CN111683966A - 与cd22结合的重链抗体 - Google Patents

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Abstract

公开了抗CD22重链抗体(例如，UniAbsTM)，以及制备此类抗体的方法，包括药物组合物在内的包含此类抗体的组合物，以及它们用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的用途。

Description

与CD22结合的重链抗体
相关申请的交叉引用
本申请要求2017年12月22日提交的美国临时专利申请号62/609,759的提交日期的优先权，所述申请的公开内容以引用的方式整体并入本文。
发明领域
本发明涉及与CD22结合的人重链抗体(例如，UniAbsTM)。本发明进一步涉及制备此类抗体的方法，包含此类抗体的组合物(包括药物组合物)以及它们用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的用途。
发明背景
CD22
CD22，也称为SIGLEC-2(UniProt P20273)，是在成熟B细胞上表达的细胞表面受体。CD22含有多个Ig结构域，并且是免疫球蛋白超家族的成员。CD22的细胞外结构域与唾液酸部分相互作用，包括CD45细胞表面蛋白上存在的那些。认为CD22充当B细胞受体信号转导的抑制性受体。与CD20和CD19一起，CD22的受限制的B细胞表达使其成为B细胞恶性肿瘤的治疗性治疗的有吸引力的靶标。对CD22具有特异性的单克隆抗体已在文献中进行了描述(例如，Jabbour，Elias，等人“Monoclonal antibodies in acute lymphoblasticleukemia.”Blood 125.26(2015)：4010-4016)，并且已在治疗上用作标准单克隆(例如依帕珠单抗)以及抗体-药物缀合物(依托珠单抗奥佐米星)。另外，抗CD22嵌合抗原受体T细胞已在临床上用于治疗白血病(Fry，Terry J.，等人″CD22-targeted CAR T cells induceremission in B-ALL that is naive or resistant to CD19-targeted CARimmunotherapy.″Nature medicine(2017))。
重链抗体
在常规IgG抗体中，重链和轻链的缔合部分由轻链恒定区和重链CH1恒定结构域之间的疏水相互作用导致。在重链框架2(FR2)和框架4(FR4)区域中存在另外的残基，所述另外的残基也对重链与轻链之间的这种疏水相互作用作出贡献。
然而，已知骆驼科动物(包括骆驼、单峰驼和美洲驼的胼足亚目)的血清含有仅由成对的H链(仅有重链的抗体或UniAbsTM)组成的主要类型的抗体。骆驼科(单峰驼(Camelusdromedarius)、双峰驼(Camelus bactrianus)、大羊驼(Lama glama)、原驼(Lamaguanaco)、美洲羊驼(Lama alpaca)和骆马(Lama vicugna))的UniAbsTM具有由单个可变结构域(VHH)、铰链区和两个恒定结构域(CH2和CH3)组成的独特结构，所述结构域与经典抗体的CH2和CH3结构域高度同源。这些UniAbsTM缺乏恒定区(CH1)的第一结构域，所述第一结构域存在于基因组中，但在mRNA加工过程中被剪接掉。缺少CH1结构域解释了UniAbsTM中不存在轻链，因为所述结构域是轻链恒定结构域的锚定位置。此类UniAbsTM天然进化以通过来自常规抗体的3个CDR或其片段赋予抗原结合特异性和高亲和力(Muyldermans，2001；JBiotechnol 74：277-302；Revets等人，2005；Expert Opin Biol Ther 5：111-124)。软骨鱼，诸如鲨鱼，也进化出独特类型的免疫球蛋白(称为IgNAR)，其缺乏轻多肽链并且完全由重链组成。可通过分子工程化操纵IgNAR分子以产生单个重链多肽(vNAR)的可变结构域((Nuttall等人Eur.J.Biochem.270，3543-3554(2003)；Nuttall等人Function andBioinformatics 55，187-197(2004)；Dooley等人，Molecular Immunology 40，25-33(2003))。
在20世纪60年代确定了缺乏轻链的仅有重链的抗体结合抗原的能力(Jaton等人(1968)Biochemistry，7，4185-4195)。与轻链物理分离的重链免疫球蛋白相对于四聚体抗体保留了80％的抗原结合活性。Sitia等人(1990)Cell，60，781-790证明从重排的小鼠μ基因中去除CH1结构域导致在哺乳动物细胞培养物中产生缺乏轻链的仅有重链的抗体。所产生的抗体保留VH结合特异性和效应子功能。
通过免疫接种可产生针对多种抗原的具有高特异性和亲和力的重链抗体(vander Linden，R.H.，等人Biochim.Biophys.Acta.1431，37-46(1999))，并且VHH部分可容易地克隆并在酵母中表达(Frenken，L.G.J.，等人J.Biotechnol.78，11-21(2000))。它们的表达水平、溶解度和稳定性显著高于经典F(ab)或Fv片段的那些(Ghahroudi，M.A.等人FEBSLett.414，521-526(1997))。
其中λ(兰姆达)轻(L)链基因座和/或λ及K(卡帕)L链基因座已被功能性沉默的小鼠以及由此类小鼠产生的抗体描述于美国专利号7,541,513和8,367,888中。例如，在WO2006008548；美国申请公布号20100122358；Nguyen等人，2003，Immunology；109(1)，93-101；Brüggemann等人，Crit.Rev.Immunol.；2006，26(5)：377-90；以及Zou等人，2007，J ExpMed；204(13)：3271-3283中报告了在小鼠和大鼠中重组产生仅有重链的抗体。在Geurts等人，2009，Science，325(5939)：433中描述了经由锌指核酸酶的胚胎显微注射产生敲除大鼠。在美国专利号8,883,150和9,365,655中描述了可溶性仅有重链的抗体和包含产生此类抗体的异源重链基因座的转基因啮齿动物。包含单结构域抗体作为结合(靶向)结构域的CAR-T结构描述于例如Iri-Sofla等人，2011，Experimental Cell Research 317：2630-2641和Jamnani等人，2014，Biochim Biophys Acta，1840：378-386中。
发明内容
本发明的方面涉及对CD22具有结合亲和力的重链抗体，包括但不限于UniAbsTM。本发明的其他方面涉及制备此类抗体的方法，包含此类抗体的组合物，以及它们在治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症中的用途。
在一些实施方案中，与CD22结合的仅有重链的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：(a)CDR1，所述CDR1在SEQ ID NO：1至10的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代；和/或(b)CDR2，所述CDR2在SEQ ID NO：11至17的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代；和/或(c)CDR3，所述CDR3在SEQ ID NO：18至23的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代。在一些实施方案中，所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。在一些实施方案中，在不存在CH1序列的情况下，仅有重链的抗体还包含重链恒定区序列。
在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含：(a)选自由SEQ ID NO：1至10组成的组的CDR1序列；和/或(b)选自由SEQ ID NO：11至17组成的组的CDR2序列；和/或(c)选自由SEQID NO：18至23组成的组的CDR3序列。在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含：(a)选自由SEQ ID NO：1至10组成的组的CDR1序列；和(b)选自由SEQ ID NO：11至17组成的组的CDR2序列；以及(c)选自由SEQ ID NO：18至23组成的组的CDR3序列。
在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含：(a)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ IDNO：11的CDR2序列和SEQ ID NO：18的CDR3序列；或(b)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：12的CDR2序列和SEQ ID NO：19的CDR3序列；或(c)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：12的CDR2序列和SEQ ID NO：20的CDR3序列。在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含与SEQID NO：24至84的序列中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变区。在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含选自由SEQ ID NO：24至84组成的组的重链可变区序列。在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含SEQ ID NO：24的重链可变区序列。
在一些实施方案中，与CD22结合的仅有重链的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含重链可变，所述重链可变包含(a)具有下式的CDR1序列：
G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6Y
其中X1是D或G；X2是S、T、I或N；X3是S或D；X4是G、S或N；X5是D、G或S；并且X6是Y或H；和(b)具有下式的CDR2序列：
X7 X8Y X9G X10 X11
其中X7是I或V；X8是Y或H；X9是S或T；X10是A、V或S；并且X11是T或A；以及(c)具有下式的CDR3序列：
X12 R X13 D S S X14 W R S
其中X12是T、A或K；X13是D或E；并且X14是N或S。
在一些实施方案中，与CD22结合的仅有重链的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列是在选自由SEQ ID NO：1-23组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。
在一些实施方案中，仅有重链的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列选自由SEQ ID NO：1-23组成的组。
在一些实施方案中，与CD22结合的仅有重链的抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：人VH框架中的(a)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：11的CDR2序列和SEQ IDNO：18的CDR3序列；或(b)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：12的CDR2序列和SEQ ID NO：19的CDR3序列；或(c)SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：12的CDR2序列和SEQ ID NO：20的CDR3序列。
在一些实施方案中，仅有重链的抗体是多特异性的。在一些实施方案中，仅有重链的抗体是双特异性的。在一些实施方案中，仅有重链的抗体对两种不同的CD22蛋白具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅有重链的抗体对同一CD22蛋白上的两个不同表位具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅有重链的抗体对效应细胞具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅有重链的抗体对T细胞抗原具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅有重链的抗体对CD3具有结合亲和力。在一些实施方案中，仅有重链的抗体呈CAR-T形式。
本发明的方面涉及包含本文所述的仅有重链的抗体的药物组合物。
本发明的方面涉及用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用本文所述的抗体或药物组合物。在某些其他方面，本发明涉及本文所述的抗体在制备用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的药物中的用途。在其他方面，本发明涉及一种本文所述的抗体，所述抗体用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症。关于这些方面，并且在一些实施方案中，所述病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。在一些实施方案中，所述病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。在一些实施方案中，所述病症是***性红斑狼疮(SLE)。在一些实施方案中，所述病症是类风湿性关节炎(RA)。在一些实施方案中，所述病症是多发性硬化症(MS)。
本发明的方面涉及编码本文所述抗体的多核苷酸、包含此类多核苷酸的载体以及包含此类载体的细胞。
本发明的方面涉及产生本文所述的抗体的方法，所述方法包括在允许表达所述抗体的条件下生长本文描述的细胞，并且从所述细胞分离所述抗体。
本发明的方面涉及制备本文所述的抗体的方法，所述方法包括用CD22免疫接种UniRat动物并鉴定结合CD22的重链序列。
这些和其他方面将在本公开的其余部分，包括实施例中进一步解释。
附图说明
图1示出抗CD22重链抗体独特CDR氨基酸序列。
图2示出抗CD22重链抗体可变结构域氨基酸序列。
图3示出抗CD22重链抗体CDR1、CDR2和CDR3氨基酸序列。
图4示出抗CD22重链抗体生物学活性。
图5A是描绘对于Daudi细胞，随抗体浓度变化的特异性裂解百分比的图。
图5B是描绘对于Raji细胞，随抗体浓度变化的特异性裂解百分比的图。
图5C是描绘对于Ramos细胞，随抗体浓度变化的特异性裂解百分比的图。
图5D是根据本发明的一个实施方案的双特异性抗CD22 x抗CD3的示意性图示。
图6是示出随稀释度变化的血清滴度的一系列曲线图。
优选实施方案的详述
除非另有说明，否则本发明的实践将采用分子生物学(包括重组技术)、微生物学、细胞生物学、生物化学和免疫学的常规技术，所述技术在本领域技术人员的能力范围内。此类技术在诸如以下文献中进行了充分解释：“Molecular Cloning：A Laboratory Manual”，第二版(Sambrook等人，1989)；“Oligonucleotide Synthesis”(M.J.Gait，编辑，1984)；“Animal Cell Culture”R.I.Freshney，编辑，1987)；“Methods in Enzymology”(AcademicPress，Inc.)；“Current Protocols in Molecular Biology”(F.M.Ausubel等人，编辑，1987以及定期更新)；“PCR：The Polymerase Chain Reaction”，(Mullis等人，编辑，1994)；“A Practical Guide to Molecular Cloning”(Perbal Bernard V.，1988)；“PhageDisplay：A Laboratory Manual”(Barbas等人，2001)；Harlow，Lane和Harlow，UsingAntibodies：A Laboratory Manual：Portable Protocol No.I，Cold Spring HarborLaboratory(1998)；以及Harlow和Lane，Antibodies：A Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory；(1988)。
在提供值的范围的情况下，应理解除非上下文另外清楚地指示，否则本发明内涵盖所述范围的上限与下限之间的各***值(至下限单位的十分之一)和在所陈述的范围中的任何其他陈述值或***值。本发明内还涵盖可独立地包括于这些较小范围中的所述较小范围的上限和下限，从属于所陈述的范围中的任何具体排除的限值。当所陈述范围包括限值中的一者或两者时，本发明中还包括排除那些所包括的限值中的任一者或两者的范围。
除非另有说明，否则本文的抗体残基根据Kabat编号***(例如，Kabat等，Sequences of Immunological Interest.第五版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))编号。
在以下描述中，阐述大量具体细节以便提供本发明的更详尽的理解。然而，对于本领域技术人员将是清楚的：可在无一种或多种这些具体细节的情况下实施本发明。在其它情况下，并没有对本领域技术人员熟知的特征和熟知的程序进行描述，以避免使本发明不清楚。
贯穿本公开内容引用的所有参考文献，包括专利申请和出版物，均以引用的方式整体并入本文。
I.定义
“包含”是指组合物/方法/药盒中需要所列举的要素，但可包括其它要素以形成权利要求范围内的组合物/方法/药盒等。
“基本上由......组成”是指针对特定材料或步骤所描述的组合物或方法的范围的限制，其不会实质上影响本发明的一种或多种基本和新颖的特征。
“由......组成”是指从组合物、方法或药盒中排除权利要求中未指定的任何元素、步骤或成分。
本文的抗体残基是根据Kabat编号***和EU编号***编号的。当提及可变结构域中的残基(大致为重链的残基1-113)时，通常使用Kabat编号***(例如，Kabat等人，Sequences of Immunological Interest.第5版Public Health Service，NationalInstitutes of Health，Bethesda，Md.(1991))。“EU编号***”或“EU索引”通常在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用(例如，Kabat等人，同上中报告的EU索引)。“如Kabat中的EU索引”是指人IgG1 EU抗体的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体可变结构域中的残基编号的提及是指通过Kabat编号***进行的残基编号。除非本文另有说明，否则对抗体恒定结构域中的残基编号的提及是指通过EU编号***进行的残基编号。
如本文中所用，术语“单克隆抗体”是指从基本上同质的抗体群体获得的抗体，即，除了可能以少量存在的可能的天然发生的突变之外，构成群体的各个抗体是相同的。单克隆抗体是高度特异性的，针对单个抗原部位的。此外，与通常包括针对不同决定簇(表位)的不同抗体的常规(多克隆)抗体制剂相反，每种单克隆抗体针对抗原上的单一决定簇。根据本发明的单克隆抗体可通过最初由Kohler等人(1975)Nature 256：495描述的杂交瘤方法来制备，或者还可例如经由重组蛋白质产生方法(参见例如，美国专利号4,816,567)制备。
如与抗体结合使用的术语“可变的”是指抗体可变结构域的某些部分在抗体之间在序列上广泛不同并且用于每种特定抗体对其特定抗原的结合和特异性的事实。然而，变异性不是均匀地分布在抗体的可变结构域中。其集中在轻链和重链可变区中称为高变区的三个区段中。可变结构域的更高保守部分称为框架区(FR)。天然重链和轻链的可变结构域各自包含通过三个高变区连接的四个FR(主要采用β-折叠构型)，所述高变区形成连接β-折叠结构的环，并且在一些情况下形成β-折叠结构的一部分。每条链中的高变区通过FR紧密地保持在一起，并且与来自另一条链的高变区一起促成抗体的抗原结合位点的形成(参见Kabat等人，Sequences of Proteins of Immunological Interest，第5版Public HealthService，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991)。恒定结构域不直接参与抗体与抗原的结合，但表现出各种效应子功能，诸如抗体参与抗体依赖性细胞的细胞毒性(ADCC)。
当在本文中使用时，术语“高变区”是指抗体的负责抗原结合的氨基酸残基。高变区通常包含来自“互补决定区”或“CDR”的氨基酸残基(例如重链可变结构域中的残基31-35(H1)、50-65(H2)和95-102(H3)；Kabat等人，Sequences of Proteins of ImmunologicalInterest，第5版Public Health Service，National Institutes of Health，Bethesda，MD.(1991))和/或来自重链可变结构域中的“高变环”残基26-32(H1)、53-55(H2)和96-101(H3)的那些残基；Chothia混溶Lesk J.Mol.Biol.196：901-917(1987))。“框架区”或“FR”残基是除本文定义的高变区残基之外的那些可变结构域残基。
示例性CDR名称在本文中示出，然而本领域技术人员将理解，CDR的许多定义通常在使用中，包括Kabat定义(参见“Zhao等人A germline knowledge based computationalapproach for determining antibody complementarity determining regions.”MolImmunol.2010；47：694-700)，其是基于序列变异性并且是最常用的。Chothia定义是基于结构环区域的位置((Chothia等人“Conformations of immunoglobulin hypervariableregions.”Nature.1989；342：877-883)。目标替代CDR定义包括但不限于以下所公开的那些：Honegger，“Yet another numbering scheme for immunoglobulin variabledomains：an automatic modeling and analysis tool.”J Mol Biol.2001；309：657-670；Ofran等人“Automated identification of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics of CDRs and B cell epitopes.”JImmunol.2008；181：6230-6235；Almagro“Identification of differences in thespecificity-determining residues of antibodies that recognize antigens ofdifferent size：implications for the rational design of antibody repertoires.”J Mol Recognit.2004；17：132-143；以及Padlan等人“Identification of specificity-determining residues in antibodies.”Faseb J.1995；9：133-139.，所述文献各自明确地以引用的方式并入本文。
术语“仅有重链的抗体”和“重链抗体”在本文中可互换使用并且在最广泛的意义上，是指缺乏常规抗体轻链的抗体。所述术语具体包括但不限于在不存在CH1结构域的情况下包含VH抗原结合结构域以及CH2和CH3恒定结构域的同二聚体抗体；此类抗体的功能性(抗原结合)变体、可溶性VH变体、Ig-NAR(其包含一个可变结构域(V-NAR)的同二聚体和五个C样恒定结构域(C-NAR)及其功能片段)；和可溶性单结构域抗体(sUniDabsTM)。在一个实施方案中，仅有重链的抗体由可变区抗原结合结构域组成，所述可变区抗原结合结构域由框架1、CDR1、框架2、CDR2、框架3、CDR3和框架4组成。在另一个实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区以及CH2和CH3结构域组成。在另一个实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH2结构域组成。在另外的实施方案中，仅有重链的抗体由抗原结合结构域、至少部分铰链区和CH3结构域组成。其中CH2和/或CH3结构域被截短的仅有重链的抗体也包括在本文中。在另外的实施方案中，重链由抗原结合结构域和至少一个CH(CH1、CH2、CH3或CH4)结构域组成，但没有铰链区。仅有重链的抗体可呈二聚体形式，其中两条重链通过二硫键键合，否则彼此共价或非共价连接。仅有重链的抗体可以属于IgG亚类，但属于其它亚类的抗体，诸如IgM、IgA、IgD和IgE亚类，也包括在本文中。在特定的实施方案中，重链抗体属于IgG1、IgG2、IgG3或IgG4亚型，特别是IgG1亚型。在一个实施方案中，本文的仅有重链的抗体用作嵌合抗原受体(CAR)的结合(靶向)结构域。所述定义具体地包括由人免疫球蛋白转基因大鼠(UniRatTM)产生的仅有人重链的抗体(称为UniAbsTM)。UniAbsTM的可变区(VH)被称为UniDabsTM，是可与Fc区或血清白蛋白连接以用于开发具有多特异性、增强的滴度和延长的半衰期的新型治疗剂的通用构件块。由于同二聚体UniAbsTM缺少轻链并因而缺乏VL结构域，因此抗原被一个单一结构域(即重链抗体的重链的可变结构域(VH))识别。
如本文所用，术语“CD22”和“分化簇22”是指属于SIGLEC凝集素家族的分子，所述分子存在于成熟B细胞的表面上，并且在一些未成熟B细胞上存在的程度较小。术语“CD22”包括任何人和非人动物物种的CD22蛋白，并且尤其包括人CD22以及非人哺乳动物的CD22。
如本文中所用，术语“人CD22”包括人CD22(UniProt P20273)的任何变体、同种型和物种同源物，无论其来源或制备方式如何。因此，“人CD22”包括由细胞天然表达的人CD22和在用人CD22基因转染的细胞上表达的CD22。
术语“仅有重链的抗CD22抗体”、“仅CD22重链的抗体”、“抗CD22重链抗体”和“CD22重链抗体”在本文中可互换使用，是指如上文所定义的与CD22(包括如上文所定义的人CD22)免疫特异性结合的仅有重链的抗体。所述定义包括但不限于如上文所定义的由转基因动物(诸如表达人免疫球蛋白的转基因大鼠或转基因小鼠，包括产生人抗CD22 UniAbsTM抗体的UniRatsTM)产生的人重链抗体。
相对于参考多肽序列的“氨基酸序列同一性百分比(％)”定义为在比对序列以及必要时引入空位(实现最大序列同一性百分比)并且不将任何保守取代当作序列同一性的一部分后，候选序列中与参考多肽序列中的氨基酸残基相同的氨基酸残基的百分比。用于确定氨基酸序列同一性百分比的目的比对可以以在本领域技术人员的能力内的各种方式来实现，例如，使用公开可用的计算机软件，诸如BLAST、BLAST-2、ALIGN或Megalign(DNASTAR)软件。本领域技术人员可以确定用于比对序列的合适参数，包括在所比较的序列的全长上实现最大比对所需的任何算法。然而，出于本文的目的，使用序列比较计算机程序ALIGN-2产生氨基酸序列同一性百分比值。
“分离的”抗体是已从其天然环境的组分中鉴定和分离和/或回收的抗体。其天然环境的污染组分是会干扰抗体的诊断或治疗用途的物质，并且可包括酶、激素和其它蛋白质性质或非蛋白质性质的溶质。在优选实施方案中，抗体将被纯化至(1)如通过Lowry方法所测定的至少大于95重量％的抗体，最优选大于99重量％的抗体，(2)至足以获得通过使用旋转杯测序仪测定的N末端或内部氨基酸序列的至少15个残基的程度，或(3)至使用考马斯蓝染色或优选银染色在还原或非还原条件下通过SDS-PAGE测定的均一性。分离的抗体包括重组细胞内的原位抗体，因为抗体的天然环境的至少一种成分将不存在。然而，通常，通过至少一个纯化步骤制备分离的抗体。
本发明的抗体包括多特异性抗体。多特异性抗体具有不止一种结合特异性。术语“多特异性”具体地包括“双特异性”和“三特异性”，以及高级独立特异性结合亲和力，诸如高级多表位特异性，以及四价抗体和抗体片段。“多特异性”抗体具体地包括包含不同结合实体的组合的抗体以及包含不止一种相同结合实体的抗体。术语“多特异性抗体”、仅有重链的多特异性抗体”、“多特异性重链抗体”和“多特异性UniAbsTM”在本文中以最广义使用，并涵盖具有不止一种结合特异性的所有抗体。本发明的多特异性重链抗CD22抗体具体地包括与CD22蛋白(如人CD22)上的不止一个非重叠表位免疫特异性地结合的抗体。
“表位”是单个抗体分子所结合的抗原分子表面上的部位。通常，抗原具有几个或许多不同的表位并与许多不同的抗体反应。所述术语具体地包括线性表位和构象表位。
“表位作图”是鉴定抗体在其靶抗原上的结合位点或表位的过程。抗体表位可以是线性表位或构象表位。线性表位由蛋白质中连续的氨基酸序列形成。构象表位由在蛋白质序列中是不连续的，但在蛋白质折叠成其三维结构时聚集在一起的氨基酸形成。
“多表位特异性”是指与相同或不同靶标上的两个或更多个不同表位特异性地结合的能力。如上所述，本发明具体地包括具有多表位特异性的抗CD22重链抗体，即与CD22蛋白(如人CD22)上的两个或更多个非重叠表位结合的抗CD22重链抗体。术语抗原的“一个或多个非重叠表位”或“一个或多个非竞争性表位”在本文中定义为指被一对抗原特异性抗体中的一个成员识别但未被另一成员识别的一个或多个表位。识别非重叠表位的成对抗体或多特异性抗体上靶向相同抗原的抗原结合区不竞争与该抗原的结合，并且能够同时结合该抗原。
当两种抗体识别相同或空间上重叠的表位时，所述抗体与参考抗体结合“基本上相同的表位”。用于确定两个表位是否与相同或空间上重叠的表位结合的最广泛使用和快速的方法是竞争测定，其可使用标记的抗原或标记的抗体以所有数量的不同形式配置。通常，将抗原固定在96孔板上，并使用放射性标记物或酶标记物测量未标记的抗体阻断标记的抗体的结合的能力。
如本文中所用，术语“价”是指抗体分子中指定数目的结合位点。
“多价”抗体具有两个或更多个结合位点。因此，术语“二价”、“三价”和“四价”分别指存在两个结合位点、三个结合位点和四个结合位点。因此，根据本发明的双特异性抗体至少是二价的并且可以是三价、四价或另外地多价的。
许多种方法和蛋白质构型是已知的并用于制备双特异性单克隆抗体(BsMAB)、三特异性抗体等。
术语“双特异性三链抗体样分子”或“TCA”在本文中用于指包含三个多肽亚基、基本上由所述三个多肽亚基组成或由所述三个多肽亚基组成的抗体样分子，其中两个亚基包含单克隆抗体的一条重链和一条轻链或包含抗原结合区和至少一个CH结构域的此类抗体链的功能性抗原结合片段组成、基本上由其组成或由其组成。该重链/轻链对对第一抗原具有结合特异性。第三多肽亚基包含仅有重链的抗体、基本上由所述抗体组成或由所述抗体组成，所述抗体包含不存在CH1结构域的包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域的Fc部分，以及结合第二抗原的表位或第一抗原的不同表位的抗原结合结构域，其中此类结合结构域源自抗体重链或轻链的可变区或与所述可变区具有序列同一性。此类可变区的部分可由VH和/或VL基因区段、D和JH基因区段或JL基因区段编码。可变区可由重排的VHDJH、VLDJH、VHJL或VLJL基因区段编码。TCA蛋白质利用如上文所定义的仅有重链的抗体。
本文在最广泛的意义上使用术语“嵌合抗原受体”或“CAR”来指工程化受体，其将所需的结合特异性(例如单克隆抗体的抗原结合区或其它配体)移植到跨膜和细胞内信号传导结构域。通常，受体用于将单克隆抗体的特异性移植到T细胞上以产生嵌合抗原受体(CAR)。(J Natl Cancer Inst，2015；108(7)：dvj439；以及Jackson等人，Nature ReviewsClinical Oncology，2016；13：370-383。)
术语“人抗体”在本文中用于包括具有源自人种系免疫球蛋白序列的可变区和恒定区的抗体。本文的人抗体可包括不由人种系免疫球蛋白序列编码的氨基酸残基，例如通过体外随机或位点特异性诱变或通过体内体细胞突变引入的突变。术语“人抗体”具体地包括如上文所定义的由转基因动物诸如转基因大鼠或小鼠产生的具有人重链可变区序列的仅有重链的抗体，特别是由UniRatsTM产生的UniAbsTM。
“嵌合抗体”或“嵌合免疫球蛋白”意指包含来自至少两个不同Ig基因座的氨基酸序列的免疫球蛋白分子，例如包含由人Ig基因座编码的部分和由大鼠Ig基因座编码的部分的转基因抗体。嵌合抗体包括具有非人Fc区或人工Fc区的转基因抗体和人独特型抗体。可从已被工程化以产生此类嵌合抗体的本发明的动物中分离此类免疫球蛋白。
如本文中所用，术语“效应细胞”是指与免疫反应的认知和活化阶段相反的，参与免疫反应的效应阶段的免疫细胞。一些效应细胞表达特定的Fc受体并执行特定的免疫功能。在一些实施方案中，效应细胞诸如天然杀伤细胞能够诱导抗体依赖性细胞毒性(ADCC)。例如，表达FcR的单核细胞和巨噬细胞参与靶细胞的特异性杀伤并将抗原呈递给免疫***的其它成分，或与呈递抗原的细胞结合。在一些实施方案中，效应细胞可以吞噬靶抗原或靶细胞。
“人效应细胞”是表达诸如T细胞受体或FcR等的受体并执行效应子功能的白细胞。优选地，所述细胞至少表达FcγRIII并执行ADCC效应子功能。介导ADCC的人白细胞的实例包括天然杀伤(NK)细胞、单核细胞、细胞毒性T细胞和嗜中性粒细胞；其中NK细胞是优选的。可从其天然来源，例如，从如本文所述的血液或PBMC分离所述效应细胞。
术语“免疫细胞”在本文中以最广义使用，包括但不限于髓样或淋巴样来源的细胞，例如淋巴细胞(诸如B细胞和T细胞，包括溶细胞性T细胞(CTL))、杀伤细胞、天然杀伤(NK)细胞、巨噬细胞、单核细胞、嗜酸性粒细胞、多形核细胞，诸如嗜中性粒细胞、粒细胞、肥大细胞和嗜碱性粒细胞。
抗体“效应子功能”是指可归因于抗体的Fc区(天然序列Fc区或氨基酸序列变体Fc区)的那些生物活性。抗体效应子功能的实例包括C1q结合；补体依赖性细胞毒性；Fc受体结合；抗体依赖性细胞介导的细胞毒性(ADCC)；吞噬作用；细胞表面受体(例如，B细胞受体；BCR)的下调等。
“抗体依赖性细胞介导的细胞毒性”和“ADCC”是指其中表达Fc受体(FcR)的非特异性细胞毒性细胞(例如，自然杀伤(NK)细胞、嗜中性粒细胞和巨噬细胞)识别靶细胞上的结合的抗体，且随后引起靶细胞裂解的细胞介导的反应。介导ADCC的原代细胞NK细胞仅表达FcγRIII，而单核细胞表达FcγRI、FcγRII和FcγRIII。FcR在造血细胞上的表达概述于Ravetch和Kinet，Annu.Rev.Immunol 9：457-92(1991)的第464页上的表3中。为了评估目标分子的ADCC活性，可进行体外ADCC测定，诸如美国专利号5,500,362或5,821,337中描述的测定。用于此类测定的有用效应细胞包括外周血单核细胞(PBMC)和天然杀伤(NK)细胞。或者或另外，可例如在如Clynes等人PNAS(USA)95：652-656(1998)中公开的动物模型中体内评估相关分子的ADCC活性。
“补体依赖性细胞毒性”或“CDC”是指分子在补体存在的情况下裂解靶标的能力。补体活化途径通过补体***的第一组分(C1q)与和同源抗原复合的分子(例如，抗体)的结合而启始。为了评估补体活化，可进行例如Gazzano-Santoro等人，J.Immunol.Methods202：163(1996)中所述的CDC测定。
“结合亲和力”是指分子(例如抗体)的单个结合位点与其结合配偶体(例如，抗原)之间的非共价相互作用的总和的强度。除非另有说明，否则如本文中所用，“结合亲和力”是指内在结合亲和力，其反映结合对的成员(例如，抗体与抗原)之间的1∶1相互作用。分子X对其配偶体Y的亲和力通常可由解离常数(Kd)表示。亲和力可以通过本领域已知的常规方法测量。低亲和力抗体通常缓慢地结合抗原并且倾向于易于解离，而高亲和力抗体通常更快地结合抗原并且倾向于保持结合。
如本文中所用，“Kd”或“Kd值”是指以动力学模式使用Octet QK384仪(FortebioInc.，Menlo Park，CA)通过生物双层干涉测量法测定的解离常数。例如，向抗小鼠Fc传感器装载小鼠-Fc融合抗原，然后将其浸入含有抗体的孔中以测量浓度依赖性结合率(kon)。在最后步骤中测量抗体解离速率(koff)，其中将传感器浸入仅含有缓冲液的孔中。Kd是koff/kon的比率。(关于进一步的细节参见Concepcion，J等人，Comb Chem High ThroughputScreen，12(8)，791-800，2009)。
术语“治疗”、“医治”等在本文中通常用于指获得所需的药理学和/或生理学作用。就完全或部分预防疾病或其症状而言，该效果可以是预防性的和/或就部分或完全治愈疾病和/或可归因于疾病的不良作用而言可以是治疗性的。如本文中所用，“治疗”涵盖对哺乳动物疾病的任何治疗，包括：(a)预防疾病在可能易患该疾病但尚未被诊断为患有该疾病的受试者中发生；(b)抑制疾病，即阻止其发展；或(c)缓解疾病，即引起疾病的消退。治疗剂可以在疾病或损伤发作之前、期间或之后施用。其中治疗稳定或减少患者的不良临床症状的正在进行的疾病的治疗特别令人感兴趣。期望在受累组织中完全丧失功能之前进行此种治疗。主题疗法可以在疾病的症状阶段期间施用，并且在一些情况下在疾病的症状阶段之后施用。
“治疗有效量”旨在用于赋予受试者治疗益处所必需的活性剂的量。例如，“治疗有效量”是诱发、改善或以其它方式引起与疾病相关的病理症状、疾病进展或生理状况的改善或提高对病症的抗性的量。
在本发明的说明书文中，术语“B细胞肿瘤”或“成熟B细胞肿瘤”包括小淋巴细胞性淋巴瘤、B细胞淋前淋巴细胞淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病、套细胞淋巴瘤、伯基特氏淋巴瘤、滤泡性淋巴瘤、弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、多发性骨髓瘤、淋巴浆细胞性淋巴瘤、脾边缘区淋巴瘤、浆细胞肿瘤(诸如浆细胞骨髓瘤、浆细胞瘤)、单克隆免疫球蛋白沉积病、重链病、MALT淋巴瘤、***边缘B细胞淋巴瘤、血管内大B细胞淋巴瘤、原发性渗出性淋巴瘤、淋巴瘤样肉芽肿病、非霍奇金淋巴瘤、霍奇金淋巴瘤、毛细胞白血病、原发性渗出性淋巴瘤和与AIDS相关的非霍奇金淋巴瘤。
术语“受试者”、“个体”和“患者”在本文中可互换地用于指就治疗而进行评估和/或被治疗的哺乳动物。在一个实施方案中，哺乳动物是人。术语“受试者”、“个体”和“患者”包括但不限于患有癌症的个体、患有自身免疫性疾病、具有病原体感染的个体等。受试者可以是人，但也包括其它哺乳动物，特别是可用作人疾病的实验室模型的那些哺乳动物，例如，小鼠、大鼠等。
术语“药物制剂”是指这样的制剂，其形式为允许活性成分的生物活性有效，并且不包含对将向其施用所述制剂的受试者有不可接受的毒性的其它组分。此类制剂是无菌的。“药学上可接受的”赋形剂(媒介物、添加剂)是可以合理地施用于受试者哺乳动物以提供有效剂量的所用活性成分的那些。
“无菌”制剂是无菌的或不含或基本上不含所有活的微生物及其孢子。“冷冻”制剂是指温度低于0℃的制剂。
“稳定的”制剂是其中其中的蛋白质在储存后基本上保持其物理稳定性和/或化学稳定性和/或生物学活性的制剂。优选地，该制剂在储存后基本上保持其物理和化学稳定性以及其生物活性。通常基于制剂的预期贮存期限来选择贮存期。用于测量蛋白质稳定性的各种分析技术在本领域中是可用的，并且综述于例如Peptide and Protein DrugDelivery，247-301.Vincent Lee编辑，Marcel Dekker，Inc.，New York，N.Y.，Pubs.(1991)以及Jones.A.Adv.Drug Delivery Rev.10：29-90)(1993)中。可以在选定的温度下测量稳定性，持续选定的时间段。可以通过多种不同的方式定性和/或定量地评价稳定性，包括评价聚集体形成(例如，使用尺寸排阻色谱法，通过测量浊度和/或通过目测)；通过使用阳离子交换色谱、图像毛细管等电聚焦(icIEF)或毛细管区带电泳评估电荷异质性；氨基末端或羧基末端序列分析；质谱分析；比较还原抗体与完整抗体的SDS-PAGE分析；肽图谱(例如胰蛋白酶或LYS-C)分析；评价抗体的生物活性或抗原结合功能，等等。不稳定性可能涉及以下的任一种或多种：聚集、脱酰胺(例如，Asn脱酰胺作用)、氧化(例如，Met氧化)、异构化(例如，Asp异构化)、剪切/水解/片段化(例如，铰链区片段化)、琥珀酰亚胺形成、一个或多个未配对的半胱氨酸、N末端延伸、C末端加工、糖基化差异等。
II.详述
抗CD22抗体
本发明提供了与人CD22结合的紧密相关的仅有重链的抗体的家族。此家族的抗体包含如本文所定义和图1中所示的一组CDR序列，并且由图2中列出的SEQ ID NO：24至84的所提供的重链可变区(VH)序列例示。所述抗体家族提供许多有助于作为一种或多种临床治疗剂的效用的益处。所述抗体包括具有一系列结合亲和力的成员，从而允许选择具有所需亲和力的特定序列。
适合的抗体可选自本文提供的用于研发和治疗或其他用途的抗体，包括但不限于用作双特异性抗体，例如，如图5B所示；或三特异性抗体，或CAR-T结构的一部分。
对候选蛋白的亲和力的确定可使用本领域已知的方法(如Biacore测量)进行。所述抗体家族的成员可对CD22具有亲和力，其中Kd为约10-6至约10-11左右，包括但不限于：约10-6至约10-10左右；约10-6至约10-9左右；约10-6至约10-8左右；约10-8至约10-11左右；约10-8至约10-10左右；约10-8至约10-9左右；约10-9至约10-11左右；约10-9至约10-10左右；或这些范围内的任何值。可通过用于调节(例如阻断)CD22生物活性的生物评估(包括体外测定、临床前模型和临床试验以及潜在毒性的评估)来确认亲和力选择。
本文的抗体家族的成员不与食蟹猴的CD22蛋白交叉反应，但是如果需要，可进行工程化以提供与食蟹猴的CD22蛋白或与任何其他动物物种的CD22的交叉反应性。
本文的CD22特异性抗体的家族包含VH结构域，所述VH结构域包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列。作为一个实例，对于CDR1、CDR2和CDR3，所述CDR序列可分别位于SEQID NO：24至84中列出的所提供的示例性可变区序列的约氨基酸残基26-35；53-59；和98-117的区域中。本领域普通技术人员将理解，如果选择不同的框架序列，则所述CDR序列可处于不同的位置中，尽管通常序列的顺序将保持不变。
本发明的抗CD22抗体的CDR1、CDR2和CDR3序列可由以下结构式涵盖，其中X表示可变氨基酸，所述氨基酸可以是如下所示的特定氨基酸。
CDR1
G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6 Y
其中X1是D或G；
X2是S、T、I或N；
X3是S或D；
X4是G、S或N；
X5是D、G或S；并且
X6是Y或H。
CDR2
X7 X8 Y X9 G X10 X11
其中X7是I或V；
X8是Y或H；
X9是S或T；
X10是A、V或S；并且
X11是T或A。
CDR3
X12 R X13 D S S X14 W R S
其中X12是T、A或K；
X13是D或E；并且
X14是N或S。
代表性CDR1、CDR2和CDR3序列在图1和图3中示出。
在一些实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQ ID NO：1-10中的任一者的CDR1序列。在特定实施方案中，所述CDR1序列是SEQ ID NO：1。
在一些实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQ ID NO：11-17中的任一者的CDR2序列。在特定实施方案中，所述CDR2序列是SEQ ID NO：11。
在一些实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQ ID NO：18-23中的任一者的CDR3序列。在特定实施方案中，所述CDR2序列是SEQ ID NO：18。
在另一实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQ ID NO：1的CDR1序列、SEQ ID NO：11的CDR2序列和SEQ ID NO：18的CDR3序列。
在其他实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQID NO：24至84的任何重链可变区氨基酸序列(图2)。
在仍然另一实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体包含SEQ ID NO：24的重链可变区序列。
在一些实施方案中，本发明的仅有重链的抗CD22抗体中的CDR序列包含相对于SEQID NO：1至23中的任一者中的CDR1、CDR2和/或CDR3序列或一组CDR1、CDR2和CDR3序列(图1)的一个或两个氨基酸取代。在一些实施方案中，所述一个或多个氨基酸取代是相对于以上提供的式，CDR1的氨基酸位置4-6中的一个或两个，和/或CDR2的氨基酸位置2、4-7中的一个或两个，和/或CDR3的氨基酸位置5和12中的一个或两个多个。在一些实施方案中，本文的仅有重链的抗CD22抗体将包含与SEQ ID NO：24至84的任何重链可变区序列(图2所示)具有至少约85％同一性、至少90％同一性、至少95％同一性、至少98％同一性或至少99％同一性的重链可变区序列。
在一些实施方案中，提供了双特异性或多特异性抗体，所述双特异性或多特异性抗体可具有本文论述的任何构型，包括但不限于双特异性三链抗体样分子。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含对CD22具有结合特异性的至少一个重链可变区和对除CD22以外的蛋白质具有结合特异性的至少一个重链可变区。在一些实施方案中，双特异性抗体可包含对第一抗原具有结合特异性的重链/轻链对；和来自仅有重链的抗体的重链，所述仅有重链的抗体包含不存在CH1结构域的包含CH2和/或CH3和/或CH4结构域的Fc部分；以及与第二抗原的表位或所述第一抗原的不同表位结合的抗原结合结构域。在一个特定实施方案中，双特异性抗体包含对效应细胞上的抗原(例如，T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性的重链/轻链对，以及来自仅有重链的抗体的重链，所述仅有重链的抗体包含对CD22具有结合特异性的抗原结合结构域。
在一些实施方案中，当本发明的蛋白质是双特异性抗体时，所述抗体的一个臂(一个结合部分)对人CD22具有特异性，而另一个臂可对靶细胞、肿瘤相关抗原、靶向抗原(例如，整联蛋白等)、病原体抗原、检查点蛋白等具有特异性。靶细胞具体地包括癌细胞，包括但不限于来自血液肿瘤(例如B细胞肿瘤)的细胞，如下所述。
各种形式的双特异性抗体属于本发明的范围，包括但不限于单链多肽、双链多肽、三链多肽、四链多肽及其倍数。本文中的双特异性抗体具体地包括与在成熟B细胞上选择性地表达的CD22以及CD3结合的T细胞双特异性抗体(抗CD22 x抗CD3抗体)。此类抗体诱导有效T细胞介导的表达CD22的细胞的杀伤。
抗CD22重链抗体的制备
本发明的重链抗体可通过本领域已知的方法制备。在优选实施方案中，本文的重链抗体由其中内源性免疫球蛋白基因被敲除或失能的转基因动物(包括转基因小鼠和大鼠，优选为大鼠)产生。在优选实施方案中，在UniRatTM中产生本文的重链抗体。UniRatTM已使其内源性免疫球蛋白基因沉默，并使用人免疫球蛋白重链易位基因来表达多种天然优化的完全人HCAb库。尽管可使用多种技术将大鼠中的内源性免疫球蛋白基因座敲除或沉默，但在UniRatTM中，将锌指(内切)核酸酶(ZNF)技术用于使内源性大鼠重链J基因座、轻链Cκ因基因座和轻链Cλ因基因座失活。用于显微注射入***的ZNF构建体可产生IgH和IgL敲除(KO)品系。关于细节，参见例如Geurts等人，2009，Science 325：433。Ig重链敲除小鼠的表征已由Menoret等人，2010，Eur.J.Immunol.40：2932-2941报告。ZNF技术的有利方面在于，通过多达数个kb的缺失而欧珀莱房基因或基因座的非同源末端连接也可提供用于同源整合的靶位点(Cui等人，2011，Nat Biotechnol 29：64-67)。UniRatTM中产生的人重链抗体称为UniAbsTM并且可结合不能用常规抗体攻击的表位。它们的高特异性、亲和力和小尺寸使其非常适合单特异性和多特异性应用。
除UniAbsTM以外，本文还具体地包括缺乏骆驼科动物VHH框架和突变及其功能性VH区的仅有重链的抗体。可例如在如例如WO2006/008548中描述的包含仅有完全人重链的基因的基因座的转基因大鼠或小鼠中产生这样的仅有重链的抗体，但也可使用其它转基因哺乳动物，诸如兔、豚鼠、大鼠、大鼠和小鼠是优选的。还可通过重组DNA技术，通过在合适的真核或原核宿主，包括例如哺乳动物细胞(例如CHO细胞)、大肠杆菌或酵母中表达编码核酸来产生仅有重链的抗体，包括其VHH或VH功能性片段。
仅有重链的抗体的结构域组合了抗体和小分子药物的有利方面：可以是单价或多价的；具有低毒性；并且制造具有成本效益。由于它们的体积小，因此这些结构域易于施用，包括口服或局部施用，其特征在于高稳定性，包括胃肠道稳定性；并且其半衰期可根据所需用途或适应症进行调整。另外，可以以具有成本效益的方式制备HCAb的VH和VHH结构域。
在特定实施方案中，包括UniAbsTM在内的本发明的重链抗体在FR4区的第一位置(根据Kabat编号***的氨基酸位置101)处的天然氨基酸残基被另一个氨基酸残基(其能够破坏在该位置包含所述天然氨基酸残基或与所述天然氨基酸残基缔合的表面暴露的疏水补丁)取代。此类疏水补丁通常包埋在与抗体轻链恒定区的界面中，但在HCAb中暴露于表面，并且至少部分地造成不想要的HCAb的聚集和轻链缔合。取代的氨基酸残基优选为带电荷的，更优选为带正电荷的，诸如赖氨酸(Lys，K)、精氨酸(Arg，R)或组氨酸(His，H)，优选为精氨酸(R)。在优选实施方案中，源自转基因动物的仅有重链的抗体在位置101处含有Trp至Arg的突变。所得的HCAb优选在生理条件下在无聚集的情况下具有高抗原结合亲和力和溶解性。
作为本发明的一部分，鉴定了具有来自UniRatTM动物的独特序列的人IgG抗CD22重链抗体(UniAbsTM)，所述抗体在ELISA(重组CD22细胞外结构域)蛋白和细胞结合测定中结合人CD22。所鉴定的重链可变区(VH)序列(参见图2)对于人CD22蛋白结合和/或对于与CD22+细胞结合呈阳性，并且对于与不表达CD22的细胞结合都呈阴性。
本文所述的抗体结合CD22阳性伯基特淋巴瘤细胞系Daudi(
Figure BDA0002550227610000261
CCL-213TM)，并且一些抗体与食蟹猴的CD22蛋白具有交叉反应性。另外，如果需要，可对它们进行工程化以提供与任何动物物种的CD22的交叉反应性。
本文的抗CD22重链抗体(如UniAbsTM)可对CD22具有亲和力，其中Kd为约10-6至约10-11左右，包括但不限于：约10-6至约10-10左右；约10-6至约10-9左右；约10-6至约10-8左右；约10-8至约10-11左右；约10-8至约10-10左右；约10-8至约10-9左右；约10-9至约10-11左右；约10-9至约10-10左右；或这些范围内的任何值。可通过用于调节(例如阻断)CD22生物活性的生物评估(包括体外测定、临床前模型和临床试验以及潜在毒性的评估)来确认亲和力选择。
可通过竞争结合测定，如酶联免疫测定法(ELISA测定)或流式细胞术竞争性结合测定来鉴定与CD22蛋白上的非重叠表位结合的重链抗体，例如UniAbsTM。例如，可利用与靶抗原结合的已知抗体与目标抗体之间的竞争。通过使用这种方法，可以将一组抗体分为与参照抗体竞争的那些抗体和不与参照抗体竞争的那些抗体。非竞争性抗体被鉴定为与不与参照抗体所结合的表位重叠的独特表位结合。通常，将一种抗体固定，抗原被结合，在ELISA测定中测试第二标记的(例如生物素化的)抗体的结合捕获的抗原的能力。这也可使用表面等离离子体共振(SPR)平台(包括ProteOn XPR36(BioRad，Inc)、Biacore 2000和BiacoreT200(GE Healthcare Life Sciences))和MX96 SPR成像仪(Ibis technologies B.V.)以及在生物层干涉测量平台(诸如Octet Red384和Octet HTX(ForteBio，Pall Inc))上进行。对于进一步细节，参见本文的实施例。
通常，如果如通过标准技术，诸如通过上述竞争结合测定所测定的，抗体引起参考抗体与靶抗原的结合降低约15-100％，则其与参考抗体“竞争”。在各个实施方案中，相对抑制为至少约15％、至少约20％、至少约25％、至少约30％、至少约35％、至少约40％、至少约45％、至少约50％、至少约55％、至少约60％、至少约65％、至少约70％、至少约75％、至少约80％、至少约85％、至少约90％、至少约95％或更高。
药物组合物、用途和治疗方法
本发明的另一方面是提供包含与合适的药学上可接受的载体的混合的一种或多种本发明的抗体的药物组合物。本文中使用的药学上可接受的载体是示例性但不限于佐剂、固体载体、水、缓冲剂或本领域中用于保持治疗组分的其它载体，或其组合。
在一个实施方案中，药物组合物包含与CD22结合的重链抗体(例如，UniAbsTM)。在另一个实施方案中，药物组合物包含对CD22蛋白上的两个或更多个非重叠表位具有结合特异性的多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如，UniAbsTM)。在一个优选的实施方案中，药物组合物包含多特异性(包括双特异性)重链抗体(例如，UniAbsTM)，所述抗体对CD22具有结合特异性并且对效应细胞上的结合靶标(例如，T细胞上的接合靶标，例如像T细胞上的CD3蛋白)具有结合特异性。
通过将具有所需纯度的蛋白质与任选的药学上可接受的载体、赋形剂或稳定剂(参见，例如，Remington′s Pharmaceutical Sciences第16版，Osol，A.编辑(1980))混合来将根据本发明使用的抗体的药物组合物制备成诸如冻干制剂或水溶液形式以用于储存。可接受的稀释剂、载体、赋形剂和稳定剂在所使用剂量和浓度下对接受者无毒性，并且包括：诸如磷酸盐、柠檬酸盐和其它有机酸的缓冲剂；包括抗坏血酸和甲硫氨酸的抗氧化剂；防腐剂(诸如十八烷基二甲基苄基氯化铵；氯化六烃季铵；氯化苯甲烃铵、氯化苄乙氧铵；苯酚、丁醇或苄醇；诸如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯甲酸丙酯的对羟基苯甲酸烷基酯；儿茶酚；间苯二酚；环己醇；3-戊醇；及间甲酚)；低分子量(小于约10个残基)多肽；诸如血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白的蛋白质；诸如聚乙烯吡咯烷酮的亲水性聚合物；诸如甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、精氨酸或赖氨酸的氨基酸；单糖、二糖及其它碳水化合物，包括葡萄糖、甘露糖或糊精；诸如EDTA的螯合剂；诸如蔗糖、甘露醇、海藻糖或山梨糖醇的糖类；诸如钠的成盐抗衡离子；金属络合物(例如，Zn-蛋白质络合物)；和/或诸如TWEENTM、PLURONICSTM或聚乙二醇(PEG)的非离子表面活性剂。
用于肠胃外施用的药物组合物优选是无菌的并且基本上是等渗的，并且是在良好生产规范(GMP)条件下生产的。药物组合物可以以单位剂型(即，单次施用的剂量)提供。制剂取决于所选的施用途径。本文的抗体可以通过静脉内注射或输注或皮下施用。对于注射施用，可将本文的抗体配制在水溶液中，优选配制在生理相容的缓冲液中，以减少注射部位的不适感。溶液可包含如上所讨论的载体、赋形剂或稳定剂。或者，抗体可呈冻干形式，以在使用前用合适的媒介物例如无菌无热原的水复溶。
例如，在美国专利号9,034,324中公开了抗体制剂。类似的制剂可用于本发明的重链抗体，包括UniAbsTM。皮下抗体制剂描述于例如US20160355591和US20160166689中。
使用方法
本文所述的仅有重链的抗CD22抗体、多特异性抗体和药物组合物可用于治疗以CD22的表达为特征的疾病和疾患，包括但不限于本文进一步描述的疾患和疾病。本发明的方面还涉及本文所述的抗体在制备用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的药物中的用途。本发明的方面还涉及本文所述的抗体，所述抗体用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症。
CD22是在前B细胞和未成熟B细胞上以低水平表达、在成熟B细胞上最大表达并最终在浆细胞上下调的135-kDa的I型跨膜蛋白。(例如，Walker等人，Immunology，2008年3月；123(3)314-25)。CD22在滤泡性(原发性和继发性B细胞区)、套膜和边缘区B细胞中强烈表达，并且据报告在60％至80％的来自患有B细胞恶性肿瘤的患者的样品中存在(Alderson等人，Clin.Cancer Res 2009；15(3)February 11，2009)。由于其在许多血液***恶性肿瘤中观察到的表达，CD22是基于抗体的治疗剂的有希望的靶标。
在一个方面，本文的CD22重链抗体(例如，UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗以CD22的表达为特征的血液恶性肿瘤，包括但不限于弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)、非霍奇金淋巴瘤、B细胞慢性淋巴细胞性白血病(CLL)以及B细胞急性淋巴母细胞性白血病(ALL)。
弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL或DLBL)是成人中非霍奇金淋巴瘤的最常见形式(Blood 1997 89(11)：3909-18)，估计在美国和英国每年的发病率为每100,000人7至8例。它被表征为几乎可出现在身体的任何部位的侵袭性癌症。DLBCL的原因尚不十分清楚，并且它可能源于正常B细胞以及其他类型的淋巴瘤或白血病细胞的恶性转化。治疗方法通常涉及化学疗法和放射，并且导致成人的大约58％的总体五年存活率平均值。尽管一些单克隆抗体已显示出用于治疗DLBCL的前景，但尚未最终证明一致的临床功效。因此，非常需要用于DLBCL的新疗法，包括免疫疗法。
在另一方面，本文的CD22重链抗体(例如UniAbsTM)和药物组合物可用于治疗以表达CD22的病原性B细胞为特征的自身免疫病症，包括但不限于***性红斑狼疮(SLE)、类风湿性关节炎(RA)和多发性硬化症(MS)。
用于治疗疾病的本发明组合物的有效剂量根据许多不同因素而变化，所述因素包括施用方式、靶位点、患者的生理状态、患者是人还是动物、施用的其它药物以及治疗是预防性的还是治疗性的。通常，患者是人，但也可治疗非人哺乳动物，例如，伴侣动物诸如狗、猫、马等，实验室哺乳动物诸如兔、小鼠、大鼠等等。可以滴定治疗剂量以优化安全性和功效。
剂量水平可以由普通熟练的临床医生容易地确定，并且可以根据需要进行修改，例如，根据需要修改受试者对疗法的反应。可与载体材料组合以产生单一剂型的活性成分的量根据所治疗的宿主和特定的施用方式而变化。剂量单位形式通常含有约1mg至约500mg活性成分。
在一些实施方案中，所述药剂的治疗剂量可在约0.0001至100mg/kg的宿主体重，更常见地0.01至5mg/kg的宿主体重的范围内。例如，剂量可以是1mg/kg的体重或10mg/kg的体重或在1-10mg/kg的范围内。示例性治疗方案需要每两周施用一次或每月施用一次或每3至6个月施用一次。通常在多重情况下施用本发明的治疗性实体。单剂量之间的间隔可以是每周、每月或每年。如通过测量患者中治疗性实体的血液水平所指示的，间隔也可以是无规律的。或者，可将本发明的治疗性实体作为持续释放制剂施用，在该情况下需要较低频率的施用。剂量和频率根据患者中多肽的半衰期而变化。
通常，将组合物制备成可注射的，制备为液体溶液或混悬液；也可以制备适于在注射前溶解或悬浮在液体媒介物中的固体形式。本文的药物组合物适合于直接或在固体(例如，冻干的)组合物复溶后静脉内或皮下施用。如上所述，还可以乳化制剂或将其包封在脂质体或微粒(诸如聚丙交酯、聚乙交酯或共聚物)中，以增强佐剂效果。Langer，Science249：1527，1990和Hanes，Advanced Drug Delivery Reviews 28：97-119，1997。本发明的药剂可以以长效注射剂或植入制剂的形式施用，可以以诸如允许持续或脉冲释放活性成分的方式配制其。通常将药物组合物配制成无菌的、基本上等渗的并且完全遵从美国食品和药物管理局的所有优质生产规范(Good Manufacturing Practice)(GMP)条例。
本文所述的抗体和抗体结构的毒性可通过细胞培养物或实验动物中的标准药学方法，例如通过测定LD50(对50％群体致死的剂量)或LD100(对100％群体致死的剂量)来测定。毒性与治疗效果之间的剂量比是治疗指数。从这些细胞培养测定和动物研究获得的数据可用于配制对在人中使用无毒的剂量范围。本文所述抗体的剂量优选在包括有效剂量且几乎没有毒性或没有毒性的循环浓度范围内。剂量可根据所用的剂型和所用的给药途径在此范围内变化。确切的制剂、施用途径和剂量可以由个体医生根据患者的状况选择。
用于施用的组合物通常包含溶解在药学上可接受的载体(优选含水载体)中的抗体或其它消融剂。可以使用各种含水载体，例如缓冲盐水等。这些溶液是无菌的并且通常没有不希望的物质。这些组合物可以通过常规的熟知的灭菌技术来灭菌。所述组合物可含有接近生理条件所需的药学上可接受的辅助物质，诸如pH调节剂和缓冲剂、毒性调节剂等，例如乙酸钠、氯化钠、氯化钾、氯化钙、乳酸钠等。这些制剂中活性剂的浓度可以广泛变化，并且将根据所选择的特定施用方式和患者的需要，主要基于流体体积、粘度、体重等来选择(例如，Remington′s Pharmaceutical Science(第15版，1980)和Goodman&Gillman，ThePharmacological Basis of Therapeutics(Hardman等人，编辑，1996))。
包括本发明的活性剂及其制剂和使用说明书的药盒也在本发明的范围内。所述药盒还可含有至少一种另外的试剂，例如，化学治疗药物等。药盒通常包括指示药盒内容物的预期用途的标记。如本文所用的术语“标记”包括在药盒上或与药盒一起或另外伴随药盒提供的任何书面或记录材料。
现在充分描述了本发明，对于本领域普通技术人员显而易见的是，在不脱离本发明的精神或范围的情况下，可进行各种改变和修改。
实施例
材料和方法
CD22蛋白结合
使用生物双层干涉测量法在Octet QK-384***(ForteBio)上进行测定抗原-抗体亲和力的动力学结合实验。在测定缓冲液(1x PBS，0.1％BSA，0.02％Tween-20，pH 7.2)中水合抗人IgG Fc捕获(AHC)生物传感器(Forte Bio，部件号：18-5064)，并在100mM甘氨酸pH1.5中进行预处理。在测定缓冲液中建立基线，持续120秒。然后用浓度为5μg/mL为的UniAbsTM固定AHC生物传感器120秒。在测定缓冲液中建立另一个基线(120秒)。接着，然后将其从250nM开始浸入人CD22蛋白于测定缓冲液中的7-点、1∶2系列稀释液中。分析物柱的最后一个孔仅含有测定缓冲液以测试缓冲液与加载的生物传感器之间的非特异性结合，并用作参考孔。观察缔合600秒，然后观察解离900秒。使用Octet Data Analysis v9.0(ForteBio)进行数据分析。使用标准的1∶1结合模型分析结合动力学。
CD22细胞结合
使用Daudi细胞系(ATCC)通过流式细胞术(Guava easyCyte 8HT，EMD Millipore)评估与CD22阳性细胞的结合。简言之，在4℃下用纯化的UniAbsTM系列稀释液对100,000个靶细胞染色30分钟。孵育后，将细胞用流式细胞术缓冲液(1X PBS，1％BSA，0.1％NaN3)洗涤两次，并用缀合至R-藻红蛋白(PE)的山羊F(ab′)2抗人IgG(Southern Biotech，目录号2042-09)染色以检测细胞结合的抗体。在4℃下孵育20分钟后，将细胞用流式细胞术缓冲液洗涤两次，然后通过流式细胞术测量平均荧光强度(MFI)。使用GraphPad Prism 7计算EC50值。使用具有以下修改的相同方案测定与食蟹猴CD22阳性细胞的结合：靶细胞来自被稳定地转染以表达食蟹猴CD22的细胞外结构域的CHO细胞，并且在单一浓度(约1.7μg/mL)下测试每种抗体，因此未计算EC50值。
实施例1：表达仅有重链的抗体的遗传工程化大鼠
构建‘人-大鼠’IgH基因座并组装在若干部分中。这涉及修饰大鼠C区基因并将其连接在人JH下游，随后在上游添加人VH6-D-区段区域。然后将具有单独的人VH基因簇的两个BAC[BAC6和BAC3]与称为Georg的编码包含人VH6、所有D、所有JH和经修饰的大鼠Cγ2a/1/2b(ΔCH1)的组装和修饰区域的BAC共注射。
产生携带呈未重排构型的人工重链免疫球蛋白基因座的转基因大鼠。IgG2a(ΔCH1).、IgG1(ΔCH1).、IgG2b(ΔCH1)基因缺乏CH1区段。恒定区基因IgE、IgA和3′增强子包含在Georg BAC中。转基因大鼠的RT-PCR和血清分析(ELISA)揭示了转基因免疫球蛋白基因座的生产性重排和各种同种型的仅有重链的抗体在血清中的表达。将转基因大鼠与先前在美国专利公布2009/0098134 A1中描述的具有突变的内源性重链和轻链基因座的大鼠杂交。对此类动物的分析证明了大鼠免疫球蛋白重链和轻链表达的失活以及具有由人V、D和J基因编码的可变区的重链抗体的高水平表达。转基因大鼠的免疫接种导致产生抗原特异性重链抗体的高滴度血清响应。这些表达具有人VDJ区域的重链抗体的转基因大鼠被称为UniRatsTM。
实施例2：免疫接种
用CD22的重组细胞外结构域进行免疫接种。
用重组人CD22蛋白免疫接种12只UniRat动物(6只HC27，6只HC28)。根据标准方案使用Titermax/铝胶佐剂免疫接种动物。CD22的重组细胞外结构域购自R&D Systems并将其用无菌盐水稀释并与佐剂合并。将免疫原与Titermax和铝胶佐剂合并。在左腿和右腿中施用利用Titermax中的免疫原的第一免疫接种(初免)。随后的加强免疫在铝胶存在的情况下进行，并且在收获前三天用PBS中的免疫原进行加强。在最终出血时从大鼠收集血清以测定血清滴度。
血清滴度结果
血清滴度总结信息在图6中示出。在图6中描绘的图中，每条线表示单个动物。所述图的图例显示每个单个动物的ID号。通过ELISA测试针对huCD22+Fc蛋白、huCD22+His标签、恒河猴CD22+His标签蛋白和His标签脱靶蛋白的血清8-点稀释系列的结合活性。在这组动物中，观察到了对人和恒河猴CD22蛋白的一系列血清反应性水平。还观察到对His蛋白标签的血清应答。
实施例3：与表达CD22的细胞系的结合
图4总结本文所述的仅有重链的抗CD22抗体的靶结合活性。第1列表示仅有重链的抗CD22抗体的克隆ID号。第2列指示以摩尔浓度测量的对蛋白质的结合亲和力(KD)。第3列表示以秒测量的与蛋白质的结合的解离常数(K-解离速率)。第4列指示与Daudi细胞的结合，所述结合测量为相对于本底MFI信号的倍数。第5列指示与稳定表达食蟹猴CD22的CHO细胞的结合，所述结合测量为相对于本底MFI信号的倍数。第6列指示与不表达CD22蛋白的CHO细胞的结合，所述结合测量为相对于本底MFI信号的倍数。
实施例4：双特异性抗体通过活化的T细胞的重定向介导人肿瘤细胞的杀伤
对三种不同的CD22阳性伯基特淋巴瘤肿瘤细胞系(Daudi、Raji和Ramos)进行了染料标记，并在存在预先活化的人T细胞的情况下，将其与增加量的双特异性抗体一起孵育。双特异性抗体由与抗CD22VH结合结构域配对的抗CD3结合臂组成，如图5D以示意图所示。阴性对照抗体包含不与CD22结合的VH结合结构域。CD22阴性的K562细胞未表现出特异性裂解(数据未示出)。图5A中示出与阴性对照相比，来自三种双特异性抗体的数据，所述三种双特异性抗体掺入了与同一抗CD3结合结构域配对的三个不同的抗CD22仅有重链的结合结构域，并且证明通过活化的T细胞的重定向，抗体介导的CD22阳性Daudi肿瘤细胞的杀伤。图5B中示出与阴性对照相比，来自两种双特异性抗体的数据，所述两种双特异性抗体掺入了与两个不同的抗CD3结合结构域配对的同一抗CD22仅有重链的结合结构域，并且证明通过活化的T细胞的重定向，抗体介导的CD22阳性Raji肿瘤细胞的杀伤。图5C中示出与阴性对照相比，来自两种双特异性抗体的数据，所述两种双特异性抗体掺入了与两个不同的抗CD3结合结构域配对的同一抗CD22仅有重链的结合结构域，并且证明通过活化的T细胞的重定向，抗体介导的CD22阳性Ramos肿瘤细胞的杀伤。
尽管本文已示出和描述了本发明的优选实施方案，但对于本领域技术人员来说将显而易见，此类实施方案仅作为举例提供。本领域技术人员现在将想到许多变化、改变和取代而不偏离本发明。应当理解的是，可在实践本发明时采用在本文中描述的本发明的实施方案的各种替代方案。以下权利要求书意图限定本发明的范围，并且这些权利要求范围内的方法和结构以及其等效物意图由其涵盖。

Claims (35)

1.一种与CD22结合的仅有重链的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：
(a)CDR1，所述CDR1在SEQ ID NO:1至10的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代；和/或
(b)CDR2，所述CDR2在SEQ ID NO:11至17的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代；和/或
(c)CDR3，所述CDR3在SEQ ID NO:18至23的氨基酸序列中的任一者中具有两个或更少取代。
2.如权利要求1所述的仅有重链的抗体，其中所述CDR1、CDR2和CDR3序列存在于人框架中。
3.如权利要求1所述的仅有重链的抗体，所述抗体在不存在CH1序列的情况下还包含重链恒定区序列。
4.如权利要求1-3中任一项所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含：
(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和/或
(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；和/或
(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。
5.如权利要求4所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含：
(a)选自由SEQ ID NO:1至10组成的组的CDR1序列；和
(b)选自由SEQ ID NO:11至17组成的组的CDR2序列；以及
(c)选自由SEQ ID NO:18至23组成的组的CDR3序列。
6.如权利要求5所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含：
(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:18的CDR3序列；或
(b)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:12的CDR2序列和SEQ ID NO:19的CDR3序列；或
(c)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:12的CDR2序列和SEQ ID NO:20的CDR3序列。
7.如权利要求1-3中任一项所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含与SEQ ID NO:24至84的序列中的任一者具有至少95％序列同一性的重链可变区。
8.如权利要求7所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含选自由SEQ ID NO:24至84组成的组的重链可变区序列。
9.如权利要求8所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含SEQ ID NO:24的重链可变区序列。
10.一种与CD22结合的仅有重链的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含重链可变，所述重链可变包含：
(a)具有下式的CDR1序列：
G X1 S I X2 X3 X4 X5 X6 Y
其中X1是D或G；
X2是S、T、I或N；
X3是S或D；
X4是G、S或N；
X5是D、G或S；并且
X6是Y或H；以及
(b)具有下式的CDR2序列：
X7 X8 Y X9 G X10 X11
其中X7是I或V；
X8是Y或H；
X9是S或T；
X10是A、V或S；并且
X11是T或A；以及
(c)具有下式的CDR3序列：
X12 R X13 D S S X14 W R S
其中X12是T、A或K；
X13是D或E；并且
X14是N或S。
11.一种与CD22结合的仅有重链的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列是在选自由SEQ ID NO:1-23组成的组的CDR序列中具有两个或更少取代的序列。
12.如权利要求11所述的仅有重链的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含人VH框架中的CDR1、CDR2和CDR3序列，其中所述CDR序列选自由SEQ ID NO:1-23组成的组。
13.一种与CD22结合的仅有重链的抗体，所述抗体包含重链可变区，所述重链可变区包含：人VH框架中的
(a)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:11的CDR2序列和SEQ ID NO:18的CDR3序列；或
(b)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:12的CDR2序列和SEQ ID NO:19的CDR3序列；或
(c)SEQ ID NO:1的CDR1序列、SEQ ID NO:12的CDR2序列和SEQ ID NO:20的CDR3序列。
14.如权利要求1至13中任一项所述的仅有重链的抗体，所述抗体是多特异性的。
15.如权利要求14所述的仅有重链的抗体，所述抗体是双特异性的。
16.如权利要求15所述的仅有重链的抗体，所述抗体对两种不同的CD22蛋白具有结合亲和力。
17.如权利要求15所述的仅有重链的抗体，所述抗体对同一CD22蛋白上的两个不同的表位具有结合亲和力。
18.如权利要求14所述的仅有重链的抗体，所述抗体对效应细胞具有结合亲和力。
19.如权利要求14所述的仅有重链的抗体，所述抗体对T细胞抗原具有结合亲和力。
20.如权利要求19所述的仅有重链的抗体，所述抗体对CD3具有结合亲和力。
21.如权利要求1至20中任一项所述的仅有重链的抗体，所述抗体呈CAR-T形式。
22.一种药物组合物，所述药物组合物包含如权利要求1至21中任一项所述的仅有重链的抗体。
23.一种用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的方法，所述方法包括向患有所述病症的受试者施用如权利要求1至21中任一项所述的抗体或如权利要求22所述的药物组合物。
24.如权利要求1至21中任一项所述的抗体在制备用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症的药物中的用途。
25.如权利要求1至21中任一项所述的抗体，所述抗体用于治疗以CD22的表达为特征的B细胞病症。
26.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述病症是弥漫性大B细胞淋巴瘤(DLBCL)。
27.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述病症是非霍奇金淋巴瘤(NHL)。
28.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述病症是***性红斑狼疮(SLE)。
29.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述病症是类风湿性关节炎(RA)。
30.如权利要求23-25中任一项所述的方法，其中所述病症是多发性硬化症(MS)。
31.一种多核苷酸，所述多核苷酸编码如权利要求1至21中任一项所述的抗体。
32.一种载体，所述载体包含如权利要求31所述的多核苷酸。
33.一种细胞，所述细胞包含如权利要求32所述的载体。
34.一种产生如权利要求1至21中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括在允许所述抗体表达的条件下生长根据权利要求31所述的细胞，以及从所述细胞中分离所述抗体。
35.一种制备如权利要求1至21中任一项所述的抗体的方法，所述方法包括用CD22对UniRat动物进行免疫接种，以及鉴定结合CD22的重链序列。
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