S(0)2NHR<1>，
-S(0)2N(R)R<1>，
-S(0)R<1>，
-S(0)2R<1>，
-0S(0)2R1，
-S(0)20R<1>，
任选被1、2或3个R<A>或R<1>取代基所取代的-苄基，
任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂芳基，
任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂环基，
任选被一个或多个连接于L和芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-芳基，
-L-NR<1>(R<1>)，
-L-)2NR<1>，
-L-(N(R1)-L)n-N(R1)R1，任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-(N(R<1>)-L)n-杂芳基，
任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-(N(R<1>)-L)n-杂环基，
任选被一个或多个连接于L和芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-(N(R<1>)-L)n-芳基，
-0-L-N(R)R<1>，
任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-杂芳基，
任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-杂环基，
任选被一个或多个连接于L和芳基基团中任一或二者上的R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-芳基，
-0-L)2-NR<1>，
-0-L-(N(R)-L)n-N(R)R<1>，
任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-(N(R<1>)-L)n-杂芳基，
任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-(N(R<1>)-L)n-杂环基，
任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-0-L-(N(R<1>)-L)n-芳基，
任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-S-L-杂芳基，
任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-S-L-杂环基，
任选被一个或多个连接于L和芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-S-L-芳基，
-S-L)2NR1，
-S-L-(N(R1)-L)"-N(R1)R1，
任选被一个或多个R<A>取代基所取代的-S-L-(N(R<1>)-L)n-杂芳基，任选被一个或多个R<A>取代基所取代的-S-L-(N(R<1>)-L)n-杂环基，任选被一个或多个R<A>取代基所取代的-S-L-(N(R<1>)-L)n-芳基，
-NR<1>(R<1>)，
-(N(R1)-L)n-N(R1)R1，
-N(R1)L)2-NR1，
76)-(N(R1)-L)"-N(R1)RA，
77)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-(N(R<1>)-L)n-杂芳基，
78)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-(N(R<1>)-L)n-杂环基，
79)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-(N(R<1>)-L)n-芳基，
80)任选被一个或多个R<A>取代基所取代的-杂芳基，或
81)任选被一个或多个R<A>取代基所取代的-芳基，
并且其中每一个取代基任选连接到L基团(如果它不是已经存在的话)，并且其中当在相同氮原子上存在两个R<1>取代基时，则每一个R<1>取代基独立地选自后文描述的R<1>值的列表，
并且其中n为等于0、1、2、3、4或5的整数，
并且其中当(R<1>)和R<1>连接到氮原子时，任选地它们与该氮原子连接在一起形成3至7-元环，所述环任选包含一个或多个选自N、O和S的其他杂原子，任选所述环被一个或多个R<1>或R<A>所取代；
L为
1)-Ci-6烷基，
2)-C2-6烯基，
3)-C2-6炔基，
4)-C3-7环烷基，
5)-C3-7环烯基，
6)杂环基，
7)-Ci-6烷基-C3-7环烷基，
8)-Ci-6烷基-杂环基，
9)芳基，或
10)杂芳基，
并且其中所述烷基、烯基、炔基、环烷基、环烯基、杂环基、芳基和杂芳基基团各自独立地任选被一个或两个R<A>取代基所取代；
Ri为
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-C2-6烯基，
4)-C2-6炔基，5)-C3-7环烷基，
6)-C3-7环烯基，
7)-C1-5全氟化，
8)-杂环基，
9)-芳基，
10)-杂芳基，
11)-苄基，或
12)5-[(3aS,4S,6aR)-2-氧代六氢-1H-噻吩并[3,4-d]咪唑-4-基]戊酰基，
并且其中所述烷基、烯基、炔基、环烯基、全氟化烷基、杂环基、芳基、杂芳基和苄基基团各自独立地任选被1、2或3个R<A>或R<1>取代基所取代；
R2为
1)-H，
2)-C1-6烷基，
3)-SR，
4)-C(0)R1，
5)-S(0)R1，
6)-S(0)2R<1>，
7)任选被1、2或3个R<A>或R<1>取代基所取代的-苄基，
8)任选被一个或多个连接于L和杂芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂芳基，
9)任选被一个或多个连接于L和杂环基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-杂环基，
10)任选被一个或多个连接于L和芳基基团中任一或二者的R<A>或R<1>取代基所取代的-L-芳基，
11)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-杂芳基，或
12)任选被一个或多个R<A>或R<1>取代基所取代的-芳基，
并且其中每一个取代基任选连接到L基团(如果它不是已经存在的话)；
R<A>为
1)-卤素，
2)-CFs，3)-OH，
4)-OR<1>，
5)-L-OH，
6)-L-OR<1>，
7)-OCFs，
8)-SH，
9)-SR1，
10)-CN，
11)-NO2，
12)-NH2，
13)-NHR<1>，
14)-NR<1>R<1>，
15)-L-NH2，
16)-L-NHR<1>，
17)-L-NR<4>R<1>，
18)-L-SR<1>，
19)-L-S(0)R<1>，
20)-L-S(0)2R<1>，
21)-C(0)OH，
22)-C(0)OR<1>，
23)-C(0)NH2，
24)-C(0)NHR<1>，
25)-C(0)N(R<1>)R<1>，
26)-NHC(0)R<1>，
27)-NR1C(0)R<1>，
28)-NHC(0)OR<1>，
29)-NR1C(0)0R<1>，
30)-OC(0)NH2，
31)-OC(0)NHR<1>，
32)-OC(0)N(R)R<1>，
33)-OC(0)R<1>，
34)-C(0)R1，35)-NHC(0)NH2，
36)-NHC(0)NHR1，
37)-NHC(0)N(R)R<1>，
38)-NRC(0)NH2，
39)-NRC(0)NHR<1>，
40)-NR1C(0)N(R1)R1，
41)-NHS(0)2R<1>，
42)-NRS(0)2R<1>，
43)-S(0)2NH2，
44)-S(0)2NHR<1>，
45)-S(0)2N(R)R<1>，
46)-S(0)R<1>，
47)-S(0)2R<1>，
48)-0S(0)2R<1>，
49)-S(0)20R<1>，
50)-苄基，
51)-N3，或
52)-C(-N＝N-)(CF3)，
并且其中所述苄基基团任选被1、2或3个R<A>或R<1>取代基所取代。
在某些方面，所述嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物具有化学结构
在某些方面，所述嘧啶并(4，5-b)吲哚衍生物具有化学结构
在某些方面，三阶段方法中使用的所述第三培养基包含IL-2和IL-15，且没有干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，除了IL-2和IL-15外，三阶段方法中使用的第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF或GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，除了IL-2和IL-15外，三阶段方法中使用的第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-2以10U/mL至10,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以100U/mL至10,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以300U/mL至3,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以10ng/mL至30ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以约1,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以约20ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以约22ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约20ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第三培养基不为
通常，特别记载的培养基组分不指所述培养基的未限定组分(例如血清)中的可能成分。例如，所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内，例如，所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在血清内。此外，所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内，例如，所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在血清内。
在某些方面，所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含人血清-AB。在某些方面，任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含1％至20％的人血清-AB、5％至15％的人血清-AB、或者约2、5或10％的人血清-AB。
在某些方面，任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含2-巯基乙醇。在某些方面，任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含庆大霉素。
在某些实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，在所述第二培养基中的所述培养之前，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方案中，在所述第三培养基中的所述培养之前，将细胞在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方案中，将细胞在所述第三培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天或者多于30天。
在一个实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养7-13天以产生第一细胞群体；将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养2-6天以产生第二细胞群体；并将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养10-30天，即，细胞被培养总共19-49天。
在一个实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养8-12天以产生第一细胞群体；将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养3-5天以产生第二细胞群体；并将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养15-25天，即，细胞被培养总共26-42天。
在一个具体的实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养约10天以产生第一细胞群体；将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养约4天以产生第二细胞群体；并将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养约21天，即，细胞被培养总共约35天。
在某些方面，在所述第一培养基、第二培养基和第三培养基中的所述培养均在静态培养条件下进行，例如在培养皿或培养瓶中进行。在某些方面，在所述第一培养基、第二培养基或第三培养基的至少之一中的所述培养在旋转瓶中进行。在某些方面，在所述第一培养基和所述第二培养基中的所述培养在静态培养条件下进行，而在所述第三培养基中的所述培养在旋转瓶中进行。
在某些方面，所述培养在旋转瓶中进行。在其他方面，所述培养在G-Rex设备中进行。在再其他的方面，所述培养在WAVE生物反应器中进行。
在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以1×104至1×105个细胞/mL接种到所述第一培养基中。在一个具体的方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以约3×104个细胞/mL接种到所述第一培养基中。
在某些方面，所述第一细胞群体最初以5×104至5×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。在一个具体的方面，所述第一细胞群体最初以约1×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。
在某些方面，所述第二细胞群体最初以1×105至5×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在某些方面，所述第二细胞群体最初以1×105至1×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个具体的方面，所述第二细胞群体最初以约5×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个更具体的实施方案中，所述第二细胞群体最初在旋转瓶中以约5×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个具体的方面，所述第二细胞群体最初以约3×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个更具体的方面，所述第二细胞群体最初在静态培养中以约3×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
在某些方面，本文公开的三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过7-氨基放线菌素D(7AAD)染色确定。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过膜联蛋白-V染色确定。在具体的方面，所述自然杀伤细胞的活力通过7-AAD染色和膜联蛋白-V染色二者确定。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过台盼蓝染色确定。
在某些方面，本文公开的三阶段方法产生包含至少20％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少70％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少75％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
在某些方面，当本文公开的三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，在所述第三培养步骤后，所述第三细胞群体，例如所述自然杀伤细胞群体，被冷冻保存。
在某些方面，本文提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，即通过本文描述的三阶段方法产生的自然杀伤细胞。相应地，本文提供了通过本文描述的三阶段方法产生的分离的自然杀伤细胞群体。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。
在一个实施方案中，本文提供了一种分离的NK祖细胞群体，其中所述NK祖细胞根据本文描述的三阶段方法产生。
在另一个实施方案中，本文提供了一种分离的成熟NK细胞群体，其中所述成熟NK细胞根据本文描述的三阶段方法产生。
在另一个实施方案中，本文提供了一种分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞是激活的，其中所述激活的NK细胞根据本文描述的三阶段方法产生。
相应地，在另一个方面，本文提供了用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体用来抑制急性髓性白血病细胞增殖的用途。在某些实施方案中，NK细胞群体与IL-2组合使用。
在另一个方面，本文提供了用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体用来抑制多发性骨髓瘤细胞增殖的用途。在某些实施方案中，NK细胞群体与IL-2组合使用。
在另一个具体的实施方案中，NK细胞群体由其产生的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)自胎盘灌洗液、脐带血或外周血获得。在一个实施方案中，NK细胞群体由其产生的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)自胎盘获得，例如自胎盘灌洗液获得。在一个实施方案中，NK细胞群体由其产生的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)不是自脐带血获得。在一个实施方案中，NK细胞群体由其产生的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)不自外周血获得。在另一个具体的实施方案中，NK细胞群体由其产生的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)为来自胎盘灌洗液和脐带血(例如来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的组合细胞。在另一个具体的实施方案中，所述脐带血从不同于所述胎盘灌洗液自其获得的胎盘的胎盘分离。在某些实施方案中，组合细胞可通过合并或组合脐带血与胎盘灌洗液来获得。在某些实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比率组合以获得组合细胞。在一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5、或3:1至1:3的比率组合。在另一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。在一个更具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85％:15％)的比率组合。
在某些实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率(如通过总有核细胞(TNC)含量确定的)组合以获得组合细胞。在一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5、或3:1至1:3的比率组合。在另一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其包括给予所述个体有效量的来自用本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体的细胞。在某些方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前已经冷冻保存。在其他方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前未经冷冻保存。
因此，在一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括给予所述个体有效量的来自用本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体的细胞。在某些方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前已经冷冻保存。在其他方面，所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前未经冷冻保存。
在一个具体的实施方案中，在所述给予之前，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体已用免疫调节化合物(例如本文描述的免疫调节化合物)或沙利度胺处理。在一个具体的实施方案中，在所述给予之前，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体已用IL2和IL12和IL18、IL12和IL15、IL12和IL18、IL2和IL12和IL15和IL18、或者IL2和IL15和IL18处理。在另一个具体的实施方案中，所述方法包括给予个体(1)有效量的用本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体；和(2)有效量的免疫调节化合物或沙利度胺。在此情况中，“有效量”指NK细胞群体中的细胞和任选地免疫调节化合物或沙利度胺的量，其导致与未给予所述NK细胞群体和任选地免疫调节化合物或沙利度胺的患有所述癌症或所述感染的个体相比，所述癌症或所述感染的一个或多个症状可检测的改善。在一个具体的实施方案中，所述免疫调节化合物为来那度胺或泊马度胺。
在另一个具体的实施方案中，本文提供了一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括使治疗有效量的NK细胞群体与急性髓性白血病细胞接近，例如使急性髓性白血病细胞与NK细胞群体中的细胞接触。后文中，除非另有指出，否则术语“接近”是指足够接近以引出期望的结果；例如，在某些实施方案中，术语接近是指接触。在某些实施方案中，所述接触在体外进行。在其他实施方案中，所述接触在体内进行。
在另一个实施方案中，本文提供了一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括使治疗有效量的NK细胞群体与急性髓性白血病细胞接近，例如使多发性骨髓瘤细胞与NK细胞群体中的细胞接触。在某些实施方案中，所述接触在体外进行。在其他实施方案中，所述接触在体内进行。
分离的NK细胞群体或其药物组合物的给予是全身性的。在具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过输注给予受试者。在具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过静脉内(IV)输注给予受试者。
在另一个方面，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其包括给予个体NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的AML有效。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞为脐带血NK细胞或自脐带血造血细胞(例如造血干细胞)产生的NK细胞。在另一个实施方案中，所述NK细胞通过本文描述的产生NK细胞(例如用本文阐述的三阶段方法产生NK细胞群体)的任何方法产生。在治疗患有急性髓性白血病的个体的方法的某些具体实施方案中，所述NK细胞群体通过如本文描述的三阶段方法产生。在一个特别的实施方案中，待通过前述方法治疗的急性髓性白血病包括难治性急性髓性白血病、预后不良的急性髓性白血病或儿童期急性髓性白血病。在某些实施方案中，所述个体患有针对急性髓性白血病的至少一种非自然杀伤细胞疗法已对其失败的急性髓性白血病。在具体的实施方案中，所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一次缓解期。在具体的实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用化疗例如氟达拉滨、阿糖胞苷或二者进行调理。
在另一个方面，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括给予个体NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的多发性骨髓瘤有效。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞为脐带血NK细胞或自脐带血造血细胞(例如造血干细胞)产生的NK细胞。在另一个实施方案中，所述NK细胞通过本文描述的产生NK细胞(例如用本文阐述的三阶段方法产生NK细胞群体)的任何方法产生。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施方案中，所述NK细胞群体通过如本文描述的三阶段方法产生。在具体的实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受自体干细胞移植。在具体的实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受美法仑。
在某些实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体被冷冻保存，例如使用本文描述的方法冷冻保存。在某些实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体被冷冻保存在冷冻保存介质(例如本文描述的冷冻保存介质)中。在一个具体的实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的NK祖细胞群体和/或NK细胞群体的冷冻保存包括(1)制备包含用本文描述的三阶段方法产生的NK祖细胞群体和/或NK细胞群体的细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液中加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)贮存冷冻保存的样品于-80℃以下。
在上述治疗或肿瘤抑制方法的某些实施方案中，将通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体与其他自然杀伤细胞(例如通过不同的方法自胎盘灌洗液、脐带血或外周血分离的或者自造血细胞产生的自然杀伤细胞)组合。在具体的实施方案中，将所述自然杀伤细胞群体与来自另一来源的或通过不同的方法制得的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率组合。
在另一个方面，本文提供了一种组合物，其包含通过本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞自分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)产生。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞占组合物中细胞的至少70％。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞占组合物中细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施方案中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞为CD3-和CD56+。在某些实施方案中，所述组合物中至少65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞为CD16-。在某些实施方案中，所述组合物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的NK细胞为CD94+。
在一个具体的实施方案中，所述NK细胞来自单个个体。在一个更具体的实施方案中，所述NK细胞包含来自至少两个不同个体的自然杀伤细胞。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞来自与预期用NK细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方案中，已使所述NK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近，其量和时间足以使与未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的相同数量自然杀伤细胞(即NK细胞)相比，所述NK细胞表达可检测地更多的颗粒酶B或穿孔素。
在一个更具体的实施方案中，组合物包含通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞和来自另一来源或通过另一方法制得的自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述其他来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方案中，所述其他来源为外周血。在更具体的实施方案中，将所述NK细胞与来自另一来源的或通过另一方法制得的自然杀伤细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率组合。
在另一个方面，本文提供了一种组合物(例如药物组合物)，其包含例如通过本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体。在一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体自造血细胞，例如分离自胎盘(例如胎盘灌洗液)、脐带血和/或外周血的造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体占组合物中细胞的至少70％。在另一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体占组合物中细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞占组合物中细胞的至少70％。在某些实施方案中，所述组合物中至少80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞为CD3-和CD56+。在某些实施方案中，所述组合物中至少65％、70％、75％、80％、82％、84％、86％、88％或90％的NK细胞为CD16-。在某些实施方案中，所述组合物中至少5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、55％或60％的NK细胞为CD94+。
在另一个具体的实施方案中，所述组合物中的所述分离的NK细胞来自单个个体。在一个更具体的实施方案中，所述分离的NK细胞包含来自至少两个不同个体的NK细胞。在另一个具体的实施方案中，所述组合物中所述分离的NK细胞来自与预期用NK细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方案中，已使所述NK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近，其量和时间足以使与未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的相同数量自然杀伤细胞(即NK细胞)相比，所述NK细胞表达可检测地更多的颗粒酶B或穿孔素。
在一个更具体的实施方案中，组合物包含来自另一来源或通过另一方法制得的NK细胞。在一个具体的实施方案中，所述其他来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方案中，所述其他来源为外周血。在更具体的实施方案中，将所述组合物中的NK细胞群体与来自另一来源的或通过另一方法制得的NK细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率组合。
3.1术语
如本文所用，术语“免疫调节化合物”和“IMiDTM”不涵盖沙利度胺。
如本文所用，“来那度胺”指3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮(化学文摘社名称)或3-(4-氨基-1,3-二氢-1-氧代-2H-异吲哚-2-基)-2,6-哌啶二酮(国际纯粹和应用化学联合会(IUPAC)名称)。如本文所用，“泊马度胺”指4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。
如本文所用，在提及细胞时，“专能(multipotent)”指该细胞具有分化成另一细胞类型的细胞的能力。在某些实施方案中，“专能细胞”为具有生长成哺乳动物体的大约260种细胞类型中的一个子集的能力的细胞。与多能细胞不同，专能细胞不具有形成所有细胞类型的能力。
如本文所用，“饲养细胞”是指与第二类型的细胞共培养以提供在其中第二类型的细胞可得以维持并可能增殖的环境的一种类型的细胞。不希望受任何理论束缚，饲养细胞可为靶细胞提供例如肽、多肽、电信号、有机分子(例如，类固醇)、核酸分子、生长因子(例如，bFGF)、其他因子(例如，细胞因子)和代谢营养素。在某些实施方案中，饲养细胞以单层生长。
如本文所用，用本文描述的方法产生的“自然杀伤细胞”或“NK细胞”(无进一步修饰)包括来自任何组织来源的自然杀伤细胞。
如本文所用，“胎盘灌洗液”指已通过胎盘(例如人胎盘)的至少一部分、例如通过胎盘脉管***的灌洗溶液，并包括在通过胎盘期间由灌洗溶液收集的多种细胞。
如本文所用，“胎盘灌洗液细胞”指有核细胞，例如自或可自胎盘灌洗液分离的总有核细胞。
如本文所用，“肿瘤细胞抑制”、“肿瘤细胞增殖的抑制”等包括例如通过杀灭肿瘤细胞群体中的一个或多个肿瘤细胞来减慢所述肿瘤细胞群体的生长，例如通过使用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞或NK细胞群体与肿瘤细胞群体接触或接近，例如使肿瘤细胞群体与用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞或NK细胞群体接触。在某些实施方案中，所述接触在体外进行。在其他实施方案中，所述接触在体内进行。
如本文所用，术语“造血细胞”包括造血干细胞和造血祖细胞。
如本文所用，“未限定组分”是培养基领域中的术语，其指的是其成分通常不提供或量化的组分。“未限定组分”的实例包括但不限于血清，例如人血清(例如，人血清AB)和胎儿血清(例如，胎牛血清或小牛血清)。
如本文所用，当用来指示特定细胞标志物的存在时，“+”指该细胞标志物相对于同型对照可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或者在定量或半定量RT-PCR中的背景上可检测到。
如本文所用，当用来指示特定细胞标志物的存在时，“-”指该细胞标记物相对于同型对照不是可检测地存在于荧光激活细胞分选中；或者在定量或半定量RT-PCR中的背景上不可检测。
4.具体实施方式
本文提供了使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，治疗患有急性髓性白血病的个体的方法。本文提供的治疗方法可以是包括IL-2的给予的抗癌疗法方案的部分。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。
本文还提供了抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，所述方法还包括使IL-2与NK细胞和/或急性髓性白血病细胞接近，例如，使NK细胞和/或急性髓性白血病细胞与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
本文提供了使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法。本文提供的治疗方法可以是包括IL-2的给予的抗癌疗法方案的部分。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在某些实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受化疗。在具体的实施方案中，化疗为烷化剂。在更具体的实施方案中，烷化剂为美法仑。在某些实施方案中，美法仑根据标签给予。在某些实施方案中，所述患有多发性骨髓瘤的个体为在所述给予之前已接受自体干细胞移植的个体。在某些实施方案中，自体干细胞移植用于治疗所述多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，自体干细胞移植中的干细胞为外周血单核细胞。
本文还提供了抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，所述方法还包括使IL-2与NK细胞和/或多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使NK细胞和/或多发性骨髓瘤细胞与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
本文提供了自造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)产生和扩增NK细胞的新方法。本文还提供了自造血细胞(例如造血干细胞或祖细胞)产生NK细胞群体的方法，例如，三阶段方法。用来产生NK细胞和NK细胞群体的造血细胞从任何来源获得，例如但不限于胎盘、脐带血、胎盘血、外周血、脾或肝。在某些实施方案中，NK细胞或NK细胞群体自扩增的造血细胞(例如造血干细胞和/或造血祖细胞)产生。在一个实施方案中，造血细胞自这样的细胞来源收集，例如，胎盘，例如自胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝和/或骨髓收集。
用来产生NK细胞和NK细胞群体的造血细胞可自任何动物物种获得。在某些实施方案中，造血干细胞或祖细胞为哺乳动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为人细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为灵长类动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为犬科动物细胞。在具体的实施方案中，所述造血干细胞或祖细胞为啮齿动物细胞。
4.1造血细胞
可用于本文公开的方法中的造血细胞可以是能够分化成NK细胞的任何造血细胞，例如前体细胞、造血祖细胞、造血干细胞等。造血细胞可自组织来源获得，例如，骨髓、脐带血、胎盘血、外周血、肝等或它们的组合。造血细胞可自胎盘获得。在一个具体的实施方案中，造血细胞自胎盘灌洗液获得。在一个实施方案中，造血细胞不是自脐带血获得。在一个实施方案中，造血细胞不是自外周血获得。来自胎盘灌洗液的造血细胞可包含胎儿和母体造血细胞的混合物，例如，其中母体细胞占造血细胞总数的超过5％的混合物。在某些实施方案中，来自胎盘灌洗液的造血细胞包含至少约90％、95％、98％、99％或99.5％的胎儿细胞。
在另一个具体的实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体由其产生的造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞，自胎盘灌洗液、脐带血、胎儿肝、动员的外周血或骨髓获得。在另一个具体的实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体由其产生的造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞，为来自胎盘灌洗液和脐带血(例如来自与灌洗液相同的胎盘的脐带血)的组合细胞。在另一个具体的实施方案中，所述脐带血从不同于所述胎盘灌洗液自其获得的胎盘的胎盘分离。在某些实施方案中，组合细胞可通过合并或组合脐带血与胎盘灌洗液来获得。在某些实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的体积比率组合以获得组合细胞。在一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1至1:10、5:1至1:5、或3:1至1:3的比率组合。在另一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。在一个更具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以8.5:1.5(85％:15％)的比率组合。
在某些实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液按照总有核细胞(TNC)含量以100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率组合以获得组合细胞。在一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1至10:1、5:1至1:5、或3:1至1:3的比率组合。在另一个具体的实施方案中，脐带血和胎盘灌洗液以10:1、5:1、3:1、1:1、1:3、1:5或1:10的比率组合。
在另一个具体的实施方案中，用本文描述的三阶段方法产生的所述NK细胞群体由其产生的造血细胞，例如造血干细胞或祖细胞，自脐带血和胎盘灌洗液二者获得，但其中所述脐带血分离自与所述胎盘灌洗液自其获得的胎盘不同的胎盘。
在某些实施方案中，造血细胞为CD34+细胞。在具体的实施方案中，可用于本文公开的方法中的造血细胞为CD34+CD38+或CD34+CD38-。在一个更具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD38-Lin-。在另一个具体的实施方案中，造血细胞为CD2–、CD3–、CD11b–、CD11c–、CD14–、CD16–、CD19–、CD24–、CD56–、CD66b–和/或血型糖蛋白A–中的一种或多种。在另一个具体的实施方案中，造血细胞为CD2–、CD3–、CD11b–、CD11c–、CD14–、CD16–、CD19–、CD24–、CD56–、CD66b–和血型糖蛋白A–。在另一个更具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD38–CD33–CD117–。在另一个更具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD38–CD33–CD117–CD235–CD36–。
在另一个实施方案中，造血细胞为CD45+。在另一个具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD45+。在另一个实施方案中，造血细胞为Thy-1+。在一个具体的实施方案中，造血细胞为CD34+Thy-1+。在另一个实施方案中，造血细胞为CD133+。在具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD133+或CD133+Thy-1+。在另一个具体的实施方案中，CD34+造血细胞为CXCR4+。在另一个具体的实施方案中，CD34+造血细胞为CXCR4–。在另一个实施方案中，造血细胞对于KDR(血管生长因子受体2)是阳性的。在具体的实施方案中，造血细胞为CD34+KDR+、CD133+KDR+或Thy-1+KDR+。在某些其他实施方案中，造血细胞对于醛脱氢酶是阳性的(ALDH+)，例如所述细胞为CD34+ALDH+。
在某些实施方案中，造血细胞为CD34–。
造血细胞还可能缺乏某些指示谱系定向的标志物或缺乏developmentalnaiveté。例如，在另一个实施方案中，造血细胞为HLA-DR–。在具体的实施方案中，造血细胞为CD34+HLA-DR–、CD133+HLA-DR–、Thy-1+HLA-DR–或ALDH+HLA-DR–。在另一个实施方案中，造血细胞对谱系标志物CD2、CD3、CD11b、CD11c、CD14、CD16、CD19、CD24、CD56、CD66b和血型糖蛋白A中的一种或多种或者全部是阴性的。
因此，可基于指示未分化状态的标志物的存在或基于表明至少已发生一些谱系分化的谱系标志物的不存在来选择用于本文公开的方法中的造血细胞。基于特定标志物的存在或不存在来分离细胞(包括造血细胞)的方法将在下文详细讨论。
本文提供的方法中使用的造血细胞可以是基本上同源的群体，例如，包含至少约95％、至少约98％或至少约99％来自单一组织来源的造血细胞的群体，或者包含表现出相同的造血细胞相关细胞标志物的造血细胞的群体。例如，在各种实施方案中，造血细胞可包含至少约95％、98％或99％来自骨髓、脐带血、胎盘血、外周血或胎盘(例如胎盘灌洗液)的造血细胞。
本文提供的方法中使用的造血细胞可自单个个体(例如自单个胎盘)或者自多个个体获得，例如可合并。在造血细胞从多个个体获得并合并的情况下，可从相同的组织来源获得造血细胞。因此，在各种实施方案中，合并的造血细胞均来自胎盘，例如胎盘灌洗液；均来自胎盘血；均来自脐带血；均来自外周血；等。
在某些实施方案中，本文公开的方法中使用的造血细胞可包含来自两个或更多个组织来源的造血细胞。例如，在某些实施方案中，在来自两个或更多个来源的造血细胞组合用于本文的方法中时，用来用本文描述的三阶段方法产生自然杀伤细胞的多个造血细胞包含来自胎盘例如胎盘灌洗液的造血细胞。在各种实施方案中，用来用本文描述的三阶段方法产生NK细胞群体的造血细胞包含来自胎盘和来自脐带血、来自胎盘和外周血、来自胎盘和胎盘血、或来自胎盘和骨髓的造血细胞。在一个实施方案中，造血细胞包含来自胎盘灌洗液的造血细胞与来自脐带血的造血细胞的组合，其中所述脐带血和胎盘来自同一个体，即其中所述灌洗液和脐带血是匹配的。在其中造血细胞包含来自两个组织来源的造血细胞的实施方案中，来自所述来源的造血细胞可以例如1:10、2:9、3:8、4:7、5:6、6:5、7:4、8:3、9:2、1:10、1:9、1:8、1:7、1:6、1:5、1:4、1:3、1:2、1:1、2:1、3:1、4:1、5:1、6:1、7:1、8:1或9:1的比率组合。
4.1.1胎盘造血干细胞
在某些实施方案中，本文提供的方法中使用的造血细胞为胎盘造血细胞。在一个实施方案中，胎盘造血细胞为CD34+。在一个具体的实施方案中，胎盘造血细胞主要(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)为CD34+CD38–细胞。在另一个具体的实施方案中，胎盘造血细胞主要(例如，至少约50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％)为CD34+CD38+细胞。胎盘造血细胞可通过本领域技术人员已知的任何方式自产后哺乳动物(例如，人)胎盘获得，例如通过灌注。
在另一个实施方案中，胎盘造血细胞为CD45–。在一个具体的实施方案中，造血细胞为CD34+CD45–。在另一个具体的实施方案中，胎盘造血细胞为CD34+CD45+。
4.2自然杀伤细胞和自然杀伤细胞群体的产生
通过本发明的方法产生NK细胞和NK细胞群体包括扩增造血细胞的群体。在细胞扩增过程中，造血细胞群体内的多个造血细胞分化成NK细胞。在一个方面，本文提供了一种产生NK细胞的方法，其包括在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如CD34+干细胞或祖细胞，以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，随后在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-的自然杀伤细胞，并且其中至少70％、例如80％的自然杀伤细胞是存活的，在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD16-的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+或CD16+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94-或CD16-的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94+和CD16+的自然杀伤细胞。在某些实施方案中，这样的自然杀伤细胞包含为CD94-和CD16-的自然杀伤细胞。
4.1.1使用三阶段方法产生NK细胞群体
在一个实施方案中，本文提供了一种产生NK细胞群体的三阶段方法。在某些实施方案中，根据本文描述的三阶段方法扩增和分化如本文所述的造血细胞以产生NK细胞群体的方法包括将包含所述造血细胞的细胞群体维持在约2×104至约6×106个细胞每毫升之间。在某些方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以1×104至1×105个细胞/mL接种到所述第一培养基中。在一个具体的方面，所述造血干细胞或祖细胞最初以约3×104个细胞/mL接种到所述第一培养基中。
在某些方面，所述第一细胞群体最初以5×104至5×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。在一个具体的方面，所述第一细胞群体最初以约1×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。
在某些方面，所述第二细胞群体最初以1×105至5×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在某些方面，所述第二细胞群体最初以1×105至1×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个具体的方面，所述第二细胞群体最初以约5×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个更具体的实施方案中，所述第二细胞群体最初在旋转瓶中以约5×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个具体的方面，所述第二细胞群体最初以约3×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。在一个更具体的方面，所述第二细胞群体最初在静态培养中以约3×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
在某些实施方案中，三阶段方法包括第一阶段(“阶段1”)，其包括将造血干细胞或祖细胞，例如CD34+干细胞或祖细胞，在第一培养基中培养指定时间段(例如如本文所述的)以产生第一细胞群体。在某些实施方案中，第一培养基包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，第一培养基还包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在一个具体的实施方案中，除了干细胞动员剂和Tpo外，第一培养基还包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在一个具体的实施方案中，第一培养基没有外加的LMWH。在一个具体的实施方案中，第一培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。在一个具体的实施方案中，第一培养基没有LMWH。在一个具体的实施方案中，第一培养基没有去硫糖胺聚糖。在一个具体的实施方案中，除了干细胞动员剂和Tpo外，第一培养基还包含Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。
在某些实施方案中，随后在“阶段2”中，将所述细胞在第二培养基中培养指定时间段(例如如本文所述的)以产生第二细胞群体。在某些实施方案中，第二培养基包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo。在某些实施方案中，除了干细胞动员剂和IL-15外，第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些实施方案中，除了干细胞动员剂和IL-15外，第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在一个具体的实施方案中，第二培养基没有外加的LMWH。在一个具体的实施方案中，第二培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。在一个具体的实施方案中，第二培养基没有LMWH。在一个具体的实施方案中，第二培养基没有去硫糖胺聚糖。在某些实施方案中，除了干细胞动员剂和IL-15外，第二培养基还包含Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。
在某些实施方案中，随后在“阶段3”中，将所述细胞在第三培养基中培养指定时间段(例如如本文所述的)以产生第三细胞群体，例如自然杀伤细胞。在某些实施方案中，第三培养基包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH。在某些实施方案中，除IL-2和IL-15外，第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些实施方案中，除IL-2和IL-15外，第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在具体的实施方案中，第三培养基没有去硫糖胺聚糖。在具体的实施方案中，第三培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。
在一个具体的实施方案中，使用三阶段方法来产生NK细胞群体。在某些实施方案中，三阶段方法在不存在基质饲养细胞支持的情况下进行。在某些实施方案中，三阶段方法在不存在外源性添加的类固醇(例如，可的松、氢化可的松或它们的衍生物)的情况下进行。
在某些方面，三阶段方法中使用的所述第一培养基包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含低分子量肝素(LMWH)、Flt-3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、IL-6、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，除了干细胞动员剂和Tpo外，三阶段方法中使用的第一培养基还包含Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在一个具体的方面，第一培养基没有外加的LMWH。在一个具体的方面，第一培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。在一个具体的方面，第一培养基没有LMWH。在一个具体的方面，第一培养基没有去硫糖胺聚糖。在某些方面，所述Tpo以1ng/mL至100ng/mL、1ng/mL至50ng/mL、20ng/mL至30ng/mL、或约25ng/mL的浓度存在于所述第一培养基中。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第一培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第一培养基还包含以下的一种或多种：抗生素如庆大霉素；抗氧化剂如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；***钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方案中，提供第一培养基的基质的培养基为本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基如SCGMTM、STEMMACSTM、X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、H3000、CELLGROCOMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或为包含通常包括在已知的细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包括在X-VIVOTM 10、X-VIVOTM15、OPTMIZER、H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640中的组分。在某些实施方案中，所述第一培养基不为
在某些方面，三阶段方法中使用的所述第二培养基包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，除了干细胞动员剂和IL-15外，三阶段方法中使用的第二培养基还包含Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在一个具体的方面，第二培养基没有外加的LMWH。在一个具体的方面，第二培养基没有外加的去硫糖胺聚糖。在一个具体的方面，第二培养基没有LMWH。在一个具体的方面，第二培养基没有去硫糖胺聚糖。在某些方面，所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL、10ng/mL至30ng/mL、或约20ng/mL的浓度存在于所述第二培养基中。在某些方面，在所述第二培养基中，LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第二培养基中，Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于第二培养基中；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于第二培养基中；Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，LMWH以约4.5U/mL的浓度存在于第二培养基中；Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些方面，在第二培养基中，Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；SCF以约27ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约25ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第二培养基还包含以下的一种或多种：抗生素如庆大霉素；抗氧化剂如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；***钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方案中，提供第二培养基的基质的培养基为本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基如SCGMTM、STEMMACSTM、X-VIVOTM10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、H3000、CELLGROCOMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或为包含通常包括在已知的细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包括在X-VIVOTM 10、X-VIVOTM15、OPTMIZER、H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640中的组分。在某些实施方案中，所述第二培养基不为
在某些实施方案中，三阶段方法中使用的第三培养基包含含有的培养基。在某些方面，三阶段方法中使用的所述第三培养基包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH。在某些方面，除了IL-2和IL-15外，三阶段方法中使用的第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF或GM-CSF中的一种或多种。在某些方面，除了IL-2和IL-15外，三阶段方法中使用的第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。在某些方面，所述IL-2以10U/mL至10,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以100U/mL至10,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以300U/mL至3,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以10ng/mL至30ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，所述IL-2以约1,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以约20ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。在某些方面，在所述第三培养基中，SCF以约22ng/mL的浓度存在；IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；IL-7以约20ng/mL的浓度存在；G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。在某些实施方案中，所述第三培养基还包含以下的一种或多种：抗生素如庆大霉素；抗氧化剂如转铁蛋白、胰岛素和/或β-巯基乙醇；***钠；抗坏血酸；乙醇胺；和谷胱甘肽。在某些实施方案中，提供第三培养基的基质的培养基为本领域技术人员已知的细胞/组织培养基，例如，可商购获得的细胞/组织培养基如SCGMTM、STEMMACSTM、X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640；或为包含通常包括在已知的细胞/组织培养基中的组分的培养基，如包括在X-VIVOTM 10、X-VIVOTM 15、OPTMIZER、H3000、CELLGRO COMPLETETM、DMEM:Ham’s F12(“F12”)(例如，2:1比率，或者高葡萄糖或低葡萄糖DMEM)、Advanced DMEM(Gibco)、EL08-1D2、MyelocultTMH5100、IMDM和/或RPMI-1640中的组分。在某些实施方案中，所述第三培养基不为
通常，特别记载的培养基组分不指所述培养基的未限定组分中的可能成分。例如，所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内，例如，所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在血清内。此外，所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内，例如，所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在血清内。
在某些方面，所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含人血清-AB。在某些方面，任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含1％至20％的人血清-AB、5％至15％的人血清-AB、或者约2、5或10％的人血清-AB。
在某些实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将细胞在所述第二培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19或20天。在某些实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，将细胞在所述第三培养基中培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29或30天或者多于30天。
在一个具体的实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，在所述第二培养基中的所述培养之前，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养7-13天以产生第一细胞群体；在所述第三培养基中的所述培养之前，将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养2-6天以产生第二细胞群体；和将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养10-30天，即，细胞被培养总共19-49天。
在一个具体的实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，在本文描述的三阶段方法中，在所述第二培养基中的所述培养之前，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养8-12天以产生第一细胞群体；在所述第三培养基中的所述培养之前，将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养3-5天以产生第二细胞群体；和将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养15-25天，即，细胞被培养总共26-42天。
在一个具体的实施方案中，在本文描述的三阶段方法中，在所述第二培养基中的所述培养之前，将所述造血干细胞或祖细胞在所述第一培养基中培养约10天以产生第一细胞群体；在所述第三培养基中的所述培养之前，将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养约4天以产生第二细胞群体；和将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养约21天，即，细胞被培养总共约35天。
在某些方面，本文公开的三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少10,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少50,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少75,000倍的自然杀伤细胞。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过7-氨基放线菌素D(7AAD)染色确定。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过膜联蛋白-V染色确定。在具体的方面，所述自然杀伤细胞的活力通过7-AAD染色和膜联蛋白-V染色二者确定。在某些方面，所述自然杀伤细胞的活力通过台盼蓝染色确定。
在某些方面，三阶段方法产生包含至少20％CD56+CD3–自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少70％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。在某些方面，所述三阶段方法产生包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时，所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时，所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时，所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养，所述自然杀伤细胞时对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。在某些方面，当三阶段方法产生的自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时，所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
在某些方面，在所述第三培养步骤后，所述第三细胞群体，例如所述自然杀伤细胞群体，被冷冻保存。
在某些方面，本文提供了包含自然杀伤细胞的细胞群体，即通过本文描述的三阶段方法产生的自然杀伤细胞。相应地，本文提供了通过本文描述的三阶段方法产生的分离的自然杀伤细胞群体。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少40％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少60％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少80％的CD56+CD3-自然杀伤细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少60％的CD16-细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少80％的CD16-细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少20％的CD94+细胞。在一个具体的实施方案中，所述自然杀伤细胞群体包含至少40％的CD94+细胞。
4.3干细胞动员因子
4.3.1化学定义
为了便于理解本文所述干细胞动员因子的公开内容，下文定义了一些术语。
通常，本文使用的命名法及本文中所描述的生物学、细胞生物学、生物化学、有机化学、药物化学和药理学的实验室程序是本领域公知和常用的那些。除非另有定义，否则本文使用的所有技术和科学术语通常具有与本公开所属领域普通技术人员通常理解的相同含义。
术语“约”或“大约”指本领域普通技术人员确定的特定值的可接受误差，其部分取决于该值是如何测量或测定的。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在1、2、3或4个标准偏差内。在某些实施方案中，术语“约”或“大约”意指在给定值或范围的50％、20％、15％、10％、9％、8％、7％、6％、5％、4％、3％、2％、1％、0.5％或0.05％内。
术语“芳基烃受体”或“AHR”是指由人类中的AHR基因编码的蛋白质或其变体例如，参见GenBank登录号P35869.2和AAH70080.1)。
术语“芳基烃受体拮抗剂”、“AHR拮抗剂”、“芳基烃受体抑制剂”或“AHR抑制剂”是指下调或降低芳基烃受体的活性的化合物。
术语“烷基”是指直链或支链的饱和一价烃基，其中所述烷基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。术语“烷基”还涵盖直链和支链烷基，另有指出除外。在某些实施方案中，烷基为具有1至20(C1-20)、1至15(C1-15)、1至10(C1-10)或1至6(C1-6)个碳原子的直链饱和一价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链饱和一价烃基。如本文所用，直链C1-6和支链C3-6烷基基团也被称为“低级烷基”。烷基基团的实例包括但不限于甲基、乙基、丙基(包括所有异构体形式)、正-丙基、异丙基、丁基(包括所有异构体形式)、正-丁基、异丁基、仲-丁基、叔-丁基、戊基(包括所有异构体形式)和己基(包括所有异构体形式)。例如，C1-6烷基是指具有1至6个碳原子的直链饱和一价烃基或具有3至6个碳原子的支链饱和一价烃基。
术语“亚烷基”是指直链或支链饱和二价烃基，其中所述亚烷基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。例如，C1-6亚烷基是指具有1至6个碳原子的直链饱和二价烃基或具有3至6个碳原子的支链饱和二价烃基。在某些实施方案中，亚烷基为具有1至20(C1-20)、1至15(C1-15)、1至10(C1-10)或1至6(C1-6)个碳原子的直链饱和二价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链饱和二价烃基。如本文所用，直链C1-6和支链C3-6亚烷基基团也被称为“低级亚烷基”。亚烷基基团的实例包括但不限于亚甲基、亚乙基、亚丙基(包括所有异构体形式)、正-亚丙基、异亚丙基、亚丁基(包括所有异构体形式)、正-亚丁基、异亚丁基、叔-亚丁基、亚戊基(包括所有异构体形式)和亚己基(包括所有异构体形式)。
术语“烯基”是指直链或支链一价烃基，其含有一个或多个碳-碳双键，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个或五个碳-碳双键，在另一个实施方案中，一个碳-碳双键。烯基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。术语“烯基”还涵盖具有“顺式”和“反式”构型或者“Z”和“E”构型的基团，如本领域普通技术人员理解的。如本文所用，术语“烯基”涵盖直链和支链烯基二者，另有指出除外。例如，C2-6烯基是指具有2至6个碳原子的直链不饱和一价烃基或具有3至6个碳原子的支链不饱和一价烃基。在某些实施方案中，烯基为具有2至20(C2-20)、2至15(C2-15)、2至10(C2-10)或2至6(C2-6)个碳原子的直链一价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链一价烃基。烯基基团的实例包括但不限于乙烯基、丙烯-1-基、丙烯-2-基、烯丙基、丁烯基和4-甲基丁烯基。
术语“亚烯基”是指直链或支链二价烃基，其含有一个或多个碳-碳双键，在一个实施方案中，一至五个碳-碳双键，在另一个实施方案中，一个碳-碳双键。亚烯基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。术语“亚烯基”涵盖具有“顺式”或“反式”构型的基团或它们的混合物，或者“Z”或“E”构型的基团或它们的混合物，如本领域普通技术人员理解的。例如，C2-6亚烯基是指具有2至6个碳原子的直链不饱和二价烃基或具有3至6个碳原子的支链不饱和二价烃基。在某些实施方案中，亚烯基为具有2至20(C2-20)、2至15(C2-15)、2至10(C2-10)或2至6(C2-6)个碳原子的直链二价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链二价烃基。亚烯基基团的实例包括但不限于亚乙烯基、亚烯丙基、亚丙烯基、亚丁烯基和4-甲基亚丁烯基。
术语“炔基”是指直链或支链一价烃其，其含有一个或多个碳-碳三键，在一个实施方案中，一个、两个、三个、四个或五个碳-碳三键，在另一个实施方案中，一个碳-碳三键。炔基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。术语“炔基”还涵盖直链和支链炔基，另有指出除外。在某些实施方案中，炔基为具有2至20(C2-20)、2至15(C2-15)、2至10(C2-10)或2至6(C2-6)个碳原子的直链一价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链一价烃基。炔基基团的实例包括但不限于乙炔基(–C≡CH)和炔丙基(–CH2C≡CH)。例如，C2-6炔基是指具有2至6个碳原子的直链不饱和一价烃基或具有3至6个碳原子的支链不饱和一价烃基。
术语“亚炔基”是指直链或支链二价烃基，其含有一个或多个碳-碳三键，在一个实施方案中，一至五个碳-碳三键，在另一个实施方案中，一个碳-碳三键。亚炔基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。例如，C2-6亚炔基是指具有2至6个碳原子的直链不饱和二价烃基或具有3至6个碳原子的支链不饱和二价烃基。在某些实施方案中，亚炔基为具有2至20(C2-20)、2至15(C2-15)、2至10(C2-10)或2至6(C2-6)个碳原子的直链二价烃基或者具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至6(C3-6)个碳原子的支链二价烃基。亚炔基基团的实例包括但不限于亚乙炔基、亚丙炔基(包括所有异构体形式，例如，1-亚丙炔基和亚炔丙基)、亚丁炔基(包括所有异构体形式，例如，1-丁炔-1-亚基和2-丁炔-1-亚基)、亚戊炔基(包括所有异构体形式，例如，1-戊炔-1-亚基和1-甲基-2-丁炔-1-亚基)和亚己炔基(包括所有异构体形式，例如，1-己炔-1-亚基)。
术语“环烷基”是指环状饱和或非芳族不饱和、桥接或非桥接一价烃基，其任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，环烷基为环状饱和桥接或非桥接一价烃基。在某些实施方案中，环烷基具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)或3至7(C3-7)个碳原子。环烷基基团的实例包括但不限于环丙基、环丁基、环戊基、环己基、环庚基、双环[2.1.1]己基、双环[2.2.1]庚基、十氢萘基和金刚烷基。
术语“亚环烷基”是指环状二价烃基，其任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在一个实施方案中，环烷基基团是饱和或不饱和的但非芳族的、和/或桥接的和/或非桥接的、和/或稠合的双环基团。在某些实施方案中，亚环烷基具有3至20(C3-20)、3至15(C3-15)、3至10(C3-10)、或3至7(C3-7)个碳原子。亚环烷基基团的实例包括但不限于亚环丙基(例如，1,1-亚环丙基和1,2-亚环丙基)、亚环丁基(例如，1,1-亚环丁基、1,2-亚环丁基或1,3-亚环丁基)、亚环戊基(例如，1,1-亚环戊基、1,2-亚环戊基或1,3-亚环戊基)、亚环己基(例如，1,1-亚环己基、1,2-亚环己基、1,3-亚环己基或1,4-亚环己基)、亚环庚基(例如，1,1-亚环庚基、1,2-亚环庚基、1,3-亚环庚基或1,4-亚环庚基)、亚十氢萘基和亚金刚烷基。
术语“芳基”是指含有至少一个芳族烃环的单环芳族碳环基团和/或多环一价芳族碳环基团。在某些实施方案中，芳基具有6至20(C6-20)、6至15(C6-15)、或6至10(C6-10)个环原子。芳基基团的实例包括但不限于苯基、萘基、芴基、薁基、蒽基、菲基、芘基、联苯基和三联苯基。在某些实施方案中，术语“芳基”是指双环或三环碳环，其中一个环是芳族的，其他环可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，例如二氢萘基、茚基、茚满基或四氢萘基(萘满基)。芳基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“亚芳基”是指含有至少一个芳族碳环的二价单环芳族基团和/或二价多环芳族基团。在某些实施方案中，亚芳基具有6至20(C6-20)、6至15(C6-15)、或6至10(C6-10)个环原子。亚芳基基团的实例包括但不限于亚苯基、亚萘基、亚芴基、亚薁基、亚蒽基、亚菲基、亚芘基、亚联苯基和亚三联苯基。亚芳基也指双环或三环碳环，其中一个环是芳族的，其他环可以是饱和的、部分不饱和的或芳族的，例如亚二氢萘基、亚茚基、亚茚满基或亚四氢萘基(亚萘满基)。亚芳基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“芳烷基”或“芳基烷基”是指被一个或多个芳基基团所取代的一价烷基基团。在某些实施方案中，芳烷基具有7至30(C7-30)、7至20(C7-20)、或7至16(C7-16)个碳原子。芳烷基基团的实例包括但不限于苄基、1-苯基乙基、2-苯基乙基和3-苯基丙基。芳烷基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“杂芳基”是指含有至少一个芳族环的一价单环芳族基团或一价多环芳族基团，其中至少一个芳族环含有一个或多个杂原子，环中的每一个杂原子独立地选自O、S、N和P。为清楚起见，如本文所用，术语“芳基”和“杂芳基”是互斥的，即“芳基”基团不包括“杂芳基”基团，反之亦然。杂芳基基团通过其芳族环键合到分子的其余部分。杂芳基基团的每一个环可含有一或两个O原子、一或两个S原子、一至四个N原子、和/或一或两个P原子，前提条件是每一个环中杂原子的总数为四个以下并且每一个环含有至少一个碳原子。在某些实施方案中，杂芳基具有5至20、5至15、或5至10个环原子。单环杂芳基基团的实例包括但不限于呋喃基、咪唑基、异噻唑基、异噁唑基、噁二唑基、噁二唑基、噁唑基、吡嗪基、吡唑基、哒嗪基、吡啶基、嘧啶基、吡咯基、噻二唑基、噻唑基、噻吩基、四唑基、三嗪基和***基。双环杂芳基基团的实例包括但不限于苯并呋喃基、苯并咪唑基、苯并异噁唑基、苯并吡喃基、苯并噻二唑基、苯并噻唑基、苯并噻吩基、苯并***基、苯并噁唑基、呋喃并吡啶基、咪唑并吡啶基、咪唑并噻唑基、吲嗪基、吲哚基、吲唑基、异苯并呋喃基、异苯并噻吩基、异吲哚基、异喹啉基、异噻唑基、萘啶基、噁唑并吡啶基、酞嗪基、蝶啶基、嘌呤基、吡啶并吡啶基、吡咯并吡啶基、喹啉基、喹喔啉基、喹唑啉基、噻二唑并嘧啶基和噻吩并吡啶基。三环杂芳基基团的实例包括但不限于吖啶基、苯并吲哚基、咔唑基、二苯并呋喃基、咟啶基(perimidinyl)、邻菲咯啉基、菲啶基、吩砒嗪基、吩嗪基、吩噻嗪基、吩噁嗪基和氧杂蒽基。杂芳基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“亚杂芳基”是指含有至少一个芳族环的二价单环芳族基团或二价多环芳族基团，其中至少一个芳族环在环中含有一个或多个独立地选自O、S和N的杂原子。为清楚起见，如本文所用，术语“亚芳基”和“亚杂芳基”是互斥的，即“亚芳基”基团不包括“亚杂芳基”基团，反之亦然。亚杂芳基基团通过其芳族环键合到分子的其余部分。亚杂芳基基团的每一个环可含有一或两个O原子、一或两个S原子、和/或一至四个N原子，前提条件是每一个环中杂原子的总数为四个以下并且每一个环含有至少一个碳原子。在某些实施方案中，亚杂芳基具有5至20、5至15、或5至10个环原子。单环亚杂芳基基团的实例包括但不限于亚呋喃基、亚咪唑基、亚异噻唑基、亚异噁唑基、亚噁二唑基、亚噁二唑基、亚噁唑基、亚吡嗪基、亚吡唑基、亚哒嗪基、亚吡啶基、亚嘧啶基、亚吡咯基、亚噻二唑基、亚噻唑基、亚噻吩基、亚四唑基、亚三嗪基和亚***基。双环亚杂芳基基团的实例包括但不限于亚苯并呋喃基、亚苯并咪唑基、亚苯并异噁唑基、亚苯并吡喃基、亚苯并噻二唑基、亚苯并噻唑基、亚苯并噻吩基、亚苯并***基、亚苯并噁唑基、亚呋喃并吡啶基、亚咪唑并吡啶基、亚咪唑并噻唑基、亚吲嗪基、亚吲哚基、亚吲唑基、亚异苯并呋喃基、亚异苯并噻吩基、亚异吲哚基、亚异喹啉基、亚异噻唑基、亚萘啶基、亚噁唑并吡啶基、亚酞嗪基、亚蝶啶基、亚嘌呤基、亚吡啶并吡啶基、亚吡咯并吡啶基、亚喹啉基、亚喹喔啉基、亚喹唑啉基、亚噻二唑并嘧啶基和亚噻吩并吡啶基。三环亚杂芳基基团的实例包括但不限于亚吖啶基、亚苯并吲哚基、亚咔唑基、亚二苯并呋喃基、亚咟啶基(perimidinylene)、亚邻菲咯啉基、亚菲啶基、亚吩砒嗪基、亚吩嗪基、亚吩噻嗪基、亚吩噁嗪基和亚氧杂蒽基。亚杂芳基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“杂环基”或“杂环”是指一价单环非芳族环系或含有至少一个非芳族环的一价多环环系，其中一个或多个非芳族环原子为杂原子，每一个杂原子独立地选自O、S、N和P；其余环原子为碳原子。在某些实施方案中，杂环基或杂环状基团具有3至20、3至15、3至10、3至8、4至7、或5至6个环原子。杂环基基团通过其非芳族环键合到分子的其余部分。在某些实施方案中，杂环基为单环、双环、三环或四环环系，其可以是螺环、稠合环或桥接环，并且其中氮或硫原子可任选被氧化，氮原子可任选被季铵化，并且一些环可以是部分或完全饱和的、或芳族的。杂环基可在导致产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接到主结构。杂环基团的实例包括但不限于氮杂环庚烷基、苯并二噁烷基、苯并二噁茂基、苯并呋喃酮基、苯并吡喃酮基、苯并吡喃基、苯并四氢呋喃基、苯并四氢噻吩基、苯并噻喃基、苯并噁嗪基、β-咔啉基、色满基、色酮基、噌啉基、香豆素基、十氢异喹啉基、二氢苯并异噻嗪基、二氢苯并异噁嗪基、二氢呋喃基、二氢异吲哚基、二氢吡喃基、二氢吡唑基、二氢吡嗪基、二氢吡啶基、二氢嘧啶基、二氢吡咯基、二氧戊环基、1,4-二噻烷基、呋喃酮基、咪唑烷基、咪唑啉基、二氢吲哚基、异苯并四氢呋喃基、异苯并四氢噻吩基、异色满基、异香豆素基、异二氢吲哚基、异噻唑烷基、异噁唑烷基、吗啉基、八氢吲哚基、八氢异吲哚基、噁唑烷酮基、噁唑烷基、氧杂环丙烷基、哌嗪基、哌啶基、4-哌啶酮基、吡唑烷基、吡唑啉基、吡咯烷基、吡咯啉基、奎宁环基、四氢呋喃基、四氢异喹啉基、四氢吡喃基、四氢噻吩基、硫代吗啉基、噻唑烷基、四氢喹啉基和1,3,5-三噻烷基。杂环基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“亚杂环基”是指二价单环非芳族环系或含有至少一个非芳族环的二价多环环系，其中一个或多个非芳族环原子为独立地选自O、S和N的杂原子；其余环原子为碳原子。在某些实施方案中，亚杂环基基团具有3至20、3至15、3至10、3至8、4至7、或5至6个环原子。在某些实施方案中，亚杂环基为单环、双环、三环或四环环系，其可以是稠合的或桥接的，并且其中氮或硫原子可任选被氧化，氮原子可任选被季铵化，并且一些环可以是部分或完全饱和的、或是芳族的。亚杂环基可在导致产生稳定化合物的任何杂原子或碳原子处连接到主结构。这样的亚杂环基团的实例包括但不限于亚氮杂环庚烷基、亚苯并二噁烷基、亚苯并二噁茂基、亚苯并呋喃酮基、亚苯并吡喃酮基、亚苯并吡喃基、亚苯并四氢呋喃基、亚苯并四氢噻吩基、亚苯并噻喃基、亚苯并噁嗪基、亚β-咔啉基、亚色满基、亚色酮基、亚噌啉基、亚香豆素基、亚十氢异喹啉基、亚二氢苯并异噻嗪基、亚二氢苯并异噁嗪基、亚二氢呋喃基、亚二氢异吲哚基、亚二氢吡喃基、亚二氢吡唑基、亚二氢吡嗪基、亚二氢吡啶基、亚二氢嘧啶基、亚二氢吡咯基、亚二氧戊环基、亚1,4-二噻烷基、亚呋喃酮基、亚咪唑烷基、亚咪唑啉基、亚二氢吲哚基、亚异苯并四氢呋喃基、亚异苯并四氢噻吩基、亚异色满基、亚异香豆素基、亚异二氢吲哚基、亚异噻唑烷基、亚异噁唑烷基、亚吗啉基、亚八氢吲哚基、亚八氢异吲哚基、亚噁唑烷酮基、亚噁唑烷基、亚氧杂环丙烷基、亚哌嗪基、亚哌啶基、亚4-哌啶酮基、亚吡唑烷基、亚吡唑啉基、亚吡咯烷基、亚吡咯啉基、亚奎宁环基、亚四氢呋喃基、亚四氢异喹啉基、亚四氢吡喃基、亚四氢噻吩基、亚硫代吗啉基、亚噻唑烷基、亚四氢喹啉基和亚1,3,5-三噻烷基。亚杂环基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“卤素”、“卤化物”或“卤代”是指氟、氯、溴和/或碘。
术语“卤代烷基”是指被一个或多个、在一个实施方案中，被一个、两个或三个卤代基团所取代的烷基基团，其中所述烷基为如本文所定义。卤代烷基任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
术语“烷氧基”是指-O-烷基，其中所述烷基为如本文所定义。
术语“卤代烷氧基”是指-O-卤代烷基，其中所述卤代烷基为如本文所定义。
术语“任选取代的”意在指基团或取代基如烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环烷基、亚环烷基、芳基、亚芳基、芳烷基(例如，苄基)、杂芳基、亚杂芳基、杂环基和亚杂环基基团可被一个或多个取代基Q所取代，其每一种独立地选自例如(a)氧代(＝O)、氰基(–CN)、卤代和硝基(–NO2)；(b)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基和杂环基，其每一种还任选被一个或多个，在一个实施方案中，被一个、两个、三个、四个或五个取代基Qa所取代；和(c)–C(O)Ra、–C(O)ORa、–C(O)NRbRc、–C(NRa)NRbRc、–ORa、–OC(O)Ra、–OC(O)ORa、–OC(O)NRbRc、–OC(＝NRa)NRbRc、–OS(O)Ra、–OS(O)2Ra、–OS(O)NRbRc、–OS(O)2NRbRc、–NRbRc、–NRaC(O)Rd、–NRaC(O)ORd、–NRaC(O)NRbRc、–NRaC(＝NRd)NRbRc、–NRaS(O)Rd、–NRaS(O)2Rd、–NRaS(O)NRbRc、–NRaS(O)2NRbRc、–P(O)RaRd、–P(O)(ORa)Rd、–P(O)(ORa)(ORd)、–SRa、–S(O)Ra、–S(O)2Ra、–S(O)NRbRc和–S(O)2NRbRc，其中每一个Ra、Rb、Rc和Rd独立地为(i)氢；(ii)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基，其每一种任选被一个或多个，在一个实施方案中，被一个、两个、三个或四个取代基Qa所取代；或(iii)Rb和Rc与它们所连接的N原子一起形成杂芳基或杂环基，其每一种任选被一个或多个，在一个实施方案中，被一个、两个、三个或四个取代基Qa所取代。如本文所用，所有可被取代的本文描述的基团是“任选被取代的”，另有明确指出除外。
在一个实施方案中，每一个取代基Qa独立地选自(a)氧代、氰基、卤代和硝基；和(b)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基和杂环基；和(c)–C(O)Re、–C(O)ORe、–C(O)NRfRg、–C(NRe)NRfRg、–ORe、–OC(O)Re、–OC(O)ORe、–OC(O)NRfRg、–OC(＝NRe)NRfRg、–OS(O)Re、–OS(O)2Re、–OS(O)NRfRg、–OS(O)2NRfRg、–NRfRg、–NReC(O)Rh、–NReC(O)ORh、–NReC(O)NRfRg、–NReC(＝NRh)NRfRg、–NReS(O)Rh、–NReS(O)2Rh、–NReS(O)NRfRg、–NReS(O)2NRfRg、–P(O)ReRh、–P(O)(ORe)Rh、–P(O)(ORe)(ORh)、–SRe、–S(O)Re、–S(O)2Re、–S(O)NRfRg和–S(O)2NRfRg；其中每一个Re、Rf、Rg和Rh独立地为(i)氢、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基；或(ii)Rf和Rg与它们所连接的N原子一起形成杂芳基或杂环基。
在某些实施方案中，“光学活性的”和“对映体活性的”是指分子的集合，其对映体过量值不低于约50％、不低于约70％、不低于约80％、不低于约90％、不低于约91％、不低于约92％、不低于约93％、不低于约94％、不低于约95％、不低于约96％、不低于约97％、不低于约98％、不低于约99％、不低于约99.5％、或不低于约99.8％。在某些实施方案中，基于所讨论的两种对映体的总重量计，化合物包含约95％以上的所需对映体和约5％以下的不太优选的对映体。
在描述光学活性化合物时，前缀R和S用来表示光学活性化合物围绕其一个或多个手性中心的绝对构型。(+)和(-)用来表示光学活性化合物的旋光性，即，偏振光平面被光学活性化合物旋转的方向。(-)前缀表示光学活性化合物是左旋的，即化合物将偏振光平面向左或逆时针旋转。(+)前缀表示光学活性化合物是右旋的，即化合物将偏振光平面向右或顺时针旋转。然而，旋光性(+)和(-)的符号与化合物的绝对构型R和S不相关。
术语“同位素变体”是指构成这种化合物的一个或多个原子处含有非天然比例的同位素的化合物。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包括但不限于氢(1H)、氘(2H)、氚(3H)、碳-11(11C)、碳-12(12C)、碳-13(13C)、碳-14(14C)、氮-13(13N)、氮-14(14N)、氮-15(15N)、氧-14(14O)、氧-15(15O)、氧-16(16O)、氧-17(17O)、氧-18(18O)、氟-17(17F)、氟-18(18F)、磷-31(31P)、磷-32(32P)、磷-33(33P)、硫-32(32S)、硫-33(33S)、硫-34(34S)、硫-35(35S)、硫-36(36S)、氯-35(35Cl)、氯-36(36Cl)、氯-37(37Cl)、溴-79(79Br)、溴-81(81Br)、碘-123(123I)、碘-125(125I)、碘-127(127I)、碘-129(129I)和碘-131(131I)。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”呈稳定的形式，即，非放射性的。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包括但不限于氢(1H)、氘(2H)、碳-12(12C)、碳-13(13C)、氮-14(14N)、氮-15(15N)、氧-16(16O)、氧-17(17O)、氧-18(18O)、氟-17(17F)、磷-31(31P)、硫-32(32S)、硫-33(33S)、硫-34(34S)、硫-36(36S)、氯-35(35Cl)、氯-37(37Cl)、溴-79(79Br)、溴-81(81Br)和碘-127(127I)。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”呈不稳定的形式，即，放射性的。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的一种或多种同位素，包括但不限于氚(3H)、碳-11(11C)、碳-14(14C)、氮-13(13N)、氧-14(14O)、氧-15(15O)、氟-18(18F)、磷-32(32P)、磷-33(33P)、硫-35(35S)、氯-36(36Cl)、碘-123(123I)、碘-125(125I)、碘-129(129I)和碘-131(131I)。应理解，在如本文所提供的化合物中，在根据本领域技术人员的判断为可行时，任何氢可例如为2H，或任何碳可例如为13C，或任何氮可例如为15N，或任何氧可例如为18O。在某些实施方案中，化合物的“同位素变体”含有非天然比例的氘(D)。
术语“溶剂化物”是指由以化学计量或非化学计量的量存在的一种或多种溶质分子(例如，本文提供的化合物)与一种或多种溶剂分子形成的复合物或聚集体。合适的溶剂包括但不限于水、甲醇、乙醇、正-丙醇、异丙醇和乙酸。在某些实施方案中，溶剂是药学上可接受的。在一个实施方案中，所述复合物或聚集体呈结晶形式。在另一个实施方案中，所述复合物或聚集体呈非晶形式。当溶剂为水时，溶剂化物为水合物。水合物的实例包括但不限于半水合物、一水合物、二水合物、三水合物、四水合物和五水合物。
表述“其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药”具有与表述“(i)其中提及的化合物的对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；(ii)其中提及的化合物的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；或(iii)其中提及的化合物的对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体的药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药”相同的含义。
4.3.2干细胞动员化合物
在一个实施方案中，干细胞动员化合物为芳基烃受体抑制剂，例如芳基烃受体拮抗剂。
在另一个实施方案中，干细胞动员化合物为5,6-稠合杂芳基化合物，包括但不限于美国专利申请公开号2010/0183564、2014/0023626和2014/0114070中描述的那些，它们中每一种的公开内容以全文引用方式并入本文。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式I的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中：
G1为N和CR3；
G2、G3和G4各自独立地为CH和N；条件是G3和G4中的至少之一为N，并且G1和G2中的至少之一不为N；
L1为–NR1a–、–NR1a(CH2)1-3–、–NR1aCH(C(O)OCH3)CH2–、–NR1a(CH2)2NR1c–、–NR1a(CH2)2S–、–NR1aCH2CH(CH3)CH2–、–NR1aCH2CH(OH)–或–NR1aCH(CH3)CH2–；
R1为(i)氢；或(ii)苯基、呋喃基、吡咯基、咪唑基、吡唑基、噻吩基、噻唑基、吡啶基、嘧啶基、吡咯烷基、吡嗪基、哒嗪基、苯并咪唑基、异喹啉基、咪唑并吡啶基或苯并噻吩基，其各自任选被一个、两个或三个取代基所取代，其中每一个取代基独立地为C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷基、C1-4卤代烷氧基、羟基、氨基、–C(O)R1a、–C(O)OR1a、–C(O)NR1aR1b、–SR1a、–S(O)R1a或–S(O)2R1a；
R2为(i)–NR1aC(O)R1c、–NR1cC(O)NR1aR1b或–S(O)2NR1aR1b；或者(ii)苯基、吡咯并吡啶-3-基、吲哚基、噻吩基、吡啶基、1,2,4-***基、2-氧代咪唑烷基、吡唑基、2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑基或吲唑基，其每一种任选被一个、两个或三个取代基所取代，其中每一个取代基独立地为羟基、卤代、甲基、甲氧基、氨基、–O(CH2)1-3NR1aR1b、–OS(O)2NR1aR1b、–NR1aS(O)2R1b或–S(O)2NR1aR1b；
R3为氢、C1-4烷基或联苯基；条件是R1和R3中的至少之一不为氢；
R4为C1-10烷基、丙-1-烯-2-基、环己基、环丙基、2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙基、氧杂环丁烷-3-基、二苯甲基、四氢-2H-吡喃-3-基、四氢-2H-吡喃-4-基、苯基、四氢呋喃-3-基、苄基、(4-戊基苯基)(苯基)甲基或1-(1-(2-氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-***-4-基)乙基，其每一种任选被一个、两个或三个取代基所取代，其中每一个取代基独立地为羟基、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；和
每一个R1a、R1b和R1c独立地为氢或C1-4烷基；或者R1a和R1b与它们所连接的N原子一起形成杂环基。
在一个实施方案中，在式I中，G1为CR3，在一个实施方案中，为CH；G2、G3和G4各为N；且R1、R2、R3、R4和L1各如本文所定义。
在另一个实施方案中，在式I中，G1、G3和G4各为N；G2为CH；R1、R2、R4和L1各如本文所定义。
在又一个实施方案中，在式I中，G1为CR3，在一个实施方案中为CH；G2和G3各为N；G4为CH；且R1、R2、R3、R4和L1各如本文所定义。
在又一个实施方案中，在式I中，G1为CR3，在一个实施方案中为CH；G2和G4各为N；G3为CH；且R1、R2、R3、R4和L1各如本文所定义。
在又一个实施方案中，在式I中，G1为CR3，在一个实施方案中为CH；G2为CH；G3和G4各为N；且R1、R2、R3、R4和L1各如本文所定义。
在再一个实施方案中，在式I中，
G1为CH；
G2、G3和G4各为N；
R1为苯并噻吩基，任选被一个、两个或三个取代基所取代，其每一种独立地为氰基、卤代、C1-4烷基、C1-4烷氧基、C1-4卤代烷基、C1-4卤代烷氧基、羟基、氨基、–C(O)R1a、–C(O)OR1a、–C(O)NR1aR1b、–SR1a、–S(O)R1a或–S(O)2R1a；
R2为苯基，任选被一个、两个或三个取代基所取代，其每一种独立地为羟基、卤代、甲基、甲氧基、氨基、–O(CH2)1-3NR1aR1b、–OS(O)2NR1aR1b、–NR1aS(O)2R1b或–S(O)2NR1aR1b；
R4为C1-10烷基，任选被一个、两个或三个取代基所取代，其每一种独立地为羟基、C1-4烷基或C1-4卤代烷基；
L1为–NR1a(CH2)2–；和
R1a和R1b各如本文所定义。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式II的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中R2和R4各如本文所定义。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式III的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中R2和R4各如本文所定义；R5a、R5b和R5c各自独立地为氢、氰基、甲基、卤代、三氟甲基或–SO2CH3。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚。在某些实施方案中，干细胞动员化合物为StemRegenin-1(SR-1)，其具有结构：
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为1-甲基-N-(2-甲基-4-(2-(2-甲基苯基)二氮烯基)苯基)-1H-吡唑-5-甲酰胺。在某些实施方案中，干细胞动员化合物为CH223191，其具有结构：
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为嘧啶并(4,5-b)吲哚。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式IV的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中：
Z为氰基、C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、苄基、杂芳基、杂环基、–L–C6-14芳基、–L–杂芳基、–L–杂环基、–C(O)R1a、–C(O)OR1a、–C(O)NHR1a、–C(O)N(R1a)R1b、–P(O)(OR1a)(OR1c)、–SR1a、–S(O)R1a、–S(O)2R1a、–S(O)2NH2、–S(O)2NHR1a或–S(O)2N(R1a)R1b；
W为氢、卤代、氰基、C6-14芳基、苄基、杂芳基、杂环基、–L–C6-14芳基、–L–杂芳基、–L–杂环基、–L–OH、–L–OR1a、–L–NH2、–L–NHR1a、–L–N(R1a)R1b、–L–SR1a、–L–S(O)R1a、–L–S(O)2R1a、–L–P(O)(OR1a)(OR1c)、–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基、–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基、–L–(N(R1c)–L)n–杂环基、–O–L–N(R1a)R1b、–O–L–C6-14芳基、–O–L–杂芳基、–O–L–杂环基、–O–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–O–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基、–O–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基、–O–L–(N(R1c)–L)n–杂环基、–S–L–N(R1a)R1b、–S–L–C6-14芳基、–S–L–杂芳基、–S–L–杂环基、–S–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–S–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基、–S–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基、–S–L–(N(R1c)–L)n–杂环基、–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基、–(N(R1c)–L)n–杂芳基、–(N(R1c)–L)n–杂环基、–C(O)R1a、–C(O)OR1a、–C(O)NH2、–C(O)NHR1a、–C(O)N(R1a)R1b、–NHR1a、–N(R1a)R1b、–NHC(O)R1a、–NR1aC(O)R1c、–NHC(O)OR1a、–NR1aC(O)OR1c、–NHC(O)NH2、–NHC(O)NHR1a、–NHC(O)N(R1a)R1b、–NR1aC(O)NH2、–NR1cC(O)NHR1a、–NR1cC(O)N(R1a)R1b、–NHS(O)2R1a、–NR1cS(O)2R1a、–OR1a、–OC(O)R1a、–OC(O)OR1a、–OC(O)NH2、–OC(O)NHR1a、–OC(O)N(R1a)R1b、–OS(O)2R1a、–P(O)(OR1a)(OR1c)、–SR1a、–S(O)R1a、–S(O)2R1a、–S(O)2NH2、–S(O)2NHR1a、–S(O)2N(R1a)R1b或–S(O)2OR1a；
每一个L独立地为C1-6亚烷基、C2-6亚烯基、C2-6亚炔基、C3-7亚环烷基、C6-14亚芳基、亚杂芳基、亚杂环基、C1-6亚烷基-C3-7亚环烷基或C1-6亚烷基-亚杂环基；
R6为氢、C1-6烷基、C6-14芳基、苄基、杂芳基、–C(O)R1a、–SR1a、–S(O)R1a、–S(O)2R1a、–L–C6-14芳基、–L–杂芳基或–L–杂环基；
每一个n独立地为整数1、2、3、4或5；和
每一个R1a、R1b和R1c独立地为(i)氢；(ii)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基；或(iii)R1a和R1b与它们所连接的N原子一起形成杂环基；
其中每一个烷基、亚烷基、烯基、亚烯基、炔基、亚炔基、环烷基、亚环烷基、芳基、苄基、亚芳基、杂芳基、亚杂芳基、杂环基和亚杂环基任选被一个或多个、在一个实施方案中被一个、两个、三个或四个取代基Q所取代，其中每一个取代基Q独立地选自(a)氧代、氰基、卤代和硝基；(b)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基和杂环基，其每一种还任选被一个或多个、在一个实施方案中被一个、两个、三个或四个取代基Qa所取代；和(c)–C(O)Ra、–C(O)ORa、–C(O)NRbRc、–C(NRa)NRbRc、–ORa、–OC(O)Ra、–OC(O)ORa、–OC(O)NRbRc、–OC(＝NRa)NRbRc、–OS(O)Ra、–OS(O)2Ra、–OS(O)NRbRc、–OS(O)2NRbRc、–NRbRc、–NRaC(O)Rd、–NRaC(O)ORd、–NRaC(O)NRbRc、–NRaC(＝NRd)NRbRc、–NRaS(O)Rd、–NRaS(O)2Rd、–NRaS(O)NRbRc、–NRaS(O)2NRbRc、–SRa、–S(O)Ra、–S(O)2Ra、–S(O)NRbRc和–S(O)2NRbRc，其中每一个Ra、Rb、Rc和Rd独立地为(i)氢；(ii)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基，其每一种还任选被一个或多个、在一个实施方案中被一个、两个、三个或四个取代基Qa所取代；和(iii)Rb和Rc与它们所连接的N原子一起形成杂环基，其还任选被一个或多个、在一个实施方案中被一个、两个、三个或四个取代基Qa所取代；
其中每一个Qa独立地选自(a)氧代、氰基、卤代和硝基；(b)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基和杂环基；和(c)–C(O)Re、–C(O)ORe、–C(O)NRfRg、–C(NRe)NRfRg、–ORe、–OC(O)Re、–OC(O)ORe、–OC(O)NRfRg、–OC(＝NRe)NRfRg、–OS(O)Re、–OS(O)2Re、–OS(O)NRfRg、–OS(O)2NRfRg、–NRfRg、–NReC(O)Rh、–NReC(O)ORh、–NReC(O)NRfRg、–NReC(＝NRh)NRfRg、–NReS(O)Rh、–NReS(O)2Rh、–NReS(O)NRfRg、–NReS(O)2NRfRg、–SRe、–S(O)Re、–S(O)2Re、–S(O)NRfRg和–S(O)2NRfRg；其中每一个Re、Rf、Rg和Rh独立地为(i)氢；(ii)C1-6烷基、C2-6烯基、C2-6炔基、C3-10环烷基、C6-14芳基、C7-15芳烷基、杂芳基或杂环基；或(iii)Rf和Rg与它们所连接的N原子一起形成杂环基。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式V的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中R6、W和Z各如本文所定义。
在一个实施方案中，在式IV或V中，
Z为氰基、杂芳基或–C(O)OR1a；
W为杂环基、–L–杂环基、–O–L–杂环基、–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–(N(R1c)–L)n–杂环基、–NHR1a或–N(R1a)R1b；
每一个L独立地为C1-6亚烷基或C3-7亚环烷基；
R6为氢、C1-6烷基、苄基、–C(O)R1a、–L–C6-14芳基或–L–杂芳基；
每一个n独立地为整数1；和
R1a、R1b和R1c各如本文所定义；
其中每一个烷基、亚烷基、亚环烷基、芳基、苄基、杂芳基和杂环基任选被一个或多个如本文所定义的取代基Q所取代。
在另一个实施方案中，在式IV或V中，
Z为氰基、5-元杂芳基或–C(O)O-C1-6烷基；
W为杂环基、–L–杂环基、–O–L–杂环基、–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–(N(R1c)–L)n–杂环基、–NHR1a或–N(R1a)R1b；
每一个L独立地为C1-6亚烷基或C3-7亚环烷基；
R6为氢、甲基、苄基、–L–C6-14芳基或–L–杂芳基；
每一个n独立地为整数1；和
R1a、R1b和R1c各如本文所定义；
其中每一个亚烷基、亚环烷基、芳基、苄基、杂芳基和杂环基任选被一个或多个如本文所定义的取代基Q所取代。
在一个实施方案中，在式IV或V中，W为-L-N(R1a)R1b、–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b、–O–L–N(R1a)R1b、-O-L-(N(R1c)-L)n-N(R1a)R1b、–S–L–N(R1a)R1b、–S–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b或–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b；R6、R1a、R1b、R1c、L和Z各如本文所定义。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为式VI的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中X为键、O、S或NR1c；R1a、R1c、R6、L和Z各如本文所定义。
在再一个实施方案中，干细胞动员化合物为式VII的化合物：
或其对映体、对映体的混合物、两种或更多种非对映体的混合物、或同位素变体；或者其药学上可接受的盐、溶剂化物、水合物或前药；其中R1a、R6、L、X和Z各如本文所定义。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为具有以下结构的化合物：
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为具有以下结构的化合物：
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物是白藜芦醇、四亚乙基五胺(TEPA)、α-萘黄酮、3'-甲氧基-4'-硝基黄酮、3,4-二甲氧基黄酮、4',5,7-三羟基黄酮(芹菜素)、6-甲基-1,3,8-三氯二苯并呋喃、表没食子儿茶素或表没食子儿茶素没食子酸酯。
在又一个实施方案中，干细胞动员化合物为白藜芦醇。在某些实施方案中，干细胞动员化合物为(Z)-白藜芦醇。在某些实施方案中，干细胞动员化合物为(E)-白藜芦醇。
在再一个实施方案中，干细胞动员化合物为四亚乙基五胺(TEPA)。
本文描述的所有化合物可商购获得或可按本文公开的专利或专利公开中描述的方法制备。此外，光学纯化合物可使用已知的拆分试剂或手性柱以及其他标准合成有机化学技术不对称地合成或拆分。关于干细胞动员化合物、其制备和用途的其他信息可见于例如美国专利申请公开号2010/0183564、2014/0023626和2014/0114070中；及Kim et al.,Mol.Pharmacol.,2006,69,1871-1878中；其每一种的公开内容以全文引用方式并入本文。
在本文提供的式例如式I至VII中，基团或变量G1、G2、G3、G4、R1、R2、R3、R4、R5a、R5b、R5c、R6、X、L、L1、X、W、Z和n在本文描述的实施方案中进一步定义。本文提供的这些基团和/或变量的实施方案的所有组合均在本公开的范围内。
在某些实施方案中，G1为N。在某些实施方案中，G1为CR3，其中R3为如本文所定义。在某些实施方案中，G1为CH。
在某些实施方案中，G2为N。在某些实施方案中，G2为CH。
在某些实施方案中，G3为N。在某些实施方案中，G3为CH。
在某些实施方案中，G4为N。在某些实施方案中，G4为CH。
在某些实施方案中，R1为氢。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的苯基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的呋喃基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的吡咯基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的咪唑基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的吡唑基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的噻吩基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的噻唑基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的吡啶基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的嘧啶基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的吡咯烷基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的吡嗪基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的哒嗪基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的苯并咪唑基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的异喹啉基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的咪唑并吡啶基。在某些实施方案中，R1为任选如本文所述被取代的苯并噻吩基。
在某些实施方案中，R2为–NR1aC(O)R1c，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，R2为–NR1cC(O)NR1aR1b，其中R1a、R1b和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，R2为–S(O)2NR1aR1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的苯基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的吡咯并吡啶-3-基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的吲哚基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的噻吩基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的吡啶基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的1,2,4-***基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的2-氧代咪唑烷基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的吡唑基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的2-氧代-2,3-二氢-1H-苯并咪唑基。在某些实施方案中，R2为任选如本文所述被取代的吲唑基。
在某些实施方案中，R3为氢。在某些实施方案中，R3为C1-4烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R3为联苯基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的C1-10烷基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的丙-1-烯-2-基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的环己基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的环丙基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的2-(2-氧代吡咯烷-1-基)乙基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的氧杂环丁烷-3-基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的二苯甲基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的四氢-2H-吡喃-3-基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的四氢-2H-吡喃-4-基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的苯基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的四氢呋喃-3-基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的苄基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的(4-戊基苯基)(苯基)甲基。在某些实施方案中，R4为任选如本文所述被取代的1-(1-(2-氧代-6,9,12-三氧杂-3-氮杂十四烷-14-基)-1H-1,2,3-***-4-基)乙基。
在某些实施方案中，L1为–NR1a–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1a(CH2)1-3–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1aCH(C(O)OCH3)CH2–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1a(CH2)2NR1c–，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1a(CH2)2S–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1aCH2CH(CH3)CH2–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1aCH2CH(OH)–，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，L1为–NR1aCH(CH3)CH2–，其中R1a为如本文所定义。
在某些实施方案中，R5a为氢。在某些实施方案中，R5a为氰基。在某些实施方案中，R5a为甲基。在某些实施方案中，R5a为卤代。在某些实施方案中，R5a为氟代、氯代或溴代。在某些实施方案中，R5a为三氟甲基。在某些实施方案中，R5a为–SO2CH3。
在某些实施方案中，R5b为氢。在某些实施方案中，R5b为氰基。在某些实施方案中，R5b为甲基。在某些实施方案中，R5b为卤代。在某些实施方案中，R5b为氟代、氯代或溴代。在某些实施方案中，R5b为三氟甲基。在某些实施方案中，R5b为–SO2CH3。
在某些实施方案中，R5c为氢。在某些实施方案中，R5c为氰基。在某些实施方案中，R5c为甲基。在某些实施方案中，R5c为卤代。在某些实施方案中，R5c为氟代、氯代或溴代。在某些实施方案中，R5c为三氟甲基。在某些实施方案中，R5c为–SO2CH3。
在某些实施方案中，L为C1-6亚烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为亚乙基、亚丙基或亚丁基，各任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C2-6亚烯基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C2-6亚炔基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C3-7亚环烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为亚环己基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C6-14亚芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为亚杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为亚杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C1-6亚烷基-C3-7亚环烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，L为C1-6亚烷基-亚杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
在某些实施方案中，R6为氢。在某些实施方案中，R6为C1-6烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R6为甲基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R6为C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R6为苄基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R6为杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，R6为–C(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–SR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–S(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–S(O)2R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–L–C6-14芳基，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–L–杂芳基，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，R6为–L–杂环基，其中L为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为氢。在某些实施方案中，W为卤代。在某些实施方案中，W为氰基。在某些实施方案中，W为C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，W为苄基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，W为杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，W为杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。
在某些实施方案中，W为–L–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–OH，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–OR1a，其中R1a和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–NH2，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–NHR1a，其中R1a和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–SR1a，其中R1a和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–S(O)R1a，其中R1a和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–S(O)2R1a，其中R1a和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–P(O)(OR1a)(OR1c)，其中R1a、R1c和L各为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b、R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–L–(N(R1c)–L)n–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–O–L–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–O–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b、R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–O–L–(N(R1c)–L)n–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–S–L–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b和L各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–S–L–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b、R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–(N(R1c)–L)n–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S–L–(N(R1c)–L)n–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–(N(R1c)–L)n–N(R1a)R1b，其中R1a、R1b、R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–(N(R1c)–L)n–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–(N(R1c)–L)n–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–(N(R1c)–L)n–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中R1c、L和n各为如本文所定义。
在某些实施方案中，W为–C(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–C(O)OR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–C(O)NH2。在某些实施方案中，W为–C(O)NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–C(O)N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHC(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1aC(O)R1c，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHC(O)OR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1aC(O)OR1c，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHC(O)NH2。在某些实施方案中，W为–NHC(O)NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHC(O)N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1aC(O)NH2，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1cC(O)NHR1a，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1cC(O)N(R1a)R1b，其中R1a、R1b和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NHS(O)2R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–NR1cS(O)2R1a，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OC(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OC(O)OR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OC(O)NH2。在某些实施方案中，W为–OC(O)NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OC(O)N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–OS(O)2R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–P(O)(OR1a)(OR1c)，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–SR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S(O)2R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S(O)2NH2。在某些实施方案中，W为–S(O)2NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S(O)2N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，W为–S(O)2OR1a，其中R1a为如本文所定义。
在某些实施方案中，Z为氰基。在某些实施方案中，Z为C1-6烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为C2-6烯基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为C2-6炔基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为C3-10环烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为C7-15芳烷基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为苄基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为5-元杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为四唑基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为1,2,4-噁二唑基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为–L–C6-14芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–L–杂芳基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–L–杂环基，任选被一个或多个如本文所述的取代基Q所取代，其中L为如本文所定义。
在某些实施方案中，Z为–C(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–C(O)OR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–C(O)OC1-6烷基，其中所述烷基任选被一个或多个如本文所定义的取代基Q所取代。在某些实施方案中，Z为–C(O)OCH3。在某些实施方案中，Z为–C(O)NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–C(O)N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–P(O)(OR1a)(OR1c)，其中R1a和R1c各为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–SR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–S(O)R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–S(O)2R1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–S(O)2NH2。在某些实施方案中，Z为–S(O)2NHR1a，其中R1a为如本文所定义。在某些实施方案中，Z为–S(O)2N(R1a)R1b，其中R1a和R1b各为如本文所定义。
在某些实施方案中，X为键。在某些实施方案中，X为O。在某些实施方案中，X为S。在某些实施方案中，X为NR1c，其中R1c为如本文所定义。
在某些实施方案中，n为1。在某些实施方案中，n为2。在某些实施方案中，n为3。在某些实施方案中，n为4。在某些实施方案中，n为5。
在某些实施方案中，本文提供的化合物显示出作为AHR拮抗剂的活性。
本文提供的化合物可以是对映体纯的，如单一对映体或单一非对映体，或者为立体异构体混合物，如对映体的混合物，例如，两种对映体的外消旋混合物；或两种或更多种非对映体的混合物。因此，本领域技术人员应认识到，对于在体内发生差向异构化的化合物，以其(R)形式给予化合物和以其(S)形式给予该化合物是等同的。用于制备/分离单个对映体的常规技术包括从合适的光学纯前体合成、从非手性起始材料不对称合成或拆分对映体混合物，例如，手性色谱、重结晶、拆分、非对映体盐形成或衍生成非对映体加合物并然后分开。
4.4 NK细胞的分离
分离自然杀伤细胞的方法是本领域已知的并可用来分离所述自然杀伤细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞。例如，在一个实施方案中，可通过用CD56和CD3的抗体对细胞染色并选择CD56+CD3–细胞来分离或富集NK细胞。可使用市售试剂盒例如NK细胞分离试剂盒(Miltenyi Biotec)来分离NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的细胞。也可通过移除包含NK细胞(例如用本文描述的三阶段方法产生的细胞)的细胞群体中NK细胞以外的细胞来分离或富集NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的细胞。例如，可通过使用例如CD3、CD4、CD14、CD19、CD20、CD36、CD66b、CD123、HLA DR和/或CD235a(血型糖蛋白A)中一种或多种的抗体耗尽显示非NK细胞标志物的细胞来分离或富集NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的细胞。可使用市售试剂盒例如NK细胞阴性分离试剂盒(Dynal Biotech)来进行阴性分离。通过这些方法分离的细胞可另外进行分选，以例如分离CD16+和CD16–细胞和/或CD94+和CD94–细胞。
细胞分离可通过例如流式细胞术、荧光激活细胞分选术(FACS)或，在一个实施方案中，使用与特异性抗体缀合的微珠进行磁性细胞分选来完成。可例如使用磁性激活细胞分选(MACS)技术来分离细胞，该技术是基于颗粒结合包含一种或多种特异性抗体(例如，抗-CD56抗体)的磁珠(例如，直径约0.5-100μm)的能力来分离它们的方法。磁性细胞分离可使用例如AUTOMACSTMSeparator(Miltenyi)进行和自动化。可对磁性微球进行各种有用的修饰，包括共价加合特异性识别特定细胞表面分子或半抗原的抗体。然后将珠子与细胞混合以允许结合。然后使细胞通过磁场以分离出具有特定细胞表面标志物的细胞。在一个实施方案中，然后可分离这些细胞并与偶联于抗另外的细胞表面标志物的抗体的磁珠重新混合。使细胞再次通过磁场，从而分离结合了两种抗体的细胞。然后可将这些细胞稀释到单独的平皿中，如用于克隆分离的微量滴定皿。
4.5胎盘灌洗液
NK细胞，例如，按本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，可自来自任何来源例如胎盘组织、胎盘灌洗液、脐带血、胎盘血、外周血、脾、肝等的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞产生。在某些实施方案中，造血干细胞为来自胎盘灌洗液和来自用来产生胎盘灌洗液的同一胎盘的脐带血的组合造血干细胞。包含胎盘灌洗液细胞的胎盘灌洗液可例如通过美国专利号7,045,148和7,468,276及美国专利申请公开号2009/0104164中公开的方法获得，它们的公开内容以全文引用方式并入本文。
4.5.1细胞收集组合物
可自其分离造血干细胞或祖细胞或者可例如与NK细胞(例如按本文提供的三阶段方法产生的NK细胞群体)组合用于具有肿瘤细胞、患癌或病毒感染的个体的肿瘤抑制或治疗中的胎盘灌洗液和灌洗液细胞可通过用胎盘细胞收集组合物灌洗哺乳动物例如人产后胎盘来收集。可通过用任何生理学上可接受的溶液例如盐水溶液、培养基或更复杂的细胞收集组合物灌洗胎盘来从胎盘收集灌洗液。适于灌洗胎盘以及适于灌洗液细胞的收集和保存的细胞收集组合物在相关的美国申请公开号2007/0190042中有详细描述，该申请以全文引用方式并入本文。
细胞收集组合物可包含适于干细胞的收集和/或培养的任何生理学上可接受的溶液，例如，盐水溶液(例如，磷酸盐缓冲盐水、Kreb溶液、改良Kreb溶液、Eagle溶液、0.9％NaCl等)、培养基(例如，DMEM，H.DMEM等)，等等。
细胞收集组合物可包含一种或多种倾向于保持胎盘细胞，即在从收集时间到培养时间内防止胎盘细胞死亡、或延迟胎盘细胞的死亡、减少死亡细胞群体中胎盘细胞的数量等的组分。这样的组分可例如为凋亡抑制剂(例如，半胱天冬酶抑制剂或JNK抑制剂)；血管扩张剂(例如，硫酸镁、抗高血压药、心房钠尿肽(ANP)、促肾上腺皮质激素、促肾上腺皮质激素释放激素、硝普钠、肼苯哒嗪、三磷酸腺苷、腺苷、吲哚美辛或硫酸镁、磷酸二酯酶抑制剂等)；坏死抑制剂(例如，2-(1H-吲哚-3-基)-3-戊基氨基-马来酰亚胺、吡咯烷二硫代氨基甲酸酯或氯硝西泮)；TNF-α抑制剂；和/或携氧全氟化碳(例如，全氟辛基溴、全氟癸基溴等)。
细胞收集组合物可包含一种或多种组织降解酶，例如，金属蛋白酶、丝氨酸蛋白酶、中性蛋白酶、透明质酸酶、RNase或Dnase，等。这样的酶可包括但不限于胶原酶(例如，胶原酶I、II、III或IV，来自溶组织梭状芽孢杆菌的胶原酶等)、分散酶、嗜热菌蛋白酶、弹性蛋白酶、胰蛋白酶、释放酶、透明质酸酶等。
细胞细胞收集组合物可包含杀菌或抑菌有效量的抗生素。在某些非限制性实施方案中，抗生素为大环内酯(例如，妥布霉素)、头孢菌素(例如，头孢氨苄、头孢拉定、头孢呋辛、头孢丙烯、头孢克洛、头孢克肟或头孢羟氨苄)、克拉霉素、红霉素、青霉素(例如，青霉素V)或喹诺酮(例如，氧氟沙星、环丙沙星或诺氟沙星)、四环素、链霉素等。在一个特别的实施方案中，抗生素对革兰氏阳性和/或革兰氏阴性细菌例如铜绿假单胞菌、金黄色葡萄球菌等具有活性。
细胞收集组合物还可包含以下化合物中的一种或多种：腺苷(约1mM至约50mM)；D-葡萄糖(约20mM至约100mM)；镁离子(约1mM至约50mM)；分子量大于20,000道尔顿的大分子，在一个实施方案中，以足以维持内皮完整性和细胞活力的量存在(例如，合成或天然存在的胶体、多糖如右旋糖酐或聚乙二醇，以约25g/l至约100g/l、或约40g/l至约60g/l存在)；抗氧化剂(例如，丁基化羟基茴香醚、丁基化羟基甲苯、谷胱甘肽、维生素C或维生素E，以约25μM至约100μM存在)；还原剂(例如，N-乙酰半胱氨酸，以约0.1mM至约5mM存在)；防止钙进入细胞的药剂(例如，维拉帕米，以约2μM至约25μM存在)；***油(例如，约0.05g/L至约0.2g/L)；抗凝血剂，在一个实施方案中，以足以帮助防止残留血凝结的量存在(例如，肝素或水蛭素，以约1000单位/升至约100,000单位/升的浓度存在)；或含阿米洛利的化合物(例如，阿米洛利、乙基异丙基阿米洛利、六亚甲基阿米洛利、二甲基阿米洛利或异丁基阿米洛利，以约1.0μM至约5μM存在)。
4.5.2胎盘的收集和处理
通常，人胎盘在其娩出后不久就被回收。在一个实施方案中，在经患者知情同意后并且在记录患者的完整病史且与胎盘关联后从患者回收胎盘。在一个实施方案中，分娩后继续记录病史。
在回收灌洗液之前，除去脐带血和胎盘血。在某些实施方案中，在分娩后回收胎盘中的脐带血。可对胎盘进行常规的脐带血回收过程。通常，使用针或套管在重力的帮助下对胎盘放血(参见例如Anderson的美国专利号5,372,581；Hessel等人的美国专利号5,415,665)。通常将针或套管放置在脐静脉中并可轻轻按摩胎盘以帮助从胎盘排出脐带血。这种脐带血回收可在商业上进行，例如，LifeBank Inc.,Cedar Knolls,N.J.,ViaCord,CordBlood Registry and CryoCell。在一个实施方案中，胎盘在没有进一步操作的情况下重力排空以最大限度地减少脐带血回收过程中的组织破坏。
通常，将胎盘从分娩室或产房运输到另一位置，例如实验室，以回收脐带血和收集灌洗液。胎盘可在无菌、隔热的运输装置中运输(保持胎盘的温度在20-28℃之间)，例如，将脐带近端夹紧的胎盘放置在无菌拉链锁塑料袋中，然后将其放置在隔热容器中。在另一个实施方案中，胎盘在脐带血收集试剂盒中运输，基本上如美国专利号7,147,626中所述。在一个实施方案中，胎盘在分娩后四至二十四小时内递送到实验室。在某些实施方案中，在回收脐带血之前将近端脐带夹紧，例如在***到胎盘盘中的***4-5cm(厘米)内。在其他实施方案中，在回收脐带血之后但在进一步处理胎盘之前将近端脐带夹紧。
在收集灌洗液之前，胎盘可在无菌条件下及室温或5至25℃(摄氏度)的温度下贮存。胎盘可贮存超过四十八小时的时间，或者在灌洗胎盘以除去任何残留的脐带血之前贮存四至二十四小时的时间。胎盘可在抗凝溶液中贮存于5℃至25℃(摄氏度)的温度下。合适的抗凝溶液是本领域熟知的。例如，可使用肝素或华法林钠的溶液。在一个实施方案中，抗凝溶液包含肝素的溶液(例如，1重量/重量％，在1:1000溶液中)。在一些实施方案中，在收集胎盘灌洗液之前，将放血的胎盘贮存不超过36小时。
4.5.3胎盘灌洗
灌洗哺乳动物胎盘和获得胎盘灌洗液的方法在例如Hariri的美国专利号7,045,148和7,255,879中及美国申请公开号2009/0104164、2007/0190042和20070275362(以美国专利号8,057,788授予)中有公开，它们的公开内容以全文引用方式并入本文。
灌洗液可通过使灌洗溶液例如上述盐水溶液、培养基或细胞收集组合物通过胎盘脉管***来获得。在一个实施方案中，通过使灌洗溶液通过脐动脉和脐静脉中任一或二者来灌洗哺乳动物胎盘。灌洗溶液流动通过胎盘可使用例如重力流动到胎盘中来完成。例如，使用泵(例如蠕动泵)迫使灌洗溶液通过胎盘。脐静脉可例如用套管(例如或塑料套管)插管，该套管连接到无菌连接装置，如无菌管道。无菌连接装置连接到灌洗歧管。
在准备灌洗时，可将胎盘以使得脐动脉和脐静脉位于胎盘的最高点处的方式定向。可通过使灌洗溶液通过胎盘脉管***或通过胎盘脉管***和周围组织来灌洗胎盘。在一个实施方案中，将脐动脉和脐静脉同时连接到移液管，所述移液管经由柔性连接器连接到灌洗溶液的贮存器。灌洗溶液进入脐静脉和动脉。灌洗溶液从血管壁渗出和/或穿过血管壁进入胎盘的周围组织中，并从妊娠期附着于母体子宫的胎盘表面收集在合适的开口容器中。灌洗溶液也可通过脐带开口引入并允许流出或渗出与母体子宫壁相接的胎盘壁中的开口。在另一个实施方案中，使灌洗溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或通过脐动脉并从脐静脉收集，即仅通过胎盘脉管***(胎儿组织)。
在一个实施方案中，例如，将脐动脉和脐静脉同时连接到例如移液管，所述移液管经由柔性连接器连接到灌洗溶液的贮存器。灌洗溶液进入脐静脉和动脉。灌洗溶液从血管壁渗出和/或穿过血管壁进入胎盘的周围组织中，并从妊娠期附着于母体子宫的胎盘表面收集在合适的开口容器中。灌洗溶液也可通过脐带开口引入并允许流出或渗出与母体子宫壁相接的胎盘壁中中开口。通过此方法(可称为“泛(pan)”方法)收集的胎盘细胞通常为胎儿和母体细胞的混合物。
在另一个实施方案中，使灌洗溶液通过脐静脉并从脐动脉收集，或通过脐动脉并从脐静脉收集。通过此方法(可称为“闭路”方法)收集的胎盘细胞通常几乎完全是胎儿的。
在一个实施方案中，闭路灌洗方法可如下进行。在生产后约48小时内获得产后胎盘。夹紧脐带并在夹具上方切割。该脐带可被弃去，或可经处理以回收例如脐带干细胞，和/或处理脐带膜以产生生物材料。羊膜在灌洗过程中可保留，或可与绒毛膜分离，例如，用手指钝性剥离。如果在灌洗之前将羊膜与绒毛膜分离，则可将其例如弃去或进行处理以例如通过酶消化获得干细胞，或产生例如羊膜生物材料，例如美国申请公开号2004/0048796中描述的生物材料。在例如使用无菌纱布从胎盘清除掉所有可见血凝块和残留血后，通过例如部分切割脐带膜以暴露脐带的横截面来暴露脐带血管。识别并打开血管，例如通过使闭合的鳄鱼夹前进通过每个血管的切割端。然后将装置例如连接到灌洗设备或蠕动泵的塑料管道***到每个胎盘动脉中。泵可以是适于该目的的任何泵，例如蠕动泵。然后将连接到无菌收集贮存器例如血袋如250mL收集袋的塑料管道***到胎盘静脉中。或者，将连接到泵的管道***到胎盘静脉中，并将连接到收集贮存器的管***到一个或两个胎盘动脉中。然后用一定体积的灌洗溶液例如约750ml灌洗溶液灌洗胎盘。然后收集灌洗液中的细胞，例如通过离心。
在一个实施方案中，近端脐带在灌洗期间被夹紧，更具体地，可在脐带***到胎盘盘中4-5cm(厘米)内处夹紧。
在放血过程中来自哺乳动物胎盘的第一批灌洗流体通常因脐带血和/或胎盘血的残留红细胞而有色。随着灌洗的进行及残留的脐带血细胞被洗出胎盘，灌洗流体变得越来越无色。通常，30至100mL灌洗流体就足以最初从胎盘冲洗血液，但可根据观察到的结果使用更多或更少的灌洗流体。
在某些实施方案中，在灌洗之前(例如，通过重力引流)从胎盘移除脐带血，但不用溶液冲洗(例如，灌洗)胎盘来移除残留血。在某些实施方案中，在灌洗之前从胎盘移除脐带血(例如，通过重力引流)，并使用溶液冲洗(例如，灌洗)胎盘来移除残留血。
用来灌洗胎盘的灌洗液体的体积可随要收集的胎盘细胞的数量、胎盘的大小、要从单个胎盘收集的批数等而异。在各种实施方案中，灌洗液体的体积可为50mL至5000mL、50mL至4000mL、50mL至3000mL、100mL至2000mL、250mL至2000mL、500mL至2000mL、或750mL至2000mL。通常，在放血后用700-800mL灌洗液体灌洗胎盘。
胎盘可在数小时或数天的过程中多次灌洗。在胎盘要多次灌洗的情况下，可在无菌条件下于容器或其他合适的容器中维持或培养它，并用细胞收集组合物或标准灌洗溶液(例如，生理盐水溶液，如磷酸盐缓冲盐水(“PBS”)，有或没有抗凝剂(例如，肝素、华法林钠、香豆素、双羟基香豆素)和/或有或没有抗微生物剂(例如，β-巯基乙醇(0.1mM)；抗生素如链霉素(例如，在40-100μg/ml下)、青霉素(例如，在40U/ml下)、两性霉素B(例如，在0.5μg/ml下))灌洗。在一个实施方案中，将分离的胎盘维持或培养一段时间而不收集灌洗液，使得在灌洗和收集灌洗液之前胎盘被维持或培养1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或者2或3天或更多天。可将经灌洗的胎盘维持一个或多个额外的时间，例如，1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24小时或更多小时，并用例如700-800mL灌洗流体二次灌洗。可将胎盘灌洗1、2、3、4、5次或更多次，例如，每1、2、3、4、5或6小时灌洗一次。在一个实施方案中，重复胎盘的灌洗和灌洗溶液例如胎盘细胞收集组合物的收集，直至回收的有核细胞的数量降至低于100个细胞/ml。不同时间点的灌洗液可单独地进一步处理以回收与时间有关的细胞群体，例如，总有核细胞。也可合并来自不同时间点的灌洗液。
4.5.4胎盘灌洗液和胎盘灌洗液细胞
通常，来自单个胎盘灌洗的胎盘灌洗液包含约1亿至约5亿个有核细胞，包括可通过本文公开的方法自其产生NK细胞(例如根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞)的造血细胞。在某些实施方案中，胎盘灌洗液或灌洗液细胞包含CD34+细胞，例如，造血干细胞或祖细胞。在一个更具体的实施方案中，这样的细胞包含CD34+CD45–干细胞或祖细胞、CD34+CD45+干细胞或祖细胞等。在某些实施方案中，在自其分离造血细胞之前，将灌洗液或灌洗液细胞冷冻保存。在某些其他实施方案中，胎盘灌洗液包含或者灌洗液细胞包含仅胎儿细胞或胎儿细胞与母体细胞的组合。
4.6 NK细胞
4.6.1通过三阶段方法产生的NK细胞
在另一个实施方案中，本文提供了一种分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞根据上文描述的三阶段方法产生。
在一个实施方案中，本文提供了一种通过本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体，其中所述NK细胞群体包含比通过本文描述的三阶段方法产生的NK祖细胞群体(例如通过相同的三阶段方法但不同在于用来产生NK祖细胞群体的第三培养步骤的持续时间短于用来产生NK细胞群体的第三培养步骤时产生的NK祖细胞群体)更大百分比的CD3–CD56+细胞。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞群体包含约70％或更多，在一些实施方案中，包含75％、80％、85％、90％、95％、98％或99％的CD3–CD56+细胞。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞群体包含不少于80％、85％、90％、95％、98％或99％的CD3–CD56+细胞。在另一个具体的实施方案中，所述NK细胞群体包含70％-75％、75％-80％、80％-85％、85％-90％、90％-95％或95％-99％的CD3–CD56+细胞。
在某些实施方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3–CD56+细胞包含另外为NKp46+的CD3–CD56+细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3–CD56+细胞包含另外为CD16-的CD3–CD56+细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3–CD56+细胞包含另外为CD16+的CD3–CD56+细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3–CD56+细胞包含另外为CD94-的CD3–CD56+细胞。在某些实施方案中，所述NK细胞群体中的所述CD3–CD56+细胞包含另外为CD94+的CD3–CD56+细胞。
在一个实施方案中，通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含为CD117+的细胞。在一个实施方案中，通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含为NKG2D+的细胞。在一个实施方案中，通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含为NKp44+的细胞。在一个实施方案中，通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体包含为CD244+的细胞。
4.7细胞的保存
使用本文描述的方法产生的细胞例如NK细胞，例如，使用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，或包含造血干细胞或祖细胞的胎盘灌洗液细胞，可被保存，即置于允许长期贮存的条件下或置于将抑制因例如凋亡或坏死而致细胞死亡的条件下。
胎盘灌洗液可通过使细胞收集组合物通过胎盘的至少一部分、例如通过胎盘脉管***来产生。细胞收集组合物包含一种或多种用来保存灌洗液中所含细胞的化合物。这样的胎盘细胞收集组合物可包含凋亡抑制剂、坏死抑制剂和/或携氧全氟化碳，如相关美国申请公开号20070190042中所述，其公开内容以全文引用方式并入本文。
在一个实施方案中，通过使灌洗液或细胞群体与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳的细胞收集组合物接近来从哺乳动物(例如人)产后胎盘收集灌洗液或胎盘细胞群体，其中所述凋亡抑制剂以与未与凋亡抑制剂接触或接近的细胞群体相比足以减少或防止胎盘细胞(例如贴壁胎盘细胞例如胎盘干细胞或胎盘专能细胞)的群体的凋亡的量和时间存在。例如，可用细胞收集组合物灌洗胎盘，并从中分离胎盘细胞，例如总有核胎盘细胞。在一个具体的实施方案中，凋亡抑制剂为半胱天冬酶抑制剂。在另一个具体的实施方案中，所述凋亡抑制剂为JNK抑制剂。在一个更具体的实施方案中，所述JNK抑制剂不调节贴壁胎盘细胞例如贴壁胎盘干细胞或贴壁胎盘专能细胞的分化或增殖。在另一个实施方案中，细胞收集组合物在分开的相中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方案中，细胞收集组合物在乳液中包含所述凋亡抑制剂和所述携氧全氟化碳。在另一个实施方案中，细胞收集组合物还包含乳化剂例如卵磷脂。在另一个实施方案中，在使胎盘细胞与细胞收集组合物接近时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在约0℃至约25℃之间。在另一个更具体的实施方案中，在使胎盘细胞与细胞收集组合物接近时，所述凋亡抑制剂和所述全氟化碳在约2℃至10℃之间、或约2℃至约5℃之间。在另一个更具体的实施方案中，所述接近在所述细胞群体的运输过程中进行。在另一个更具体的实施方案中，所述接近在所述细胞群体的冷冻和解冻过程中进行。
在另一个实施方案中，可通过使灌洗液和/或细胞与凋亡抑制剂和器官保存化合物接近来收集和保存胎盘灌洗液和/或胎盘细胞，其中所述凋亡抑制剂以与未与凋亡抑制剂接触或接近的灌洗液或胎盘细胞相比足以减少或防止细胞凋亡的量和时间存在。在一个具体的实施方案中，器官保存化合物为UW溶液(描述于美国专利号4,798,824中；也称VIASPANTM；也参见Southard等,Transplantation 49(2):251-257(1990))或Stern等的美国专利号5,552,267中描述的溶液，它们的公开内容以全文引用方式并入本文。在另一个实施方案中，所述器官保存组合物为羟乙基淀粉、乳糖酸、棉子糖或它们的组合。在另一个实施方案中，胎盘细胞收集组合物还在两相中或作为乳液包含携氧全氟化碳。
在所述方法的另一个实施方案中，在灌洗过程中使胎盘细胞与包含凋亡抑制剂和携氧全氟化碳、器官保存化合物或它们的组合的细胞收集组合物接近。在另一个实施方案中，在通过灌洗收集后使胎盘细胞与所述细胞收集化合物接近。
通常，在胎盘细胞收集、富集和分离期间，优选最小化或消除由于缺氧和机械应力引起的细胞应激。因此，在所述方法的另一个实施方案中，在所述保存期间，胎盘灌洗液或胎盘细胞群体在收集、富集或分离期间暴露于缺氧条件不到六小时，其中缺氧条件为氧浓度低于正常血氧浓度。在一个更具体的实施方案中，在所述保存期间，所述灌洗液或胎盘细胞群体暴露于所述缺氧条件不到两小时。在另一个更具体的实施方案中，在收集、富集或分离期间，所述胎盘细胞群体暴露于所述缺氧条件不到一小时或不到三十分钟，或不暴露于缺氧条件。在另一个具体的实施方案中，在收集、富集或分离期间，所述胎盘细胞群体不暴露于剪切应力。
细胞例如胎盘灌洗细胞、造血细胞例如CD34+造血干细胞、用本文描述的方法产生的NK细胞、本文提供的分离的贴壁胎盘细胞可在小容器例如安瓿或隔膜小瓶中冷冻保存于例如冷冻保存介质中。在某些实施方案中，本文提供的细胞以约1×104–5×108个细胞/mL的浓度冷冻保存。在具体的实施方案中，本文提供的细胞以约1×106–1.5×107个细胞/mL的浓度冷冻保存。在更具体的实施方案中，本文提供的细胞以约1×104、5×104、1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、1.5×107个细胞/mL的浓度冷冻保存。
合适的冷冻保存培养基包括但不限于生理盐水、培养基，包括例如生长培养基或细胞冷冻培养基，例如市售细胞冷冻培养基，例如C2695、C2639或C6039(Sigma)；CS2、CS5或CS10(BioLife Solutions)。在一个实施方案中，冷冻保存介质以例如约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10％(体积/体积)的浓度包含DMSO(二甲基亚砜)。冷冻保存介质可包含其他试剂，例如甲基纤维素、右旋糖酐、白蛋白(例如，人血清白蛋白)、海藻糖和/或甘油。在某些实施方案中，冷冻保存介质包含约1％-10％的DMSO、约25％-75％的右旋糖酐和/或约20-60％的人血清白蛋白(HSA)。在某些实施方案中，冷冻保存介质包含约1％-10％的DMSO、约25％-75％的海藻糖和/或约20-60％的人HSA。在一个具体的实施方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％的右旋糖酐和40％的HSA。在一个更具体的实施方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％的右旋糖酐(10重量/体积％，在生理盐水中)和40％的HSA。在另一个具体的实施方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％的海藻糖和40％的HSA。在一个更具体的实施方案中，冷冻保存介质包含5％的DMSO、55％的海藻糖(10重量/体积％，在生理盐水中)和40％的HSA。在另一个具体的实施方案中，冷冻保存培养基包含CS5。在另一个具体的实施方案中，冷冻保存培养基包含CS10。
本文提供的细胞可通过多种方法中的任何一种冷冻保存，并可在细胞培养、扩增或分化的任何阶段冷冻保存。例如，本文提供的细胞可在从原始组织或器官例如胎盘灌洗液或脐带血分离后立即冷冻保存，或在上述方法的第一、第二或第三步骤期间或之后冷冻保存。在某些实施方案中，造血细胞例如造血干细胞或祖细胞在从原始组织或器官分离后约1、5、10、15、20、30、45分钟内或约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时内冷冻保存。在某些实施方案中，所述细胞在从原始组织或器官分离后1、2或3天内冷冻保存。在某些实施方案中，所述细胞在如上所述于第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后冷冻保存。在一些实施方案中，所述细胞在如上所述于第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天并在如上所述于第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后冷冻保存。在一些实施方案中，当使用本文描述的三阶段方法制备NK细胞时，所述细胞在于第一培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天和/或在于第二培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25天和/或在于第三培养基中培养约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24或25后冷冻保存。在一个具体的实施方案中，使用本文描述的三阶段方法制备NK细胞，并且所述细胞在于第一培养基中培养10天后，在于第二培养基中培养4天后，和在于第三培养基中培养21天后冷冻保存。
在一个方面，本文提供了一种冷冻保存NK细胞例如通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞的群体的方法。在一个实施方案中，所述方法包括：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如CD34+干细胞或祖细胞，以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，随后在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+、和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，并且其中至少70％、或至少80％的自然杀伤细胞是存活的，接下来将NK细胞冷冻保存于冷冻保存介质中。在一个具体的实施方案中，所述冷冻保存步骤还包括(1)制备细胞悬液；(2)向来自步骤(1)的细胞悬液中加入冷冻保存介质以获得冷冻保存的细胞悬液；(3)冷却来自步骤(3)的冷冻保存的细胞悬液以获得冷冻保存的样品；和(4)贮存冷冻保存的样品于-80℃以下。在某些实施方案中，所述方法不包括中间步骤。
在冷冻保存期间，本文提供的细胞可在速率受控冷冻器中以例如约0.1、0.3、0.5、1或2℃/min冷却。在一个实施方案中，冷冻保存温度为约-80℃至约-180℃、或约-125℃至约-140℃。冷冻保存的细胞可在解冻以使用之前转移到液氮中。在一些实施方案中，例如，一旦安瓿达到约-90℃，即将它们转移到液氮贮存区。冷冻保存的细胞可在约25℃至约40℃的温度下解冻，更具体而言可解冻至约37℃的温度。在某些实施方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、4、6、10、12、18、20或24小时或者约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后解冻。在某些实施方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28个月后解冻。在某些实施方案中，冷冻保存的细胞在冷冻保存约1、2、3、4、5、6、7、8、9或10年后解冻。
合适的解冻介质包括但不限于生理盐水、包括例如生长培养基的勃脉力(plasmalyte)培养基，例如RPMI培养基。在某些实施方案中，解冻介质包含一种或多种培养基补充剂(例如，营养素、细胞因子和/或因子)。适于解冻本文提供的细胞的培养基补充剂包括例如但不限于血清如人血清AB、胎牛血清(FBS)或小牛血清(FCS)、维生素、人血清白蛋白(HSA)、牛血清白蛋白(BSA)、氨基酸(例如，L-谷氨酰胺)、脂肪酸(例如，油酸、亚油酸或棕榈酸)、胰岛素(例如，重组人胰岛素)、转铁蛋白(铁饱和的人转铁蛋白)、β-巯基乙醇、干细胞因子(SCF)、Fms样酪氨酸激酶3配体(Flt3-L)、细胞因子如白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-15(IL-15)、血小板生成素(Tpo)或肝素。在一个具体的实施方案中，可用于本文提供的方法中的解冻介质包含RPMI。在另一个具体的实施方案中，所述解冻介质包含勃脉力。在另一个具体的实施方案中，所述解冻介质包含约0.5-20％的FBS。在另一个具体的实施方案中，所述解冻介质包含约1、2、5、10、15或20％的FBS。在另一个具体的实施方案中，所述解冻介质包含约0.5％-20％的HSA。在另一个具体的实施方案中，所述解冻介质包含约1、2.5、5、10、15或20％的HSA。在一个更具体的实施方案中，所述解冻介质包含RPMI和约10％的FBS。在另一个更具体的实施方案中，所述解冻介质包含勃脉力和约5％的HSA。
可优化本文提供的冷冻保存方法以允许长期贮存或者贮存在将抑制因例如凋亡或坏死而致细胞死亡的条件下。在一个实施方案中，如通过例如自动细胞计数器或台盼蓝方法所测得，解冻后细胞包含大于60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、95％或98％的活细胞。在另一个实施方案中，解冻后细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或25％的死细胞。在另一个实施方案中，解冻后细胞包含约0.5、1、5、10、15、20或25％的早期凋亡细胞。在另一个实施方案中，例如如通过凋亡检测(例如，TO-PRO3或AnnV/PI A凋亡检测试剂盒)所测得，约0.5、1、5、10、15或20％的解冻后细胞在解冻后1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27或28天后经历凋亡。在某些实施方案中，解冻后细胞在使用本文提供的方法培养、扩增或分化后被再次冷冻保存。
4.8包含NK细胞的组合物
4.8.1使用三阶段方法产生的NK细胞
在一些实施方案中，本文提供了一种组合物，例如，药物组合物，其包含使用本文描述的三阶段方法产生的分离的NK细胞群体。在一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体自分离自胎盘灌洗液、脐带血和/或外周血的造血细胞例如造血干细胞或祖细胞产生。在另一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体占组合物中细胞的至少50％。在另一个具体的实施方案中，所述分离的NK细胞群体例如CD3–CD56+占组合物中细胞的至少80％、85％、90％、95％、98％或99％。在某些实施方案中，所述分离的NK细胞群体中不超过5％、10％、15％、20％、25％、30％、35％或40％的细胞为CD3–CD56+细胞。在某些实施方案中，所述CD3–CD56+细胞为CD16-。
在另一个具体的实施方案中，所述组合物中所述分离的NK细胞来自单个个体。在一个更具体的实施方案中，所述分离的NK细胞包含来自至少两个不同个体的NK细胞。在另一个具体的实施方案中，所述组合物中所述分离的NK细胞来自与预期用NK细胞治疗的个体不同的个体。在另一个具体的实施方案中，已使所述NK细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近，所述接触或接近的量和时间足以使所述NK细胞比未与所述免疫调节化合物或沙利度胺接触或接近的相同数量的自然杀伤细胞即NK细胞表达可检测地更多的颗粒酶B或穿孔素。在另一个具体的实施方案中，所述组合物还包含免疫调节化合物或沙利度胺。在某些实施方案中，免疫调节化合物为下文描述的化合物。参见例如美国专利号7,498,171，其公开内容以全文引用方式并入本文。在某些实施方案中，免疫调节化合物为氨基取代的异吲哚啉。在一个实施方案中，免疫调节化合物为3-(4-氨基-1-氧代-1,3-二氢异吲哚-2-基)-哌啶-2,6-二酮；3-(4'-氨基异吲哚啉-1'-酮)-1-哌啶-2,6-二酮；4-(氨基)-2-(2,6-二氧代(3-哌啶基))-异吲哚啉-1,3-二酮；或4-氨基-2-(2,6-二氧代哌啶-3-基)异吲哚-1,3-二酮。在另一个实施方案中，免疫调节化合物为泊马度胺或来那度胺。在另一个实施方案中，所述免疫调节化合物为具有以下结构的化合物
其中X和Y中之一为C＝O，X和Y中的另一为C＝O或CH2，R2为氢或低级烷基，或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体混合物。在另一个实施方案中，所述免疫调节化合物为具有以下结构的化合物
其中X和Y中之一为C＝O，另一为CH2或C＝O；
R1为H、(C1–C8)烷基、(C3–C7)环烷基、(C2–C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基–(C2-C5)杂芳基、C(O)R3、C(S)R3、C(O)OR4、(C1-C8)烷基–N(R6)2、(C1-C8)烷基–OR5、(C1-C8)烷基–C(O)OR5、C(O)NHR3、C(S)NHR3、C(O)NR3R3’、C(S)NR3R3’或(C1-C8)烷基–O(CO)R5；
R2为H、F、苄基、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基或(C2-C8)炔基；
R3和R3’独立地为(C1-C8)烷基、(C3-C7)环烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)杂环烷基、(C0-C4)烷基–(C2-C5)杂芳基、(C0-C8)烷基–N(R6)2、(C1-C8)烷基–OR5、(C1-C8)烷基–C(O)OR5、(C1-C8)烷基–O(CO)R5或C(O)OR5；
R4为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、(C1-C4)烷基–OR5、苄基、芳基、(C0-C4)烷基–(C1-C6)杂环烷基或(C0-C4)烷基–(C2-C5)杂芳基；
R5为(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基或(C2-C5)杂芳基；
每一次出现的R6独立地为H、(C1-C8)烷基、(C2-C8)烯基、(C2-C8)炔基、苄基、芳基、(C2-C5)杂芳基或(C0-C8)烷基–C(O)O–R5，或者R6基团可连接形成杂环烷基基团；
n为0或1；和
*表示手性碳中心；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物。在另一个实施方案中，所述免疫调节化合物为具有以下结构的化合物
其中：
X和Y中之一为C＝O，另一为CH2或C＝O；
R为H或CH2OCOR'；
(i)R1、R2、R3或R4中的每一种彼此独立地为卤代、1至4个碳原子的烷基或1至4个碳原子的烷氧基或者(ii)R1、R2、R3或R4中之一为硝基或NHR5并且R1、R2、R3或R4中的余者为氢；
R5为氢或1至8个碳的烷基；
R6为氢、1至8个碳原子的烷基、苯并、氯代或氟代；
R’为R7-CHR10-N(R8R9)；
R7为间-亚苯基或对-亚苯基或-(CnH2n)-，其中n具有0至4的值；
R8和R9中的每一种彼此独立地为氢或1至8个碳原子的烷基，或者R8和R9合在一起为四亚甲基、五亚甲基、六亚甲基或-CH2CH2X1CH2CH2–，其中X1为-O-、-S-或-NH-；
R10为氢、1至8个碳原子的烷基或苯基；和
*表示手性碳中心；
或者其药学上可接受的盐、水合物、溶剂化物、包合物、对映体、非对映体、外消旋体或立体异构体的混合物。
在另一个具体的实施方案中，组合物还包含一种或多种抗癌化合物，例如一种或多种下文描述的抗癌化合物。
在一个更具体的实施方案中，组合物包含来自另一来源或通过另一方法制得的NK细胞。在一个具体的实施方案中，所述其他来源为胎盘血和/或脐带血。在另一个具体的实施方案中，所述其他来源为外周血。在更具体的实施方案中，将所述组合物中的NK细胞群体与来自另一来源的或通过另一方法制得的NK细胞以约100:1、95:5、90:10、85:15、80:20、75:25、70:30、65:35、60:40、55:45、50:50、45:55、40:60、35:65、30:70、25:75、20:80、15:85、10:90、5:95、100:1、95:1、90:1、85:1、80:1、75:1、70:1、65:1、60:1、55:1、50:1、45:1、40:1、35:1、30:1、25:1、20:1、15:1、10:1、5:1、1:1、1:5、1:10、1:15、1:20、1:25、1:30、1:35、1:40、1:45、1:50、1:55、1:60、1:65、1:70、1:75、1:80、1:85、1:90、1:95、1:100等的比率组合。
在另一个具体的实施方案中，组合物包含用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体和分离的胎盘灌洗液或分离的胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液来自与所述NK细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液包含来自与所述NK细胞群体不同的个体的胎盘灌洗液。在另一个具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液中所有或基本上所有(例如，大于90％、95％、98％或99％)的细胞为胎儿细胞。在另一个具体的实施方案中，胎盘灌洗液或胎盘灌洗液细胞包含胎儿和母体细胞。在一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液中的胎儿细胞占所述灌洗液中细胞的不到约90％、80％、70％、60％或50％。在另一个具体的实施方案中，所述灌洗液通过使0.9％的NaCl溶液通过胎盘脉管***获得。在另一个具体的实施方案中，所述灌洗液包含培养基。在另一个具体的实施方案中，所述灌洗液已经处理以除去红细胞。在另一个具体的实施方案中，所述组合物包含免疫调节化合物，例如下文描述的免疫调节化合物，例如氨基取代的异吲哚啉化合物。在另一个具体的实施方案中，组合物还包含一种或多种抗癌化合物，例如一种或多种下文描述的抗癌化合物。
在另一个具体的实施方案中，组合物包含NK细胞群体和胎盘灌洗液细胞。在一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞来自与所述NK细胞群体相同的个体。在另一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液细胞来自与所述NK细胞群体不同的个体。在另一个具体的实施方案中，组合物包含分离的胎盘灌洗液和分离的胎盘灌洗液细胞，其中所述分离的灌洗液和所述分离的胎盘灌洗液细胞来自不同的个体。在包含胎盘灌洗液的任何上述实施方案的另一个更具体的实施方案中，所述胎盘灌洗液包含来自至少两个个体的胎盘灌洗液。在包含胎盘灌洗液细胞的任何上述实施方案的另一个更具体的实施方案中，所述分离的胎盘灌洗液细胞来自至少两个个体。在另一个具体的实施方案中，所述组合物包含免疫调节化合物。在另一个具体的实施方案中，组合物还包含一种或多种抗癌化合物，例如一种或多种下文描述的抗癌化合物。
4.9使用三阶段方法产生的NK细胞的用途
本文提供的使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞，可用在治疗患有急性髓性白血病的个体例如具有急性髓性白血病细胞的个体的方法中。在一些此类实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞的有效剂量范围为1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至5×106、5×106至1×107或更多个细胞/千克体重。在更具体的实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞的有效剂量范围为1×106至30×106。用本文描述的方法产生的NK细胞也可用在抑制肿瘤细胞的增殖的方法中。
本文提供的用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞，可用在治疗患有多发性骨髓瘤的个体例如具有多发性骨髓瘤细胞的个体的方法中。在一些此类实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞的有效剂量范围为1×104至5×104、5×104至1×105、1×105至5×105、5×105至1×106、1×106至5×106、5×106至1×107或更多个细胞/千克体重。在更具体的实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞的有效剂量范围为1×106至30×106。用本文描述的方法产生的NK细胞也可用在抑制肿瘤细胞的增殖的方法中。
4.9.1患有癌症的个体的治疗
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体。在某些实施方案中，所述个体具有自然杀伤细胞的缺陷，例如，缺乏对急性髓性白血病具有活性的NK细胞。在某些实施方案中，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，其还包括给予所述个体治疗有效量的IL-2。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
在一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体。在某些实施方案中，所述个体具有自然杀伤细胞的缺陷，例如，缺乏对多发性骨髓瘤具有活性的NK细胞。在某些实施方案中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括给予所述个体治疗有效量的用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，其还包括给予所述个体治疗有效量的IL-2。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。在某些实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受化疗。在具体的实施方案中，化疗为烷化剂。在更具体的实施方案中，烷化剂为美法仑。在某些实施方案中，美法仑根据标签给予。
在一个实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物的给予是全身性的。在具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过输注给予受试者。在更具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过静脉内(IV)输注给予受试者。在某些实施方案中，IL-2通过皮下注射给予受试者。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
在某些实施方案中，患有急性髓性白血病的个体为在所述给予前已接受骨髓移植的个体。在某些实施方案中，骨髓移植是在所述急性髓性白血病的治疗中。在某些其他实施方案中，骨髓移植是在所述癌症以外的病症的治疗中。在某些实施方案中，除所述骨髓移植外，个体还接受了免疫抑制剂。在某些实施方案中，已进行骨髓移植的个体在所述给予时表现出移植物抗宿主病(GVHD)的一种或多种症状。在某些其他实施方案中，在GVHD的症状出现之前向已进行骨髓移植的个体给予所述细胞。
在某些实施方案中，患有多发性骨髓瘤的个体为在所述给予前已接受骨髓移植的个体。在某些实施方案中，骨髓移植是在所述多发性骨髓瘤的治疗中。在某些其他实施方案中，骨髓移植是在所述癌症以外的病症的治疗中。在某些实施方案中，除所述骨髓移植外，个体还接受了免疫抑制剂。在某些实施方案中，已进行骨髓移植的个体在所述给予时表现出移植物抗宿主病(GVHD)的一种或多种症状。在某些其他实施方案中，在GVHD的症状出现之前向已进行骨髓移植的个体给予所述细胞。在某些实施方案中，所述患有多发性骨髓瘤的个体为在所述给予之前已接受自体干细胞移植的个体。在某些实施方案中，自体干细胞移植是在所述多发性骨髓瘤的治疗中。在某些实施方案中，自体干细胞移植中的干细胞为外周血单核细胞。自体干细胞移植使用从患者采集、贮存并冷冻以备后用的干细胞来进行。在某些实施方案中，从患者的外周血采集自体干细胞，冷冻、贮存并在用化疗和/或放射处理后重新引入到患者体内。
在某些具体的实施方案中，患有急性髓性白血病或多发性骨髓瘤的个体在所述给予之前已接受至少一个剂量的TNFα抑制剂，例如，(Enbrel)。在具体的实施方案中，所述个体在诊断所述急性髓性白血病的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内接受所述剂量的TNFα抑制剂。在具体的实施方案中，在接受所述剂量的TNFα抑制剂的1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月内向接受所述剂量的TNFα抑制剂的所述个体给予用本文提供的三阶段方法产生的NK细胞。在一个具体的实施方案中，已接受一定剂量TNFα抑制剂并表现出急性髓性白血病的个体还表现出血细胞中5号染色体长臂的缺失。在另一个实施方案中，患有急性髓性白血病的个体表现出费城染色体。
在某些其他实施方案中，所述个体中的急性髓性白血病或多发性骨髓瘤是一种或多种抗癌药物难治的。在一个具体的实施方案中，急性髓性白血病或多发性骨髓瘤是(甲磺酸伊马替尼)难治的。
在某些实施方案中，所述个体中的急性髓性白血病对至少一种抗癌药物有响应；在此实施方案中，胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞例如胎盘自然杀伤细胞例如源自胎盘的中间体自然杀伤细胞、分离的组合自然杀伤细胞、或本文描述的NK细胞、和/或它们的组合及任选地IL-2作为辅助治疗或作为与所述抗癌药物的联合疗法添加。在某些其他实施方案中，患有急性髓性白血病的个体已经用至少一种抗癌药物治疗并且在所述给予前已复发。在某些实施方案中，待治疗的个体患有难治性急性髓性白血病。在某些实施方案中，待治疗的个体患有继发性急性髓性白血病。在具体的实施方案中，继发性髓性白血病是治疗相关的。在具体的实施方案中，继发性急性髓性白血病由骨髓增生异常综合征转化导致。在某些实施方案中，待治疗的个体在移植后大于两个月有急性髓性白血病复发。在一个实施方案中，使用本文所述细胞的急性髓性白血病治疗方法可防止(例如，预防或延迟)急性髓性白血病的复发。在一个实施方案中，本文所述的急性髓性白血病治疗方法使得急性髓性白血病缓解1个月或更长时间，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长时间，1年或更长时间，2年或更长时间，3年或更长时间，或者4年或更长时间。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其包括给予所述个体NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的急性髓性白血病有效。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞为脐带血NK细胞或自脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施方案中，所述NK细胞通过本文描述用于产生NK细胞的三阶段方法产生。在治疗患有急性髓性白血病的个体的方法的某些具体实施方案中，所述NK细胞通过如本文描述的三阶段方法产生。在一个特别的实施方案中，待通过前述方法治疗的急性髓性白血病包括难治性急性髓性白血病、预后不良的急性髓性白血病或儿童期急性髓性白血病。本领域已知的用于给予NK细胞来治疗难治性急性髓性白血病、预后不良的急性髓性白血病或儿童期急性髓性白血病的方法可适用于此目的；参见例如Miller等,2005,Blood 105:3051-3057；Rubnitz等,2010,J Clin Oncol.28:955-959，其各自以全文引用方式并入本文。在某些实施方案中，所述个体患有急性髓性白血病，至少一种针对急性髓性白血病的非自然杀伤细胞疗法已对其失败。在具体的实施方案中，所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一次缓解期。在具体的实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或二者进行调理。
在治疗患有急性髓性白血病的个体的方法的其他具体实施方案中，所述NK细胞通过包括以下步骤的方法产生：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+干细胞或祖细胞，以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，随后在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+、和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，并且其中至少70％、或至少80％的自然杀伤细胞是存活的。
在某些实施方案中，所述个体中的多发性骨髓瘤对至少一种抗癌药物有响应；在此实施方案中，胎盘灌洗液、分离的胎盘灌洗液细胞、分离的自然杀伤细胞例如胎盘自然杀伤细胞例如源自胎盘的中间体自然杀伤细胞、分离的组合自然杀伤细胞、或本文描述的NK细胞、和/或它们的组合及任选地IL-2作为辅助治疗或作为与所述抗癌药物的联合疗法添加。在某些其他实施方案中，患有多发性骨髓瘤的个体已经用至少一种抗癌药物治疗并且在所述给予前已复发。在某些实施方案中，待治疗的个体患有难治性多发性骨髓瘤。在某些实施方案中，待治疗的个体患有继发性多发性骨髓瘤。在具体的实施方案中，继发性多发性骨髓瘤是治疗相关的。在具体的实施方案中，继发性多发性骨髓瘤由骨髓增生异常综合征转化导致。在某些实施方案中，待治疗的个体在移植后大于两个月有多发性骨髓瘤复发。在一个实施方案中，使用本文所述细胞的多发性骨髓瘤治疗方法可防止(例如，预防或延迟)多发性骨髓瘤的复发。在一个实施方案中，本文所述的多发性骨髓瘤治疗方法使得多发性骨髓瘤缓解1个月或更长时间，2、3、4、5、6、7、8、9、10、11或12个月或更长时间，1年或更长时间，2年或更长时间，3年或更长时间，或者4年或更长时间。
在另一个实施方案中，本文提供了一种治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其包括给予所述个体NK细胞，其中所述NK细胞对于治疗所述个体中的多发性骨髓瘤有效。在一个具体的实施方案中，所述NK细胞为脐带血NK细胞或自脐带血造血细胞例如造血干细胞产生的NK细胞。在另一个实施方案中，所述NK细胞通过本文描述的用于产生NK细胞的三阶段方法产生。在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的某些具体实施方案中，所述NK细胞通过如本文描述的三阶段方法产生。在具体的实施方案中，所述个体为成年人。在某些实施方案中，所述个体为65岁或更大年龄。在具体的实施方案中，所述个体处于第一次缓解期。在某些实施方案中，所述个体患有多发性骨髓瘤，至少一种针对多发性骨髓瘤的非自然杀伤细胞疗法已对其失败。在具体的实施方案中，所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一次缓解期。
在治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法的其他具体实施方案中，所述NK细胞通过包括以下步骤的方法产生：在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞，例如，CD34+干细胞或祖细胞，以产生第一细胞群体，随后在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体，随后在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体，其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+、和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞，并且其中至少70％、或至少80％的自然杀伤细胞是存活的。
4.9.2急性髓性白血病细胞和多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制
本文还提供了一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与急性髓性白血病细胞接近，例如，使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，其还包括使IL-2与NK细胞和/或急性髓性白血病细胞接近，例如，使NK细胞和/或急性髓性白血病细胞与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。
本文还提供了一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触。在某些实施方案中，本文提供了一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，其包括将使用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，与多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞接触，所述方法还包括使IL-2与NK细胞和/或多发性骨髓瘤细胞接近，例如，使NK细胞和/或多发性骨髓瘤与IL-2接触。在具体的实施方案中，IL-2为rhIL-2。在某些实施方案中，在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受化疗。在具体的实施方案中，化疗为烷化剂。在更具体的实施方案中，烷化剂为美法仑。在某些实施方案中，根据标签给予美法仑。在某些实施方案中，所述患有多发性骨髓瘤的个体为在所述给予之前已接受自体干细胞移植的个体。在某些实施方案中，自体干细胞移植是在所述多发性骨髓瘤的治疗中。在某些实施方案中，自体干细胞移植中的干细胞为外周血单核细胞。
如本文所用，在某些实施方案中，关于细胞的“接触”在一个实施方案中涵盖胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞例如根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体、和/或分离的组合自然杀伤细胞与急性髓性白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞之间的直接物理(例如细胞-细胞)接触。在另一个实施方案中，“接触”涵盖存在于同一物理空间中，例如将胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、自然杀伤细胞例如胎盘中间体自然杀伤细胞、本文描述的自然杀伤细胞例如根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体、和/或分离的组合自然杀伤细胞置于与急性髓性白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞的相同容器(例如，培养皿、多孔板)中。在另一个实施方案中，使胎盘灌洗液、胎盘灌洗液细胞、组合的自然杀伤细胞、胎盘中间体自然杀伤细胞、或本文描述的自然杀伤细胞例如根据本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体与急性髓性白血病细胞或多发性骨髓瘤细胞“接触”通过例如向个体，例如具有急性髓性白血病细胞的人例如癌症患者中注射或输注胎盘灌洗液或细胞例如胎盘灌洗液细胞、组合的自然杀伤细胞或自然杀伤细胞例如胎盘中间体自然杀伤细胞来实现。在免疫调节化合物和/或沙利度胺的情况下，“接触”指例如使细胞与免疫调节化合物和/或沙利度胺彼此直接物理接触，或置于同一物理体积(例如，细胞培养容器或个体)中。
如本文所用，“治疗有益的”和“治疗益处”包括但不限于例如肿瘤尺寸减小；肿瘤的扩增减轻或停止；减少或防止转移性疾病；每单位体积组织样品(例如血液样品)中的癌细胞数量的减少；所述个体所患特定癌症或肿瘤的任何症状的临床改善；个体所患特定癌症的任何症状的恶化的减轻或停止等。
4.9.3使用NK细胞和IL-2治疗急性髓性白血病或多发性骨髓瘤细胞
使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，对患有急性髓性白血病的个体的治疗可以是包括IL-2的给予的抗癌治疗方案的部分。使用用本文描述的方法产生的NK细胞，例如，用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，对患有多发性骨髓瘤的个体的治疗可以是包括IL-2的给予的抗癌治疗方案的部分。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在某些实施方案中，rhIL-2为阿地白介素(Novartis)。rhIL-2的氨基酸序列的一个非限制性实例由GenBank登录号NP_000577.2提供。在某些实施方案中，rhIL-2的氨基酸序列具有与GenBank登录号NP_000577.2的99％序列同一性。在某些实施方案中，IL-2与对乙酰氨基酚和/或苯海拉明组合给予。在某些实施方案中，NK细胞和任选的IL-2在调理方案后给予。例如，可例如在调理方案之后即刻或者一天、两天、三天或四天后给予NK细胞和给予任选的IL-2。在具体的实施方案中，调理方案包括给予一种或多种化疗，例如给予氟达拉滨和/或环磷酰胺。在更具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨和环磷酰胺的治疗。在甚至更具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用环磷酰胺治疗一、二、三或四天。
4.9.4给予
细胞(例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体)的数量的确定以及IL-2的量的确定可彼此独立地进行。
分离的NK细胞群体或其药物组合物的给予是全身性的。在具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过输注给予受试者。在具体的实施方案中，分离的NK细胞群体或其药物组合物通过静脉内(IV)输注给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物通过注射给予受试者。在具体的实施方案中，IL-2或其药物组合物通过皮下注射给予受试者。在某些实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞与一个或多个剂量的IL-2例如rhIL-2组合给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以6百万单位的剂量每隔一天给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，在给予NK细胞之前进行本文描述的调理方案，例如，包括给予氟达拉滨和/或环磷酰胺的调理方案。在某些实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞与一个或多个剂量的rhIL-2组合给予受试者，其中在给予NK细胞之前进行包括给予氟达拉滨和环磷酰胺的调理方案，并且其中在给予每一剂量的rhIL-2之前和之后给予对乙酰氨基酚和苯海拉明。
4.9.4.1细胞的给予
在某些实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，以将对个体带来可检测的治疗益处的任何量或数量(例如有效量)使用，例如给予个体，其中所述个体患有急性髓性白血病，例如急性髓性白血病患者。在其他实施方案中，所述个体患有多发性骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤患者。此类细胞可按照绝对细胞数量给予此类个体，例如，所述个体可被给予约、至少约或至多约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予约、至少约或至多约3×106、1×107、3×107、1×108、3×108或1×109个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予约、至少约或至多约1×106个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予约、至少约或至多约3×106个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予约、至少约或至多约10×106个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予约、至少约或至多约30×106个用本文描述的方法产生的NK细胞。在其他实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞可按照相对细胞数量给予此类个体，例如，所述个体可被给予每千克个体体重约、至少约或至多约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108、5×108、1×109、5×109、1×1010、5×1010或1×1011个用本文描述的方法产生的NK细胞。在具体的实施方案中，所述个体被给予每千克个体体重约、至少约或至多约1×106、3×106、10×106或30×106个用本文描述的方法产生的NK细胞。在其他实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞可按照相对细胞数量给予此类个体，例如，所述个体可被给予每千克个体体重约、至少约或至多约1×105、5×105、1×106、5×106、1×107、5×107、1×108或5×108个用本文描述的方法产生的NK细胞。
在某些实施方案中，抑制例如个体中急性髓性白血病细胞的增殖、治疗具有个体自然杀伤细胞缺陷的个体或治疗具有急性髓性白血病细胞的个体例如具有急性髓性白血病细胞的个体的方法包括使急性髓性白血病细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞中一种或多种的组合接近或者给予所述个体用本文描述的方法产生的NK细胞和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞中一种或多种的组合。
在某些实施方案中，抑制例如个体中多发性骨髓瘤细胞的增殖、治疗具有个体自然杀伤细胞缺陷的个体或治疗具有多发性骨髓瘤细胞的个体例如具有多发性骨髓瘤细胞的个体的方法包括使多发性骨髓瘤细胞与用本文描述的方法产生的NK细胞和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞中一种或多种的组合接近或者给予所述个体用本文描述的方法产生的NK细胞和胎盘灌洗液和/或胎盘灌洗液细胞中一种或多种的组合。
在另一个具体的实施方案中，具有个体的自然杀伤细胞缺陷的个体的治疗、患有急性髓性白血病的个体的治疗、或急性髓性白血病细胞增殖的抑制、或多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制使用免疫调节化合物或沙利度胺与用本文描述的方法产生的NK细胞组合进行，其中所述细胞被补充以条件培养基，例如通过CD34–、CD10+、CD105+、CD200+组织培养塑料制品贴壁胎盘细胞条件化的培养基，例如每单位灌洗液或者每104、105、106、107、108、109、1010或1011个用本文描述的方法产生的NK细胞0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.1、0.8、0.9、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10mL的干细胞条件化培养基。在某些实施方案中，组织培养塑料制品贴壁胎盘细胞为美国专利号7,468,276和美国专利申请公开号2007/0275362中描述的专能贴壁胎盘细胞，它们的公开内容以全文引用方式并入本文。在另一个具体的实施方案中，所述方法还包括使肿瘤细胞与免疫调节化合物或沙利度胺接近或者给予个体免疫调节化合物或沙利度胺。
用本文描述的方法产生的NK细胞和任选地灌洗液或灌洗液细胞可在抗癌治疗过程中一次给予患有急性髓性白血病的个体或具有急性髓性白血病细胞的个体；或者可在治疗过程中多次给予，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时给予一次，或每1、2、3、4、5、6或7天给予一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36周或更多周给予一次。
用本文描述的方法产生的NK细胞和任选地灌洗液或灌洗液细胞可在抗癌治疗过程中一次给予患有多发性骨髓瘤的个体或具有多发性骨髓瘤细胞的个体；或者可在治疗过程中多次给予，例如，每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22或23小时给予一次，或每1、2、3、4、5、6或7天给予一次，或每1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、24、36周或更多周给予一次。
在某些实施方案中，用本文描述的方法产生的NK细胞，例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体，以将对个体带来可检测的治疗益处的任何量或数量(例如有效量)使用，例如给予个体，其中所述个体患有急性髓性白血病，例如急性髓性白血病患者，或其中所述个体患有多发性骨髓瘤，例如多发性骨髓瘤患者。
可给予用本文描述的方法产生的NK细胞而不管过去是否已经给予该个体用本文描述的方法产生的NK细胞。
4.9.4.2 IL-2的给予
在另一个具体的实施方案中，对于具有个体的自然杀伤细胞缺陷的个体的治疗、患有急性髓性白血病的个体的治疗、或急性髓性白血病细胞增殖的抑制、或患有多发性骨髓瘤的个体的治疗、或多发性骨髓瘤细胞增殖的抑制，用本文描述的方法产生的所述NK细胞以白细胞介素-2(IL-2)补充。在其中使用细胞和IL-2的实施方案中，IL-2和细胞可一起给予个体，即在相同制剂中；可分开给予，即在单独的制剂中，大约同时给予；或可分开给予，例如按不同的给药时间表或在一天的不同时间给予。在某些实施方案中，IL-2为人IL-2。在某些实施方案中，IL-2为重组人IL-2(rhIL-2)。在某些实施方案中，rhIL-2为阿地白介素(Novartis)。rhIL-2的氨基酸序列的一个非限制性实例由GenBank登录号NP_000577.2提供。在某些实施方案中，rhIL-2的氨基酸序列具有与GenBank登录号NP_000577.2的99％序列同一性。在某些实施方案中，IL-2单位是指国际单位。
在其中使用细胞和IL-2的实施方案中，IL-2可皮下给予。在具体的实施方案中，IL-2可通过注射皮下给予。在更具体的实施方案中，在不存在4级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的4级)输注相关毒性的情况下在NK细胞输注后不早于4小时开始皮下IL-2注射。在更具体的实施方案中，如果受试者已经历4级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的4级)输注相关毒性并且其消退至2级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的2级)或更好，则在NK细胞输注后48小时内开始皮下IL-2注射。在某些实施方案中，如果IL-2不能在NK细胞输注后48小时内开始，则不给予IL-2。
在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以6百万单位的剂量给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万或9百万单位的剂量给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每隔一天给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每隔一天给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每天给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每天给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每1、2、3、4或5天给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每周给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每1、2、3、4或5天给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物每周给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万或9百万单位的剂量每隔一天给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万或9百万单位的剂量每隔一天给予受试者，总共6个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以3百万、4百万、5百万、6百万、7百万、8百万或9百万单位的剂量每隔一天给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以6百万单位的剂量每隔一天给予受试者。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以6百万单位的剂量每隔一天给予受试者，总共3、4、5、6、7、8或9个剂量。在某些实施方案中，IL-2或其药物组合物以6百万单位的剂量每1、2、3、4或5天给予受试者，总共6个剂量。
在某些实施方案中，IL-2与对乙酰氨基酚组合给予。在某些实施方案中，IL-2与苯海拉明组合给予。在具体的实施方案中，IL-2与对乙酰氨基酚和苯海拉明组合给予。在更具体的实施方案中，对乙酰氨基酚和苯海拉明在IL-2之前给予。在更具体的实施方案中，对乙酰氨基酚和苯海拉明在IL-2之后给予。在更具体的实施方案中，对乙酰氨基酚和苯海拉明在IL-2之前和之后给予。
在其中使用细胞和IL-2的实施方案中，IL-2可以6百万单位的剂量每隔一天给予，总共6个剂量。在具体的实施方案中，对于体重小于45千克的患者，IL-2以3百万单位/m2的剂量每隔一天给予，总共6个剂量。在具体的实施方案中，在给予每个剂量的IL-2之前和之后4小时，用对乙酰氨基酚650mg PO和苯海拉明25mg PO/IV前驱给药。在更具体的实施方案中，持续时间超过24小时的新的(即，之前不存在的)3级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的3级)或更高的不良事件的发生将导致IL-2剂量减少50％。在具体的实施方案中，3级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的3级)或更高的不良事件选自以下事件：心脏紊乱、调查(investigations)(血液学除外)、神经***紊乱、肾和泌尿***紊乱、以及呼吸***(肺)紊乱。在具体的实施方案中，如果毒性在48小时内消退至2级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的2级)或更好，则以减少50％的剂量恢复IL-2并以此减少的剂量继续。在更具体的实施方案中，如果相同的毒性持续存在、变得更坏或再次发生，则永久中断rhIL-2。在具体的实施方案中，如果毒性为4级(例如，根据国家癌症研究所通用毒性标准的4级)，则永久中断IL-2。
4.9.4.3调理方案
在某些实施方案中，在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前给予受试者调理方案。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗五天。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗五天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗五天。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗五天。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗五天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗五天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗2天。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗2天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用60mg/kg环磷酰胺治疗2天。在具体的实施方案中，调理方案包括用50至70mg/kg环磷酰胺治疗2天。在具体的实施方案中，调理方案包括用60mg/kg环磷酰胺治疗2天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用50至70mg/kg环磷酰胺治疗2天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨和环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗五天和用环磷酰胺治疗两天。在具体的实施方案中，预处理方案包括用氟达拉滨治疗五天和用环磷酰胺治疗两天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗五天和用60mg/kg环磷酰胺治疗两天。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗五天和用50至70mg/kg环磷酰胺治疗两天。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗五天和用60mg/kg环磷酰胺治疗两天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗五天和用50至70mg/kg环磷酰胺治疗两天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。
在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6、7或8天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天。在具体的实施方案中，预处理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6、7或8天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6、7或8天开始用氟达拉滨治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗1、2、3或4天。在具体的实施方案中，调理方案包括用环磷酰胺治疗1、2、3或4天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6或7天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用60mg/kg环磷酰胺治疗1、2、3或4天。在具体的实施方案中，调理方案包括用50至70mg/kg环磷酰胺治疗1、2、3或4天。在具体的实施方案中，调理方案包括用60mg/kg环磷酰胺治疗1、2、3或4天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6或7天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用50至70mg/kg环磷酰胺治疗1、2、3或4天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6或7天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨和环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用环磷酰胺治疗一、二、三或四天。在具体的实施方案中，调理方案包括用氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用环磷酰胺治疗一、二、三或四天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6、7或8天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6或7天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用60mg/kg环磷酰胺治疗一、二、三或四天。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用50至70mg/kg环磷酰胺治疗一、二、三或四天。在具体的实施方案中，调理方案包括用25mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用60mg/kg环磷酰胺治疗一、二、三或四天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前6天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前5天开始用环磷酰胺治疗。在具体的实施方案中，调理方案包括用20至30mg/m2氟达拉滨治疗三、四、五、六或七天和用50至70mg/kg环磷酰胺治疗一、二、三或四天，其中在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6、7或8天开始用氟达拉滨治疗并且在用NK细胞和任选的IL-2治疗之前4、5、6或7天开始用环磷酰胺治疗。
5.试剂盒
本文提供了一种药物包装或试剂盒，其包含一个或多个装有一种或多种本文所述组合物的容器，例如包含通过本文描述的方法产生的NK细胞(例如用本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体)的组合物。任选地此类容器可附有通知，所述通知呈管理药物或生物制品的制造、使用或销售的政府机关所规定的形式，所述通知反映政府机关对制造、使用或销售用于人施用的批准。
本文涵盖的试剂盒可根据本文描述的方法使用，例如抑制急性髓性白血病细胞的生长的方法和/或治疗急性髓性白血病的方法或者抑制多发性骨髓瘤细胞的生长的方法和/或治疗多发性骨髓瘤的方法。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含通过本文描述的方法产生的NK细胞或其组合物。在一个具体的实施方案中，本文提供了一种试剂盒，其包含通过本文描述的三阶段方法产生的NK细胞群体或其组合物。在一个实施方案中，试剂盒在一个或多个容器中包含通过本文描述的方法产生的NK细胞或其组合物和在一个或多个容器中的IL-2或其组合物。在一个实施方案中，试剂盒包含(i)在一个或多个容器中的通过本文描述的方法产生的NK细胞或其组合物，(ii)在一个或多个容器中的IL-2或其组合物，和(iii)在一个或多个容器中的对乙酰氨基酚，和/或(iv)在一个或多个容器中的苯海拉明。在一个实施方案中，试剂盒包含(i)在一个或多个容器中的通过本文描述的方法产生的NK细胞或其组合物，(ii)在一个或多个容器中的IL-2或其组合物，和(iii)在一个或多个容器中的氟达拉滨，和/或(iv)在一个或多个容器中的环磷酰胺。在一个实施方案中，试剂盒包含(i)在一个或多个容器中的通过本文描述的方法产生的NK细胞或其组合物，(ii)在一个或多个容器中的IL-2或其组合物，和(iii)在一个或多个容器中的对乙酰氨基酚，和/或(iv)在一个或多个容器中的苯海拉明，和(v)在一个或多个容器中的氟达拉滨，和/或(vi)在一个或多个容器中的环磷酰胺。
6.实施例
6.1实施例1：临床研究-急性髓性白血病
在复发和/或难治性急性髓性白血病的成年人中进行一项人脐带血衍生、培养扩增三阶段自然杀伤细胞输注及皮下重组人IL-2(rhIL-2)的I期、多中心、开放标签、剂量递增的安全性研究。
筛选/基线期定义为在给予三阶段NK细胞之前第-28天至第-7天的21天，在此期间评估受试者的合格性。筛选/基线期后是为期5天的调理治疗期，其由环磷酰胺(第-5天和第-4天60mg/kg×2天，但如果距离先前的移植不到4个月，则省略第-4天的环磷酰胺剂量)和氟达拉滨(25mg/m2×5天，从第-6天开始)(研究日-6至-2)组成。如果距离先前的移植不到四个月，则省略第二天的氟达拉滨。
在治疗期中，受试者在三阶段NK细胞输注之前60分钟内和在三阶段NK细胞输注之后大约4小时内用对乙酰氨基酚650mg PO和苯海拉明25mg PO/IV预先给药。在第0天IV给予三阶段NK细胞输注。不早于输注结束后4小时，并且在不存在任何4级(根据国家癌症研究所通用毒性标准)输注相关毒性的情况下，根据说明皮下(SC)注射6百万单位的rhIL-2。然后每隔一天重复rhIL-2注射，从第0天开始总共进行6次注射。建议使用对乙酰氨基酚650mgPO和苯海拉明25mg PO作为每次rhIL-2注射前的预先用药和每次rhIL-2注射后的后用药。
这些预先用药和后用药的给予时间由研究人员酌情决定或按现场方案进行。如果临床指示有需要，也可给予哌替啶以控制寒颤(rigors)。
该研究利用3+3剂量递增设计，其中3至6名受试者参加4个剂量群组中的每一个(1×106个细胞/kg、3×106个细胞/kg、10×106个细胞/kg和30×106个细胞/kg)，另外4名受试者增加至最大耐受剂量(MTD)。
最初，招募三名受试者以接受1×106个细胞/kg的单次输注。根据进入研究的顺序将受试者分配到剂量群组。本研究中计划了四个三阶段NK细胞剂量水平：
剂量水平1：在研究第0天给予1×106个细胞/kg。
剂量水平2：在研究第0天给予3×106个细胞/kg。
剂量水平3：在研究第0天给予10×106个细胞/kg。
剂量水平4：在研究第0天给予30×106个细胞/kg。
主要结果指标是评估剂量限制性毒性(DLT)、给予后28天内不良事件的数量和严重程度以及MTD，安全给予以治疗AML患者的最大剂量。主要结果指标的时间框架为至多大约28天。不良事件的数量测定至多大约12个月。
次要结果指标是具有不完全血小板恢复的完全缓解(CRp)和完全缓解(CR)。CRp定义为白血病清除(<5％骨髓原始细胞和无循环的外周血原始细胞)和嗜中性粒细胞恢复但具有不完全血小板恢复。CR定义为白血病清除(<5％骨髓原始细胞和无循环的外周血原始细胞)，结合绝对嗜中性粒细胞计数(>1000/μL)和血小板计数(>100,000/μL)达到正常值并且不依赖于红细胞输注。次要结果指标的时间框架为至多大约42天。
受试者必须具有如下符合条件的疾病才能参加本研究：
原发性急性髓性白血病诱导失败：2次或更多次诱导尝试后未取得CR；或
复发的急性髓性白血病：1个或多个标准再诱导化疗周期后未取得CR。对于年龄大于60岁的复发受试者，如果满足以下任一标准，则不要求1个标准再诱导化疗周期：最后一次化疗后6个月内复发；或在开始该方案治疗的10天内原始细胞计数<30％；或
继发性急性髓性白血病(MDS转化或治疗相关的)；或
移植后>2个月急性髓性白血病复发，先前累及中枢神经***的受试者是适格的，前提是其已经治疗并且在第1次访视前至少两周脑脊液是干净的。
实施例2：临床研究-多发性骨髓瘤
在患有多发性骨髓瘤(MM)的成年人中进行一项自体干细胞移植(ASCT)后人脐带血衍生、培养扩增三阶段自然杀伤细胞输注及皮下重组人IL-2(rhIL-2)的I期、多中心、开放标签安全性研究。
本研究的主要目的是在MM受试者中评估ASCT后给予三阶段NK细胞的安全性并确定最大耐受剂量。次要目标在于探索到第100天时的潜在临床疗效。
在ASCT后第2天和第7天评价三阶段自然杀伤细胞的最大耐受剂量，并在ASCT后第14天确定。静脉内给予三阶段自然杀伤细胞，然后总共注射六次IL-2以支持体内的NK细胞。
主要结果指标为不良事件和剂量限制性毒性，二者的时间框架为至多28天。次要结果指标为响应率，时间框架为至多100天，其中响应包括最小残留病。
研究方案如下：首先给予美法仑，然后给予ASCT(第-5天至第0天)，然后给予至多3个不同剂量水平的三阶段自然杀伤细胞，然后从第0天至第13天每隔一天给予rhIL-2。
等价物：
本发明不限于本文所述的具体实施方案的范围。实际上，除了所描述的那些外，本发明的各种修改对于本领域技术人员来说将从前面的描述和附图中显而易见。这些修改旨在落入所附权利要求的范围内。
本文引用的所有参考文献均出于所有目的以全文引用的方式并入本文，其程度就好像每一个单独的出版物、专利或专利申请被明确地并单独地指出出于所有目的以全文引用的方式并入一样。任何出版物的引用是因为其在申请日之前公开并且不应理解为承认本发明无权凭借在先发明而先于这些出版物。

Claims (129)

1.一种通过给予有效量的包含自然杀伤细胞的细胞群体来治疗患有急性髓性白血病的个体的方法，其中所述包含自然杀伤细胞的细胞群体通过包括以下步骤的方法产生：
(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；
(b)在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体；和
(c)在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体；
其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞并且其中至少80％的所述自然杀伤细胞是存活的；
其中所述治疗方法还包括给予所述患者有效量的IL-2。
2.一种通过给予有效量的包含自然杀伤细胞的细胞群体来治疗患有多发性骨髓瘤的个体的方法，其中所述包含自然杀伤细胞的细胞群体通过包括以下步骤的方法产生：
(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；
(b)在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体；和
(c)在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体；
其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞并且其中至少80％的所述自然杀伤细胞是存活的；
其中所述治疗方法还包括给予所述患者有效量的IL-2。
3.根据权利要求1或2所述的方法，其中所述有效量的IL-2为有效量的重组人IL-2(rhIL-2)。
4.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞为CD34+造血干细胞。
5.根据权利要求1-4中任一项所述的方法，其中所述造血干细胞为胎盘造血干细胞。
6.根据权利要求5所述的方法，其中所述胎盘造血干细胞获自或可获自人胎盘灌洗液。
7.根据权利要求5所述的方法，其中所述胎盘造血干细胞获自或可获自从人胎盘灌洗液分离的有核细胞。
8.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述Tpo以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第一培养基中。
9.根据权利要求8所述的方法，其中所述Tpo以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在于所述第一培养基中。
10.根据权利要求8所述的方法，其中所述Tpo以约25ng/mL的浓度存在于所述第一培养基中。
11.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第二培养基中。
12.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-15以10ng/mL至30ng/mL的浓度存在于所述第二培养基中。
13.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-15以约20ng/mL的浓度存在于所述第二培养基中。
14.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-2以10U/mL至10,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。
15.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-2以300U/mL至3,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以10ng/mL至30ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。
16.根据权利要求1-3中任一项所述的方法，其中所述IL-2以约1,000U/mL的浓度存在于所述第三培养基中并且所述IL-15以约20ng/mL的浓度存在于所述第三培养基中。
17.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在所述第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内。
18.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述Tpo、IL-2和IL-15不包含在血清内。
19.根据权利要求1-16中任一项所述的方法，其中所述干细胞动员剂为芳基烃受体抑制剂。
20.根据权利要求19所述的方法，其中所述芳基烃受体抑制剂为StemRegenin-1(SR-1)(4-(2-(2-(苯并[b]噻吩-3-基)-9-异丙基-9H-嘌呤-6-基氨基)乙基)苯酚)。
21.根据权利要求19所述的方法，其中所述芳基烃受体抑制剂为白藜芦醇。
22.根据权利要求19所述的方法，其中所述芳基烃受体抑制剂为化合物CH223191(1-甲基-N-[2-甲基-4-[2-(2-甲基苯基)二氮烯基]苯基-1H-吡唑-5-甲酰胺]。
23.根据权利要求1-18中任一项所述的方法，其中所述干细胞动员剂为嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物。
24.根据权利要求24所述的方法，其中所述嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物具有化学结构
25.根据权利要求24所述的方法，其中所述嘧啶并(4,5-b)吲哚衍生物具有化学结构
26.根据权利要求1-25中任一项所述的方法，其中所述第一培养基还包含低分子量肝素(LMWH)、Flt-3配体(Flt-3L)、干细胞因子(SCF)、IL-6、IL-7、粒细胞集落刺激因子(G-CSF)或粒细胞-巨噬细胞刺激因子(GM-CSF)中的一种或多种。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述第一培养基包含LMWH、Flt-3L、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。
28.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中在所述第一培养基中，所述LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；所述Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；所述IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。
29.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中在所述第一培养基中，所述LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于所述第一培养基中；所述Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；所述IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。
30.根据权利要求26或权利要求27所述的方法，其中在所述第一培养基中，所述LMWH以约4.5U/mL的浓度存在于所述第一培养基中；所述Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；所述SCF以约27ng/mL的浓度存在；所述IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；所述IL-7以约25ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以约.25ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。
31.根据权利要求1-30中任一项所述的方法，其中所述第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的一种或多种。
32.根据权利要求1-31中任一项所述的方法，其中所述第二培养基还包含LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。
33.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中在所述第二培养基中，所述LMWH以1U/mL至10U/mL的浓度存在；所述Flt-3L以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；所述IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。
34.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中在所述第二培养基中，所述LMWH以4U/mL至5U/mL的浓度存在于所述第二培养基中；所述Flt-3L以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；所述IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。
35.根据权利要求31或权利要求32所述的方法，其中在所述第二培养基中，所述LMWH以约4.5U/mL的浓度存在于所述第二培养基中；所述Flt-3L以约25ng/mL的浓度存在；所述SCF以约27ng/mL的浓度存在；所述IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；所述IL-7以约25ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。
36.根据权利要求1-35中任一项所述的方法，其中所述第三培养基还包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF或GM-CSF中的一种或多种。
37.根据权利要求36所述的方法，其中所述第三培养基包含SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和GM-CSF中的每一种。
38.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中在所述第三培养基中，所述SCF以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.01ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在；所述IL-7以1ng/mL至50ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.01ng/mL至0.50ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.1ng/mL的浓度存在。
39.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中在所述第三培养基中，所述SCF以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述IL-6以0.04ng/mL至0.06ng/mL的浓度存在；所述IL-7以20ng/mL至30ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以0.20ng/mL至0.30ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以0.005ng/mL至0.5ng/mL的浓度存在。
40.根据权利要求36或权利要求37所述的方法，其中在所述第三培养基中，所述SCF以约22ng/mL的浓度存在；所述IL-6以约0.05ng/mL的浓度存在；所述IL-7以约20ng/mL的浓度存在；所述G-CSF以约0.25ng/mL的浓度存在；和所述GM-CSF以约0.01ng/mL的浓度存在。
41.根据权利要求26-40中任一项所述的方法，其中所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在所述第一培养基、第二培养基或第三培养基的未限定组分内。
42.根据权利要求26-40中任一项所述的方法，其中所述LMWH、Flt-3、SCF、IL-6、IL-7、G-CSF和/或GM-CSF不包含在血清内。
43.根据权利要求1-42中任一项所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含人血清-AB。
44.根据权利要求43所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含1％至20％的人血清-AB。
45.根据权利要求43所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含5％至15％的人血清-AB。
46.根据权利要求43所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含约10％的人血清-AB。
47.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含2-巯基乙醇。
48.根据权利要求1-46中任一项所述的方法，其中任何所述第一培养基、第二培养基或第三培养基包含庆大霉素。
49.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述造血干细胞在所述第一培养基中培养7-13天。
50.根据权利要求49所述的方法，其中所述方法包括将所述造血干细胞在所述第一培养基中培养8-12天。
51.根据权利要求49所述的方法，其中所述方法包括将所述造血干细胞在所述第一培养基中培养约10天。
52.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养2-6天。
53.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养3-5天。
54.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第一细胞群体在所述第二培养基中培养约4天。
55.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养10-30天。
56.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养15-25天。
57.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中所述方法包括将所述第二细胞群体在所述第三培养基中培养约21天。
58.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基、第二培养基和第三培养基中的所述培养均在静态培养条件下进行。
59.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基、第二培养基或第三培养基中的至少之一中的所述培养在旋转瓶中进行。
60.根据权利要求1-48中任一项所述的方法，其中在所述第一培养基和所述第二培养基中的所述培养在静态培养条件下进行，而在所述第三培养基中的所述培养在旋转瓶中进行。
61.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述造血细胞最初以1×104至1×105个细胞/mL接种到所述第一培养基中。
62.根据权利要求61所述的方法，其中所述造血细胞最初以约3×104个细胞/mL接种到所述第一培养基中。
63.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述第一细胞群体最初以5×104至5×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。
64.根据权利要求63所述的方法，其中所述第一细胞群体最初以约1×105个细胞/mL接种到所述第二培养基中。
65.根据权利要求1-60中任一项所述的方法，其中所述第二细胞群体最初以1×105至5×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
66.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二细胞群体最初以1×105至1×106个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
67.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二细胞群体最初以约5×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
68.根据权利要求65所述的方法，其中所述第二细胞群体最初以约3×105个细胞/mL接种到所述第三培养基中。
69.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述方法产生比最初接种到所述第一培养基中的造血干细胞的数量多至少5000倍的自然杀伤细胞。
70.根据权利要求69所述的方法，其中所述方法产生多至少10,000倍的自然杀伤细胞。
71.根据权利要求69所述的方法，其中所述方法产生多至少50,000倍的自然杀伤细胞。
72.根据权利要求69所述的方法，其中所述方法产生多至少75,000倍的自然杀伤细胞。
73.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少20％的CD56+CD3–自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
74.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少40％的CD56+CD3–自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
75.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少60％的CD56+CD3–自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
76.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中所述方法产生包含至少80％的CD56+CD3–自然杀伤细胞的自然杀伤细胞。
77.根据权利要求1-68中任一项所述的方法，其中当所述自然杀伤细胞与K562细胞在体外以10:1的比率共培养时，所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少20％的细胞毒性。
78.根据权利要求77所述的方法，其中所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少35％的细胞毒性。
79.根据权利要求77所述的方法，其中所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少45％的细胞毒性。
80.根据权利要求77所述的方法，其中所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少60％的细胞毒性。
81.根据权利要求77所述的方法，其中所述自然杀伤细胞对所述K562细胞表现出至少75％的细胞毒性。
82.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞的活力通过7-氨基放线菌素D(7AAD)染色确定。
83.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞的活力通过膜联蛋白-V染色确定。
84.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞的活力通过7-AAD染色和膜联蛋白-V染色二者确定。
85.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞的活力通过台盼蓝染色确定。
86.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)后冷冻保存所述细胞群体。
87.根据权利要求1-81中任一项所述的方法，所述方法还包括在步骤(c)后冷冻保存所述自然杀伤细胞。
88.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述个体患有复发的/难治性急性髓性白血病。
89.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述个体患有至少一种针对急性髓性白血病的非自然杀伤细胞疗法已对其失败的急性髓性白血病。
90.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一次缓解期。
91.根据权利要求1-87中任一项所述的方法，其中在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或二者进行调理。
92.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前已经冷冻保存。
93.根据权利要求1-91中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前未经冷冻保存。
94.根据权利要求1-92中任一项所述的方法，其中所述IL-2皮下给予。
95.根据权利要求1-94中任一项所述的方法，其中所述IL-2以每隔一天6百万单位的剂量给予，总共6个剂量。
96.根据权利要求1-95中任一项所述的方法，其中在向所述个体给予所述IL-2之前、在向所述个体给予所述IL-2之后、或在向所述个体给予所述IL-2之前和之后向所述个体给予对乙酰氨基酚和/或苯海拉明。
97.根据权利要求1-96中任一项所述的方法，其中所述个体被给予每千克个体体重约1×106、3×106、10×106或30×106个自然杀伤细胞。
98.根据权利要求1-97中任一项所述的方法，其中在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、环磷酰胺或二者进行调理。
99.一种抑制急性髓性白血病细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述急性髓性白血病细胞与多个自然杀伤细胞接触，其中所述自然杀伤细胞通过包括以下步骤的方法产生：
(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；
(b)在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体；和
(c)在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体；
其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞并且其中至少80％的所述自然杀伤细胞是存活的；
其中所述抑制方法还包括使所述急性髓性白血病细胞与IL-2接触。
100.根据权利要求99所述的方法，进一步其中在所述急性髓性白血病细胞的所述接触中使用的IL-2为rhIL-2。
101.根据权利要求99所述的方法，其中所述接触在体外进行。
102.根据权利要求99所述的方法，其中所述接触在体内进行。
103.根据权利要求102所述的方法，其中所述接触在人个体中进行。
104.根据权利要求103所述的方法，其中所述方法包括向所述个体给予所述自然杀伤细胞。
105.根据权利要求103所述的方法，其中所述个体患有复发的/难治性AML。
106.根据权利要求103所述的方法，其中所述个体患有至少一种针对AML的非自然杀伤细胞疗法已对其失败的AML。
107.根据权利要求103所述的方法，其中所述个体为65岁或更大年龄，并且处于第一次缓解期。
108.根据权利要求103-107中任一项所述的方法，其中在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、阿糖胞苷或二者进行调理。
109.根据权利要求103-108中任一项所述的方法，其中所述IL-2皮下给予所述个体。
110.根据权利要求103-109中任一项所述的方法，其中所述IL-2以每隔一天6百万单位的剂量给予所述个体，总共6个剂量。
111.根据权利要求103-110中任一项所述的方法，其中在向所述个体给予所述IL-2之前、在向所述个体给予所述IL-2之后、或在向所述个体给予所述IL-2之前和之后向所述个体给予对乙酰氨基酚和/或苯海拉明。
112.根据权利要求103-111中任一项所述的方法，其中所述个体被给予每千克个体体重约1×106、3×106、10×106或30×106个自然杀伤细胞。
113.根据权利要求103-112中任一项所述的方法，其中在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已经用氟达拉滨、环磷酰胺或二者进行调理。
114.根据权利要求99-113中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前已经冷冻保存。
115.根据权利要求99-113中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前未经冷冻保存。
116.一种抑制多发性骨髓瘤细胞的增殖的方法，所述方法包括使所述多发性骨髓瘤细胞与多个自然杀伤细胞接触，其中所述自然杀伤细胞通过包括以下步骤的方法产生：
(a)在包含干细胞动员剂和血小板生成素(Tpo)的第一培养基中培养造血干细胞或祖细胞以产生第一细胞群体；
(b)在包含干细胞动员剂和白细胞介素-15(IL-15)且没有Tpo的第二培养基中培养所述第一细胞群体以产生第二细胞群体；和
(c)在包含IL-2和IL-15且没有干细胞动员剂和LMWH的第三培养基中培养所述第二细胞群体以产生第三细胞群体；
其中所述第三细胞群体包含CD56+、CD3-、CD16–或CD16+和CD94+或CD94-的自然杀伤细胞并且其中至少80％的所述自然杀伤细胞是存活的；
其中所述抑制方法还包括使所述多发性骨髓瘤细胞与IL-2接触。
117.根据权利要求116所述的方法，进一步其中在所述多发性骨髓瘤细胞的所述接触中使用的IL-2为rhIL-2。
118.根据权利要求116所述的方法，其中所述接触在体外进行。
119.根据权利要求116所述的方法，其中所述接触在体内进行。
120.根据权利要求119所述的方法，其中所述接触在人个体中进行。
121.根据权利要求120所述的方法，其中所述方法包括向所述个体给予所述自然杀伤细胞。
122.根据权利要求121所述的方法，其中所述个体已接受自体干细胞移植。
123.根据权利要求120-122中任一项所述的方法，其中所述IL-2皮下给予所述个体。
124.根据权利要求120-123中任一项所述的方法，其中所述IL-2以每隔一天6百万单位的剂量给予所述个体，总共6个剂量。
125.根据权利要求120-124中任一项所述的方法，其中在向所述个体给予所述IL-2之前、在向所述个体给予所述IL-2之后、或在向所述个体给予所述IL-2之前和之后向所述个体给予对乙酰氨基酚和/或苯海拉明。
126.根据权利要求120-125中任一项所述的方法，其中所述个体被给予每千克个体体重约1×106、3×106、10×106或30×106个自然杀伤细胞。
127.根据权利要求120-126中任一项所述的方法，其中在给予所述自然杀伤细胞之前，所述个体已接受美法仑。
128.根据权利要求116-127中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前已经冷冻保存。
129.根据权利要求116-127中任一项所述的方法，其中所述自然杀伤细胞在所述接触或所述给予之前未经冷冻保存。
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