CN111683523B

CN111683523B - 病毒抗性植物及其制备方法

Info

Publication number: CN111683523B
Application number: CN201980011387.1A
Authority: CN
Inventors: 新子泰规; 中原健二; 山田哲也; 增田税
Original assignee: Kikkoman Corp; Hokkaido University NUC
Current assignee: Kikkoman Corp; Hokkaido University NUC
Priority date: 2018-02-02
Filing date: 2019-01-31
Publication date: 2023-07-14
Anticipated expiration: 2039-01-31
Also published as: JP7264832B2; US20210123071A1; CN111683523A; WO2019151417A1; KR20200112957A; CL2020001982A1; KR102517095B1; EP3760037A4; JPWO2019151417A1; EP3760037A1; US11814639B2

Abstract

本发明的目的是提供黄瓜花叶病毒(CMV)抗性茄科植物。本发明提供具有突变型eIF4E基因的CMV抗性茄科植物，所述突变型基因编码对CMV无功能的eIF4E蛋白。本发明还提供CMV抗性植物的制备方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变。

Description

病毒抗性植物及其制备方法

技术领域

本发明涉及植物病毒抗性植物，尤其涉及茄科的黄瓜花叶病毒(CMV)抗性植物。本发明还涉及这样的病毒抗性植物的制备方法。

背景技术

黄瓜花叶病毒(Cucumber mosaic virus，下称CMV)是一种在番茄(Solanumlycopersicum)等茄科作物或黄瓜(Cucumis sativas L.)等多种作物中引发严重疾病的植物病毒。CMV主要由蚜虫传播，感染1000种以上的植物、作物，使全世界温带、亚热带和热带地区的重要农作物遭受经济损失。该病毒一旦感染作物，在感染部位增殖后，通过维管束尤其是筛管扩散到全株，引起花叶、黄化、蕨叶(fernleaf)、矮化、坏疽等症状，果实、叶的品质和产量降低。例如，有报道称，1987年，在意大利、西班牙的番茄主要产地突然发生CMV，已坐果的番茄果实几乎全部受害，陷入毁灭性状况。还有在印度尼西亚和韩国辣椒、菜椒也严重受害于CMV的报道。此外，日本也存在防治疏忽而发病的情况。

对于这样感染多种作物、导致经济损失的CMV的感染，保护植物抵挡其的技术却不多见。杀菌剂等对绝大部分的植物病毒无效。此外，作为对包括CMV在内的多种常见植物病毒的防治方法，可举出用防虫网等阻挡蚜虫这类媒介昆虫侵入的方法、用农药等杀虫的方法，但却难以完全防治病毒病。

宿主基因也与植物病毒的感染有关，不仅有遗传学上显性的病毒抗性(自烟草分离的、阻止烟草花叶病毒感染扩大的N基因等)，而且也发现了隐性遗传的病毒抗性。作为该现象的代表，可举出马铃薯Y病毒(Potyvirus)科的病毒及作为与其对应的抗性基因的eIF4E家族(eIF4E、eIF(iso)4E等)之间的关系。马铃薯Y病毒科的病毒非常多，分化并存在有感染各种植物的马铃薯Y病毒。而且，eIF4E是一种真核翻译起始因子(eukaryotictranslation initiation factor)，是宿主的翻译起始因子。例如，马铃薯Y病毒科的芫菁花叶病毒(Turnip mosaic virus)为了翻译用于自身复制的RNA依赖性RNA聚合酶等各种病毒蛋白质，要使病毒RNA与植物脂质体结合，其以此为目的而利用宿主植物的翻译起始因子。此外，还已知eIF4E还是病毒复制和细胞间移动所必需的。因此，该宿主翻译基因的缺陷可以赋予病毒抗性。

此前显示，在模式植物拟南芥、茄科的烟草属、番茄、辣椒等中，通过实际地突变eIF4E家族基因，获得了对马铃薯Y病毒科病毒的抗性(非专利文献1和2等)。但是，关于对CMV的抗性，仅限于在拟南芥中确认到，在包括番茄在内的其他植物中尚未发现。特别地，非专利文献1虽然涉及番茄中的马铃薯Y病毒感染和eIF4E1及eIF4E2的敲低，但其中记载：在eIF4E或eIF(iso)4E被沉默的转基因株中，CMV等马铃薯Y病毒科以外的病毒感染并未变弱，因此认为病毒感染循环中eIF4E的参与仅限于马铃薯Y病毒科(非专利文献1，第4页左栏12～15行等)。而且，还报道了在向黄瓜导入使eIF4E的功能完全丧失的突变时，虽然赋予了针对CVYV(黄瓜黄脉病毒，cucumber vein yellow virus)、ZYMV(小西葫芦黄化花叶病毒，Zucchini yellow mosaic virus)、PRSV(木瓜环斑花叶病毒，Papaya ring spot mosaicvirus)的抗性，但并未赋予对CMV的抗性(非专利文献3，尤其是表2)。

现有技术文献

非专利文献

非专利文献1：Mazier等，(2011)PLOS ONE 6:e29595

非专利文献2：Sato等，(2005)FEBS Lett.579(5):1167-1171.

非专利文献3：J.Chandrasekaran等，(2016)Molecular Plant Pathology,17(7):1140-1153

发明内容

发明所要解决的课题

被认为是由对eIF4E家族基因的抑制所产生的病毒抗性随该基因的各同源物、宿主而异。而且，绝大部分是针对马铃薯Y病毒科的植物病毒的抗性，番茄中所发现的仅限于针对马铃薯病毒Y(PVY)、辣椒斑驳病毒(PepMov)、烟草蚀纹病毒(TEV)等的抗性。另一方面，没有确认到对属于其他科的病毒的CMV的抗性。CMV虽然与马铃薯Y病毒科的病毒同属RNA病毒，，但是其基因构成差异很大，基因组RNA也与马铃薯Y病毒的形态不同。马铃薯Y病毒科的病毒是一节段基因组，而CMV由三节段基因组构成，每个节段分别形成病毒颗粒，所有颗粒、节段聚齐进行感染增殖。虽然由CMV造成的病害是呈现严重症状的重要病害，但是迄今为止，即使不限于翻译起始因子，在作物中也几乎没有发现抗性基因，在茄科中更是完全不存在。因此，CMV的防治仅依赖于防治媒介昆虫蚜虫，制备出抗性品种是育种现场所期望的。

基于上述背景，本发明的课题是提供CMV抗性茄科植物及其制备方法、用于制备CMV抗性茄科植物的突变型基因及它们的用途。

用于解决课题的手段

为了解决上述课题，本申请的发明人进行了深入研究，结果制备出了在茄科植物番茄的eIF4E的特定同源物的规定位点具有突变的个体，确认到向该个体接种CMV时其长期具有CMV抗性，由此完成了本发明。茄科中的上述CMV抗性植物属于首次报道。

即，本发明涉及以下的项：

(1)CMV抗性茄科植物，其具有突变型eIF4E基因，所述突变型eIF4E基因编码对黄瓜花叶病毒(CMV)无功能的eIF4E蛋白。

(2)如(1)所述的CMV抗性茄科植物，其为茄属植物。

(3)如(1)或(2)所述的CMV抗性植物，所述植物为番茄，所述突变型eIF4E基因为番茄3号染色体上的eIF4E基因。

(4)如(1)～(3)中任一项所述的CMV抗性植物，所述突变型eIF4E基因在外显子2的碱基序列中具有以下任一种以上的突变：

(a)移码突变

(b)无义突变

(c)连续或不连续的3n个碱基(n＝1～7)的缺失

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***。

(5)如(1)～(4)中任一项所述的CMV抗性植物，所述植物为番茄，所述突变型eIF4E基因具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列(序列号2)中的选自下组的突变，所述组由1个碱基的***、3个碱基的缺失、和9个碱基的缺失组成。

(6)如(1)～(4)中任一项所述的CMV抗性植物，所述植物为番茄，所述突变型eIF4E基因具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变，所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基的***、第16～18位的3个碱基的缺失、和第8～18位中任意9个碱基的缺失组成。

(7)黄瓜花叶病毒(CMV)抗性植物的制备方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变。

(8)如(7)所述的CMV抗性植物的制备方法，所述植物为番茄，所述突变步骤为使番茄3号染色体上的eIF4E基因突变的步骤。

(9)如(7)或(8)所述的CMV抗性植物的制备方法，所述突变步骤为向eIF4E基因的外显子2的碱基序列中导入以下任一种以上的突变的步骤：

(a)移码突变

(b)无义突变

(c)连续的或不连续的3n个碱基(n＝1～7)的缺失

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***。

本发明还涉及以下的项：

(10)如(1)～(4)中任一项所述的CMV抗性植物的加工品。

(11)黄瓜花叶病毒(CMV)抗性植物的加工品的制造方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变。

(12)如(11)所述的加工品的制造方法，所述植物为番茄，所述突变步骤为使番茄3号染色体上的eIF4E基因突变的步骤。

(13)如(11)或(12)所述的加工品的制造方法，所述突变步骤为向eIF4E基因的外显子2的碱基序列中导入以下任一种以上的突变的步骤：

(a)移码突变

(b)无义突变

(c)连续或不连续的3n个碱基(n＝1～7)的缺失

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***。

本发明还涉及以下的项：

(14)突变型eIF4E基因，其编码对黄瓜花叶病毒(CMV)无功能的eIF4E蛋白。

(15)如(14)所述的突变型eIF4E基因，其源自茄科植物。

(16)如(14)或(15)所述的突变型eIF4E基因，其源自番茄3号染色体上的eIF4E基因。

(17)如(14)～(16)中任一项所述的突变型eIF4E基因，其在外显子2的碱基序列中具有以下任一种以上的突变：

(a)移码突变

(b)无义突变

(c)连续的或不连续的3n个碱基(n＝1～7)的缺失

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***。

(18)如(14)～(17)中任一项所述的突变型eIF4E基因，其源自番茄，其具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2的碱基序列(序列号2)中的选自下组的突变，所述组由1个碱基的***、3个碱基的缺失、和9个碱基的缺失组成。

(19)如(14)～(18)中任一项所述的突变型eIF4E基因，其源自番茄，其具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变，所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基的***、第16～18位的3个碱基缺失、和第8～18位中任意9个碱基的缺失组成。

(20)如(14)～(19)中任一项所述的突变型eIF4E基因在CMV抗性茄科植物的制备中的用途。

(21)如(1)～(6)中任一项所述的CMV抗性茄科植物在茄科植物的加工品的制造中的用途。

(22)茄科植物的植物细胞，其具有如(14)～(19)中任一项所述的突变型eIF4E基因。

(23)如(1)～(6)中任一项所述的CMV抗性茄科植物的植物细胞的制备方法。

(24)如(1)～(6)中任一项所述的CMV抗性茄科植物的种子的制备方法。

(25)如(14)～(19)中任一项所述的突变型eIF4E基因在CMV抗性茄科植物的种子的制备中的用途。

(26)载体、启动子或试剂盒，其包含如(14)～(19)中任一项所述的突变型eIF4E基因。

(27)如(26)所述的载体、启动子或试剂盒在CMV抗性茄科植物、其植物细胞、其植物种子或其后代的制备中的用途。

发明效果

通过本发明可以提供CMV抗性茄科植物及其制备方法、用于制备CMV抗性茄科植物的突变型基因以及它们的用途。

附图说明

[图1]示出了与野生型番茄3号染色体中存在的eIF4E的mRNA序列对应的碱基序列(序列号1)。实际的RNA中，图中的T(胸腺嘧啶)为U(尿嘧啶)。以波浪线示出的位置(166个碱基)是外显子2的碱基序列(序列号2)，阴影部分是编辑靶位点(序列号3)。从图中矩形框内TGG(PAM序列)的3个碱基前存在的碱基(A)起，上游被编辑。

[图2]图2是示出A127品系的6个个体、B95品系的4个个体、B100品系的5个个体(均为T1个体)进行CMV接种26天后的病毒积蓄量的图。对A127-1从4个部位取样，其他品系从2个部位取样，对上述样品使用抗CMV抗体测量ELISA值(吸光值)，确认到了A127-1和A127-8的CMV抗性。

[图3]图3是示出A127品系的18个个体(均为T1个体)进行CMV接种20天后的病毒积蓄量的图。使用抗CMV抗体测量ELISA值(吸光值)，确认到了A127-14、A127-21和A127-24的CMV抗性。

[图4]图4是示出A132品系的5个个体、A143品系的4个个体(均为T1个体)进行CMV接种30天后的病毒积蓄量的图。使用抗CMV抗体测量ELISA值(吸光值)，确认到了A132-1和A132-5的CMV抗性。

[图5]图5是示出A127品系的T1个体进行CMV接种23天后的症状的照片。图5a：无症状的A127-8。图5b：观察到花叶、黄化和叶萎缩的A127-2。

[图6-1]图6-1示出了A127-14、A127-21和A127-24的T1个体的3号染色体上存在的eIF4E基因中编辑位点附近的序列分析结果。各组序列中，最上方的是野生型(WT)序列。图中有上划线的位置是编辑靶位点，方框框住的碱基示出了较之野生型的突变。

[图6-2]图6-2示出了A132-1和A132-5的T1个体的3号染色体上存在的eIF4E基因中编辑位点附近的序列分析结果。各组序列中，最上方的是野生型(WT)序列。图中有上划线的位置是编辑靶位点，方框框住的碱基示出了较之野生型的突变。

[图7]图7是示出A132品系的4个个体和A143品系的3个个体(均为T1个体)进行PVY接种24天后的病毒积蓄量的图。使用抗PVY抗体测量ELISA值(吸光值)，所有个体都确认到PVY抗性。

[图8]图8是确认了实施例5中各T2世代的CMV抗性的图。基于目测发病率和基于ELISA(病毒积蓄度)检测的感染率这二者确定了患病率。因此，患病率显示了发病率和感染率的总和。括号内的数字显示了供实验的株数。

[图9-1]图9-1是将实施例6中来自A132-5和A127-24的各T2世代的基于目测和ELISA的患病率与野生型对照进行比较的图。需要说明，由于确认到发病的植株全部都是ELISA阳性，在发病率与病毒感染率相同的情况下，仅示出发病率。

[图9-2]图9-2示出了实施例6中通过ELISA测定数株植株T2世代的病毒积蓄度的各株结果。

[图10]图10示出了实施例7中进行蚜虫虫媒CMV接种试验、确认到T2世代的CMV抗性的结果。

具体实施方式

下文中对用于实施本发明的实施方式(下文也称为“本实施方式”)进行详细说明。需要说明，本发明不限于本实施方式和附图，可以在其主旨范围内进行各种变形而实施。

在一个方面，本实施方式涉及CMV抗性茄科植物。本实施方式中，CMV抗性植物是指具有抑制感染后的CMV增殖的性质和/或抑制CMV的感染症状表现的性质的植物。

作为RNA病毒的CMV由三节段基因组构成，每个节段分别形成病毒颗粒，所有颗粒、分节聚齐而感染植物并增殖。CMV感染植物时，其利用作为宿主的植物的基因组的翻译起始因子eIF4E，通过CMV的RNA末端的帽结构与eIF4E结合，病毒运动蛋白的翻译由此开始。需要说明，CMV在病毒基因组RNA的5’末端具有帽结构，这与动植物mRNA相同，但与在病毒基因组RNA的5’末端结合有被称为VPg的蛋白质的马铃薯Y病毒等在结构上大为不同。对于具有VPg的病毒而言，VPg与植物的eIF4E具有高亲和力，VPg与植物的eIF4E较强地结合，病毒基因利用植物的翻译体系，但认为CMV与上述具有VPg的病毒在感染机制方面不同。

某一植物是否为CMV抗性植物，可以例如如后述实施例所示，通过以常规方法使植物感染CMV，利用ELISA法、PCR等已知手段确认植物体中的CMV积蓄来判断。此外，还可以通过对经CMV感染的植物是否具有CMV感染症状(花叶、黄化、蕨叶、矮化、坏疽等)来判断。CMV中，已知有CMV-Y系、CMV-O系、CMV-Fny系、CMV-Nt9系等多个株系，已知各株系感染所对应的植物CMV感染症状可能有所不同，因此可以根据用于所感染的CMV株系来确认症状的有无。在一个方面，本实施方式的CMV抗性植物是下述这样的植物，所述植物与不具有下文所述的突变型eIF4E基因的植物相比，植物体内的CMV的积蓄低，和/或在使其感染CMV时CMV的感染症状轻。在一个方面，本实施方式的CMV抗性植物是下述这样的植物，其在CMV感染后即使已经过20天以上时，植物体内的CMV积蓄与CMV未接种株为相同程度，和/或未确认到CMV感染症状。

本实施方式中的CMV抗性植物只要表现出CMV抗性即可，其也可以是复合抗性植物，例如显示出针对下述病毒等的抗性：感染茄科的所有马铃薯Y病毒(PVY等)；属于大麦黄化花叶病毒属(Bymovirus)和南方菜豆花叶病毒属(Sobemovirus)的病毒(其与PVY同样在病毒基因组5’末端具有VPg，被报道过因翻译起始因子的突变而产生的抗性)；被报道过因翻译起始因子突变而产生的抗性的属于康乃馨斑点病毒属(Carmovirus)的病毒；此前虽未报道过因翻译起始因子突变而产生的抗性、但会在包括番茄在内的作物生产中造成严重损害的双生病毒科(Geminivirus)的病毒(番茄黄化卷叶病毒(TYLCV)等)。

本实施方式中，CMV抗性植物是茄科植物，只要是属于茄科(Solanaceae)的植物即可，没有特别限制，可列举属于茄属(Solanum属)、烟草属(Nicotiana属)、辣椒属(Capsicum属)等的植物，更具体地，可列举番茄、茄子、烟草、辣椒、马铃薯等。在一个方面，优选地，本实施方式的CMV抗性植物是茄属植物，更优选番茄、茄子、马铃薯，特别优选番茄。

在一个方面，本实施方式也可以是上述CMV抗性植物的一部分，更具体地，可列举果实、芽、茎、根、枝条、花药等器官、植物的组织、花粉、种子等。在一个方面，本实施方式还涉及这样的植物或其一部分的制备方法、本实施方式的突变型eIF4E基因在这样的植物或其一部分的制备中的用途。

在一个方面，本实施方式中的上述CMV抗性植物也可制成为例如食用等的加工品。即，本实施方式涉及具有突变型eIF4E基因的CMV抗性茄科植物的加工品，该突变型eIF4E基因编码对CMV无功能的eIF4E蛋白。本实施方式还涉及CMV抗性植物的加工品的制造方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变。

加工品没有特别限制，可制成为取决于植物种类的食用、医用等加工品。例如，CMV抗性植物是番茄的情况下，作为番茄的食用加工品，可列举罐装番茄、番茄浓酱、番茄沙司、番茄酱、番茄汤、干番茄、番茄汁、番茄粉、番茄浓缩物、以番茄为原料的营养辅助食品(补充剂)等。可以以CMV抗性植物为原料，使用本领域技术人员已知的手段来实施加工品的制造。

本实施方式中的CMV抗性植物，只要是表现出CMV抗性的植物，也可以是在嫁接中利用的接穗、砧木等。在一个方面，本实施方式还涉及能够再生出上述CMV抗性植物的植物细胞(包括愈伤组织)等，所述植物细胞与本实施方式中的CMV抗性植物同样具有编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因。本实施方式中的CMV抗性植物包括从这样的植物细胞得到的植物。在一个方面，本实施方式还涉及这样的植物细胞的制备方法，以及本实施方式的突变型eIF4E基因在这样的植物细胞的制备中的用途。

本实施方式中的CMV抗性植物具有编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因(以下也称为“CMV抗性基因”)。在一个方面，本实施方式还涉及这样的突变型eIF4E基因，包含这样的突变型eIF4E基因的载体、启动子或试剂盒，以及这样的载体、启动子或试剂盒在CMV抗性茄科植物、其植物细胞、其植物的一部分(种子等)或其后代的制备中的用途。

eIF4E是真核生物中的翻译起始因子之一，其在蛋白质合成的起始中具有重要作用。eIF4E与eIF(iso)4E一起构成eIF4E家族，并且，茄科植物被认为具有多种eIF4E同工酶。例如，已知番茄中eIF4E位于2号染色体和3号染色体上的2种同工酶。还已知番茄中存在1种eIF(iso)4E，其位于9号染色体上。在辣椒中，作为与番茄的eIF4E同源的基因，位于4号染色体上的pvr1和pvr2的存在是已知的(pvr1和pvr2是等位基因的关系)，作为与番茄的eIF(iso)4E同源的基因，位于3号染色体上的pvr6也是已知的。这些基因中，编码eIF4E或与其同源的蛋白质的基因优选是对CMV无功能的。

本实施方式中，对CMV无功能的eIF4E蛋白质是指CMV在植物中感染、增殖时不能利用，或使得CMV的感染和增殖降低的eIF4E蛋白质，在一个方面，CMV抗性基因也可以是经突变而不编码蛋白质的基因。在不被理论束缚的情况下，可以认为：CMV在感染植物时，利用茄科植物中存在的多种同工酶中的特定eIF4E，如果编码该特定同工酶(对CMV有功能的eIF4E)的基因突变，从而编码对CMV无功能的eIF4E蛋白质，此时，病毒基因组上编码的对感染增殖来说必需的蛋白质的翻译将无法进行，或者，与eIF4E的相互作用所必需的CMV蛋白质不能实现其功能，由此，CMV感染、CMV增殖和CMV感染症状的表现中的任一者以上被抑制，从而成为CMV抗性植物。另一方面，茄科植物中存在的多种eIF4E同源物中，即使1种发生突变，植物本身还可以利用其他同源物，或者植物本身有可能能够利用对CMV无功能的eIF4E蛋白质，因此，可以认为能够在不影响作为宿主的茄科植物生长的情况下赋予CMV抗性。

在一个方面，本实施方式的CMV抗性植物中，编码对CMV有功能的eIF4E蛋白质的基因全部均经突变。例如，在复二倍体等多倍体植物的情况下，优选地，存在的多种编码对CMV有功能的eIF4E蛋白质的基因全部突变为CMV抗性基因。这样的CMV抗性植物中，只要编码对CMV有功能的eIF4E蛋白质的基因经突变即可，其也可以具有其他的正常eIF4E基因。此外，其还可以是导入外源CMV抗性基因，将编码对CMV有功能的eIF4E蛋白质的内源基因全部缺失、破坏而得到的。

在一个方面，本实施方式中的CMV抗性基因是在茄科植物的对CMV有功能的eIF4E基因的碱基序列中具有突变的基因，优选是在上述eIF4E基因的外显子2的碱基序列中具有突变的基因。更具体地，茄科植物为番茄的情况下，在番茄3号染色体上的eIF4E基因中具有突变，优选在其外显子2的碱基序列(序列号2)中具有突变，更优选在上述外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中具有突变。

在一个方面，本实施方式中的CMV抗性基因在eIF4E基因的外显子2的碱基序列中具有以下任一种以上的突变：

(a)移码突变

(b)无义突变

(c)连续或不连续的3n个碱基(n＝1～7)的缺失

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***。

(a)移码突变是因碱基的缺失或***使得密码子读码框偏移、从而导致编码不同的氨基酸序列的突变，由此而成为CMV抗性基因。

(b)无义突变是本来编码氨基酸的密码子变成了终止密码子的突变，由此而成为CMV抗性基因。

(c)连续或不连续的3n个碱基(n＝1～7，优选n＝1～3，例如3、6或9个碱基，更优选n＝3，例如9个碱基)的缺失导致该缺失区域下游的碱基所编码的氨基酸发生微小变化，由此而成为CMV抗性基因。

(d)1个或多个碱基的取代、缺失、添加和/或***导致突变区域下游的碱基所编码的氨基酸读码框发生变化。由此，eIF4E蛋白质被破坏，结构发生变化等，从而成为CMV抗性基因。在一个方面，优选地，该突变是密码子中第3位以外的碱基的突变。本实施方式中，取代、缺失、添加和/或***的碱基的个数只要能够获得CMV抗性基因即可，没有特别限制，可以是例如1～5个、1～3个、1～2个或1个。

上述(a)～(d)的突变不是择一性的，例如作为(c)或(d)的突变的结果，可以产生(a)或(b)的突变。

在一个方面，优选地，本实施方式的CMV抗性基因具有连续或不连续的9个碱基的缺失、连续或不连续的3个碱基的缺失、1个碱基的***导致的移码突变中的任一种以上。

在一个方面，所述突变型eIF4E基因具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列(序列号2)中，优选在外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变，所述组由1个碱基的***、3个碱基的缺失、和9个碱基的缺失组成，其也可以具有所述突变以外的突变(例如，在序列号2和/或序列号3的碱基序列中的1个或多个碱基的替换等)。并且，在一个方面，所述突变型eIF4E基因具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变，所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基的***(在一个方面，C(胞嘧啶)的***)、第16～18位的3个碱基的缺失、和第8～18位中的任意9个碱基的缺失(优选地，第10位和第13位以外的9个碱基的缺失)组成，其也可以具有所述突变以外的突变。序列号3的碱基序列对应于番茄外显子2的碱基序列(序列号2)的第135～154位的碱基。

在一个方面，优选地，所述突变型eIF4E基因是番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)突变为序列号4～9中任一者的基因。

如前文所述，本实施方式的CMV抗性基因只要表现出所预期的CMV抗性即可，也可以具有上述以外的突变，在一个方面，例如，其也可以是在与eIF4E基因的碱基序列具有85％以上、优选90％以上、更优选95％以上、进一步优选98％以上、特别优选99％以上的序列同一性的碱基序列中具有上文所述的任意突变的基因。

本实施方式还涉及上述突变型eIF4E基因用于向茄科植物赋予CMV抗性的用途、以及作为CMV抗性基因的上述突变型eIF4E基因本身。

具有上述CMV抗性基因的CMV抗性植物大致可通过下文示例的2种方法获得，但不限定于此。

(1)直接基因组编辑：通过对具有对CMV有功能的eIF4E的植物进行直接基因组编辑，向目标位点准确导入突变，制备具有CMV抗性基因的植物。

(2)突变基因的导入：其为将下述(A)和(B)组合得到的方法。(A)：制备CMV抗性基因，使用合适的启动子将其导入植物。(B)：使植物具有的内源eIF4E中对CMV有功能的eIF4E成为对CMV无功能的eIF4E。

下面，对各种方法进行说明。

上述(1)的方法可以使用CRISPR、TALEN等利用了位点特异性核酸酶的已知的基因组编辑技术实施。使用能够在基因组特定位点进行切割的限制性酶导入双链切口，当其被修复时，因修复错误而导入各种突变，由此，编码对CMV有功能的eIF4E的基因突变为CMV抗性基因。

为了以特别高的特异性和高效率进行导入，优选可以使用CRISPR***，特别优选可以使用CRISPR/Cas9***。该***中，含有与靶基因互补的长度约20个碱基的序列的guide RNA(sgRNA)识别靶，Cas9蛋白切割双链，其经非同源末端重组(NHEJ)修复途径而被修复时，通过修复错误而将突变导入靶位点。

向植物递送Cas蛋白和sgRNA可以介由编码其的载体使用本领域技术人员已知的方法(例如农杆菌法、标准转染法、电穿孔法、微粒轰击法等)来进行。

简单而言，如下文实施例所示，构建整合了Cas基因和sgRNA的二元载体，使用其转化农杆菌之后，使用该农杆菌对植物进行转化，从而能够向植物递送Cas蛋白和sgRNA(参见Friedrich Fauser等，The Plant Journal(2014)79,348-359；大泽良、江面浩(2013)，理解新型植物育种技术，国际文献社等)。

经农杆菌转化的植物的形态没有特别限制，只要能够再生出植物体即可，可列举例如悬浮培养细胞、原生质体、叶的切片、愈伤组织等。在将农杆菌除去后，在与所使用的载体对应的试剂中进行培养，可以以试剂耐受性为指标实现对整合有目的基因的切片的选择性培养。

为了能够高效地向靶位点导入突变，可以设计引导RNA(guideRNA)。

在CRISPR***中，基本上在被称为PAM序列的3碱基序列(在使用最常见的化脓链球菌(S.pyogenes)来源的Cas9的情况下，为NGG)的3个碱基前切割。因为需要在靶序列之后紧接着存在PAM序列，因此可以将PAM序列的上游作为靶序列，来设计引导RNA。例如，在图1(其示出与番茄3号染色体上存在的eIF4E基因的mRNA相对应的序列(序列号1))中，可以以外显子2(图1中波浪线部分，序列号2)中存在的方框所示的位置作为PAM序列，以该3个碱基起的上游的通常20个碱基(序列号3)作为靶，设计引导RNA。对于茄科的其他植物进行直接基因组编辑时，也与番茄的情况相同，可以在编码对CMV有功能的eIF4E的基因的外显子2中选择PAM序列设计引导RNA，向该靶位点导入突变，由此制备具有CMV抗性基因的植物。

引导RNA的碱基序列中GC含量越高，则切割效率越高，因此可以考虑到GC含量来设计引导RNA。并且，可以将其设计为使得由脱靶效应造成的非特异性切割尽量减少。在一个方面，在植物为番茄的情况下，引导RNA可被设计为具有以3号染色体的外显子2中的特定序列(序列号3)为靶的碱基序列。

通过CRISPR***在1个位置导入双链切割时，有约20个碱基将被修复，可认为将通过修复错误而导入突变。因此，在一个方面，本实施方式的CMV抗性基因所具有的突变是连续或不连续的3n个碱基(n＝1～7,优选1～3)的突变。

接下来对上述(2)的方法进行说明。该方法是将下述(A)和(B)的步骤组合而成的方法。关于实施(A)和(B)的顺序，只要不导致植物死亡，也可以先实施(B)。需要说明，在特定部位仅实施(B)的方法是上述(1)的方法。

(A)：制备编码对CMV无功能的eIF4E蛋白质的突变型基因，使用合适的启动子将其导入植物的步骤。

(A)中突变型基因的制备可以使用本领域技术人员已知的方法来实施，例如，合成具有所期望的突变的碱基序列，使用PCR等对其进行扩增来获得。将制备得到的突变基因向植物导入也可以使用本领域技术人员已知的方法来实施。简单而言，可以使用携带有突变型基因的载体，使用例如聚乙二醇法、电穿孔法、农杆菌法、基因枪法等来实施。只要是使茄科植物来源的eIF4E基因突变而得到的CMV抗性基因即可，其他植物的CMV抗性基因也可被导入。

(B)：使植物具有的内源eIF4E中对CMV有功能的eIF4E成为对CMV无功能的eIF4E的步骤。

在(B)的实施中，作为向植物中导入突变的方法，可使用已知的方法，例如，可以利用离子束、EMS等突变原处理。也可以通过上述CRISPR、TALEN等基因组编辑技术来实施。理想地，使内源eIF4E中对CMV有功能的eIF4E全部成为对CMV无功能的eIF4E。

从具有CMV抗性基因的植物细胞再生出植物体，可根据植物种类以本领域技术人员已知的方法来进行。例如，对于番茄，可以参照SunHJ等，Plant Cell Physiol.47:426,2006，对于烟草，可以参照Jefferson RA等，EMBO J.6:3901,1987等来进行。

关于植物具有CMV抗性基因这点的确认，如上文所述，可以通过利用常规方法接种CMV，以ELISA法、PCR等确认植物体中CMV的积蓄，此外，还可以通过观察植物体的CMV感染症状，来进行确认。

一旦获得了具有CMV抗性基因的CMV抗性植物，可以通过已知的方法获得所述植物的后代、克隆。因此，本实施方式的CMV抗性植物也包括其后代和克隆。

本实施方式还涉及制备CMV抗性植物的方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤。该方法可以参照与CMV抗性植物相关的上文中的记载来实施。在一个方面，上述制备方法还包括使本实施方式的CMV抗性植物自花授粉或异花授粉而获得后代的步骤。植物的自花授粉或异花授粉可以通过已知的手段来实施。

本实施方式还涉及用于制备上述CMV抗性植物的引导RNA和包含引导RNA的载体。引导RNA具有的序列如上所述。本实施方式还涉及包含上述引导RNA的试剂盒。所述试剂盒可以包含用于实施利用CRISPR***的基因组编辑所必需的位点特异性核酸酶等，其可被用于制备CMV抗性植物。

实施例

实施例1：制备在3号染色体上的eIF4基因中导入了突变的番茄

首先，在被认为存在于番茄3号染色体上的eIF4E基因(Solyc03g005870)的第二外显子(序列号2)中，任意设定sgRNA能够识别的位点，将该20个碱基长(AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3))的双链DNA构建到载体pUC19_AtU6oligo(获得自国立研究开发法人农业生物资源研究所)内的限制性酶BbsI位点处。需要说明，图1示出了与野生株番茄3号染色体上存在的eIF4E的mRNA序列对应的碱基序列(序列号1)。实际的RNA中，图中的T(胸腺嘧啶)为U(尿嘧啶)。

从该载体切出包含sgRNA序列区域的盒位点，将其构建到二元载体pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII内的限制性酶I-SceI位点处。再使用该二元载体来转化农杆菌LBA4404(TakaraBio公司制)。

此外，针对番茄9号染色体上存在的eIF(iso)4E基因(Solyc09g090580)，也以同样的方法在二元载体中构建第二外显子内的识别位点(GGCCACCGAAGCACCGGTAG(序列号10))，并对农杆菌进行转化。

作为进行转化的番茄品种，使用Moneymaker和本公司的品种S。使用农杆菌的番茄转化遵循一般书籍等中提到的方法来进行(《转化操作手册(Protocols for PlantTransformation)》(化学同人社))。即，将番茄种子播种到无菌培养基中，对由此得到的子叶或经普通播种得到的子叶或真叶进行杀菌后，在上述重组农杆菌培养基(浊度0.1～1.0)中浸泡约10分钟，使其感染农杆菌。

3天后，除去农杆菌，将叶片移至添加了羧苄青霉素(100～500mg/ml)、或美罗培南(20～50mg/ml)和卡那霉素(30～100mg/ml)的Murashige Skoog培养基(MS培养基；MS基础培养基、3％蔗糖、1.5mg/L玉米素、1％琼脂)上，25℃照明下(16小时光照/8小时黑暗)进行选择性培养。此后，自约10天起，每2周通过移植传代更换培养基，促进从叶片形成愈伤组织，通过继续重复进行传代培养，诱导出不定芽。

不定芽达到数厘米大小时，将其移植至生根培养基(MS基础培养基、1.5％蔗糖、1％琼脂、50～250mg/ml羧苄青霉素、20～100mg/ml卡那霉素、根据情况添加萘乙酸(NAA))上，每个月传代1次，培养1～3个月。

在生根培养基之前，全部为无菌培养。将已生根的个体从无菌培养基中取出，移栽到将市售黑土、赤玉土等混合而成的盆栽土中，使其生长。

为了确定再生出的个体(转染初代；下文为T0)是否是经重组和编辑(碱基的缺失、***或替换)的，使用任意的引物通过PCR(KODPlus Neo/东洋纺公司)进行扩增，例如，针对Solyc03g005870内的区域，使用引物1(ATCCATCACCCAAGCAAGTTAATT(序列号11))和引物2(GTCCACAAAGCTATTTTTTCTCCC(序列号12))，针对Solyc09g090580内的区域，使用引物3(CCGTCGTGAAAAAGCTATACAAAAGGAG(序列号13))和引物4(GCTTTTCGAAGAGAACTTCCCC(序列号14))进行扩增，对扩增片段的编辑位点中存在的限制性酶切位点是否被限制性酶切断加以确认(数据未示出)。

作为其结果，确认到数个再生个体中eIF4E的序列是经编辑的，并挑选出经编辑的品系(表1)。

【表1】

实施例2：突变番茄的CMV抗性确认试验

接着，使经编辑品系系的个体(T0)在隔离温室内生长，使其自花授粉，回收种子。对这些成为转染后代(T1)的种子进行播种，在实生苗上以机械方式接种CMV-Y系。结果，eIF4E的经编辑品系A127和A132的T1个体A127-8、A127-14、A127-21、A127-24、A132-1、A132-5即使在接种20天以上时也未见症状(图5)。并且，使用抗CMV抗体(获得自日本植物防疫协会)，在CMV接种20天后进行了测量病毒积蓄程度的ELISA检测，结果发现，病毒积蓄与非接种株为相同程度，没有确认到CMV的感染(图2～4)。而且，所述个体即使在接种60天后也未见病征，表现出CMV抗性(表2)。

【表2】

另一方面，在eIF(iso)4E的突变品系B95、B100的T1的实生苗中，接种了CMV的实生苗全部在接种20天后出现症状，没有显示出抗性(数据未示出)。

实施例3：对CMV抗性基因的测序

使用上述引物1和2，通过PCR(T100热循环仪，Bio-Rad公司制)对CMV抗性T1个体的eIF4E标记位点附近，即，3号染色体上eIF4E基因中的外显子2序列(序列号2)的第14位附近起的3’侧的区域进行扩增，克隆扩增片段，对碱基序列加以确认。

结果在同一区域中确认到数个碱基的缺失、***，或数个碱基的取代(图6-1、图6-2)。确认到在序列号3对应的区域中具有以下突变的个体。下划线表示突变位置，“·”表示不存在碱基的位置。

野生型：AGGGTAAATCTGATA·CCAGC(序列号3)

突变1：AGGGTAAATCTGATACCCAGC(序列号4)

突变2：AGGGTAAATCTGATA····GC(序列号5)

突变3：AGGGTAA··C··A······GC(序列号6)

突变4：AGGGTAAATGTGATA····GC(序列号7)

突变5：AGTGTAA··C··A······GC(序列号8)

突变6：AGGGTAAATGTAACA····GC(序列号9)

实施例4：PVY抗性的确认试验

将A132和A143的T1种子分别播种，向它们的实生苗接种PVY-N系，所有个体中自接种21天以上均未见症状或病毒积蓄，确认到PVY抗性(图7)。

实施例5：突变番茄的CMV抗性确认试验(T2代)1

对于从实施例2获得的T1个体A127-24、A132-1和A132-5，与实施例2同样地使其在隔离温室内生长，使其自花授粉，回收T2种子。

对这些成为T2代的种子进行播种，针对各T2代，以机械方式向以图8右栏括号内所示株数的实生苗接种CMV-Y系。对碱基序列加以确认，来自A127-24的16株T2代全部是***1个碱基的纯合子(1***纯合子)。来自A132-1的30株T2代包括以下编辑模式：4株缺失9个碱基的纯合子(9缺失纯合子)、16株缺失9个碱基/缺失3个碱基(9缺失/3缺失)和10株缺失3个碱基的纯合子(3缺失纯合子)。来自A132-5的27株T2代全部是缺失3个碱基的纯合子。即，图8中，“9缺失纯合子”和“9缺失/3缺失”是来自A132-1的T2代，“3缺失纯合子”是来自A132-1和A132-5的T2代，“1***纯合子”是来自A127-24的T2代。

接种20天后，以与实施例2相同的方法对CMV抗性加以确认。即，通过对感染症状的观察和测量病毒积蓄程度的ELISA检测，确定病毒患病率。结果示于图8。图8中，抗性率是指ELISA检测为阴性的株的比例。

实施例6：突变番茄的CMV抗性确认试验(T2代)2

进一步地，使用被认为是缺失3个碱基的纯合子的A132-5和被认为是***了1个碱基的纯合子的A127-24的T2代的实生苗，与实施例5同样以机械方式接种CMV-Y，对抗性加以确认。图9-1中，括号内所示数字是供试株数。作为对照，使用未编辑(未重组)的野生株(野生型品种S)。接种20天后，通过对感染症状的观察来调查发病率，通过ELISA检测来调查病毒感染率，综合起来作为患病率，对CMV抗性加以确认。图9-2显示了针对若干株通过ELISA检测病毒感染的测定结果。作为阳性对照，使用向野生株(野生型品种S)接种CMV而得到的株，作为阴性对照，使用未接种CMV的野生株。其结果如图9-1所示，包括图8中1***纯合子所对应的A127-24的T2代在内，来自所有株的T2代的病毒抗性都比对照提高。

根据实施例5和6的结果，在T2代中也确认到eIF4E突变的所有突变模式均具有CMV抗性。

实施例7：蚜虫虫媒接种试验

在果苗圃中，CMV主要经由蚜虫传播感染，此外是种子传染、接触传染。因此，除机械方式的接种试验外，还进行蚜虫虫媒接种试验，与对照比较抗性。

首先，通过从感染了CMV-O***的烟草吸汁，使桃蚜获得CMV。

将从实施例5获得的A132-1的T2代中缺失9个碱基的纯合株(A132-1-13)的种子进行播种，将获得了CMV的桃蚜以每1株10头放到真叶1～2枚大小的实生苗上，进行虫媒接种。

作为对照，使用野生型S的实生苗，在相同条件下实施。从接种后第21天至第26天，通过症状调查和RT-PCR计算患病率。即，目测的发病率与RT-PCR测得的感染率综合而得到的比例为患病率。

RT-PCR中使用引物5和6，用酶(逆转录酶AMV reverse transcriptase(Promega公司制)和EXTaq聚合酶(TakaraBio公司制)来进行。结果，经编辑品系的患病率比对照显著降低，确认到具有CMV抗性。

引物5：GTACAGAGTTCAGGGTTGAGCG(序列号15)

引物6：AGCAATACTGCCAACTCAGCTCC(序列号16)

产业上的可利用性

通过本发明，可以提供CMV抗性的茄科植物、CMV抗性植物的制备方法。本发明主要在农业领域具有产业上的可利用性。

Claims

1.突变型eIF4E基因，其编码对黄瓜花叶病毒(CMV)无功能的eIF4E蛋白，所述突变型eIF4E基因源自番茄3号染色体上的eIF4E基因，所述突变型eIF4E基因具有在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变，所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基C的***、第16～18位的3个碱基的缺失、和第8～18位中任意9个碱基的缺失组成。

2.权利要求1所述的突变型eIF4E基因在CMV抗性番茄的制备中的用途。

3.权利要求1或2所述的突变型eIF4E基因在CMV抗性番茄的种子的制备中的用途。

4.载体、启动子或试剂盒，其包含权利要求1～3中任一项所述的突变型eIF4E基因。

5.权利要求4所述的载体、启动子或试剂盒在CMV抗性番茄、其植物细胞、其植物种子或其后代的制备中的用途。

6.黄瓜花叶病毒(CMV)抗性植物的制备方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变，所述植物为番茄，所述突变步骤为使番茄3号染色体上的eIF4E基因突变的步骤，所述突变步骤为导入在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变的步骤，所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基C的***、第16～18位的3个碱基的缺失、和第8～18位中任意9个碱基的缺失组成。

7.黄瓜花叶病毒(CMV)抗性植物的加工品的制造方法，所述方法包括使茄科植物的eIF4E基因突变的步骤，所述突变为成为编码对CMV无功能的eIF4E蛋白的突变型eIF4E基因的突变，所述植物为番茄，所述突变步骤为使番茄3号染色体上的eIF4E基因突变的步骤，所述突变步骤为导入在番茄3号染色体上eIF4E基因的外显子2中的碱基序列AGGGTAAATCTGATACCAGC(序列号3)中的选自下组的突变的步骤，

所述组由第15位和第16位碱基之间1个碱基C的***、第16～18位的3个碱基的缺失、和第8～18位中任意9个碱基的缺失组成。