JP2010130926A - ミヤコグサ由来のレトロトランスポゾンlore1を用いた変異体植物の作製方法 - Google Patents
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Abstract
【解決手段】(a) 植物組織を脱分化させてカルスを形成させるステップと、(b) ステップ(a)で得たカルスを植物体まで再分化させるステップと、(c) 再分化させた植物体を自殖して、次世代個体を得るステップとを含み、ここで、植物組織はそのゲノム中にレトロトランスポゾンLORE1又はその変異体を含んでいることを特徴とする、変異体植物の作製方法。
【選択図】なし
Description
(1) 変異体植物の作製方法であって、(a) 植物組織を脱分化させてカルスを形成させるステップと、(b) ステップ(a)で得たカルスを植物体まで再分化させるステップと、(c) 再分化させた植物体を自殖して、次世代個体を得るステップとを含み、ここで、植物組織はそのゲノム中にレトロトランスポゾンLORE1又はその変異体を含んでいることを特徴とする、前記方法。
(2) LORE1又はその変異体は植物組織のゲノム中に外的に導入されたものであることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(3) LORE1は配列番号1に示すヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、上記(2)記載の方法。
(4) 前記植物組織は胚軸であることを特徴とする上記(1)記載の方法。
(5) (d)次世代個体の自殖を繰り返すことによりさらに後代の個体を得るステップをさらに含む、上記(1)記載の方法。
(6) 植物組織はLORE1又はその変異体を内在している植物由来であることを特徴とする上記(1)又は(5)記載の方法。
(7) 植物組織はミヤコグサ(Lotus japonicus)由来であることを特徴とする上記(6)記載の方法。
(8) ステップ(c)を開放系にて実施することを特徴とする、上記(6)記載の方法。
(9) ステップ(d)を開放系にて実施することを特徴とする、上記(6)記載の方法。
LORE1は、両末端側にLTRを有するLTR型のレトロトランスポゾンである。両末端LTRに挟まれた領域には、転移に必要な逆転写酵素及びインテグラーゼなどをコードする配列を含み、機能ドメインの並び順からTy3-gypsy型に分類されている(図1)。ミヤコグサのアクセッションGifuにおいて、LORE1ファミリーのメンバーが10コピー見出されており、そのうち9コピー(それぞれLORE1a〜iと命名される)については全体又は部分塩基配列が決定されている(Madsen et al., 前掲)。
(1) ミヤコグサを含むマメ科植物は、食料、工業原料、薬効成分原料など多岐の用途にわたる重要な作物を含んでいる。近年マメ科植物は塩基配列情報の蓄積が進み、今後分子育種が急速に進むと予想されるが、マメ科には有用な遺伝子破壊実験系がまだ存在せず、このことが有用遺伝子単離とその育種利用の律速となっていた。本発明の方法は、マメ科植物における新規な遺伝子破壊実験系の確立するものである。
[実施例1] ミヤコグサにおけるLORE1転移誘導
本実施例は、ミヤコグサ内在のLORE1が配偶体的に転移することを立証する。
本実施例に使用した培地の組成は以下の通りである。
Callus培地及びShoot Induction培地
1xB5, 2% sucrose, BAP 0.5mg/ml, NAA 0.05mg/ml, 10mM NH4, 0.3% phytagel
Shoot Elongation培地
1xB5, 2% sucrose, BAP 0.2mg/ml, 0.3% phytagel
Root Induction培地
1/2 B5, 1% sucrose, 0.5mg/ml NAA, 0.4% phytagel
Root Elongation培地
1/2 B5, 1% sucrose
本実施例においては、変異体植物作製の対象としてミヤコグサ(Lotus japonicus)アクセッションGifuを使用した。
まずミヤコグサ種子200種子を2〜3mlの濃硫酸に漬け、20分間静置した。次に、滅菌水で5回洗浄後、市販の次亜塩素酸ソーダの1/2希釈液に0.02%Tween20を加え、種子をこの中に漬けて10分間穏やかに攪拌しながらインキュベートした後、滅菌水で10分x3回、及び20分x3回洗浄した。
次いで、滅菌した濾紙(6x6cm)を5mm程度の厚さにパイルし、90x20mmペトリ皿においた。これに20-25mlの滅菌水を加え、この上に約100粒を播種し、パラフィルムでシールした。その後、暗黒下、26℃で4日間培養し、その後2日間連続照明においた。
幼植物の胚軸(長さ1〜2cm)を子葉の直下と根の境目で切り、10本程度を束ねてピンセットで押さえ、メスで3mm程度に細切し、隙間に空気が入らないようにして90x20mmペトリ皿中のCallus培地の上に置いた。23℃、明(17hrs)、暗(7hrs)のグロースキャビネット内におき、7日間培養した。切片を1つずつ新しいCallus培地に植え継ぎ、これを7日ごとに繰り返して4〜8週間選別培養を継続した。
再分化は以下の通りにして行った。
苗条の誘導:カルスをShoot Induction培地に植え継ぎ、これを7日ごとに繰り返しながら3〜7週間培養を続けた。
苗条の伸長:苗条原基が形成されたカルスをShoot Elongation培地に植え継ぎ、これを7日ごとに繰り返しながら3〜7週間培養を続けた。
根の誘導:1cm程度に成長した苗条を切り取り、これをRoot Induction培地に浅く突き刺して、10日間培養した。
根の伸長:円形プラントボックスにRoot Elongation培地(約40ml)を入れて減菌し、植物を浅く突き刺した。その後、3〜4週間26℃(明、16hrs)、23℃(暗、8hrs)のグロースキャビネットで培養した。
鉢上げ:根が1.5〜2cm程度伸びたら、Root Elongation培地から取り出し、バーミキュライトを詰めた2段重ねの角形プラントボックスに移植した。その後、蓋をして、3週間程度グロースキャビネット内で育成し、蓋をはずしてさらに1週間培養した。植物が十分な大きさ(苗条の長さ3〜4cm)になった時点で、パワーソイル(クレハ園芸用培土)を詰めたビニールポットに移植し(1個体/ポット)、温室に出した。
上記のようにして得た1個体の再分化R0植物体を生育させ、自殖によりR1個体を得た。R0とR1のLORE1のコピー数は、ゲノムサザンブロット分析により解析した。葉からCTAB法(Murray and Thompson, (1980)Nucleic Acids Res. 8:4321-4325)により抽出したR0とR1植物のゲノムDNAをHind IIIで消化し、1.0%アガロースゲルに電気泳動後ナイロンメンブランにトランスファーし、LORE1特異的プローブをハイブリダイズさせた。この解析では、LORE1の5’末端と5’フランキング配列を含むHind III断片が検出される。
図2から明らかな通り、LORE1の転移は、再分化当代個体(R0)では観察されず、R1世代で初めて検出される。さらに、R1個体間で独立の転移を生じていることがわかる。これらの結果はLORE1の転移が再分化当代個体(R0)の配偶体で起こることを示しており、したがってLORE1は主に配偶体的に転移することが示された。
本実施例は、LORE1がミヤコグサの遺伝子を効率的に破壊していることを立証する。この目的のために、実施例1に記載されるようにして得たR1個体において転移していたLORE1の近傍配列を以下のようにして解析した。
本実施例では、ROでのLORE1転写量の増加とLORE1転移とが相関していることを示す。この目的のために、実施例1に記載されるようにして誘導した再分化当代におけるLORE1転写量と、その後の自殖個体におけるLORE1転移の有無とを以下のようにして調べた。
本実施例は、LORE1が数世代にわたって転移を繰り返すことを示す。この目的のために、実施例1に記載されるようにして取得した3種のR1系統(A〜C)をそれぞれ自殖してR2個体を取得し、各系統からのR2をそれぞれ5個体無作為に選別した。これらを実施例1に記載されるようにサザンブロット分析に供し、各R2個体についてR1個体からさらにLORE1転移を生じているかを調べた。結果を図4に示す。
LORE1の挿入により生じた共生変異体nup133-3 (Kanamori, et al. Proc Natl Acad Sci U S A. (2006), 103:359-364)の後代において、LORE1の新規の転移が生じているか否かを、実験例1と同様に、ゲノムサザンブロット分析により解析した(図5)。
Claims (9)
- 変異体植物の作製方法であって、
(a) 植物組織を脱分化させてカルスを形成させるステップと、
(b) ステップ(a)で得たカルスを植物体まで再分化させるステップと、
(c) 再分化させた植物体を自殖して、次世代個体を得るステップ
とを含み、ここで、植物組織はそのゲノム中にレトロトランスポゾンLORE1又はその変異体を含んでいることを特徴とする、前記方法。 - LORE1又はその変異体は植物組織のゲノム中に外的に導入されたものであることを特徴とする請求項1記載の方法。
- LORE1は配列番号1に示すヌクレオチド配列を含むことを特徴とする、請求項2記載の方法。
- 前記植物組織は胚軸であることを特徴とする請求項1記載の方法。
- (d)次世代個体の自殖を繰り返すことによりさらに後代の個体を得るステップをさらに含む、請求項1記載の方法。
- 植物組織はLORE1又はその変異体を内在している植物由来であることを特徴とする請求項1又は5記載の方法。
- 植物組織はミヤコグサ(Lotus japonicus)由来であることを特徴とする請求項6記載の方法。
- ステップ(c)を開放系にて実施することを特徴とする、請求項6記載の方法。
- ステップ(d)を開放系にて実施することを特徴とする、請求項6記載の方法。
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