JP7264832B2 - ウイルス抵抗性植物及びその作出方法 - Google Patents
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Description
[1]
キュウリモザイクウイルス(CMV)に対して非機能的であるeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子を有する、CMV抵抗性ナス科植物。
[2]
ナス属の植物である、[1]に記載のCMV抵抗性ナス科植物。
[3]
前記植物がトマトであり、前記変異eIF4E遺伝子が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子である、[1]又は[2]に記載のCMV抵抗性植物。
[4]
前記変異eIF4E遺伝子が、エクソン2の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異:
(a)フレームシフト変異
(b)ナンセンス変異
(c)連続又は非連続の3n塩基(n=1~7)の欠損
(d)1又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び/又は挿入
を有する、[1]~[3]のいずれかに記載のCMV抵抗性植物。
[5]
前記植物がトマトであり、前記変異eIF4E遺伝子が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2の塩基配列(配列番号2)における:1塩基挿入;3塩基欠損;及び9塩基欠損からなる群から選択される変異を有する、[1]~[4]のいずれか一項に記載のCMV抵抗性植物。
[6]
前記植物がトマトであり、前記変異eIF4E遺伝子が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2中の塩基配列AGGGTAAATCTGATACCAGC(配列番号3)における:15番目と16番目の塩基間への1塩基挿入;16~18番目の3塩基欠損;8~18番目のいずれか9塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、[1]~[4]のいずれか一項に記載のCMV抵抗性植物。
[7]
ナス科植物のeIF4E遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス(CMV)抵抗性植物の作出方法であって、前記変異が、CMVに対して非機能的なeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子への変異である、方法。
[8]
前記植物がトマトであり、前記変異工程が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子を変異させる工程である、[7]に記載のCMV抵抗性植物の作出方法。
[9]
前記変異工程が、eIF4E遺伝子のエクソン2の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異:
(a)フレームシフト変異
(b)ナンセンス変異
(c)連続又は非連続の3n塩基(n=1~7)の欠損
(d)1又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び/又は挿入
を導入する工程である、[7]又は[8]に記載のCMV抵抗性植物の作出方法。
[10]
[1]~[4]のいずれか一項に記載のCMV抵抗性植物の加工品。
[11]
ナス科植物のeIF4E遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス(CMV)抵抗性植物の加工品の製造方法であって、前記変異が、CMVに対して非機能的なeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子への変異である、方法。
[12]
前記植物がトマトであり、前記変異工程が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子を変異させる工程である、[11]に記載の加工品の製造方法。
[13]
前記変異工程が、eIF4E遺伝子のエクソン2の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異:
(a)フレームシフト変異
(b)ナンセンス変異
(c)連続又は非連続の3n塩基(n=1~7)の欠損
(d)1又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び/又は挿入
を導入する工程である、[11]又は[12]に記載の加工品の製造方法。
[14]
キュウリモザイクウイルス(CMV)に対して非機能的であるeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子。
[15]
ナス科植物由来である、[14]に記載の変異eIF4E遺伝子。
[16]
トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子由来である[14]又は[15]に記載の変異eIF4E遺伝子。
[17]
エクソン2の塩基配列に、以下のいずれか一以上の変異:
(a)フレームシフト変異
(b)ナンセンス変異
(c)連続又は非連続の3n塩基(n=1~7)の欠損
(d)1又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び/又は挿入
を有する、[14]~[16]のいずれかに記載の前記変異eIF4E遺伝子。
[18]
トマト由来であり、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2の塩基配列(配列番号2)における:1塩基挿入;3塩基欠損;及び9塩基欠損からなる群から選択される変異を有する、[14]~[17]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子。
[19]
トマト由来であり、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2中の塩基配列AGGGTAAATCTGATACCAGC(配列番号3)における:15番目と16番目の塩基間への1塩基挿入;16~18番目の3塩基欠損;8~18番目のいずれか9塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、[14]~[18]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子。
[20]
CMV抵抗性ナス科植物の作出における、[14]~[19]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子の使用。
[21]
ナス科植物の加工品の製造における、[1]~[6]のいずれかに記載のCMV抵抗性ナス科植物の使用。
[22]
[14]~[19]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子を有する、ナス科植物の植物細胞。
[23]
[1]~[6]のいずれかに記載のCMV抵抗性ナス科植物の植物細胞の作出方法。
[24]
[1]~[6]のいずれかに記載のCMV抵抗性ナス科植物の種子の作出方法。
[25]
CMV抵抗性ナス科植物の種子の作出における、[14]~[19]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子の使用。
[26]
[14]~[19]のいずれかに記載の変異eIF4E遺伝子を含む、ベクター、プロモーター又はキット。
[27]
CMV抵抗性ナス科植物、その植物細胞、その植物の種子又はその子孫の作出における、[26]記載のベクター、プロモーター又はキットの使用。
本実施形態におけるCMV抵抗性植物は、CMV抵抗性を示す植物である限り、接ぎ木に利用する穂木、台木等であってもよい。また、一態様において、本実施形態は、上述のCMV抵抗性植物を再生し得る植物細胞(カルスを含む)等にも関し、かかる植物細胞は、本実施形態におけるCMV抵抗性植物と同様、CMVに対して非機能的であるeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子を有する。本実施形態におけるCMV抵抗性植物は、このような植物細胞から得られた植物も含む。一態様において、本実施形態は、このような植物細胞の作出方法及びこのような植物細胞の作出における本実施形態の変異eIF4E遺伝子の使用にも関する。
(a)フレームシフト変異
(b)ナンセンス変異
(c)連続又は非連続の3n塩基(n=1~7)の欠損
(d)1又は複数の塩基の置換、欠失、付加、及び/又は挿入。
上述のとおり、本実施形態のCMV抵抗性遺伝子は、所望のCMV抵抗性を示す限り上記以外の変異を有するものであってもよく、一態様において、例えば、eIF4E遺伝子の塩基配列と、85%以上、好ましくは90%以上、より好ましくは95%以上、さらに好ましくは98%以上、特に好ましくは99%以上の配列同一性を有する塩基配列において、上記のいずれか変異を有するものであってもよい。
(1)直接ゲノム編集:CMVに対して機能的なeIF4Eを有する植物の直接ゲノム編集により、目的とする箇所にピンポイントで変異を導入し、CMV抵抗性遺伝子を有する植物を作出する。
(2)変異遺伝子導入:下記(A)と(B)を組み合わせた方法である。(A):CMV抵抗性遺伝子を作製し、適当なプロモーターを用いて植物に導入する。(B):植物が有する内生eIF4Eのうち、CMVに対して機能的なeIF4Eを、CMVに対して非機能的なものとする。
以下、それぞれの方法について説明する。
CRISPRシステムでは、PAM配列と呼ばれる3塩基の配列(最も一般的なS.pyogenes由来Cas9を用いる場合、NGG)の3塩基前が基本的に切断される。標的配列の直後にPAM配列が存在する必要があるため、PAM配列の上流を標的配列として、ガイドRNAを設計することができる。例えば、トマトの3番染色体に存在するeIF4E遺伝子のmRNAに対応する配列(配列番号1)を示す図1中、エクソン2(図1中、波線部。配列番号2)に存在する四角で示した箇所をPAM配列とし、この3塩基から上流の通常20塩基(配列番号3)を標的としてガイドRNAを設計することができる。ナス科の他の植物に対して直接ゲノム編集を行う場合も、トマトの場合と同様に、CMVに対して機能的なeIF4Eコードする遺伝子のエクソン2の中でPAM配列を選択してガイドRNAを設計し、この標的部位に変異を導入して、CMV抵抗性遺伝子を有する植物を作出することができる。
(A)の変異遺伝子の作製は、当業者に公知の手法を用いて実施することができ、例えば、所望の変異を有する塩基配列を合成し、これをPCR等で増幅して得ることができる。作製した変異遺伝子の植物への導入も、当業者に公知の手法を用いて実施することができる。簡便には、変異遺伝子を搭載したベクターを用いて、例えば、ポリエチレングリコール法、エレクトロポレーション法、アグロバクテリウム法、パーティクルガン法等を用いて実施することができる。ナス科植物由来のeIF4E遺伝子を変異させたCMV抵抗性遺伝子であれば、別種の植物のCMV抵抗性遺伝子を導入してもよい。
(B)の実施には、植物に変異を導入する方法として公知の手法を用いることができ、例えば、イオンビーム、EMSなどの変異原処理を用いることができる。上述のCRISPRやTALENなどのゲノム編集技術等によっても実施することができる。内生eIF4Eのうち、CMVに対して機能的なeIF4Eを、全てCMVに対して非機能的なものとすることが望ましい。
まず、トマトの染色体3番に存在するとされているeIF4E遺伝子(Solyc03g005870)の2番目のエクソン(配列番号2)内にsgRNAが認識する部位を任意に設定し、この20塩基長(AGGGTAAATCTGATACCAGC(配列番号3))の二本鎖DNAをベクターpUC19_AtU6oligo(国立研究開発法人農業生物資源研究所より入手)内の制限酵素BbsIサイトに構築した。なお、野生株のトマトの3番染色体に存在するeIF4EのmRNA配列に対応する塩基配列を図1に示す(配列番号1)。実際のRNAは図中のT(チミン)がU(ウラシル)である。
次に、編集系統の個体(T0)を隔離温室内で生育し、自家受粉させて種子を回収した。トランスジェニック後代(T1)となるこれらの種子を播種し、実生苗にCMV-Y系統を機械的接種した。その結果、eIF4Eの編集系統A127及びA132のT1個体A127-8、A127-14、A127-21、A127-24、A132-1、A132-5は接種20日以上でも症状が見られなかった(図5)。また、抗CMV抗体(日本植物防疫協会より入手)を用いて、CMV接種20日以降、ウイルス蓄積度を測るELISA検定を行ったところ、非接種株と同程度のウイルス蓄積度であり、CMVの感染は確認できなかった(図2~4)。また、当該個体は接種後60日以上たっても病徴が見られず、CMV抵抗性を示していた(表2)。
前述のプライマー1及び2を用いてCMV抵抗性T1個体のeIF4E編集部位付近、すなわち、3番染色体上のeIF4E遺伝子中、エクソン2の配列(配列番号2)の14番目付近から3’側の領域をPCR(T100サーマルサイクラー、Bio-Rad社製)で増幅し、増幅断片をクローニングして塩基配列を確認した。
野生型:AGGGTAAATCTGATA・CCAGC(配列番号3)
変異1:AGGGTAAATCTGATACCCAGC(配列番号4)
変異2:AGGGTAAATCTGATA・・・・GC(配列番号5)
変異3:AGGGTAA・・C・・A・・・・・・GC(配列番号6)
変異4:AGGGTAAATGTGATA・・・・GC(配列番号7)
変異5:AGTGTAA・・C・・A・・・・・・GC(配列番号8)
変異6:AGGGTAAATGTAACA・・・・GC(配列番号9)
A132及びA143のT1種子を別に播種し、それら実生苗にPVY-N系統を接種したところ、全ての個体で接種から21日以上たっても症状やウイルスの蓄積が見られず、PVY抵抗性が確認された(図7)。
実施例2で得られたT1個体、A127-24、A132-1及びA132-5について、実施例2と同様隔離温室内で生育し、自家受粉によってT2種子を回収した。
T2世代となるこれらの種子を播種し、各T2世代につき、図8中右欄の括弧内に示す株数の実生苗にCMV-Y系統を機械的接種した。塩基配列を確認したところ、A127-24からのT2世代16株は、全て1塩基挿入ホモ(1挿ホモ)であった。A132-1からのT2世代30株は、9塩基欠損ホモ4株(9欠ホモ)、9塩基欠損/3塩基欠損16株(9欠/3欠)及び3塩基欠損ホモ10株(3欠ホモ)の編集パターンを含んでいた。A132-5からのT2世代27株は、全て3欠ホモであった。すなわち、図8中、「9欠ホモ」及び「9欠/3欠」はA132-1からのT2世代、「3欠ホモ」はA132-1及びA132-5からのT2世代、「1挿ホモ」はA127-24からのT2世代である。
さらに3塩基欠損ホモと考えられるA132-5と、1塩基挿入ホモと考えられるA127-24のT2世代の実生苗を用い、実施例5と同様、CMV―Yを機械的接種して抵抗性を確認した。図9-1中括弧内に示す数字は供試株数である。対照には、非編集(非組換え)の野生株(野生型品種S)を用いた。接種20日後、感染症状の観察により発病率を、ELISAによる検定によりウイルス感染率を調査し、総合して罹病率としてCMV抵抗性を確認した。図9-2はいくつかの株について、ウイルス感染をELISA検定で測定した結果を示す。陽性対照として、野生株(野生型品種S)にCMV接種したものを用い、陰性対照としてCMV接種をしていない野生株を用いた。その結果、図9-1に示すように、図8中、1挿ホモにあたるA127-24からのT2世代を含め、いずれの株からのT2世代も、対照に比べ、ウイルス抵抗性が高かった。
キュウリモザイクウイルス(CMV)は実圃場では、主にアブラムシによって伝搬感染するほか、種子伝染、接触伝染する。そのため、機械的接種試験に加えて、アブラムシ虫媒接種試験を行い、対照との抵抗性の比較を行った。
まず、CMV-O系統を感染させたタバコから吸汁させることにより、モモアカアブラムシにCMVを獲得させた。
対照には野生型Sの実生苗を用い、同様の条件で実施した。接種後21日から26日にかけ、症状調査とRT-PCRにより罹病率を算出した。すなわち、目視観察による発病率と、RT-PCRによる感染率を統合したものが罹病率である。
プライマー5:GTACAGAGTTCAGGGTTGAGCG(配列番号15)
プライマー6:AGCAATACTGCCAACTCAGCTCC(配列番号16)
Claims (2)
- キュウリモザイクウイルス(CMV)に対して非機能的であるeIF4Eタンパク質をコードする変異eIF4E遺伝子を有する、CMV抵抗性トマトであって、前記変異eIF4E遺伝子が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2中の塩基配列AGGGTAAATCTGATACCAGC(配列番号3)における:15番目と16番目の塩基間への1塩基挿入;16~18番目の3塩基欠損;8~18番目のいずれか9塩基の欠損からなる群から選択される変異を有する、CMV抵抗性トマト。
- トマトのeIF4E遺伝子を変異させる工程を含む、キュウリモザイクウイルス(CMV)抵抗性トマトの作出方法であって、前記変異させる工程が、トマトの3番染色体上のeIF4E遺伝子のエクソン2中の塩基配列AGGGTAAATCTGATACCAGC(配列番号3)に、15番目と16番目の塩基間への1塩基挿入;16~18番目の3塩基欠損;8~18番目のいずれか9塩基の欠損からなる群から選択される変異を導入する工程である、CMV抵抗性トマトの作出方法。
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