KR20210080470A

KR20210080470A - 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법

Info

Publication number: KR20210080470A
Application number: KR1020217015170A
Authority: KR
Inventors: 히로키 아타라시; 겐지 나카하라
Original assignee: 기꼬만 가부시키가이샤; 내셔널 유니버시티 코포레이션 홋카이도 유니버시티
Priority date: 2018-11-28
Filing date: 2019-11-27
Publication date: 2021-06-30
Also published as: EP3888452A4; JPWO2020111149A1; CN113163728A; CN113163728B; WO2020111149A1; CL2021001350A1; US20220033840A1; EP3888452A1

Abstract

본 발명은, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 감염을 저해하는 성질, 감염 후의 당해 바이러스의 증식을 억제하는 성질 및/또는 당해 바이러스의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는, 바이러스 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 본 발명은, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자, 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 이들의 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖고, 이 변이에 의하여, 변이를 갖는 유전자의 발현이 억제되고 있거나, 또는 변이를 갖는 유전자가 코드하는 단백질이 당해 바이러스에 대하여 비기능적이며, 당해 바이러스에 대하여 저항성을 갖는, 가지과 식물을 제공한다.

Description

토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법

본 발명은, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법에 관한 것이다.

토마토 황화 잎말림병을 일으키는 대표적인 바이러스인 토마토 황화 잎말림 바이러스(Tomato yellow leaf curl virus; 이하 「TYLCV」라고 약기하는 경우가 있다)는, 1964년에 이스라엘에서 발견된 비교적 새로운 식물 바이러스의 일종이다. 세계적으로 TYLCV나, TYLCV가 속하는 베고모 바이러스속의 바이러스가 다수 발견되어, 열대, 아열대, 온대 지역을 중심으로, 다양한 식물이나 농작물에 피해를 주고 있다. 베고모 바이러스속에는 1분절의 타입과 2분절의 타입이 있고(각각 Monopartite, Bipartite), TYLCV는 1분절 타입이다. TYLCV의 유연(類緣)의 바이러스의 발생 분포는 다양하고 전 세계에서 발생하고 있지만, 예를 들면 TYLCV의 근연종인 토마토 황화 잎말림 사르디니아 바이러스(Tomato yellow leaf curl Sardinia virus)는, 지중해 주변에서만 발생하고 있다. 한편, TYLCV는, 토마토 생산 지역을 중심으로 세계적으로 만연하고 있다(비특허문헌 1을 참조).

일본에서는, 1996년에 TYLCV를 병원(病源)으로 하는 토마토 황화 잎말림병이 나가사키현, 아이치현, 및 시즈오카현에서 동시에 발견되고, 그 후, 시설 토마토의 생산지에서 급속히 발생이 확대되고 있다. 특히, 2000년 이후, 생식 토마토 주산지인 규슈에서의 발생은 막대하여, 재배하고 있는 토마토 전부가 TYLCV 피해를 입는 농가도 속출하고 있다. 각 현(縣)에 있어서, 농가에 대하여 엄중하게 주의 환기를 행하고, 약제 살포 등에 의한 TYLCV 방제를 철저히 하고 있지만, TYLCV의 피해의 발생은 계속되고 있으며, 전국으로 확산되고 있다. 2016년 시점에서도, TYLCV는 토마토 생산에 있어서 가장 피해액이 큰 병해가 되고 있다.

토마토 황화 잎말림병의 증상은, 토마토의 잎의 황화로부터 시작되어, 서서히 잎의 가장자리가 하측으로 말려 기형이 된다(예를 들면, 도 3의 (b)를 참조). 증상이 심해지면, 포기 전체가 파마를 한 것처럼 된다. 과실에는 증상이 나타나지 않지만, 재배 초기에 토마토가 TYLCV에 감염되면, 과방(果房) 2단째 정도까지밖에 착과하지 않기 때문에, 수확량이 70~80% 감소가 되는 다대한 피해가 발생한다.

토마토 황화 잎말림병은, TYLCV의 매개충인 담배 가루이(Bemisia tabaci(Gennadius))에 의하여 전염되고, 영속적으로 만연해 버린다.

또, 식물 바이러스 자체에 대한, 효과적인 항바이러스 약제는 존재하지 않는다. 지금까지의 일반적인 식물 바이러스의 방제 방법은, 바이러스를 전염하는 매개충으로의 살충제 살포, 재배 시설로의 매개충의 진입을 물리적으로 방지하는 방충 네트나 기피 자재의 이용, 토양 소독, 감염주(株)의 제거, 재배 관리 기구의 소독, 장벽 작물의 이용, 및 바이러스 저항성 작물의 육종 등이 중심으로 되어 있다.

TYLCV의 방제 방법에 대해서도 동일하다. TYLCV의 매개충인 담배 가루이의 방제와 감염주의 조기 제거 등에 의하여, TYLCV의 전염 고리를 끊는 것이 주된 대책이다.

그러나, 담배 가루이의 방제를 위하여, 침입 저지에 유효한 0.4mm 메시 이하의 방충 네트를 사용하면, 재배 시설 내의 기온의 상승이 우려된다. 따라서, 현장에서는 실시되기 어렵다.

또, 토마토의 대산지인 규슈 등에서는, 재배 기간이 다른 다양한 재배형의 토마토가 재배되고 있기 때문에, 일년내내 어딘가의 지역에서 토마토가 재배되고 있다. 이 때문에, TYLCV를 보독(保毒)한 담배 가루이는, 다양한 토마토의 재배형에 맞추어 야외나 시설을 이동하여, 추운 겨울의 시기에도 사멸하지 않는다. 이와 같이 TYLCV의 전염 고리가 중단되는 경우가 없기 때문에, TYLCV의 방제가 곤란하다.

또한, 최근에는 살충제 내성이 있는 담배 가루이로서, 담배 가루이-바이오 타입 Q가 만연해 오고 있어, 살충제 방제에도 한계가 보인다.

TYLCV 저항성 토마토에 관련하여, 내성 유전자라고 불리는 Ty-1, Ty-2, Ty-3 등의 유전자가 토마토 야생종으로부터 발견되고 있다. 그러나, 이들 유전자의 존재에 의하여, 병징이 억제되지만, TYLCV의 감염 자체를 저지할 수는 없다.

TYLCV 내성 유전자를 교배로 도입한 토마토의 품종이 이미 시장에 나와 있지만, 이들 유전자의 특성상, 어느 품종도 TYLCV에 감염되어, 토마토의 생체 내에서 바이러스가 증식하는 것이 알려져 있다. 따라서, TYLCV 내성 유전자가 도입된 토마토를 재배함에 있어서, 담배 가루이의 방제를 소홀히 하면, 당해 토마토는 TYLCV를 보독되게 된다. 이와 같은 토마토는 TYLCV에 의한 병징이 억제되어도, TYLCV의 감염원이 되기 때문에, 주위의 TYLCV 감수성의 토마토 품종을 TYLCV 감염의 위기에 노출시켜 버린다(예를 들면, 비특허문헌 2~4를 참조).

상술한 문제는 TYLCV에 고유한 것은 아니고, 담배 가루이로 매개되어, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 공통의 문제이다.

European Food Safety Authority, "EFSA Journal," 2013, 11(4): 3162 B. Mabvakure et al., "Virology," 2016, 498: 257-264 J. Basak, "Journal of Plant Pathology & Microbiology," 2016, 7: 346 H. Czosnek 편, "Tomato Yellow Leaf Curl Virus Disease", Springer, 2007, pp. 85-118

상술한 바와 같은 종래의 식물 바이러스의 방제 방법에서는, TYLCV 등의, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 만연을 충분히 방제하는 것이 어려웠다. 또, TYLCV 내성 유전자를 도입한 가지과 식물의 품종에서는, 비록 TYLCV 감염에 따른 증상이 억제되고 있어도, 식물 내에서는 TYLCV가 증식하기 때문에, TYLCV의 전염 고리를 완전하게 분단할 수 없었다.

이상과 같은 배경하에, 본 발명은, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 감염을 저해하는 성질, 감염 후의 당해 바이러스의 증식을 억제하는 성질 및/또는 당해 바이러스의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는, 바이러스 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법을 제공하는 것을 과제로 한다.

본 발명은, 이하의 가지과 식물, 그 부분 및 그들의 가공품을 제공한다.

[1] 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖고, 상기 변이에 의하여, 상기 변이를 갖는 상기 유전자의 발현이 억제되고 있거나, 또는 상기 변이를 갖는 상기 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이며, 상기 바이러스에 대하여 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물.

[2] 상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, [1]에 기재된 가지과 식물.

[3] 상기 변이가, 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입된 것인, [1] 또는 [2]에 기재된 가지과 식물.

[4] 상기 변이가, 하기 (a)~(d) 중 적어도 1종인, [1] 내지 [3] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

(a) 프레임 시프트 변이,

(b) 넌센스 변이,

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및

(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실(缺失), 부가, 및/또는 삽입.

[5] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

[6] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

[7] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

[8] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [1] 내지 [4] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

[9] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [5]에 기재된 가지과 식물.

[10] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [9]에 기재된 가지과 식물.

[11] 상기 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 13~18로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [10]에 기재된 가지과 식물.

[12] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 번역 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [6]에 기재된 가지과 식물.

[13] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [12]에 기재된 가지과 식물.

[14] 상기 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 19~22로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [13]에 기재된 가지과 식물.

[15] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [7]에 기재된 가지과 식물.

[16] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 35 또는 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [15]에 기재된 가지과 식물.

[17] 상기 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 48~50으로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있거나, 및/또는 상기 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 51 또는 52에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [16]에 기재된 가지과 식물.

[18] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [17]에 기재된 가지과 식물.

[19] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [18]에 기재된 가지과 식물.

[20] 상기 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 53 또는 54에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [19]에 기재된 가지과 식물.

[21] 토마토인, [1] 내지 [20] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물.

[22] [1] 내지 [21] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물의 부분.

[23] 과실인, [22]에 기재된 가지과 식물의 부분.

[24] 종자인, [22]에 기재된 가지과 식물의 부분.

[25] [1] 내지 [24] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 또는 그 부분의 가공품.

[26] 식용인, [25]에 기재된 가공품.

또한, 본 발명은, 이하의 가지과 식물 세포, 및 그것을 갖는 가지과 식물과 그 부분을 제공한다.

[27] 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖고, 상기 변이에 의하여, 상기 변이를 갖는 상기 유전자의 발현이 억제되고 있거나, 또는 상기 변이를 갖는 상기 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이며, 상기 바이러스에 대하여 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물 세포.

[28] 상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, [27]에 기재된 가지과 식물.

[29] 상기 변이가, 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입된 것인, [27]에 기재된 가지과 식물 세포.

[30] 상기 변이가, 하기 (a)~(d) 중 적어도 1종인, [27] 내지 [29] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

(a) 프레임 시프트 변이,

(b) 넌센스 변이,

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및

(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입.

[31] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [27] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

[32] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [27] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

[33] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [27] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

[34] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, [27] 내지 [30] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

[35] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [31]에 기재된 가지과 식물 세포.

[36] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [35]에 기재된 가지과 식물 세포.

[37] 상기 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 13~18로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [36]에 기재된 가지과 식물 세포.

[38] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 번역 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [32]에 기재된 가지과 식물 세포.

[39] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [38]에 기재된 가지과 식물 세포.

[40] 상기 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 19~22로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [39]에 기재된 가지과 식물 세포.

[41] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [33]에 기재된 가지과 식물 세포.

[42] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 35 또는 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [41]에 기재된 가지과 식물 세포.

[43] 상기 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 48~50으로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있거나, 및/또는 상기 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 51 또는 52에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [42]에 기재된 가지과 식물 세포.

[44] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [43]에 기재된 가지과 식물 세포.

[45] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, [44]에 기재된 가지과 식물 세포.

[46] 상기 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 53 또는 54에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, [45]에 기재된 가지과 식물 세포.

[47] 토마토인, [27] 내지 [46] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포.

[48] [27] 내지 [47] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 세포를 갖고, 토마토 황화 잎말림 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물 및 그 부분.

[49] 과실인, [48]에 기재된 가지과 식물의 부분.

[50] 종자인, [48]에 기재된 가지과 식물의 부분.

[51] [48] 내지 [50] 중 어느 하나에 기재된 가지과 식물 또는 그 부분의 가공품.

[52] 식용인, [51]에 기재된 가공품.

또한, 본 발명은 이하의 가지과 식물의 생산 방법, 및 당해 생산 방법에 따라 얻어진 가지과 식물을 제공한다.

[53] 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자를 선택하는 공정과, 가지과 식물의 게놈 내의 선택한 유전자에 대하여, 상기 선택한 유전자의 발현이 억제되는 변이, 또는 상기 선택한 유전자가 코드하는 단백질이, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이 되는 변이를 도입하는 공정과, 상기 바이러스에 대하여 저항성을 갖는 가지과 식물을 선별하는 공정을 포함하는, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[54] 상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, [53]에 기재된 가지과 식물.

[55] 상기 변이를, 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입하는, [53] 또는 [54]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[56] 상기 변이가, 하기 (a)~(d) 중 적어도 1종인, [53]~「55]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

(a) 프레임 시프트 변이,

(b) 넌센스 변이,

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및

(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입.

[57] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, [53] 내지 [56] 중 어느 하나에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[58] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, [53] 내지 [56] 중 어느 하나에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[59] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, [53] 내지 [56] 중 어느 하나에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[60] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, [53] 내지 [56] 중 어느 하나에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[61] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [57]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[62] 상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, [61]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[63] 상기 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 13~18로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, [62]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[64] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [58]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[65] 상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, [64]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[66] 상기 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 19~22로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, [65]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[67] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [59]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[68] 상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 35 또는 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, [67]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[69] 상기 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 48~50으로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하거나, 및/또는 상기 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 51 또는 52에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, [68]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[70] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며, 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, [60]에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[71] 상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, [70]에 기재된 토마토 황화 잎말림 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[72] 상기 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 53 또는 54에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, [71]에 기재된 토마토 황화 잎말림 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[73] 상기 가지과 식물이 토마토인, [53] 내지 [72] 중 어느 하나에 기재된 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.

[74] [53] 내지 [73] 중 어느 하나에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진, 바이러스 저항성 가지과 식물.

또한 본 발명은, 이하의 가지과 식물 육종 후대의 생산 방법 및 당해 생산 방법에 따라 얻어진 가지과 식물을 제공한다.

[75] [53] 내지 [73] 중 어느 하나에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진 바이러스 저항성 가지과 식물 또는 그 후대를, 자가수분 또는 타가수분시키는 공정을 포함하는, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인 바이러스 저항성 가지과 식물의 육종 후대의 생산 방법.

[76] [75]에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인, 바이러스 저항성 가지과 식물.

본 발명에 의하면, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 감염을 저해하는 성질, 감염 후의 당해 바이러스의 증식을 억제하는 성질 및/또는 당해 바이러스의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는, 당해 바이러스에 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법이 제공된다.

도 1은, 토마토의 번역 개시 인자 eIF4E 유전자(solyc03g005870)의 cDNA 배열이며, 하선부가 엑손 2이고, 이중 하선부가 가이드 RNA 인식 부분(엑손 2의 135번 염기~154번 염기)이며, 사각으로 둘러싼 부분이 PAM 배열이다.
도 2는, 토마토의 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자(solyc02g091840)의 cDNA 배열이며, 하선부가 엑손 1이고, 이중 하선부가 가이드 RNA 인식 부분(엑손 1의 790번 염기~809번 염기)이며, 사각으로 둘러싼 부분이 PAM 배열이다.
도 3은, TYLCV 접종으로부터 42일 후의, TYLCV 감염의 증상을 나타내지 않는, eIF4E 유전자의 편집 계통 A132의 T1 개체(도 중의 (a)), 및 TYLCV 감염의 증상을 나타낸 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토(도 중의 (b))이다.
도 4는, eIF4E 유전자의 편집 계통 A132의 T1 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 25일째에 증상의 유무 및 PCR 검정에 근거하여 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 5는, eIF4E 유전자의 편집 계통 A132의, 무증상 T1 개체에 대하여 실시한 PCR 검정의 결과이다.
도 6은, eIF4E 유전자의 편집 계통 A132-10의 T2 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 22일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 7은, TYLCV 접종으로부터 25일 후의, TYLCV 감염의 증상을 나타내지 않는, RLK 유전자의 편집 계통 C6의 T1 개체(도 중의 (a) 및 (b)), 및 TYLCV 감염의 증상을 나타낸 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토(도 중의 (c))이다.
도 8은, RLK 유전자의 편집 계통 C6의 무증상 T1 개체에 대하여 실시한 PCR 검정의 결과이다.
도 9는, RLK 유전자의 편집 계통 C72의 T1 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 28일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 10은, RLK 유전자의 편집 계통 C6-18의 T2 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 22일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 11은, 토마토의 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 내의 변이 패턴을 나타내는 도이며, 밑줄은 변이부를 나타내고, 「·」은 염기의 부재(결손)를 나타낸다.
도 12는, 토마토의 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 내의 변이 패턴을 나타내는 도이며, 밑줄은 변이부를 나타내고, 「·」은 염기의 부재(결손)를 나타낸다.
도 13은, 토마토의 염색체 1번에 존재하는, 폴리머 코트 복합체 COPI의 성분을 코드하는 deltaCOP 유전자(Solyc01g103480)이며, 하선부가 엑손 6이고, 이중 하선부가 가이드 RNA 인식 부분(엑손 6의 70번 염기~89번 염기)이며, 사각으로 둘러싼 부분이 PAM 배열이다.
도 14는, 토마토의 염색체 10번에 존재하는, 폴리머 코트 복합체 COPI의 성분을 코드하는 deltaCOP 유전자(Solyc10g038120)이며, 하선부가 엑손 2이고, 이중 하선부가 가이드 RNA 인식 부분(엑손 2의 31번 염기~50번 염기)이며, 사각으로 둘러싼 부분이 PAM 배열이다.
도 15는, 토마토의 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자(Solyc10g074910)의 cDNA 배열이며, 이중 하선부가 가이드 RNA 인식 부분(엑손 4의 74번 염기~93번 염기)이고, 사각으로 둘러싼 부분이 PAM 배열이다.
도 16은, 염색체 1번에 존재하는 deltaCOP 유전자의 편집 계통 D16의 T1 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 21일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 17은, 염색체 10번에 존재하는 deltaCOP 유전자의 편집 계통 E4의 T1 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 21일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 18은, NSI 유전자의 편집 계통 F43의 T1 개체, 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토에 대하여, 바이러스 접종으로부터 21일째에 증상의 유무 및 PCR 검정의 결과로부터 구한 이병률을 나타내는 그래프이며, 각 바 아래의 괄호 내의 숫자는 샘플수이다.
도 19의 (A)는, 토마토의 염색체 1번에 존재하는, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 내의 변이 패턴을 나타내는 도이며, 도 19의 (B)는, 토마토의 염색체 10번에 존재하는, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 내의 변이 패턴을 나타내는 도이고, 밑줄은 변이부를 나타내며, 「」은 염기의 부재(결손)를 나타낸다.
도 20은, 토마토의 셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 내의 변이 패턴을 나타내는 도이며, 밑줄은 변이부를 나타내고, 「」은 염기의 부재(결손)를 나타낸다.

본 발명자들은, 상기 과제를 해결하기 위하여 예의 검토를 거듭한 결과, 가지과 식물이 그 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자, 및/또는 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖고, 당해 변이에 의하여, 변이를 갖는 유전자(eIF4E 유전자, RLK 유전자, deltaCOP 유전자, NSI 유전자 혹은 그들의 상동 유전자)의 발현이 억제되고 있거나, 또는 변이를 갖는 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스(예를 들면 TYLCV)에 대하여 비기능적이면, 가지과 식물이 당해 바이러스에 대하여 저항성을 갖는 것을 알아냈다. 이와 같은 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스 저항성의 식물은, 가지과에서는 최초의 보고이다.

이하, 본 발명을 실시하기 위한 형태(이하, 「본 실시형태」라고도 한다)에 대하여 상세하게 설명한다. 또한, 본 발명은, 이하의 본 실시형태 및 도면에 한정되는 것은 아니고, 그 요지의 범위 내에서 다양하게 변형하여 실시할 수 있다.

본 발명에 있어서, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 특별히 한정은 없지만, 토마토 황화 잎말림 바이러스(TYLCV)인 것이 바람직하다. 이하, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 구체예로서 TYLCV를 이용하여 본 발명을 설명하지만, 이들의 설명은, 본 발명에 관한 베고모 바이러스속 바이러스를 TYLCV에 한정하는 것은 아니다. 이하의 설명에 있어서는, 「TYLCV」를 「토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스」라고 바꿔 읽을 수도 있는 것을 이해하기 바란다.

[I] TYLCV 저항성인 가지과 식물

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, TYLCV 저항성 가지과 식물에 관한 것이다. 본 실시형태에 있어서, TYLCV 저항성 가지과 식물이란, TYLCV의 감염을 저해하는 성질, 감염되어도 TYLCV의 증식을 억제하는 성질 및/또는 TYLCV의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는 식물이다. TYLCV 저항성 가지과 식물은, TYLCV의 감염을 저해하거나, 감염되어도 TYLCV의 증식을 억제하는 성질을 갖는 식물인 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 「토마토 황화 잎말림 바이러스(TYLCV)」란, 제미니 바이러스과(Geminiviridae) 베고모 바이러스속(Begomovirus)으로 분류되는, 환상 1개쇄 DNA를 1분절 게놈으로서 갖고, 직경 약 20nm의 구체상의 바이러스 입자가 2개 결합된 쌍구상인 바이러스를 의미한다.

TYLCV는, 중근동, 북중미, 동남 아시아, 동아시아(일본, 중국) 등에서 주로 발생하고 있다. 일본에서 발생하고 있는 TYLCV는, 주로 2계통 존재하고, 나가사키에서 발견된 분리주를 비롯하여, 규슈, 간토 등에서 발생하고 있는 TYLCV 이스라엘 계통과, 도카이, 간토에서 발생하고 있는 이스라엘 마일드 계통이 있다.

본 실시형태에 있어서 가지과 식물은, Solanaceae과에 속하는 식물인 한 특별히 한정은 없고, 가지속(Solanum속), Nicotiana속, Capsicum속 등에 속하는 식물을 들 수 있다. 구체적으로는, 토마토(Solanum lycopersicum), 가지(Solanum melongena), 담배(Nicotiana tabacum), 고추(Capsicum annuum), 감자(Solanum tuberosum) 등을 들 수 있고, 바람직하게는 토마토, 가지, 감자이며, 특히 바람직하게는 토마토이다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태의 TYLCV 저항성 가지과 식물은, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖는다.

(eIF4E 유전자)

eIF4E 유전자란, "eukaryotic translation iniciation factor 4E", 즉 진핵생물 번역 개시 인자 4E를 코드하는 유전자이다. eIF4E는, 진핵생물에 있어서의 번역 개시 인자의 일종이며, 단백질 합성의 개시에 있어서 중요한 역할을 갖는다. eIF4E는, eIF(iso)4E와 함께, eIF4E 패밀리를 구성하고 있다. 또, 가지과 식물은, 복수의 eIF4E의 아이소폼를 갖는다고 생각된다. 예를 들면, 토마토에 있어서는, eIF4E는 2종의 아이소폼으로 이루어지고, 2번 염색체 및 3번 염색체상에 존재하는 것이 알려져 있다. 또, eIF(iso)4E는, 토마토에 있어서 1종 존재하고, 9번 염색체상에 존재하는 것이 알려져 있다.

또 다른 가지과 식물에도, 토마토의 eIF4E와 상동인 유전자의 존재가 알려져 있다. 예를 들면, 고추에는 토마토의 eIF4E와 상동인 유전자로서, 4번 염색체상에 있는 pvr1 및 pvr2의 존재가 알려져 있다(또한, pvr1과 pvr2는 대립 유전자의 관계에 있다). 또한, 토마토의 eIF(iso)4E와 상동인 유전자로서, 3번 염색체상의 pvr6이 알려져 있다.

상술한 eIF4E의 아이소폼과 같은, eIF4E 패밀리를 구성하는 멤버의 유전자나, 다른 가지과 식물에 대하여 알려져 있는 eIF4E와 상동인 유전자는, 모두 본 발명에 관한 eIF4E 유전자의 상동 유전자이다.

본 실시형태에 있어서, 「eIF4E 유전자」는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것, 또는 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 또한, 「cDNA 배열」이란, 유전자로부터 전사된 mRNA로부터 역전사 의하여 합성된 DNA이며, 유전자에 존재하는 인트론이 제거된, 단백질 코드 영역만으로 이루어지는 DNA 배열이다.

또한 본 실시형태에 있어서, 「eIF4E 유전자의 상동 유전자」란, 그 cDNA 배열이, 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것, 혹은 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 배열 번호 1의 염기 배열과의 상동성에 특별히 한정은 없지만, 85% 이상, 100% 미만인 것이 바람직하다. 또, 상동성의 하한값은, 87% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 등, 어떠한 값이어도 상관없다. 또한, 배열 번호 1에 나타내는 염기 배열과, 상동성 유전자의 cDNA 배열의 상동성은, 공지의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, BLAST와 같은 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, 염기 배열의 상동성을 결정할 수 있다.

(RLK 유전자)

RLK 유전자란, "Receptor-Like Kinase", 즉 수용체 유사 키나아제를 코드하는 토마토의 유전자이다. RLK는, 애기장대에서는 BAM1(Barely Any Meristem 1)이라고 불리고, 잎이나 배우자 형성에 관한, 슈트(shoot)와 화분열 조직 기능에 필요한 CLAVATA1 관련 리셉터 유사 키나아제 단백질을 코드하고 있다. 또, 애기장대의 BAM1에는 꽤 상동성이 높은 BAM2의 존재가 확인되고 있으며, 토마토에 있어서도, 최근의 연구로부터, 상동성이 높은 상동체의 존재를 알 수 있었다. 이와 같은 상동체란, 본 실시형태에 관한 RLK를 「RLK1」(Solyc02g091840, 2번 염색체상)로 하면, 「RLK2」로서 알려지는 것이다. 또한, 애기장대의 BAM1에 대해서는, TYLCV의 근연 바이러스의 C4단백질과의 관련이나, 근연 바이러스의 복제에도 관여하는 것이 시사되고 있지만, 토마토의 RLK와 TYLCV의 관계에 대해서는, 지금까지 보고는 없다.

본 실시형태에 있어서, 「RLK 유전자」는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것, 또는 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 「RLK 유전자의 상동 유전자」란, 그 cDNA 배열이, 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것, 혹은 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 배열 번호 4의 염기 배열과의 상동성에 특별히 한정은 없지만, 85% 이상, 100% 미만인 것이 바람직하다. 또, 상동성의 하한값은, 87% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 등, 어떠한 값이어도 상관없다. 또한, 배열 번호 4에 나타내는 염기 배열과, 상동성 유전자의 cDNA 배열의 상동성은, 공지의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, BLAST와 같은 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, 염기 배열의 상동성을 결정할 수 있다.

(deltaCOP 유전자)

deltaCOP 유전자는, 폴리머 코트 복합체 COPI의 성분을 코드하는 유전자이다. COPI의 정확한 역할의 상세는 불명확하지만, 골지체와의 관련, 및 골지체에 대한 소포 수송과의 관련이 알려져 있다. 애기장대의 연구에 있어서는, 소포 수송은 제미니 바이러스과의 바이러스의 이행 단백질의 수송에 관련이 있기 때문에, 바이러스 감염에도 관계가 있다고 추측되고 있다.

토마토에서는, 2종의 deltaCOP 유전자의 존재가 확인되고 있으며, 각각 염색체 1번과 10번에 존재한다(Solyc01g103480, Solyc10g038120). 따라서 본 명세서에 있어서는, 염색체 1번에 존재하는 deltaCOP 유전자를 「delta01 유전자」라고 약기하고, 염색체 10번에 존재하는 deltaCOP를 「delta10 유전자」라고 약기하는 경우가 있으며, 「deltaCOP 유전자」라는 기재는, 상기 2종의 유전자의 양방 또는 어느 일방을 의미하는 것으로 한다.

담배에 있어서는, TYLCV와 근연의 TYLCSV의 감염에 관여하는 것이 시사되고 있지만, 토마토의 deltaCOP와 TYLCV의 관계에 대해서는, 지금까지 보고는 없다.

본 실시형태에 있어서, deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 배열 번호 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것, 혹은 배열 번호 33 또는 배열 번호 36에 나타나는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 또한, 배열 번호 33의 cDNA 배열은 염색체 1번에 존재하는 delta01 유전자에 대응하는 것이며, 배열 번호 34의 cDNA 배열은 염색체 10번에 존재하는 delta10 유전자에 대응하는 것이다.

본 실시형태에 있어서, 「deltaCOP 유전자의 상동 유전자」란, 그 cDNA 배열이, 배열 번호 33 또는 배열 번호 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것, 혹은 배열 번호 33 또는 배열 번호 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 배열 번호 33 또는 배열 번호 36의 염기 배열과의 상동성에 특별히 한정은 없지만, 85% 이상, 100% 미만인 것이 바람직하다. 또, 상동성의 하한값은, 87% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 등, 어떠한 값이어도 상관없다. 또한, 배열 번호 33 또는 배열 번호 36에 나타내는 염기 배열과, 상동성 유전자의 cDNA 배열의 상동성은, 공지의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, BLAST와 같은 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, 염기 배열의 상동성을 결정할 수 있다.

(NSI 유전자)

NSI 유전자는, 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자라고 생각되고 있다. 애기장대의 연구에 있어서, NSI 유전자는, 베고모 바이러스속의 Cabbage leaf curl virus(CaLCuV)의 이행 단백(NSP; 핵셔틀 단백질)과 상호 작용 하는 것이 나타나 있다. 그 때문에, CaLCuV의 바이러스 감염 및 복제에 관여한다고 추측된다. 토마토에서는, NSI 유전자는, 아세틸트랜스페라아제 유사 단백 유전자로서 염색체 10번에 존재한다(Solyc10g074910). 아세틸트랜스페라아제 유사 단백 유전자는, 염색체 5번에 또 하나 존재하지(Solyc05g010250)만, 전자와 후자의 상동성은 높지 않다. 토마토의 NSI 유전자와 TYLCV의 관계에 대해서는, 지금까지 보고는 없다.

본 실시형태에 있어서, NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것, 또는 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다.

본 실시형태에 있어서 「NSI 유전자의 상동 유전자」란, 그 cDNA 배열이, 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것, 혹은 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 배열 상동성을 갖는 염기 배열로 이루어지는 것인 것이 바람직하다. 배열 번호 39의 염기 배열과의 상동성에 특별히 한정은 없지만, 85% 이상, 100% 미만인 것이 바람직하다. 또, 상동성의 하한값은, 87% 이상, 90% 이상, 93% 이상, 95% 이상, 97% 이상, 99% 이상, 99.5% 이상 등, 어떠한 값이어도 상관없다. 또한, 배열 번호 39에 나타내는 염기 배열과, 상동성 유전자의 cDNA 배열의 상동성은, 공지의 방법으로 결정할 수 있다. 예를 들면, BLAST와 같은 공지의 상동성 검색 프로그램을 사용하여, 염기 배열의 상동성을 결정할 수 있다.

(TYLCV 저항성 유전자)

본 실시형태에 있어서, 가지과 식물은, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자에 변이를 갖는다(이하, 변이를 갖는 유전자를 「TYLCV 저항성 유전자」라고도 한다). 당해 변이란, 변이를 갖는 유전자의 발현을 억제하거나, 또는 유전자가 코드하는 단백질을 TYLCV에 대하여 비기능적으로 하는 것이다. TYLCV에 대하여 비기능적인 단백질이란, TYLCV가 식물에 감염되어, 증식할 때에 이용할 수 없거나, TYLCV의 감염 및 증식을 저감시키는 단백질을 가리킨다. 일 양태에 있어서, TYLCV 저항성 유전자는, 단백질을 코드하지 않도록 변이된 것이어도 된다.

이론에 속박되는 것은 아니지만, TYLCV가 식물에 감염될 때에는, 가지과 식물에 존재하는 복수의 eIF4E의 아이소폼 중, 특정의 eIF4E를 이용한다고 생각된다. 이때, TYLCV가 사용하는 특정의 아이소폼(즉, TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E)을 코드하는 유전자가 변이되어, TYLCV가 사용하는 특정의 eIF4E 단백질이 생산되지 않게 되거나, 또는 생산된 eIF4E 단백질이 TYLCV에 대하여 비기능적인 것이면, 바이러스 게놈상에 코드되는, 감염 증식에 필요한 단백질의 번역이 진행하지 않게 된다고 생각된다. 혹은 eIF4E와의 상호 작용을 필요로 하는 TYLCV 단백질이 그 기능을 할 수 없게 되어, TYLCV의 감염 및 증식이 저해됨으로써, 가지과 식물이 TYLCV 저항성을 획득한다고 생각된다.

한편, 가지과 식물에 존재하는 복수의 eIF4E 상동체 중 하나가 변이해도, 식물 자체는 다른 상동체를 이용 가능하거나, 또는 식물 자체는 TYLCV에 비기능적인 eIF4E 단백질을 이용 가능하기 때문에, 숙주인 가지과 식물의 생육에 영향을 주지 않고, TYLCV 저항성을 부여하는 것이 가능하다고 생각된다.

RLK에 대해서도, 상술한 바와 같이, RLK1(Solyc02g091840, 2번 염색체상)과 상동성이 높은 RLK2의 존재가 알려져 있고, 식물에 있어서 서로 보좌하면서 존재하고 있다고 생각된다.

deltaCOP 유전자는, 상술한 바와 같이 2개의 호몰로그가 존재하고, 서로 보좌하여 존재한다고 생각된다.

또, NSI 유전자는, 아세틸트랜스페라아제 유사 단백 유전자라고 생각되고, 토마토에는 2종의 유전자가 존재하고 있다.

상술한 바와 같이 TYLCV 저항성 유전자를 갖는 가지과 식물은, TYLCV 저항성을 획득한다. 예를 들면, TYLCV 접종으로부터 20일 이상 지나도, 식물체 중의 TYLCV의 축적량이, TYLCV 비접종주와 동일한 정도 또는 그 이하인 것, 및/또는 TYLCV 감염 증상이 육안에 의하여 확인할 수 없는 것으로, 식물이 「TYLCV 저항성」을 갖는다고 판정할 수 있다. 구체적으로는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, 통상의 방법에 따라 식물에 TYLCV를 감염시켜, 식물체 중의 TYLCV의 축적을 ELISA법, PCR법 등의 공지의 수법으로 확인함으로써, 식물의 TYLCV 저항성을 판단할 수 있다. 또, TYLCV를 감염시킨 식물의 TYLCV 감염 증상(잎의 모자이크화나 황화, 실잎, 왜화(矮花), 괴저 등)의 유무를 확인함으로써도 식물의 TYLCV 저항성을 판단할 수 있다.

가지과 식물이 상술한 TYLCV 저항성을 갖는 한, 유전자 변이는, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자에 존재하면 된다. 따라서, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및/또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는 가지과 식물, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및/또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는 가지과 식물, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및/또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는 가지과 식물, 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및/또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는 가지과 식물, 및 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자와, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 2개 이상에 변이를 갖는 가지과 식물이 본 실시형태에는 포함될 수 있다.

또한 본 실시형태에 있어서의 TYLCV 저항성 가지과 식물은, eIF4E 유전자에 변이를 갖는 경우, TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코드하는 유전자의 모두에 변이를 가져도 된다. 예를 들면, 복이배체 등의 배수체 식물의 경우, 복수 존재하는, TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코드하는 유전자가, 모두 TYLCV 저항성 유전자로 변이되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 TYLCV 저항성 가지과 식물은, TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코드하는 유전자가 변이되어 있는 한, 다른 정상적인 eIF4E 유전자를 갖는 것이어도 된다. 또, TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E 단백질을 코드하는 내생(內生)의 유전자가 모두 결실, 파괴 등 하여 기능을 상실하고, 대신에 외래의 eIF4E 유전자를 도입한 것이어도 된다.

TYLCV 저항성 가지과 식물이 RLK 유전자, deltaCOP 유전자, 및/또는 NSI 유전자에 변이를 갖는 경우도 상기와 동일하다. 즉, 본 발명에 관한 TYLCV에 대하여 기능적인 어느 하나의 단백질을 코드하는 유전자의 모두에 변이를 가져도 되고, TYLCV에 대하여 기능적인 단백질을 코드하는 유전자가, 모두 TYLCV 저항성 유전자로 변이되어 있는 것이 바람직하다. 이와 같은 TYLCV 저항성 가지과 식물은, TYLCV에 대하여 기능적인 어느 하나의 단백질을 코드하는 유전자가 변이되어 있는 한, 다른 정상적인 유전자를 갖는 것이어도 된다. 또, TYLCV에 대하여 기능적인 어느 하나의 단백질을 코드하는 내생의 유전자를 모두 결실, 파괴 등 하여 기능을 상실하고, 대신에 외래의 상동인 유전자를 도입한 것이어도 된다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태에 있어서의 TYLCV 저항성 가지과 식물은, 그 게놈 내의 유전자에 변이를 갖는다. 유전자 변이의 구체예로서는, 이하의 (a)~(d)를 들 수 있다.

(a) 프레임 시프트 변이,

(b) 넌센스 변이,

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및

(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입.

(a) 프레임 시프트 변이는, 염기의 결실 또는 삽입에 의하여, 코돈의 해독틀이 어긋나, 다른 아미노산 배열을 코드하게 되는 변이이다. 코드하는 아미노산 배열이 바뀜으로써, 변이 유전자는 TYLCV 저항성 유전자가 된다.

(b) 넌센스 변이는, 본래 아미노산을 코드하고 있던 코돈이 종지 코돈으로 바뀌는 변이이며, 이로써 TYLCV 저항성 유전자가 된다.

(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7, 바람직하게는 n=1~3, 예를 들면 3n 염기는, 3, 6또는 9염기)의 결손에 의하여, 당해 결손 영역에서 하류의 염기 배열에 의하여 코드되는 아미노산 배열이 변화한다. 이와 같은 변화가 발생하기 때문에, TYLCV 저항성 유전자가 된다.

(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입에 의하여, 변이 영역의 하류의 염기 배열이 코드하는 아미노산 배열의 해독틀이 변화한다. 해독틀의 변화에 의하여, 원래 코드하고 있던 아미노산 배열이 바뀌어, 단백질의 구조 변화 등이 발생하기 때문에, TYLCV 저항성 유전자가 된다. 일 양태에 있어서, 이 변이는, 코돈의 3번째 이외의 염기의 변이인 것이 바람직하다. 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입되는 염기의 개수는, TYLCV 저항성 유전자가 얻어지는 한 특별히 한정되지 않지만, 예를 들면 1~5개, 1~3개, 또는 1~2개로 할 수 있다.

TYLCV 저항성 유전자가 갖는 변이는, 상기 (a)~(d)로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종인 것이 바람직하다. 또한, 상기 (a)~(d)의 변이는, 택일적인 것은 아니고, 예를 들면 (c)나 (d)의 변이의 결과로서, (a)나 (b)의 변이가 일어나는 경우도 있다.

가지과 식물의 게놈 내의 변이는, 변이를 갖는 유전자의 발현을 억제하는 것, 또는 당해 유전자가 코드하는 단백질을 TYLCV에 대하여 비기능적으로 하는 것이며, 변이 유전자를 갖는 식물에 TYLCV 저항성을 부여하고, 또한 당해 식물의 생명 및 생육에 현저한 장애를 주지 않는 것인 한, 특별히 한정은 없다.

다음으로, 이와 같은 변이에 대하여 구체적으로 설명한다.

일 양태에 있어서, 가지과 식물이 eIF4E 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, eIF4E 유전자의 엑손 2(배열 번호 2) 내에 존재하는 것이 바람직하고, 엑손 2 내의 135번~154번 염기를 포함하는 영역, 즉 배열 번호 3에 나타낸 AGGGTAAATCTGATACCAGC를 포함하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 가지과 식물이 eIF4E 유전자의 상동 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 당해 상동 유전자 내의, 배열 번호 2에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 바람직하고, 당해 영역 내의 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다.

가지과 식물이 배열 번호 3에 나타낸 AGGGTAAATCTGATACCAGC 또는 그에 대응하는 영역에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 1염기 삽입, 3염기 결손, 혹은 9염기의 결손 또는 치환인 것이 바람직하다. 이와 같은 변이의 구체예로서는, 15번째와 16번째의 염기 사이로의 1염기 삽입(일례로서, C(사이토신)의 삽입), 16~18번째의 3염기 결손, 8~18번째 중 어느 9염기의 결손(바람직하게는, 10번째 및 13번째 이외의 9염기의 결손)을 들 수 있다. 이와 같은 변이를 갖는 영역의 염기 배열을 도 11 및 배열 번호 13~18에 나타냈다.

또, 본 발명에 있어서는, eIF4E 유전자의 아이소폼인 eIF(iso)4E유전자에, 상기 eIF4E 유전자와 유사한 변이를 갖는, TYLCV 저항성 가지과 식물의 생산에도 성공했다.

일 양태에 있어서, 가지과 식물이 RLK 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, RLK 유전자의 엑손 1(배열 번호 5) 내에 존재하는 것이 바람직하고, 엑손 1 내의 790번~809번 염기를 포함하는 영역, 즉 배열 번호 6에 나타낸 TCTCTAGAGTACCTTGCAGT를 포함하는 영역 내에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 가지과 식물이 RLK 유전자의 상동 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 당해 상동 유전자 내의, 배열 번호 5에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 바람직하고, 당해 영역 내의 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다.

가지과 식물이 배열 번호 6에 나타낸 TCTCTAGAGTACCTTGCAGT 또는 그에 대응하는 영역에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 5염기 결손, 7염기 결손, 혹은 1염기의 삽입 또는 치환인 것이 바람직하다. 이와 같은 변이를 갖는 영역의 염기 배열을 도 12 및 배열 번호 19~22에 나타냈다.

일 양태에 있어서, 가지과 식물이 deltaCOP 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 염색체 1번의 deltaCOP 유전자(즉 delta01 유전자)의 엑손 6(배열 번호 34) 내에 존재하는 것이 바람직하고, delta01 유전자의 엑손 6 내의 70번~89번 염기를 포함하는 영역, 즉 배열 번호 35에 나타낸 ACTGGCTTTGGCAGCGACTC를 포함하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 가지과 식물이 delta01 유전자의 상동 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 당해 상동 유전자 내의, 배열 번호 34에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 바람직하고, 당해 영역 내의 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다.

가지과 식물이 배열 번호 35에 나타낸 ACTGGCTTTGGCAGCGACTC 또는 그에 대응하는 영역에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 2염기 결손, 3염기 결손, 혹은 6염기의 결손 및 1염기 치환인 것이 바람직하다. 이와 같은 변이의 구체예로서는, 16~17번째의 2염기 결손, 15~17번째의 3염기 결손, 11번째의 염기의 치환과 12~17번째의 6염기의 결손을 들 수 있다.

혹은, deltaCOP 유전자의 변이는, 염색체 10번의 deltaCOP 유전자(즉 delta10 유전자)의 엑손 2(배열 번호 37)에 존재하는 것이 바람직하고, delta10 유전자의 엑손 2 내의 31번~50번 염기를 포함하는 영역, 즉 배열 번호 38에 나타낸 TTCATGTCTCTGCAATCCAT를 포함하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 가지과 식물이 delta10 유전자의 상동 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 당해 상동 유전자 내의, 배열 번호 37에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 바람직하고, 당해 영역 내의 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다.

가지과 식물이 배열 번호 38에 나타낸 TTCATGTCTCTGCAATCCAT 또는 그에 대응하는 영역에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 1염기 결손, 혹은 4염기의 결손인 것이 바람직하다. 이와 같은 변이의 구체예로서는, 17번째의 1염기 결손, 14~17번째의 4염기 결손을 들 수 있다.

deltaCOP 유전자의 변이를 갖는 영역의 염기 배열을 도 19, 배열 번호 48~52에 나타냈다.

일 양태에 있어서, 가지과 식물이 NSI 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, NSI 유전자의 엑손 4(배열 번호 40) 내에 존재하는 것이 바람직하고, 엑손 4 내의 74번~93번 염기를 포함하는 영역, 즉 배열 번호 41에 나타낸 GAGGAATTTGTTCTAGTTGA를 포함하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다. 가지과 식물이 NSI 유전자의 상동 유전자에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 당해 상동 유전자 내의, 배열 번호 40에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 바람직하고, 당해 영역 내의 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 존재하는 것이 보다 바람직하다.

가지과 식물이 배열 번호 41에 나타낸 GAGGAATTTGTTCTAGTTGA 또는 그에 대응하는 영역에 변이를 갖는 경우, 당해 변이는, 1염기 삽입, 혹은 9염기의 결손인 것이 바람직하다. 이와 같은 변이의 구체예로서는, 3번째와 4번째의 염기 사이로의 1염기 삽입(일례로서, T(티민)의 삽입), 4~12번째의 9염기의 결손을 들 수 있다. 이와 같은 변이를 갖는 영역의 염기 배열을 도 20 및 배열 번호 53과 54에 나타냈다.

본 실시형태는, TYLCV 저항성 유전자인, 배열 번호 13~18 중 어느 하나에 나타낸 변이 영역을 갖는 변이 eIF4E 유전자 자체, 배열 번호 19~22 중 어느 하나에 나타낸 변이 영역을 갖는 변이 RLK 유전자 자체, 배열 번호 48~50 및 배열 번호 51~52 중 어느 하나에 나타낸 변이 영역을 갖는 변이 deltaCOP 유전자 자체, 및 배열 번호 53~54 중 어느 하나에 나타낸 변이 영역을 갖는 변이 NSI 유전자 자체에 관한 것이다. 이와 같은 유전자로서는, cDNA 배열이 배열 번호 23~28 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열을 포함하거나, 또는 배열 번호 23~28 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 변이 eIF4E 유전자, cDNA 배열이 배열 번호 29~32 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열을 포함하거나, 또는 배열 번호 29~32 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 변이 RLK 유전자, cDNA 배열이 배열 번호 55~59 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열을 포함하거나, 또는 배열 번호 55~59 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 변이 deltaCOP 유전자, cDNA 배열이 배열 번호 60~61 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열을 포함하거나, 또는 배열 번호 60~61 중 어느 하나에 나타낸 염기 배열로 이루어지는 변이 NSI 유전자가 바람직하다. 본 실시형태는, 또, 가지과 식물에 TYLCV 저항성을 부여하기 위한, 상기 변이 eIF4E 유전자, 변이 RLK 유전자, 변이 deltaCOP 유전자, 또는 변이 NSI 유전자의 사용에도 관한 것이다.

또한, 가지과 식물이 갖는 변이는, 상술한 영역에 한정되는 것은 아니고, TYLCV 저항성이 손상되지 않는 한 eIF4E 유전자, RLK 유전자, deltaCOP 유전자, NSI 유전자 내의 다른 영역이나, 다른 유전자에 변이가 존재해도 된다.

일 양태에 있어서, 가지과 식물의 유전자의 변이는, 후술하는 CRISPR 시스템 등의 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입된 것인 것이 바람직하다.

게놈 내의 변이 유전자는, 2개의 대립 유전자의 양방에 존재하는 호모 접합형이어도 되고, 일방의 대립 유전자에만 존재하는 헤테로 접합형이어도 되지만, 호모 접합형인 것이 바람직하다. 이것은 동일한 변이 배열에 의하여 2개의 대립 유전자가 특징지어지는 호모 접합형의 쪽이, 변이 유전자에 의하여 초래되는 성질이, 보다 강하게 발현된다고 생각되기 때문이다.

(TYLCV 저항성인 가지과 식물 및 그 부분)

본 실시형태에 있어서의 TYLCV 저항성인 가지과 식물은, TYLCV에 저항성을 나타내는 한, 다른 바이러스나 세균에 대한 저항성을 나타내는, 복합 저항성 가지과 식물이어도 된다. 다른 바이러스의 구체예로서는, 가지과에 감염되는 모든 포티바이러스(PVY 등), PVY와 동일한 VPg를 바이러스 게놈의 5’ 말단에 갖고, 번역 개시 인자의 변이에 의한 저항성이 보고되어 있는 Bymovirus속 및 Sobemovirus속에 속하는 바이러스, 번역 개시 인자의 변이에 의한 저항성이 보고되어 있는 Carmovirus속에 속하는 바이러스 등을 들 수 있다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, TYLCV 저항성을 갖는 가지과 식물의 부분에 관한 것이다. 당해 부분에는, 상기 특징을 갖는 가지과 식물 및 그 후대 식물이나 클론의 식물체로부터 채취되는 부분, 혹은 식물체 또는 부분으로부터 얻어지는 파생물이 포함된다. 부분의 구체예로서는, 과실, 슈트, 줄기, 뿌리, 어린 가지, 약(葯)과 같은 기관(器官), 및 식물의 조직이나 세포를 들 수 있다. 이와 같은 부분은 어떠한 형태여도 되고, 현탁 배양물, 프로토플라스트, 배(胚), 캘러스 조직, 엽편(葉片), 배우체, 포자체, 화분 및 소포자여도 된다. 가지과 식물의 파생물로서는, 종자를 들 수 있다.

또, 본 실시형태에 있어서의 TYLCV 저항성 가지과 식물의 부분은, 접목에 이용하는 수목(穗木), 대목(臺木) 등이어도 된다. 또, 일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 상술한 TYLCV 저항성 가지과 식물을 재생할 수 있는 식물 세포(캘러스를 포함한다) 등에도 관한 것이며, 본 실시형태에 있어서의 TYLCV 저항성 가지과 식물은, 이와 같은 식물 세포로부터 얻어진 식물도 포함한다.

TYLCV 저항성을 갖는 가지과 식물의 부분은, 생식용이나 가공용으로 유용한 과실이 바람직하다. 또, 후대의 생산 등에 유용한 점에서, 당해 부분은 종자인 것도 바람직하다.

(가지과 식물 또는 그 부분의 가공품)

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 가지과 식물 또는 그 부분의 가공품에 관한 것이다. 당해 가공품에 특별히 한정은 없고, 식용, 공업용, 의료용 등의 가공품을 들 수 있으며, 특히 식용의 가공품인 것이 바람직하다.

예를 들면 TYLCV 저항성을 갖는 가지과 식물이 토마토인 경우, 토마토의 식용 가공품으로서는, 통조림 토마토, 토마토 페이스트, 케첩, 토마토 소스, 토마토 스프, 건조 토마토, 토마토 주스, 토마토 파우더, 토마토 농축물 등을 들 수 있다. 또, 토마토를 원료로 하는 영양 보조 식품(서플리먼트) 등도 가공품의 일례이다.

[II] TYLCV 저항성을 갖는, 가지과 식물 세포

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, TYLCV 저항성을 갖는 가지과 식물 세포에 관한 것이다.

본 실시형태의 가지과 식물 세포는, 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖는다. 이들 유전자 및 그 변이에 대해서는, TYLCV 저항성인 가지과 식물에 관련하여 상술한 바와 같다.

가지과 식물 세포의 TYLCV 저항성은, 상술한 방법에 따라 확인할 수 있다. 예를 들면, 통상의 방법에 따라 식물 세포에 TYLCV를 감염시켜, 세포 중의 TYLCV의 축적을 ELISA법, PCR법 등의 공지의 수법으로 검출함으로써, TYLCV 저항성의 유무를 확인할 수 있다.

본 실시형태의 TYLCV 저항성 가지과 식물 세포는, 상술한 TYLCV 저항성인 가지과 식물 및 그 후대 식물이나 클론의 식물체 또는 부분으로부터 단리한 것이어도 되고, 후술하는 TYLCV 저항성인 가지과 식물의 생산 방법에 따라 얻어지는, 유전자 변이를 도입한 식물 세포여도 된다. 또한 TYLCV 저항성 가지과 식물 세포의 형태에도 특별히 한정은 없고, 현탁 배양물이나 프로토플라스트도 포함된다.

당해 식물 세포는, 가지과 식물의 세포인 한 그 종류에 특별히 한정은 없지만, 토마토, 가지, 담배, 고추, 감자의 세포인 것이 바람직하고, 토마토, 가지, 감자의 세포인 것이 보다 바람직하며, 토마토의 세포인 것이 더 바람직하다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 상술한 가지과 식물 세포를 갖고, TYLCV 저항성을 갖는, 가지과 식물체 및 그 부분에 관한 것이다. 당해 가지과 식물체 및 그 부분에는, 유전자 변이를 도입한 식물 세포로부터 재생한 식물체 또는 조직이나 기관과 같은 부분이 포함된다. 식물 세포로부터 재생한 식물체의 부분도 또, 상술한 가지과 식물 세포를 갖는 부분이다. 또한, 부분의 상세에 대해서는, TYLCV 저항성 가지과 식물에 관련하여 상술한 바와 같다.

또, 가지과 식물의 부분은, 생식용이나 가공용으로 유용한 과실이 바람직하다. 또, 후대의 생산 등에 유용한 점에서, 당해 부분은 종자인 것도 바람직하다.

[III] TYLCV 저항성인 가지과 식물의 생산 방법

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 본 발명의 TYLCV 저항성 가지과 식물의 생산 방법에 관한 것이다. 구체적으로는, 하기의 공정을 포함하는 생산 방법에 관한 것이다.

번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 적어도 1종의 유전자를 선택하는 공정과,

가지과 식물의 게놈 내의 선택한 유전자에 대하여, 선택한 유전자의 발현이 억제되는 변이, 또는 선택한 유전자가 코드하는 단백질이 TYLCV에 대하여 비기능적이 되는 변이를 도입하는 공정과,

TYLCV에 대하여 저항성을 갖는 가지과 식물을 선별하는 공정.

먼저, 변이를 도입할 표적 유전자를 선택한다. 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 적어도 1종의 유전자를 표적 유전자로서 선택한다. 선택하는 유전자는, 1종이어도 되고, 다른 2종 이상의 유전자의 조합이어도 된다. 이들 유전자에 대해서는, TYLCV 저항성인 가지과 식물에 관련하여 상술한 바와 같다.

다음으로, 선택한 유전자에 변이를 도입한다. 게놈 내의 유전자에 변이를 도입하기 위한 방법으로서는, 크게 나누면, 이하에 예시하는 2가지의 방법을 들 수 있다.

(1) 직접 게놈 편집: TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E, RLK, deltaCOP 또는 NSI를 갖는 식물의 게놈을 직접 편집함으로써, 목적으로 하는 개소에 핀 포인트로 변이를 도입하여, TYLCV 저항성 유전자를 갖는 식물을 생산하는 방법.

(2) 변이 유전자 도입: 다음의 수순 (A)와 (B)를 조합한 방법이다. (A): TYLCV 저항성 유전자를 제작하고, 적당한 프로모터를 이용하여 식물에 도입한다. (B): 식물이 갖는, 상기 (A)에서 제작한 TYLCV 저항성 유전자에 대응하는 내생의 유전자 중, TYLCV에 대하여 기능적인 유전자를 TYLCV에 대하여 비기능적인 것으로 한다.

이하, 각각의 방법에 대하여 설명한다.

(1) 직접 게놈 편집

직접 게놈 편집은, CRISPR, TALEN등, 부위 특이적 뉴클레아제를 이용한 공지의 게놈 편집 기술을 이용하여 실시할 수 있다. 게놈의 특정 부위를 절단 가능한 제한 효소를 이용하여 2 개쇄 절단을 도입하면, 이것이 수복될 때에, 수복 에러에 의하여 각종 변이가 도입된다. 그 결과, 표적 유전자(본 실시형태에서는 TYLCV에 대하여 기능적인 eIF4E, RLK, deltaCOP 또는 NSI를 코드하는 유전자)에 변이가 도입된다.

특히 높은 특이성 및 고효율로 변이를 도입할 수 있기 때문에, CRISPR 시스템을 이용하는 것이 바람직하고, CRISPR/Cas9 시스템을 이용하는 것이 특히 바람직하다. CRISPR/Cas9 시스템에서는, 표적 유전자와 상보적인 20염기 길이 정도의 배열을 포함하는 가이드 RNA(sgRNA)가 표적을 인식하고, Cas9 단백질이 2 개쇄를 절단하여, 이것이 비상동성 말단 결합(NHEJ) 수복 경로에 의하여 수복될 때에, 수복 에러에 의하여 표적 부위에 변이가 도입된다.

식물로의 Cas 단백질 및 sgRNA의 송달은, 그들을 코드하는 벡터를 통하여, 당업자에게 공지의 방법, 예를 들면 아그로박테리움법, 표준적인 트랜스펙션법, 일렉트로포레이션법, 파티클 봄바드먼트법 등을 이용하여 행할 수 있다.

간편하게는, 후술하는 실시예에 나타내는 바와 같이, Cas 유전자 및 sgRNA를 도입한 바이너리 벡터를 구축하고, 이것을 이용하여 아그로박테리움을 형질 전환한 후, 이 아그로박테리움을 이용하여 식물을 형질 전환함으로써, 식물로의 Cas 단백질 및 sgRNA의 송달을 행할 수 있다(Friedrich Fauser et al., "The Plant Journal," 2014, 79: 348-359, 및 오사와 료 및 에즈라 히로시, 「새로운 식물 육종 기술을 이해하자-NBT(New plant breeding techniques)」, 국제 문헌사, 2013 등을 참조).

아그로박테리움에 의하여 형질 전환하는 식물의 형태는, 식물체를 재생할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 현탁 배양 세포, 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등을 들 수 있다. 아그로박테리움의 제거 후, 이용한 벡터에 따른 약제를 포함하는 배지 내에서 배양하여, 약제 내성을 지표로 목적 유전자가 도입된 절편의 선별 배양을 할 수 있다.

고효율로 표적 부위로의 변이 도입이 가능해지도록, 가이드 RNA를 설계할 수 있다. CRISPR 시스템에서는, PAM 배열이라고 불리는 3염기의 배열(가장 일반적인 S. pyogenes 유래 Cas9를 이용하는 경우는 NGG)의 3염기 전이 기본적으로 절단된다. 표적 배열의 직후에 PAM 배열이 존재할 필요가 있기 때문에, PAM 배열의 상류를 표적 배열로 하여, 가이드 RNA를 설계할 수 있다.

가이드 RNA의 설계에 있어서는, 염기 배열의 GC 함유율이 높을수록 절단 효율이 높아지기 때문에, GC 함유율을 고려하는 것이 바람직하다. 또, 오프 타겟 효과에 의한 비특이적인 절단을 최대한 줄이도록 설계할 수 있다. 일 양태에 있어서, 식물이 토마토인 경우, 가이드 RNA는, 3번 염색체의 엑손 2 중의 특정의 배열(예를 들면, 배열 번호 3) 및/또는 2번 염색체의 엑손 1 중의 특정의 배열(예를 들면, 배열 번호 6)을 표적으로 하는 염기 배열을 갖도록 설계하는 것이 바람직하다.

예를 들면, 토마토의 3번 염색체상에 존재하는 eIF4E 유전자의 cDNA 배열(배열 번호 1)을 나타내는 도 1 중, 엑손 2(도 1 중의 하선부, 배열 번호 2)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 배열로 하고, 이 3염기로부터 상류의 통상 20염기(배열 번호 3)를 표적으로 하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우도, 토마토의 경우와 동일하게, eIF4E 유전자의 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역을 표적으로서 선택하여, PAM 배열의 선택 및 가이드 RNA의 설계를 행할 수 있다. 이와 같이 하여 표적 부위에 변이를 도입하여, TYLCV 저항성의 eIF4E 유전자를 갖는 식물을 생산할 수 있다.

토마토의 2번 염색체상에 존재하는 RLK 유전자의 cDNA 배열(배열 번호 4)을 나타내는 도 2 중, 엑손 1(도 2 중의 하선부, 배열 번호 5)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 배열로 하고, 이 3염기로부터 상류의 통상 20염기(배열 번호 6)를 표적으로 하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우도, 토마토의 경우와 동일하게, RLK 유전자의 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역을 표적으로서 선택하여, PAM 배열의 선택 및 가이드 RNA의 설계를 행할 수 있다. 이와 같이 하여 표적 부위에 변이를 도입하여, TYLCV 저항성의 RLK 유전자를 갖는 식물을 생산할 수 있다.

토마토의 1번 염색체상에 존재하는 deltaCOP 유전자(즉 delta01 유전자)의 cDNA 배열(배열 번호 33)을 나타내는 도 13 중, 엑손 6(도 13 중의 하선부, 배열 번호 34)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 배열로 하고, 이 3염기로부터 상류의 통상 20염기(배열 번호 35)를 표적으로서 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우도, 토마토의 경우와 동일하게, delta01 유전자의 상동 유전자 내의, 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역을 표적으로서 선택하여, PAM 배열의 선택 및 가이드 RNA의 설계를 행할 수 있다. 이와 같이 하여 표적 부위에 변이를 도입하여, TYLCV 저항성의 deltaCOP 유전자를 갖는 식물을 생산할 수 있다.

동일하게, 토마토의 10번 염색체상에 존재하는 deltaCOP 유전자(즉 delta10 유전자)의 cDNA 배열(배열 번호 36)을 나타내는 도 14중, 엑손 2(도 14중의 하선부, 배열 번호 37)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 배열로 하고, 이 3염기로부터 상류의 통상 20염기(배열 번호 38)를 표적으로 하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우도, 토마토의 경우와 동일하게, delta10 유전자의 상동 유전자 내의, 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역을 표적으로서 선택하여, PAM 배열의 선택 및 가이드 RNA의 설계를 행할 수 있다. 이와 같이 하여 표적 부위에 변이를 도입하여, TYLCV 저항성의 deltaCOP 유전자를 갖는 식물을 생산할 수 있다.

토마토의 10번 염색체상에 존재하는 NSI 유전자의 cDNA 배열(배열 번호 39)을 나타내는 도 15 중, 엑손 4(도 15 중의 하선부, 배열 번호 40)에 존재하는 사각으로 나타낸 개소를 PAM 배열로 하고, 이 3염기로부터 상류의 통상 20염기(배열 번호 41)를 표적으로 하여 가이드 RNA를 설계할 수 있다. 가지과의 다른 식물에 대하여 직접 게놈 편집을 행하는 경우도, 토마토의 경우와 동일하게, NSI 유전자의 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역을 표적으로서 선택하여, PAM 배열의 선택 및 가이드 RNA의 설계를 행할 수 있다. 이와 같이 하여 표적 부위에 변이를 도입하여, TYLCV 저항성의 NSI 유전자를 갖는 식물을 생산할 수 있다.

CRISPR 시스템에 의하여 유전자 내에 1개소의 2 개쇄 절단을 도입하면, 20염기 정도가 수복되고, 수복 에러에 의하여 변이가 도입된다고 생각된다. 따라서, 일 양태에 있어서, 본 실시형태의 TYLCV 저항성 유전자가 갖는 변이는, 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7, 바람직하게는 1~3)의 변이이다.

또한 본 실시형태는, 상기 TYLCV 저항성 가지과 식물을 생산하기 위하여 사용한 가이드 RNA 및 가이드 RNA를 포함하는 벡터에도 관한 것이다. 가이드 RNA가 갖는 배열은 상술한 바와 같다. 본 실시형태는, 또한 상기 가이드 RNA를 포함하는 키트에도 관한 것이다. 당해 키트는, CRISPR 시스템에 의한 게놈 편집을 실시하기 위하여 필요한 부위 특이적 뉴클레아제 등을 포함하고 있어도 되고, TYLCV 저항성 가지과 식물을 생산하기 위하여 사용할 수 있다.

(2) 변이 유전자 도입

변이 유전자 도입은, 하기 (A)와 (B)의 수순을 조합한 방법이다.

(A): TYLCV 저항성 유전자를 제작하고, 적당한 프로모터를 이용하여 식물에 도입한다.

(B): 식물이 갖는, 상기 (A)에서 제작한 TYLCV 저항성 유전자에 대응하는 내생의 유전자 중, TYLCV에 대하여 기능적인 유전자를 TYLCV에 대하여 비기능적인 것으로 한다.

상기 (A)와 (B)를 실시하는 순서는, 식물이 죽음에 이르지 않는 한, 특별히 한정은 없고, (B)를 먼저 실시해도 된다. 또한, (B)만을 특정의 부위에 있어서 실시하는 방법이, 상기 (1) 직접 게놈 편집이다.

수순 (A)에 있어서, TYLCV에 대하여 비기능적인 eIF4E 단백질을 코드하는 변이 유전자, 비기능적인 RLK 단백질을 코드하는 변이 유전자, 비기능적인 deltaCOP 단백질을 코드하는 변이 유전자, 및/또는 비기능적인 NSI 단백질을 코드하는 변이 유전자를 제작하고, 적당한 프로모터를 이용하여 식물에 도입한다. 변이 유전자의 제작은, 당업자에게 공지의 수법을 이용하여 실시할 수 있다. 예를 들면, 원하는 변이를 갖는 염기 배열을 합성하고, 이것을 PCR 등으로 증폭하여 얻을 수 있다. 여기에서 도입하는 변이는, TYLCV 저항성인 가지과 식물에 관련하여 상술한 바와 같다.

제작한 변이 유전자의 식물로의 도입도, 당업자에게 공지의 수법을 이용하여 실시할 수 있다. 간편하게는, 변이 유전자를 탑재한 벡터를 이용하여, 예를 들면 폴리에틸렌글라이콜법, 일렉트로포레이션법, 아그로박테리움법, 파티클 건법 등을 이용하여 실시할 수 있다. 여기에서 도입하는 변이 유전자는, 가지과 식물 유래의 eIF4E 유전자(또는 그 상동 유전자), RLK 유전자(또는 그 상동 유전자), deltaCOP 유전자(또는 그 상동 유전자) 및/또는 NSI 유전자(또는 그 상동 유전자)를 변이시킨 TYLCV 저항성 유전자이며, 별종의 식물의 TYLCV 저항성 유전자여도 된다.

상기 벡터를 도입하는 식물의 형태는, 식물체를 재생할 수 있는 것이면 특별히 한정되지 않고, 예를 들면 현탁 배양 세포, 프로토플라스트, 잎의 절편, 캘러스 등을 들 수 있다.

다음으로 수순 (B)에 있어서, 식물이 갖는 내생의 eIF4E 유전자(또는 그 상동 유전자), RLK 유전자(또는 그 상동 유전자), deltaCOP 유전자(또는 그 상동 유전자) 및/또는 NSI 유전자(또는 그 상동 유전자) 중에서 TYLCV에 대하여 기능적인 것을, TYLCV에 대하여 비기능적인 것으로 변화시킨다. 수순 (B)의 실시에는, 식물에 변이를 도입하는 방법으로서 공지의 수법을 이용할 수 있다. 예를 들면, 이온빔, EMS 등의 변이원 처리를 이용할 수 있다. 상술한 CRISPR이나 TALEN 등의 게놈 편집 기술 등에 의해서도 실시할 수 있다. 내생 eIF4E, RLK, deltaCOP 및/또는 NSI 중에서, TYLCV에 대하여 기능적인 것의 모두를, TYLCV에 대하여 비기능적인 것으로 하는 것이 바람직하다.

다음으로, TYLCV 저항성 유전자를 갖는 식물의 부분(엽편이나 식물 세포 등)으로부터 식물체를 재생한다. 식물체의 재생은, 식물의 종류에 따라 당업자에게 공지의 방법으로 행할 수 있다. 예를 들면, 토마토에 대해서는, Sun H. J. et al., "Plant Cell Physiol.," 2006, 47: 426 등 , 담배에 대해서는, Jefferson R. A. et al., "EMBO J.," 1987, 6: 3901 등을 참조하여 행할 수 있다.

또한 재생한 식물 중에서, TYLCV에 대하여 저항성을 갖는 가지과 식물을 선별한다. 당해 선별은, 상술한 TYLCV 저항성을 확인하기 위한 방법에 따라 행할 수 있다. 예를 들면, 통상의 방법에 따라 식물에 TYLCV를 감염시켜, 식물체 중의 TYLCV의 축적을 ELISA법, PCR법 등의 공지의 수법으로 확인함으로써, TYLCV 저항성을 갖는 식물을 선별할 수 있다. 또, TYLCV를 감염시킨 식물의 TYLCV 감염 증상(잎의 모자이크화나 황화, 실잎, 왜화, 괴저 등)의 유무를 확인함으로써, TYLCV에 대하여 저항성을 갖는 가지과 식물을 선별할 수 있다.

상기 방법에 따라 생산하는 가지과 식물로서는, 토마토, 가지, 담배, 고추, 감자 등을 들 수 있고, 바람직하게는 토마토, 가지, 감자이며, 특히 바람직하게는 토마토이다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 상술한 방법에 따라 생산한 가지과 식물에 관한 것이다. 당해 가지과 식물은, 상기에서 설명한 TYLCV 저항성인 가지과 식물과 동일하다.

TYLCV 저항성 유전자를 갖는 TYLCV 저항성 가지과 식물이 일단 얻어지면, 당해 식물의 후대나 클론을 공지의 수법에 따라 얻을 수 있다. 따라서, 본 실시형태의 TYLCV 저항성 가지과 식물에는, 이들의 후대 및 클론도 포함된다.

일 양태에 있어서, 본 실시형태는, 상술한 생산 방법에 따라 얻어진 TYLCV 저항성 가지과 식물(초대) 또는 그 후대를, 자가수분 또는 타가수분시키는 공정을 포함하는, TYLCV 저항성 가지과 식물의 육종 후대의 생산 방법에 관한 것이다. 식물의 자가수분 또는 타가수분은, 당업계에서 공지의 방법으로 실시하는 것이 가능하고, 자연 상태에서 행해져도 되며, 인위적으로 행해져도 된다. 이와 같이 하여 얻어진 후대를 다시 자가수분 또는 타가수분시켜, 또 다른 후대를 생산할 수도 있다.

타가수분에 있어서 초대 또는 후대와 교배시키는 가지과 식물은, 동일한 유전자에 동일한 변이를 갖는 가지과 식물, 동일한 유전자에 다른 변이를 갖는 가지과 식물, 또는 다른 유전자에 변이를 갖는 가지과 식물 중 어느 것이어도 된다. 예를 들면, eIF4E 유전자에 변이를 갖는 식물, RLK 유전자에 변이를 갖는 식물, deltaCOP 유전자에 변이를 갖는 식물, 및 NSI 유전자에 변이를 갖는 식물로부터 선택된 2종의 사이에서 교배시켜도 가능하다. 또, 복수 회의 교배를 실시함으로써, 3종 이상의 유전자에 변이를 갖는 식물을 생산하는 것도 가능하다.

[실시예]

[실시예 1]

eIF4 유전자에 변이를 도입하기 위한 재조합 아그로박테리움 A의 제작

토마토의 3번 염색체에 존재한다고 여겨지는 eIF4E 유전자(Solyc03g005870)의 엑손 2(배열 번호 2) 내에, 가이드 RNA가 인식하는 부위를 임의로 설정했다. 설정한 20염기 길이 부위(배열 번호 3: AGGGTAAATCTGATACCAGC)에 대응하는 2 개쇄 DNA를 합성하고, 벡터 pUC19_AtU6oligo(국립 연구 개발 법인 농업 생물 자원 연구소로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 삽입하여, 재조합 벡터 A를 구축했다. 또한, 야생주의 토마토의 3번 염색체에 존재하는 eIF4E 유전자의 cDNA 배열을 도 1 및 배열 번호 1에 나타냈다.

구축한 재조합 벡터 A로부터 가이드 RNA 배열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 삽입하여, 재조합 바이너리 벡터 A를 얻었다. 이 바이너리 벡터 A를 이용하여, 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 통상의 방법에 따라 형질 전환시켜, 재조합 아그로박테리움 A를 얻었다.

[실시예 2]

RLK 유전자에 변이를 도입하기 위한 재조합 아그로박테리움 B의 제작

토마토의 2번 염색체에 존재한다고 여겨지는 RLK 유전자(Solyc02g091840)의 엑손 1(배열 번호 5) 내에, 가이드 RNA가 인식하는 부위를 임의로 설정했다. 설정한 20염기 길이 부위(배열 번호 6: TCTCTAGAGTACCTTGCAGT)에 대응하는 2 개쇄 DNA를 합성하고, 벡터 pUC19_AtU6oligo(국립 연구 개발 법인 농업 생물 자원 연구소로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 삽입하여, 재조합 벡터 B를 구축했다. 또한, 야생주의 토마토의 2번 염색체에 존재하는 RLK 유전자의 cDNA 배열을 도 2 및 배열 번호 4에 나타냈다.

구축한 재조합 벡터 B로부터 가이드 RNA 배열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 삽입하여, 재조합 바이너리 벡터 B를 얻었다. 이 바이너리 벡터 B를 이용하여, 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 통상의 방법에 따라 형질 전환시켜, 재조합 아그로박테리움 B를 얻었다.

[실시예 3]

염색체 1번의 deltaCOP 유전자에 변이를 도입하기 위한 재조합 아그로박테리움 C의 제작

토마토의 1번 염색체에 존재한다고 여겨지는 deltaCOP 유전자(Solyc01g103480)의 엑손 6(배열 번호 34) 내에, 가이드 RNA가 인식하는 부위를 임의로 설정했다. 설정한 20염기 길이 부위(배열 번호 35: ACTGGCTTTGGCAGCGACTC)에 대응하는 2 개쇄 DNA를 합성하고, 벡터 pUC19_AtU6oligo(국립 연구 개발 법인 농업 생물 자원 연구소로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 삽입하여, 재조합 벡터 C를 구축했다. 또한, 야생주의 토마토의 1번 염색체에 존재하는 deltaCOP 유전자의 cDNA 배열을 도 13 및 배열 번호 33에 나타냈다.

구축한 재조합 벡터 C로부터 가이드 RNA 배열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 삽입하여, 재조합 바이너리 벡터 B를 얻었다. 이 바이너리 벡터 B를 이용하여, 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 통상의 방법에 따라 형질 전환시켜, 재조합 아그로박테리움 C를 얻었다.

[실시예 4]

염색체 10번의 deltaCOP 유전자에 변이를 도입하기 위한 재조합 아그로박테리움 D의 제작

토마토의 10번 염색체에 존재한다고 여겨지는 deltaCOP 유전자(Solyc10g038120)의 엑손 2(배열 번호 37) 내에, 가이드 RNA가 인식하는 부위를 임의로 설정했다. 설정한 20염기 길이 부위(배열 번호 38: TTCATGTCTCTGCAATCCAT)에 대응하는 2 개쇄 DNA를 합성하고, 벡터 pUC19_AtU6oligo(국립 연구 개발 법인 농업 생물 자원 연구소로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 삽입하여, 재조합 벡터 D를 구축했다. 또한, 야생주의 토마토의 10번 염색체에 존재하는 deltaCOP 유전자의 cDNA 배열을 도 14 및 배열 번호 36에 나타냈다.

구축한 재조합 벡터 D로부터 가이드 RNA 배열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 삽입하여, 재조합 바이너리 벡터 B를 얻었다. 이 바이너리 벡터 D를 이용하여, 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 통상의 방법에 따라 형질 전환시켜, 재조합 아그로박테리움 D를 얻었다.

[실시예 5]

NSI 유전자에 변이를 도입하기 위한 재조합 아그로박테리움 E의 제작

토마토의 10번 염색체에 존재한다고 여겨지는 NSI 유전자(Solyc10g074910)의 엑손 4(배열 번호 40) 내에, 가이드 RNA가 인식하는 부위를 임의로 설정했다. 설정한 20염기 길이 부위(배열 번호 41: GAGGAATTTGTTCTAGTTGA)에 대응하는 2 개쇄 DNA를 합성하고, 벡터 pUC19_AtU6oligo(국립 연구 개발 법인 농업 생물 자원 연구소로부터 입수) 내의 제한 효소 BbsI 사이트에 삽입하여, 재조합 벡터 E를 구축했다. 또한, 야생주의 토마토의 10번 염색체에 존재하는 NSI 유전자의 cDNA 배열을 도 15 및 배열 번호 39에 나타냈다.

구축한 재조합 벡터 E로부터 가이드 RNA 배열 영역을 포함하는 카세트 부위를 잘라, 바이너리 벡터 pZD_OsU3gYSA_HolgerCas9_NPTII 내의 제한 효소 I-SceI 사이트에 삽입하여, 재조합 바이너리 벡터 E를 얻었다. 이 바이너리 벡터 E를 이용하여, 아그로박테리움 LBA4404(다카라 바이오사제)를 통상의 방법에 따라 형질 전환시켜, 재조합 아그로박테리움 E를 얻었다.

[실시예 6]

토마토의 형질 전환

형질 전환하는 토마토로서, 공지의 품종인 머니 메이커 혹은 자사 품종 S를 이용했다. 아그로박테리움을 이용한 토마토의 형질 전환은 일반적인 교과서(예를 들면, 다베이 유타카 편, 「형질 전환 프로토콜 <식물편> (Protocols for plant transformation)」, 주식회사 가가쿠 도진샤, 2012)에 기재된 방법에 준하여 실시했다. 구체적으로는, 토마토의 종자를 무균 배지 내에서 발아시켜 얻은 자엽편, 또는 통상 파종한 자엽편 혹은 본엽편을 살균한 것을 준비했다. 다음으로, 실시예 1~5에서 얻은 재조합 아그로박테리움 A~E의 각각을, 탁도가 0.1~1.0이 될 때까지 배양한 배양액을 준비하고, 당해 배양액에 엽편을 10분 정도 침지하여, 아그로박테리움에 감염시켰다.

감염으로부터 3일 후에, 아그로박테리움을 제거했다. 토마토의 엽편을 카르베니실린(100~500mg/ml) 및 카나마이신(20~100mg/ml)을 첨가한 무라시게 스쿠그 배지(MS 배지라고 약기하는 경우도 있다)(MS기본 배지에 3% 자당, 1.5mg/L지틴, 1% 한천을 첨가한 것) 상으로 옮겨, 25℃ 조명하(16시간 조명/8시간 암흑)에서의 선발 배양을 했다. 배양 개시로부터 10일~2주간마다 배지를 교환하여 이식 계대함으로써, 엽편으로부터의 캘러스 형성을 촉진시켰다. 이어서 계대 배양을 반복함으로써 부정아(不定芽)를 유도했다.

부정아가 수 센티미터 정도로 커지면, 발근 배지(MS기본 배지에 1.5% 자당, 1% 한천, 50~250mg/ml카르베니실린, 20~100mg/ml카나마이신, 경우에 따라 나프탈렌아세트산(NAA)을 첨가한 것)에 이식하고, 1개월마다 계대하면서 1~3개월 배양했다.

발근 배지에 의한 배양까지는 모두 무균 배양으로 했다. 발근한 개체는, 무균 배지로부터 취출하고, 시판 중인 흑토나 적옥토 등을 혼합한 포트 배토에 이식하여, 생육시켰다. 이와 같이 하여 얻어진 재생 개체를 트랜스제닉 당대(이하, T0이라고 약기하는 경우도 있다)로 했다.

[실시예 7]

유전자 편집 계대의 선발

트랜스제닉 당대의 표적 유전자 내에 유전자 재조합 및 편집(염기의 결손, 삽입 또는 치환) 부위가 존재하는지 아닌지를 확인하기 위하여, 하기 프라이머를 이용한 PCR에 의하여 목적의 부위를 증폭했다.

eIF4E 유전자(Solyc03g005870) 내의 영역에 대해서는, 프라이머 1(ATCCATCACCCAAGCAAGTTAATT(배열 번호 7)) 및 프라이머 2(GTCCACAAAGCTATTTTTTCTCCC(배열 번호 8)),

RLK 유전자(Solyc02g091840) 내의 영역에 대해서는, 프라이머 3(TTAACACGTCTGCGTAACCTC(배열 번호 9)) 및 프라이머 4(CCGGTGAAGGTATTGTAGTATCC(배열 번호 10)),

delta01 유전자(Solyc01g103480) 내의 영역에 관해서는, 프라이머 7(CGCATGTCAGCTATGCTAAATG(배열 번호 42)) 및 프라이머 8(GTAGAGCAAATCCACCAGAACCAT(배열 번호 43)),

delta10 유전자(Solyc10g038120) 내의 영역에 관해서는, 프라이머 9(ATGAAGCGCAAAGCCAGTGAG(배열 번호 44)) 및 프라이머 10(ATCCACATCAGTGCTTGGTC(배열 번호 45)),

NSI 유전자(Solyc10g074910) 내의 영역에 관해서는, 프라이머 11(CAGGTTATAGATACACCATCCA(배열 번호 46)) 및 프라이머 12(TAAATCACCGGAAAGAAAG(배열 번호 47)).

또한, 프라이머 7은, delta01 유전자의 인트론 내의 배열에 근거하는 것이기 때문에, 배열 번호 33의 cDNA 배열 중에는 대응하는 배열은 존재하지 않는다.

PCR에는 도요보사제의 「KOD Plus Neo」를 사용하고, 첨부된 매뉴얼에 따라 DNA의 증폭을 실시했다.

다음으로, 표적 부위 내에 제한 효소 절단 부위가 존재하는 제한 효소, 구체적으로는, eIF4E 유전자는 PvuII, RLK 유전자는 XbaI, delta01 유전자에 대해서는 HinfI, delta10 유전자에 대해서는 NcoI, NSI 유전자에 대해서는 Bsu36I에 의하여, 증폭 단편을 처리하고, 당해 증폭 단편이 전달되는지 아닌지를 확인했다. 유전자 재조합 및 편집이 발생한 유전자에 있어서는, 제한 효소 부위가 변화하고 있는 점에서, 제한 효소에 의하여 증폭 단편이 절단되지 않는다. 이로써, 유전자 재조합 및 편집이 표적 유전자 내에서 발생했다고 판단했다(데이터 비표시).

그 결과, 몇개의 재생 개체에 있어서, eIF4E 유전자, RLK 유전자, delta01 유전자, delta10 유전자, 또는 NSI 유전자의 배열이 편집되어 있는 것이 확인되고, 편집 계통이 선발되었다.

[실시예 8]

eIF4E 변이 토마토의 TYLCV 저항성 확인 시험

TYLCV는 자연계에서는 가루이에 의하여 충매되지만, 감염잎 즙액에 의한 기계적 접종으로는 감염되지 않는다. 그 때문에 다검체에 효율적으로 TYLCV를 감염시키기 위하여, 아그로박테리움에 의한 바이러스 감염성 클론 접종법을 이용했다. 이 방법에서는, 유전자 재조합의 방법과 동일하게, 아그로박테리움의 바이너리 벡터에 TYLCV의 전체 길이 배열을 도입한 것(감염성 클론)을 제작하고, 당해 클론으로 아그로박테리움을 형질 전환한다. 얻어진 재조합 아그로박테리움을 액체 배양한 후, 배지를 0.01M의 MES 버퍼(pH 5.7)로 치환하고, 식물체(여기에서는 토마토)의 성장점, 어린 줄기 혹은 엽병(葉柄)에 아그로박테리움을 주사 등으로 접종하면, 주사 부위 부근의 세포에 아그로박테리움이 감염된다. 감염된 아그로박테리움이 식물의 게놈에 TYLCV의 DNA를 도입하면, 식물 게놈에 도입된 TYLCV의 DNA는 바이너리 벡터에 설계된 NOS 프로모터 등에 의하여 발현되어, 바이러스가 생산되고, 감염이 성립된다. 자연계의 TYLCV도 식물 세포의 핵내에서 복제되는 점에서, 이 감염성 클론 접종을 유사 접종으로서 이용했다.

실시예 7에서 선발한, eIF4E 유전자의 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가수분시켜 종자를 회수했다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘(實生苗)에 대하여, 상술한 TYLCV 저항성 확인 시험의 방법으로, TYLCV-이스라엘 계통의 감염성 클론을 접종했다. 또한, 대조로서 변이 도입을 실시하고 있지 않은 야생형 품종에 대해서도 시험을 행했다.

그 결과, eIF4E 유전자의 편집 계통 A132의 T1 개체인 A132-4 등의 수 개체에서는, 바이러스 접종으로부터 20일 이상 지나도 바이러스 감염의 증상(잎의 모자이크화나 황화, 실잎, 왜화, 괴저 등)이 보이지 않았다. 도 3에, 바이러스 접종으로부터 42일째의 A132-4(도 3의 (a)) 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 야생형 토마토(도 3의 (b))를 나타냈다. 대조에서는, 잎의 가장자리가 하측으로 말려 기형이 되어 있는 것을 알 수 있다. 또, 바이러스 접종으로부터 25일째의 감염 증상의 유무를 육안에 의하여 판정했다. 검사한 식물 개체수(샘플수)에 대한, 증상 및 PCR로 양성을 나타낸 식물 개체수의 비율을 이병률로 했다. 그 결과, 대조의 이병률은 약 0.9이며, eIF4E 편집 계통 A132의 이병률은 0.6으로 낮았다(도 4를 참조). 또한, 여기에서 실시한 시험 방법은, 자연계의 충매에 의한 바이러스 감염보다 감염압이 높은 방법이기 때문에, 본 시험에 있어서의 이병률 0.6은, 자연계에 있어서 바이러스 감염이 발생하지 않는다고 추정되는 값이다.

다음으로 무증상주의 잎으로부터 DNA를 추출하고, TYLCV 검출용의 프라이머 5(CCCTCTGGAATGAAGGAACA, 배열 번호 11) 및 프라이머 6(TTGAAAAATTGGRCTCTCAA, 배열 번호 12)을 이용하여 PCR 검정을 행했다. 그 결과, 무증상의 eIF4E 편집 계통의 1주(A132-8)에서는 PCR에 의하여 바이러스가 검출되었지만, 나머지의 포기(eIF4E 편집 계통 A132-2, A132-4, A132-9 및 A132-10)에서는 바이러스는 검출되지 않았다(도 5를 참조).

또한, T1 세대에 저항성이 보인 eIF4E 편집 계통 A132-10으로부터 종자를 채취하고, 당해 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘(T2 세대에 해당된다)에 대하여 상술한 TYLCV 감염성 클론 접종을 행했다. 변이 도입전의 S8주를 대조로 했다. 바이러스 감염으로부터 22일째에 증상의 유무에 근거하여 이병률을 구한 결과, 대조는 0.9% 이상이며, eIF4E 편집 계통 A132-10은 0.6 미만이고, 이병률에 명확한 차가 확인되었다. 또한 무증상주의 잎으로부터 TYLCV의 DNA를 추출하고, 상술과 같이 PCR 검정을 실시한 결과, 무증상주 중 하나로부터 바이러스 감염이 확인되었다. PCR에 의하여 바이러스 감염이 확인된 개체수를, 육안으로 증상이 확인된 개체수와 합계하여, 샘플수에 대한 합계수의 비율을 PCR 검사 후의 이병률로서 구했다. 그 결과, eIF4E 편집 계통의 이병률은 약 0.7이 되었지만, 그래도 대조보다 분명하게 낮은 값이었다(도 6을 참조). 이 결과로부터, eIF4E 유전자에 도입한 변이에 의하여, TYLCV 저항성이 유전되고 있는 것을 확인했다.

[실시예 9]

RLK 변이 토마토의 TYLCV 저항성 확인 시험

실시예 8과 동일하게, 실시예 7에서 선발한, RLK 유전자의 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가수분시켜 종자를 회수했다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘에 대하여, 실시예 8과 동일하게, TYLCV-이스라엘 계통의 감염성 클론을 접종했다.

그 결과, RLK 유전자의 편집 계통에 대해서는, 접종으로부터 25일째에, 바이러스를 접종한 41주 중 3주가 무증상이었다. 한편, 대조에서는, 바이러스를 접종한 42주 모두가 증상을 나타내고 있었다. 도 7에, 바이러스 접종으로부터 35일째의 C6-18(도 7의 (a)), C6-37(도 7의 (b)), 및 대조의 변이를 도입하고 있지 않은 토마토(도 7의 (c))를 나타냈다. 대조에서는, 잎의 가장자리가 하측으로 말려 기형이 되어 있는 것을 알 수 있다. 다음으로 무증상주인 C6-18 및 C6-37의 잎으로부터 DNA를 추출하고, TYLCV 검출용 프라이머를 이용하여 PCR 검정을 행했다. 그 결과, 이들 2주에서는 바이러스는 검출되지 않았다(도 8을 참조).

또, 다른 RLK 유전자의 편집 계통인 C72의 트랜스제닉 후대(T1)에 대해서도, 상술한 TYLCV 저항성 확인 시험을 실시했다. 그 결과, 바이러스 감염으로부터 25일째에 증상의 유무에 근거하여 구한 이병률은, 대조가 약 0.9이며, RLK 편집 계통은 약 0.4로 낮았다. 또한 무증상의 잎에 있어서의 바이러스의 유무에 대하여 PCR 검정을 행한 결과, 바이러스는 검출되지 않았다(도 9를 참조).

또한, T1 세대에 저항성이 보인 RLK의 편집 계통 C6-18로부터 종자를 채취하고, 당해 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘(T2 세대에 해당된다)에 대하여 TYLCV 감염성 클론 접종을 재차 행했다. 바이러스 접종으로부터 22일째에는, 대조와 비교하여, 이병률에 차가 보여져, RLK 유전자에 도입한 변이에 의하여, TYLCV 저항성이 유전되고 있는 것을 확인했다(도 10을 참조). 또한, 이병률의 측정은 2회 실시했지만, 모두 동일한 결과가 얻어졌다.

[실시예 10]

delta01 변이 토마토의 TYLCV 저항성 확인 시험

실시예 8과 동일하게, 실시예 7에서 선발한, delta01 유전자의 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가수분시켜 종자를 회수했다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘에 대하여, 실시예 8과 동일하게, TYLCV-이스라엘 계통의 감염성 클론을 접종했다.

그 결과, delta01 유전자의 편집 계통인 D16의 트랜스제닉 후대(T1)에 대하여, 상술한 TYLCV 저항성 확인 시험을 실시했다. 그 결과, 바이러스 감염으로부터 21일째에 증상의 유무에 근거하여 구한 이병률은, 대조가 약 0.9이며, D16 편집 계통은 약 0.75로 낮았다. 또한 무증상의 잎에 있어서의 바이러스의 유무에 대하여 PCR 검정을 행한 결과, 바이러스는 검출되지 않았다(도 16).

[실시예 11]

delta10 변이 토마토의 TYLCV 저항성 확인 시험

실시예 8과 동일하게, 실시예 7에서 선발한, delta10 유전자의 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가수분시켜 종자를 회수했다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘에 대하여, 실시예 5와 동일하게, TYLCV-이스라엘 계통의 감염성 클론을 접종했다.

그 결과, delta10 유전자의 편집 계통인 E4의 트랜스제닉 후대(T1)에 대하여, 상술한 TYLCV 저항성 확인 시험을 실시했다. 그 결과, 바이러스 감염으로부터 21일째에 증상의 유무에 근거하여 구한 이병률은, 대조가 약 0.9이며, E4편집 계통은 약 0.6으로 우위로 낮았다. 또한 무증상의 잎에 있어서의 바이러스의 유무에 대하여 PCR 검정을 행한 결과, 바이러스는 검출되지 않았다(도 17).

[실시예 12]

NSI 변이 토마토의 TYLCV 저항성 확인 시험

실시예 8과 동일하게, 실시예 7에서 선발한, NSI 유전자의 편집 계통의 개체(T0)를 격리 온실 내에서 생육하고, 자가수분시켜 종자를 회수했다. 트랜스제닉 후대(T1)가 되는 이들 종자를 파종하여, 생육시켰다. 이렇게 하여 얻어진 실생묘에 대하여, 실시예 5와 동일하게, TYLCV-이스라엘 계통의 감염성 클론을 접종했다.

그 결과, NSI 유전자의 편집 계통인 F43의 트랜스제닉 후대(T1)에 대하여, 상술한 TYLCV 저항성 확인 시험을 실시했다. 그 결과, 바이러스 감염으로부터 21일째에 증상의 유무에 근거하여 구한 이병률은, 대조가 약 0.9이며, F43 편집 계통은 약 0.6으로 우위로 낮았다. 또한 무증상의 잎에 있어서의 바이러스의 유무에 대하여 PCR 검정을 행한 결과, 바이러스는 검출되지 않았다(도 18).

[실시예 13]

TYLCV 저항성 eIF4E 유전자의 시퀀싱

상술한 프라이머 1 및 프라이머 2를 이용하여 TYLCV 저항성 T1 개체의 eIF4E 편집 부위 부근(즉, 3번 염색체상의 eIF4E 유전자 내의 엑손 2(배열 번호 2)의 14번 염기 근방으로부터 3’ 측의 영역)을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 배열을 확인했다.

그 결과, 동일한 영역에 수 염기의 결손, 삽입 또는 치환이 확인되었다. 확인된 6종의 eIF4E 유전자의 변이 배열을, 배열 번호 3에 나타낸 야생형의 염기 배열과 함께, 도 11에 나타냈다.

[실시예 14]

TYLCV 저항성 RLK 유전자의 시퀀싱

상술한 프라이머 3 및 프라이머 4를 이용하여 TYLCV 저항성 T1 개체의 RLK 편집 부위 부근(즉, 2번 염색체상의 RLK 유전자 내의 엑손 1(배열 번호 5)의 631번 염기 근방으로부터 3’ 측의 영역)을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 배열을 확인했다.

그 결과, 동일한 영역에 수 염기의 결손이 확인되었다. 확인된 2종의 RLK 유전자의 변이 배열을, 배열 번호 6에 나타낸 야생형의 염기 배열과 함께 도 12에 나타냈다.

[실시예 15]

delta01 유전자의 시퀀싱

상술한 프라이머 7(배열 번호 42) 및 프라이머 8(배열 번호 43)을 이용하여 T0 개체의 delta01 유전자 엑손 6내의 편집 부위 부근을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 배열을 확인했다.

그 결과, 동일한 영역에 수 염기의 결손 및 치환이 확인되었다. 확인된 3종의 delta01 유전자의 변이 배열을, 배열 번호 35에 나타낸 야생형의 염기 배열과 함께 도 19의 (A)에 나타냈다.

[실시예 16]

delta10 유전자의 시퀀싱

상술한 프라이머 9(배열 번호 44) 및 프라이머 10(배열 번호 45)을 이용하여 T0 개체의 delta10 유전자 엑손 2 내의 편집 부위 부근을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 배열을 확인했다.

그 결과, 동일한 영역에 수 염기의 결손이 확인되었다. 확인된 2종의 delta10 유전자의 변이 배열을, 배열 번호 38에 나타낸 야생형의 염기 배열과 함께 도 19의 (B)에 나타냈다.

[실시예 17]

NSI의 시퀀싱

상술한 프라이머 11(배열 번호 46) 및 프라이머 12(배열 번호 47)를 이용하여 T1 개체의 NSI 유전자 엑손 4 내의 편집 부위 부근을 PCR(T100 서멀 사이클러, Bio-Rad사제)로 증폭하고, 증폭 단편을 클로닝하여 염기 배열을 확인했다.

그 결과, 동일한 영역에 수 염기의 결손 및 삽입이 확인되었다. 확인된 2종의 NSI 유전자의 변이 배열을, 배열 번호 41에 나타낸 야생형의 염기 배열과 함께 도 20에 나타냈다.

[실시예 18]

TYLCV 저항성의 eIF4E 유전자 및 RLK 유전자를 도입한 토마토의 형질 전환체의 생산

실시예 1에서 얻은 재조합 아그로박테리움 A 및 실시예 2에서 얻은 재조합 아그로박테리움 B를 이용하거나, 혹은 실시예 1 및 2의 가이드 RNA 인식 부위를 연결하여 배치한 바이너리 벡터 F로 재조합한 아그로박테리움 F를 이용하여, 실시예 6과 동일하게, 토마토에 아그로박테리움을 감염시켜, 트랜스제닉 당대를 얻는다.

다음으로, 트랜스제닉 당대의 표적 유전자, 즉 eIF4E 유전자 및 RLK 유전자의 양방에, 유전자 재조합 및 편집(염기의 결손, 삽입 또는 치환) 부위가 존재하는지 아닌지를 실시예 7과 동일하게 확인하고, 양방의 유전자에 변이를 갖는 편집 계통을 선발한다.

선발한 편집 계통에 대하여, 실시예 8 및 실시예 9와 동일한 시험 방법으로 TYLCV 저항성 확인 시험을 실시한다. 이와 같은 시험에 의하여, eIF4E 유전자 및 RLK 유전자의 양방에 유전자 재조합 및 편집(염기의 결손, 삽입 또는 치환)이 존재하여, TYLCV 저항성을 획득한 토마토의 생산을 확인할 수 있다.

본 출원은, 2018년 11월 28일 출원의 특원 2018-222289 및 2019년 5월 21일 출원의 특원 2019-095150에 근거하여 우선권을 주장한다. 당해 출원 명세서에 기재된 내용은, 모두 본원 명세서에 원용된다.

본 발명에 의하면, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스의 감염을 저해하는 성질, 감염 후의 당해 바이러스의 증식을 억제하는 성질 및/또는 당해 바이러스의 감염 증상의 발현을 억제하는 성질을 갖는, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인 가지과 식물, 가지과 식물 세포, 및 가지과 식물의 생산 방법을 제공한다. 본 발명은, 당해 바이러스의 감염에 의한 가지과 식물의 수확량의 저감과 같은, 주로 농업 분야에 있어서의 문제를 해소할 수 있다.

[배열표 프리 텍스트]

배열 번호 1: eIF4E 유전자(Solyc03g005870)의 cDNA 배열이며, 317번~482번 염기가 엑손 2이고, 451번~470번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 2: eIF4E 유전자의 엑손 2이며, 135번~154번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 3: eIF4E 유전자의 엑손 2 내의 표적 배열

배열 번호 4: RLK 유전자(Solyc02g091840)의 cDNA 배열이며, 1번~2818번 염기가 엑손 1이고, 790번~809번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 5: RLK 유전자의 엑손 1이며, 790번~809번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 6: RLK 유전자의 엑손 1 내의 표적 배열

배열 번호 7: eIF4E 유전자 검출용의 프라이머 1

배열 번호 8: eIF4E 유전자 검출용의 프라이머 2

배열 번호 9: RLK 유전자 검출용의 프라이머 3

배열 번호 10: RLK 유전자 검출용의 프라이머 4

배열 번호 11: TYLCV 검출용의 프라이머 5

배열 번호 12: TYLCV 검출용의 프라이머 6

배열 번호 13: eIF4E 유전자의 변이 영역 I1

배열 번호 14: eIF4E 유전자의 변이 영역 I2

배열 번호 15: eIF4E 유전자의 변이 영역 I3

배열 번호 16: eIF4E 유전자의 변이 영역 I4

배열 번호 17: eIF4E 유전자의 변이 영역 I5

배열 번호 18: eIF4E 유전자의 변이 영역 I6

배열 번호 19: RLK 유전자의 변이 영역 R1

배열 번호 20: RLK 유전자의 변이 영역 R2

배열 번호 21: RLK 유전자의 변이 영역 R3

배열 번호 22: RLK 유전자의 변이 영역 R4

배열 번호 23: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~471번 염기가 변이 영역 I1이다.

배열 번호 24: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~467번 염기가 변이 영역 I2이다.

배열 번호 25: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~467번 염기가 변이 영역 I3이다.

배열 번호 26: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~467번 염기가 변이 영역 I4이다.

배열 번호 27: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~461번 염기가 변이 영역 I5이다.

배열 번호 28: 변이 eIF4E 유전자의 cDNA 배열이며, 451번~467번 염기가 변이 영역 I6이다.

배열 번호 29: 변이 RLK 유전자의 cDNA 배열이며, 790번~804번 염기가 변이 영역 R1이다.

배열 번호 30: 변이 RLK 유전자의 cDNA 배열이며, 790번~802번 염기가 변이 영역 R2이다.

배열 번호 31: 변이 RLK 유전자의 cDNA 배열이며, 790번~810번 염기가 변이 영역 R3이다.

배열 번호 32: 변이 RLK 유전자의 cDNA 배열이며, 790번~804번 염기가 변이 영역 R4이다.

배열 번호 33: 염색체 1번에 존재하는 deltaCOP 유전자(delta01 유전자)(Solyc01g103480)의 cDNA 배열이며, 402번~572번 염기가 엑손 6이고, 471번~490번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 34: delta01 유전자의 엑손 6이며, 70번~89번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 35: delta01 유전자의 엑손 6의 표적 배열

배열 번호 36: 염색체 10번에 존재하는 deltaCOP 유전자(delta10 유전자)(Solyc10g038120)의 cDNA 배열이며, 106번~274번 염기가 엑손 2이고, 136번~155번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 37: delta10 유전자의 엑손 2이며, 31번~50번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 38: delta01 유전자의 엑손 2의 표적 배열

배열 번호 39: NSI 유전자(Solyc10g074910)의 cDNA 배열이며, 209번~393번 염기가 엑손 4이고, 283번~302번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 40: NSI 유전자의 엑손 4이며, 74번~93번 염기가 표적 배열이다.

배열 번호 41: NSI 유전자의 엑손 4의 표적 배열

배열 번호 42: delta01 유전자 검출용의 프라이머 7

배열 번호 43: delta01 유전자 검출용의 프라이머 8

배열 번호 44: delta10 유전자 검출용의 프라이머 9

배열 번호 45: delta10 유전자 검출용의 프라이머 10

배열 번호 46: NSI 유전자 검출용의 프라이머 11

배열 번호 47: NSI 유전자 검출용의 프라이머 12

배열 번호 48: delta01 유전자의 변이 영역 D011

배열 번호 49: delta01 유전자의 변이 영역 D012

배열 번호 50: delta01 유전자의 변이 영역 D013

배열 번호 51: delta10 유전자의 변이 영역 D101

배열 번호 52: delta10 유전자의 변이 영역 D102

배열 번호 53: NSI 유전자의 변이 영역 N1

배열 번호 54: NSI 유전자의 변이 영역 N2

배열 번호 55: 변이 delta01 유전자의 cDNA 배열이며, 471번~488번 염기가 변이 영역 D011이다.

배열 번호 56: 변이 delta01 유전자의 cDNA 배열이며, 470번~487번 염기가 변이 영역 D012이다.

배열 번호 57: 변이 delta01 유전자의 cDNA 배열이며, 470번~484번 염기가 변이 영역 D013이다.

배열 번호 58: 변이 delta10 유전자의 cDNA 배열이며, 135번~154번 염기가 변이 영역 D101이다.

배열 번호 59: 변이 delta10 유전자의 cDNA 배열이며, 135번~151번 염기가 변이 영역 D102이다.

배열 번호 60: 변이 NSI 유전자의 cDNA 배열이며, 283번~303번 염기가 변이 영역 N1이다.

배열 번호 61: 변이 NSI 유전자의 cDNA 배열이며, 283번~293번 염기가 변이 영역 N2이다.

[배열표]

SEQUENCE LISTING <110> Kikkoman Corporation National University Corporation Hokkaido University <120> Solanaceae plant and solanaceae plant cells resistant to Begomovirus causing yellow leaf curling symptoms in tomato and method for producing such solanaceae plant <130> 2F19422-PCT <150> JP2018-222289 <151> 2018-11-28 <150> JP2019-095150 <151> 2019-05-21 <160> 61 <170> PatentIn version 3.5 <210> 1 <211> 916 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(916) <223> cDNA sequence of eIF4E gene <220> <221> misc_feature <222> (317)..(482) <223> Exon 2 <220> <221> misc_feature <222> (451)..(470) <223> Target sequence <400> 1 agtgctccac agtccacaga gcagcaaaaa tggcagcagc tgaaatggag agaacgatgt 60 cgtttgatgc agctgagaag ttgaaggccg ccgatggagg aggaggagag gtagacgatg 120 aacttgaaga aggtgaaatt gttgaagaat caaatgatac ggcatcgtat ttagggaaag 180 aaatcacagt gaagcatcca ttggagcatt catggacttt ttggtttgat aaccctacca 240 ctaaatctcg acaaactgct tggggaagct cacttcgaaa tgtctacact ttctccactg 300 ttgaagattt ttggggtgct tacaataata tccatcaccc aagcaagtta attatgggag 360 cagactttca ttgttttaag cacaaaattg agccaaagtg ggaagatcct gtatgtgcca 420 atggagggac gtggaaaatg agtttttcga agggtaaatc tgataccagc tggctgtata 480 cgctgctggc aatgattgga catcaattcg atcatggaga tgaaatttgt ggagcagttg 540 ttagtgtccg ggctaaggga gaaaaaatag ctttgtggac caagaatgct gcaaatgaaa 600 cagctcaggt tagcattggt aagcaatgga agcagtttct agattacagt gattcggttg 660 gcttcatatt tcacgacgat gcaaagaggc tcgacagaaa tgccaagaat cgttacaccg 720 tatagttctt gatgcagtgt gggattgcaa gaaacacaat tcgtactgga aaggttggta 780 ggtactagtt tagtttctca tttgataagc ttctggtttg agtaactcgt gtgttggtgt 840 ttacactttc taatcgtgga aaattgtttg atttgaatcc atgcctctat gtttcgtcac 900 ataacaaaac acaaat 916 <210> 2 <211> 166 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(166) <223> Exon 2 of eIF4E gene <220> <221> misc_feature <222> (135)..(154) <223> Target sequence <400> 2 tgcttacaat aatatccatc acccaagcaa gttaattatg ggagcagact ttcattgttt 60 taagcacaaa attgagccaa agtgggaaga tcctgtatgt gccaatggag ggacgtggaa 120 aatgagtttt tcgaagggta aatctgatac cagctggctg tatacg 166 <210> 3 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Target sequence in exon 2 of eIF4E gene <400> 3 agggtaaatc tgataccagc 20 <210> 4 <211> 3516 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3516) <223> cDNA sequence of RLK gene <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2818) <223> Exon 1 <220> <221> misc_feature <222> (790)..(809) <223> Target sequence <400> 4 gttacaaaaa agagttgggg cctcctctac ttgtacaatc tcacaattca aattttattt 60 ctttataata atcaatccct tcgtattata tttatttact caaaacaaaa gaatatacac 120 accaaacgga ttacccaccc tcaaaccaaa tcctcatttt tgcctttctc actctaactg 180 agtgaaactg caaaccaaac agtaggtggg cgttagatta acgaagcaaa aatgcgtctt 240 cttttttttc ttcttcttct tatgcatttt actgactttt ctgccggtaa acaaccacgc 300 ttaccggaat accaggcttt gcttgccctg aaaactgcca ttaccgatga cccgcagtta 360 actcttgcct catggaacat ctccaccagt cactgtacgt ggaatggtgt cacgtgcgac 420 acgcatcgtc acgtgacctc tcttgatatt tctgggttta atcttaccgg tactcttccg 480 ccggaagttg gaaatcttcg tttcttacaa aatttgtctg ttgctgttaa ccagtttact 540 ggacctgtac ctgttgaaat ctcctttatt ccaaatctga gttaccttaa tctttctaat 600 aacatattcg ggatggaatt cccttcgcag ttaacacgtc tgcgtaacct ccaagtcctt 660 gacctttaca acaacaatat gaccggtgaa cttcccgttg aggtgtatca gatgactaaa 720 cttcgacatc tacacctagg cgggaacttt ttcagtggcc gcattcctcc ggagtatgga 780 agattcccgt ctctagagta ccttgcagtt tcaggcaatg cattggtagg agagatacca 840 ccggagattg gaaacatcgc tacacttcag cagttgtatg taggatacta caataccttc 900 accggtggga ttccaccggc aatagggaac ttatcgcagc tccttcggtt tgatgctgct 960 aactgtggac tttcggggaa gattccaccg gagattggga agcttcagaa ccttgatacc 1020 ctcttcctgc aagtgaattc tctatctgga tctttaactc cggagatagg ttatctgaag 1080 agcttgaaat ctttggatct gtcgaataac atgttctctg gcgagatacc gccgacattt 1140 gcggagctta agaatatcac tcttgttaat cttttccgga ataagcttta tgggtcaata 1200 ccagagttca tagaggactt gccggaacta gaggtgttgc aactttggga aaataacttt 1260 actggaagca ttcctcaggg gttaggcaca aagagcaagc tcaaaactct tgatctcagt 1320 tccaataaat taacgggaaa tttaccccca aacatgtgct ccggtaacaa tctgcagaca 1380 attatcactc tagggaactt cttgtttggc ccaattcctg aatctttggg taggtgtgaa 1440 tcacttaatc gtattagaat gggagaaaat tatctgaatg ggtctattcc aaaagggctc 1500 ttaagcttgc cacatctgtc acaagttgaa cttcagaata atattctcac tggtacattt 1560 cctgatattt cttccaaatc taacagtctt ggccagatta tcctttcaaa taatcgctta 1620 actggacctt tgccaccaag cattggaaac tttgctgtag cccaaaaatt gcttcttgat 1680 gggaacaaat tttcgggacg aattccagct gaaataggaa agcttcaaca gctatccaaa 1740 attgatttca gtcataacaa cttgtctgga cccattgctc cggagattag ccagtgcaag 1800 ttgctgactt atgttgatct cagcaggaac caactttcgg gtgagattcc tactgagatc 1860 acaggtatga gaatactcaa ctacttgaat ttatcgcgaa accacttagt tgggagtatt 1920 cctgccccta tttctagtat gcagagttta acttctgttg atttctcgta taacaacttt 1980 tctggtttag ttcctggaac cgggcaattt agttatttca attacacctc atttctaggc 2040 aatccagatc tttgcggacc ctatttgggc ccttgcaaag agggcgttgt tgatggggtt 2100 agtcaacctc accaacgagg agccttaacg ccttcgatga agcttttact tgttataggt 2160 ttgcttgtct gttctattgt gtttgctgtt gctgcaatta taaaggcccg atctttaaag 2220 aaggcaagtg aagctcgtgc ctggaagcta actgcttttc agcgcctgga ttttacttgt 2280 gatgatattt tggatagctt gaaggaggat aacgttattg gaaaaggagg tgctggtatt 2340 gtctacaagg gggtaatgcc tagcggggaa catgtagcgg ttaagaggtt gccagctatg 2400 agcaggggtt cctctcatga tcatgggttc aatgcagaga tacagactct tgggaggatc 2460 cgacacaggc acattgttag attattaggg ttttgctcga atcatgagac aaatcttttg 2520 gtttacgagt acatgcctaa tggaagtctt ggggaaatgc ttcatggcaa gaaaggcggt 2580 catttacatt gggataccag gtataagatt gccttggagt ctgctaaggg tctttgctat 2640 ctccatcacg attgctctcc tttgatcctc catcgtgatg tgaaatcaaa caacattctg 2700 ctggactcca gctttgaagc tcatgttgct gattttggac ttgctaagtt cttgcaagat 2760 tcagggacat cagaatgcat gtctgctatt gctggttctt atgggtacat tgctccagaa 2820 tatgcttaca cacttaaggt tgatgagaag agtgatgtat atagcttcgg tgtggtgcta 2880 ctagaactgg taagtggcaa aaaaccagtt ggagaatttg gtgatggtgt tgacatagtc 2940 caatgggtta ggaaaatgac tgatgggaaa aaggatggag ttctcaagat ccttgaccca 3000 agactctcaa cggttcccct taatgaggtg atgcatgtct tctatgtcgc attgttgtgt 3060 gtcgaagagc aggctgtgga acgtcccacc atgcgagagg tagtgcaaat actaacggaa 3120 cttcccaagc caccaggtgc aaaatcagat gactcaaccg tcactgatca gtcgccccca 3180 tcagcctctg cattagagtc cccaacctca attcccgggg acacaaaaga ccatcatcaa 3240 ccaacacctc aatcacctcc acctgaccta ctcagtatct aatttgcaat gttcttgaag 3300 taggagtgtt ttatttagtt tgattctcta gttctattat gatcaattgt gctaagcttt 3360 attcctttgt tttaaaaaaa ttgggtcttt ctaggctcgg gggtttattc taactctaag 3420 atgggtttaa tgctcagaag ttttcctctt gtacagtaag attggtaggg ttttcaagtg 3480 tattattaaa tggaaaaaaa ttgcccttca tttgct 3516 <210> 5 <211> 2818 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(2818) <223> Exon 1 of RLK gene <220> <221> misc_feature <222> (790)..(809) <223> Target sequence <400> 5 gttacaaaaa agagttgggg cctcctctac ttgtacaatc tcacaattca aattttattt 60 ctttataata atcaatccct tcgtattata tttatttact caaaacaaaa gaatatacac 120 accaaacgga ttacccaccc tcaaaccaaa tcctcatttt tgcctttctc actctaactg 180 agtgaaactg caaaccaaac agtaggtggg cgttagatta acgaagcaaa aatgcgtctt 240 cttttttttc ttcttcttct tatgcatttt actgactttt ctgccggtaa acaaccacgc 300 ttaccggaat accaggcttt gcttgccctg aaaactgcca ttaccgatga cccgcagtta 360 actcttgcct catggaacat ctccaccagt cactgtacgt ggaatggtgt cacgtgcgac 420 acgcatcgtc acgtgacctc tcttgatatt tctgggttta atcttaccgg tactcttccg 480 ccggaagttg gaaatcttcg tttcttacaa aatttgtctg ttgctgttaa ccagtttact 540 ggacctgtac ctgttgaaat ctcctttatt ccaaatctga gttaccttaa tctttctaat 600 aacatattcg ggatggaatt cccttcgcag ttaacacgtc tgcgtaacct ccaagtcctt 660 gacctttaca acaacaatat gaccggtgaa cttcccgttg aggtgtatca gatgactaaa 720 cttcgacatc tacacctagg cgggaacttt ttcagtggcc gcattcctcc ggagtatgga 780 agattcccgt ctctagagta ccttgcagtt tcaggcaatg cattggtagg agagatacca 840 ccggagattg gaaacatcgc tacacttcag cagttgtatg taggatacta caataccttc 900 accggtggga ttccaccggc aatagggaac ttatcgcagc tccttcggtt tgatgctgct 960 aactgtggac tttcggggaa gattccaccg gagattggga agcttcagaa ccttgatacc 1020 ctcttcctgc aagtgaattc tctatctgga tctttaactc cggagatagg ttatctgaag 1080 agcttgaaat ctttggatct gtcgaataac atgttctctg gcgagatacc gccgacattt 1140 gcggagctta agaatatcac tcttgttaat cttttccgga ataagcttta tgggtcaata 1200 ccagagttca tagaggactt gccggaacta gaggtgttgc aactttggga aaataacttt 1260 actggaagca ttcctcaggg gttaggcaca aagagcaagc tcaaaactct tgatctcagt 1320 tccaataaat taacgggaaa tttaccccca aacatgtgct ccggtaacaa tctgcagaca 1380 attatcactc tagggaactt cttgtttggc ccaattcctg aatctttggg taggtgtgaa 1440 tcacttaatc gtattagaat gggagaaaat tatctgaatg ggtctattcc aaaagggctc 1500 ttaagcttgc cacatctgtc acaagttgaa cttcagaata atattctcac tggtacattt 1560 cctgatattt cttccaaatc taacagtctt ggccagatta tcctttcaaa taatcgctta 1620 actggacctt tgccaccaag cattggaaac tttgctgtag cccaaaaatt gcttcttgat 1680 gggaacaaat tttcgggacg aattccagct gaaataggaa agcttcaaca gctatccaaa 1740 attgatttca gtcataacaa cttgtctgga cccattgctc cggagattag ccagtgcaag 1800 ttgctgactt atgttgatct cagcaggaac caactttcgg gtgagattcc tactgagatc 1860 acaggtatga gaatactcaa ctacttgaat ttatcgcgaa accacttagt tgggagtatt 1920 cctgccccta tttctagtat gcagagttta acttctgttg atttctcgta taacaacttt 1980 tctggtttag ttcctggaac cgggcaattt agttatttca attacacctc atttctaggc 2040 aatccagatc tttgcggacc ctatttgggc ccttgcaaag agggcgttgt tgatggggtt 2100 agtcaacctc accaacgagg agccttaacg ccttcgatga agcttttact tgttataggt 2160 ttgcttgtct gttctattgt gtttgctgtt gctgcaatta taaaggcccg atctttaaag 2220 aaggcaagtg aagctcgtgc ctggaagcta actgcttttc agcgcctgga ttttacttgt 2280 gatgatattt tggatagctt gaaggaggat aacgttattg gaaaaggagg tgctggtatt 2340 gtctacaagg gggtaatgcc tagcggggaa catgtagcgg ttaagaggtt gccagctatg 2400 agcaggggtt cctctcatga tcatgggttc aatgcagaga tacagactct tgggaggatc 2460 cgacacaggc acattgttag attattaggg ttttgctcga atcatgagac aaatcttttg 2520 gtttacgagt acatgcctaa tggaagtctt ggggaaatgc ttcatggcaa gaaaggcggt 2580 catttacatt gggataccag gtataagatt gccttggagt ctgctaaggg tctttgctat 2640 ctccatcacg attgctctcc tttgatcctc catcgtgatg tgaaatcaaa caacattctg 2700 ctggactcca gctttgaagc tcatgttgct gattttggac ttgctaagtt cttgcaagat 2760 tcagggacat cagaatgcat gtctgctatt gctggttctt atgggtacat tgctccag 2818 <210> 6 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Target sequence in exon 1 of RLK gene <400> 6 tctctagagt accttgcagt 20 <210> 7 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 1 for eIF4E <400> 7 atccatcacc caagcaagtt aatt 24 <210> 8 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 2 for eIF4E <400> 8 gtccacaaag ctattttttc tccc 24 <210> 9 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 3 for RLK <400> 9 ttaacacgtc tgcgtaacct c 21 <210> 10 <211> 23 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 4 for RLK <400> 10 ccggtgaagg tattgtagta tcc 23 <210> 11 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 5 for TYLCV <400> 11 ccctctggaa tgaaggaaca 20 <210> 12 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 6 for TYLCV <400> 12 ttgaaaaatt ggrctctcaa 20 <210> 13 <211> 21 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> mutation <222> (1)..(21) <223> Mutated region I1 of eIF4E gene <400> 13 agggtaaatc tgatacccag c 21 <210> 14 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Mutated region I2 of eIF4E gene <400> 14 agggtaaatc tgatagc 17 <210> 15 <211> 11 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Mutated region I3 of eIF4E gene <400> 15 agggtaacag c 11 <210> 16 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Mutated region I4 of eIF4E gene <400> 16 agggtaaatg tgatagc 17 <210> 17 <211> 11 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Mutated region I5 of eIF4E gene <400> 17 agtgtaacag c 11 <210> 18 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Mutated region I6 of eIF4E gene <400> 18 agggtaaatg taacagc 17 <210> 19 <211> 15 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Mutated region R1 of RLK gene <400> 19 tctgtacctt gcagt 15 <210> 20 <211> 13 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(13) <223> Mutated region R2 of RLK gene <400> 20 tctaccttgc agt 13 <210> 21 <211> 21 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Mutated region R3 of RLK gene <400> 21 tctactagag taccttgcag t 21 <210> 22 <211> 15 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(15) <223> Mutated region R4 of RLK gene <400> 22 tctgtacctt gacct 15 <210> 23 <211> 917 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(917) <223> cDNA sequence of mutated eIF4E gene <220> <221> misc_difference <222> (451)..(471) <223> Mutated region I1 <400> 23 agtgctccac agtccacaga gcagcaaaaa tggcagcagc tgaaatggag agaacgatgt 60 cgtttgatgc agctgagaag ttgaaggccg ccgatggagg aggaggagag gtagacgatg 120 aacttgaaga aggtgaaatt gttgaagaat caaatgatac ggcatcgtat ttagggaaag 180 aaatcacagt gaagcatcca ttggagcatt catggacttt ttggtttgat aaccctacca 240 ctaaatctcg acaaactgct tggggaagct cacttcgaaa tgtctacact ttctccactg 300 ttgaagattt ttggggtgct tacaataata tccatcaccc aagcaagtta attatgggag 360 cagactttca ttgttttaag cacaaaattg agccaaagtg ggaagatcct gtatgtgcca 420 atggagggac gtggaaaatg agtttttcga agggtaaatc tgatacccag ctggctgtat 480 acgctgctgg caatgattgg acatcaattc gatcatggag atgaaatttg tggagcagtt 540 gttagtgtcc gggctaaggg agaaaaaata gctttgtgga ccaagaatgc tgcaaatgaa 600 acagctcagg ttagcattgg taagcaatgg aagcagtttc tagattacag tgattcggtt 660 ggcttcatat ttcacgacga tgcaaagagg ctcgacagaa atgccaagaa tcgttacacc 720 gtatagttct tgatgcagtg tgggattgca agaaacacaa ttcgtactgg aaaggttggt 780 aggtactagt ttagtttctc atttgataag cttctggttt gagtaactcg tgtgttggtg 840 tttacacttt ctaatcgtgg aaaattgttt gatttgaatc catgcctcta tgtttcgtca 900 cataacaaaa cacaaat 917 <210> 24 <211> 913 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(913) <223> cDNA sequence of mutated eIF4E gene <220> <221> misc_difference <222> (451)..(467) <223> Mutated region I2 <400> 24 agtgctccac agtccacaga gcagcaaaaa tggcagcagc tgaaatggag agaacgatgt 60 cgtttgatgc agctgagaag ttgaaggccg ccgatggagg aggaggagag gtagacgatg 120 aacttgaaga aggtgaaatt gttgaagaat caaatgatac ggcatcgtat ttagggaaag 180 aaatcacagt gaagcatcca ttggagcatt catggacttt ttggtttgat aaccctacca 240 ctaaatctcg acaaactgct tggggaagct cacttcgaaa tgtctacact ttctccactg 300 ttgaagattt ttggggtgct tacaataata tccatcaccc aagcaagtta attatgggag 360 cagactttca ttgttttaag cacaaaattg agccaaagtg ggaagatcct gtatgtgcca 420 atggagggac gtggaaaatg agtttttcga agggtaaatc tgatagctgg ctgtatacgc 480 tgctggcaat gattggacat caattcgatc atggagatga aatttgtgga gcagttgtta 540 gtgtccgggc taagggagaa aaaatagctt tgtggaccaa gaatgctgca aatgaaacag 600 ctcaggttag 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misc_feature <222> (1)..(907) <223> cDNA sequence of mutated eIF4E gene <220> <221> misc_difference <222> (451)..(461) <223> Mutated region I5 <400> 27 agtgctccac agtccacaga gcagcaaaaa tggcagcagc tgaaatggag agaacgatgt 60 cgtttgatgc agctgagaag ttgaaggccg ccgatggagg aggaggagag gtagacgatg 120 aacttgaaga aggtgaaatt gttgaagaat caaatgatac ggcatcgtat ttagggaaag 180 aaatcacagt gaagcatcca ttggagcatt catggacttt ttggtttgat aaccctacca 240 ctaaatctcg acaaactgct tggggaagct cacttcgaaa tgtctacact ttctccactg 300 ttgaagattt ttggggtgct tacaataata tccatcaccc aagcaagtta attatgggag 360 cagactttca ttgttttaag cacaaaattg agccaaagtg ggaagatcct gtatgtgcca 420 atggagggac gtggaaaatg agtttttcga agtgtaacag ctggctgtat acgctgctgg 480 caatgattgg acatcaattc gatcatggag atgaaatttg tggagcagtt gttagtgtcc 540 gggctaaggg agaaaaaata gctttgtgga ccaagaatgc tgcaaatgaa acagctcagg 600 ttagcattgg taagcaatgg aagcagtttc tagattacag tgattcggtt ggcttcatat 660 ttcacgacga tgcaaagagg ctcgacagaa atgccaagaa tcgttacacc gtatagttct 720 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tcttgatatt tctgggttta atcttaccgg tactcttccg 480 ccggaagttg gaaatcttcg tttcttacaa aatttgtctg ttgctgttaa ccagtttact 540 ggacctgtac ctgttgaaat ctcctttatt ccaaatctga gttaccttaa tctttctaat 600 aacatattcg ggatggaatt cccttcgcag ttaacacgtc tgcgtaacct ccaagtcctt 660 gacctttaca acaacaatat gaccggtgaa cttcccgttg aggtgtatca gatgactaaa 720 cttcgacatc tacacctagg cgggaacttt ttcagtggcc gcattcctcc ggagtatgga 780 agattcccgt ctactagagt accttgcagt ttcaggcaat gcattggtag gagagatacc 840 accggagatt ggaaacatcg ctacacttca gcagttgtat gtaggatact acaatacctt 900 caccggtggg attccaccgg caatagggaa cttatcgcag ctccttcggt ttgatgctgc 960 taactgtgga ctttcgggga agattccacc ggagattggg aagcttcaga accttgatac 1020 cctcttcctg caagtgaatt ctctatctgg atctttaact ccggagatag gttatctgaa 1080 gagcttgaaa tctttggatc tgtcgaataa catgttctct ggcgagatac cgccgacatt 1140 tgcggagctt aagaatatca ctcttgttaa tcttttccgg aataagcttt atgggtcaat 1200 accagagttc atagaggact tgccggaact agaggtgttg caactttggg aaaataactt 1260 tactggaagc attcctcagg ggttaggcac aaagagcaag ctcaaaactc ttgatctcag 1320 ttccaataaa ttaacgggaa atttaccccc aaacatgtgc tccggtaaca atctgcagac 1380 aattatcact ctagggaact tcttgtttgg cccaattcct gaatctttgg gtaggtgtga 1440 atcacttaat cgtattagaa tgggagaaaa ttatctgaat gggtctattc caaaagggct 1500 cttaagcttg ccacatctgt cacaagttga acttcagaat aatattctca ctggtacatt 1560 tcctgatatt tcttccaaat ctaacagtct tggccagatt atcctttcaa ataatcgctt 1620 aactggacct ttgccaccaa gcattggaaa ctttgctgta gcccaaaaat tgcttcttga 1680 tgggaacaaa ttttcgggac gaattccagc tgaaatagga aagcttcaac agctatccaa 1740 aattgatttc agtcataaca acttgtctgg acccattgct ccggagatta gccagtgcaa 1800 gttgctgact tatgttgatc tcagcaggaa ccaactttcg ggtgagattc ctactgagat 1860 cacaggtatg agaatactca actacttgaa tttatcgcga aaccacttag ttgggagtat 1920 tcctgcccct atttctagta tgcagagttt aacttctgtt gatttctcgt ataacaactt 1980 ttctggttta gttcctggaa ccgggcaatt tagttatttc aattacacct catttctagg 2040 caatccagat ctttgcggac cctatttggg cccttgcaaa gagggcgttg ttgatggggt 2100 tagtcaacct caccaacgag gagccttaac gccttcgatg aagcttttac ttgttatagg 2160 tttgcttgtc tgttctattg tgtttgctgt tgctgcaatt ataaaggccc gatctttaaa 2220 gaaggcaagt gaagctcgtg cctggaagct aactgctttt cagcgcctgg attttacttg 2280 tgatgatatt ttggatagct tgaaggagga taacgttatt ggaaaaggag gtgctggtat 2340 tgtctacaag ggggtaatgc ctagcgggga acatgtagcg gttaagaggt tgccagctat 2400 gagcaggggt tcctctcatg atcatgggtt caatgcagag atacagactc ttgggaggat 2460 ccgacacagg cacattgtta gattattagg gttttgctcg aatcatgaga caaatctttt 2520 ggtttacgag tacatgccta atggaagtct tggggaaatg cttcatggca agaaaggcgg 2580 tcatttacat tgggatacca ggtataagat tgccttggag tctgctaagg gtctttgcta 2640 tctccatcac gattgctctc ctttgatcct ccatcgtgat gtgaaatcaa acaacattct 2700 gctggactcc agctttgaag ctcatgttgc tgattttgga cttgctaagt tcttgcaaga 2760 ttcagggaca tcagaatgca tgtctgctat tgctggttct tatgggtaca ttgctccaga 2820 atatgcttac acacttaagg ttgatgagaa gagtgatgta tatagcttcg gtgtggtgct 2880 actagaactg gtaagtggca aaaaaccagt tggagaattt ggtgatggtg ttgacatagt 2940 ccaatgggtt aggaaaatga ctgatgggaa aaaggatgga gttctcaaga tccttgaccc 3000 aagactctca acggttcccc ttaatgaggt gatgcatgtc ttctatgtcg cattgttgtg 3060 tgtcgaagag caggctgtgg aacgtcccac catgcgagag gtagtgcaaa tactaacgga 3120 acttcccaag ccaccaggtg caaaatcaga tgactcaacc gtcactgatc agtcgccccc 3180 atcagcctct gcattagagt ccccaacctc aattcccggg gacacaaaag accatcatca 3240 accaacacct caatcacctc cacctgacct actcagtatc taatttgcaa tgttcttgaa 3300 gtaggagtgt tttatttagt ttgattctct agttctatta tgatcaattg tgctaagctt 3360 tattcctttg ttttaaaaaa attgggtctt tctaggctcg ggggtttatt ctaactctaa 3420 gatgggttta atgctcagaa gttttcctct tgtacagtaa gattggtagg gttttcaagt 3480 gtattattaa atggaaaaaa attgcccttc atttgct 3517 <210> 32 <211> 3511 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(3511) <223> cDNA sequence of mutated RLK gene <220> <221> misc_difference <222> (790)..(804) <223> Mutated region R4 <400> 32 gttacaaaaa agagttgggg cctcctctac ttgtacaatc tcacaattca aattttattt 60 ctttataata atcaatccct tcgtattata tttatttact caaaacaaaa gaatatacac 120 accaaacgga ttacccaccc tcaaaccaaa tcctcatttt tgcctttctc actctaactg 180 agtgaaactg caaaccaaac agtaggtggg cgttagatta acgaagcaaa aatgcgtctt 240 cttttttttc ttcttcttct tatgcatttt actgactttt ctgccggtaa acaaccacgc 300 ttaccggaat accaggcttt gcttgccctg aaaactgcca ttaccgatga cccgcagtta 360 actcttgcct catggaacat ctccaccagt cactgtacgt ggaatggtgt cacgtgcgac 420 acgcatcgtc acgtgacctc tcttgatatt tctgggttta atcttaccgg tactcttccg 480 ccggaagttg gaaatcttcg tttcttacaa aatttgtctg ttgctgttaa ccagtttact 540 ggacctgtac ctgttgaaat ctcctttatt ccaaatctga gttaccttaa tctttctaat 600 aacatattcg ggatggaatt cccttcgcag ttaacacgtc tgcgtaacct ccaagtcctt 660 gacctttaca acaacaatat gaccggtgaa cttcccgttg aggtgtatca gatgactaaa 720 cttcgacatc tacacctagg cgggaacttt ttcagtggcc gcattcctcc ggagtatgga 780 agattcccgt ctgtaccttg acctttcagg caatgcattg gtaggagaga taccaccgga 840 gattggaaac atcgctacac ttcagcagtt gtatgtagga tactacaata ccttcaccgg 900 tgggattcca ccggcaatag ggaacttatc gcagctcctt cggtttgatg ctgctaactg 960 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gacttatgtt gatctcagca ggaaccaact ttcgggtgag attcctactg agatcacagg 1860 tatgagaata ctcaactact tgaatttatc gcgaaaccac ttagttggga gtattcctgc 1920 ccctatttct agtatgcaga gtttaacttc tgttgatttc tcgtataaca acttttctgg 1980 tttagttcct ggaaccgggc aatttagtta tttcaattac acctcatttc taggcaatcc 2040 agatctttgc ggaccctatt tgggcccttg caaagagggc gttgttgatg gggttagtca 2100 acctcaccaa cgaggagcct taacgccttc gatgaagctt ttacttgtta taggtttgct 2160 tgtctgttct attgtgtttg ctgttgctgc aattataaag gcccgatctt taaagaaggc 2220 aagtgaagct cgtgcctgga agctaactgc ttttcagcgc ctggatttta cttgtgatga 2280 tattttggat agcttgaagg aggataacgt tattggaaaa ggaggtgctg gtattgtcta 2340 caagggggta atgcctagcg gggaacatgt agcggttaag aggttgccag ctatgagcag 2400 gggttcctct catgatcatg ggttcaatgc agagatacag actcttggga ggatccgaca 2460 caggcacatt gttagattat tagggttttg ctcgaatcat gagacaaatc ttttggttta 2520 cgagtacatg cctaatggaa gtcttgggga aatgcttcat ggcaagaaag gcggtcattt 2580 acattgggat accaggtata agattgcctt ggagtctgct aagggtcttt gctatctcca 2640 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accaaatcca agggtcgtcc agctgcatct gctactgctc 600 caccgaaagg tcttggtatg caactgggta aaacacagaa gaccaaccaa tttctggaat 660 ccctaaaagc tgagggtgag gtaattgtcg aggatgtgag gccaagcgtt ggtcaggcca 720 aaccagctgc tgctccacta actgatcccg tcacgttgac tgttgaagag aagataaatg 780 taacactaaa gcgtgatggt ggtctcagca attttgtcgt ccagggtact ttgtctctcc 840 aaattctgaa ccaagaagat gcttttatcc aagtgcagat tgaaaccagt ggtaatccag 900 caatcctctt caaagcacac ccaaacatga acaaggagtt gtttgcaaat gaaaatattc 960 ttggccttaa agatcccaat aggtcatttc ccacagggca aggtggtgat ggtgttagtc 1020 ttttgaggtg gagaatgcaa agcacagatg agtcaatttt gcctttgaca attaactgct 1080 ggccttcagt ttctggaagt gaaacctatg tgaatatcga gtatgaaacc cccgcgcaga 1140 ttgatttaca aaatgttgta atttctgtac cccttccagc tctcagggag gctccaaatg 1200 tacaacagat tgatggagag tggaggtacg attccagaaa ttctgttttg gagtggtctg 1260 ttcttctcat tgacaattcg aaccgcagtg gatcactaga gtttgttgtt ccagctgctg 1320 atccatcagc attctttcca atttctgcac agtttacttc ttcgagaacc ttcagtgatg 1380 tgaaggttgt caacgtgctg cctctaaaag 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<220> <221> misc_feature <222> (1)..(1176) <223> cDNA sequence of deltaCOP gene on chromosome 10 (delta10 gene) <220> <221> misc_feature <222> (106)..(274) <223> Exon2 <220> <221> misc_feature <222> (136)..(155) <223> Target sequence <400> 36 atggagagcc atgaagagaa actgcataag ttagtcttac aaagcaagat taatgaaact 60 aaggatgtca tgaagcgcaa agccagtgag attgataaaa gcaagattga gaggaataga 120 ggtgaaaaag gaggtttcat gtctctgcaa tccatgggtt ctggaagaat ggataccggc 180 tttggcagtg atacaaactt atctagttta ggaggcagtg gttctggatt tggaccaagc 240 actgatgtgg attcattttc caccaagtcc aagggtcgtc cagttgcatc tgctacaggc 300 cccccaaaag gtcttggtat gcagctaggt aaaacacaaa ggaccaacca gtttttgcaa 360 tccctgaaag ctgagggtga agtcattgtc gaagatgtca gaccaagcat tggtccgtcc 420 aagccacctg ctccaccacc aactgaccct gtcaccctta ctattgaaga gaaaattaat 480 gtaacattaa agcgtgatgg aggtatcagc aacttcaatg tccagggtac cttatctctc 540 caaattctga accaagaaga tgggcttatc caagttcaga ttgaaaccag tggtaatcca 600 gccatccact tcaacacaca cccaaatatc aataaggagt tgttttctaa 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ttttccacca agtccaagg 169 <210> 38 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Target sequence <400> 38 ttcatgtctc tgcaatccat 20 <210> 39 <211> 768 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(768) <223> cDNA sequence of NSI gene <220> <221> misc_feature <222> (209)..(393) <223> Exon 4 <220> <221> misc_feature <222> (283)..(302) <223> Target sequence <400> 39 atgcaaactc tccacttagt atccacttct actgttgctt cttcttcttc ttcttcttcc 60 ctacccacta ttgtttctct taattgctgc cgttgtcaac cttcaaatca gttgccattt 120 cccaattcta atttgggttt tctgaaagtt aagaggcaac caaaagtttc taacttgaag 180 gctagctttt gggattccat cagatccggg tttggcaaga ataacataat acaggttata 240 gatacaccat ccagtgaaga agaagaggaa gaacctttgc ctgaggaatt tgttctagtt 300 gaaaagactc aacctgatgg aacagttgaa cagattatat tctcttctgg aggagatgtt 360 gatgtgtatg atctccaaga tttatgtgat aaggttggtt ggcctcgaag accactgtct 420 aagctagctg cagctctgaa aaatagctat atagttgcaa ctttgcattc taggaaattc 480 tcatcaggag aagaggggag tggagaaaag aagctgatag gcatggcccg tgcaacatca 540 gatcatgcat tcaatgcaac aatttgggat gttcttgttg atccttccta tcagggacaa 600 ggacttggaa aagttcttat cgagaaactg atacgaaccc ttctccaaag ggacatcgga 660 aatatttcac tgtttgcaga tagtaaagtt gtggaatttt acaggaatct tggttttgaa 720 cctgatccag agggaattaa gggaatgttc tggtacccca tgtattag 768 <210> 40 <211> 184 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(184) <223> Exon 4 of NSI gene <220> <221> misc_feature <222> (74)..(93) <223> Target sequence <400> 40 gtttggcaag aataacataa tacaggttat agatacacca tccagtgaag aagaagagga 60 agaacctttg cctgaggaat ttgttctagt tgaaaagact caacctgatg gaacagttga 120 acagattata ttctcttctg gaggagatgt tgatgtgtat gatctccaag atttatgtga 180 taag 184 <210> 41 <211> 20 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(20) <223> Target sequence <400> 41 gaggaatttg ttctagttga 20 <210> 42 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 7 for delta01 gene <400> 42 cgcatgtcag ctatgctaaa tg 22 <210> 43 <211> 24 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 8 for delta01 gene <400> 43 gtagagcaaa tccaccagaa ccat 24 <210> 44 <211> 21 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 9 for delta10 gene <400> 44 atgaagcgca aagccagtga g 21 <210> 45 <211> 20 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 10 for delta10 gene <400> 45 atccacatca gtgcttggtc 20 <210> 46 <211> 22 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 11 for NSI gene <400> 46 caggttatag atacaccatc ca 22 <210> 47 <211> 19 <212> DNA <213> Artificial Sequence <220> <223> Primer 12 for NSI gene <400> 47 taaatcaccg gaaagaaag 19 <210> 48 <211> 18 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Mutated region D011 of deltaCOP gene on chromosome 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(18) <223> Mutated region D011 of delta01 gene <400> 48 actggctttg gcagcctc 18 <210> 49 <211> 17 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Mutated region D012 of deltaCOP gene on chromosome 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(17) <223> Mutated region D012 of delta01 gene <400> 49 actggctttg gcagctc 17 <210> 50 <211> 14 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Mutated region D013 of deltaCOP gene on chromosome 1 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(14) <223> Mutated region D013 of delta01 gene <400> 50 actggctttg actc 14 <210> 51 <211> 19 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Mutated region D101 of deltaCOP gene on chromosome 10 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(19) <223> Mutated region D101 of delta10 gene <400> 51 ttcatgtctc tgcaatcat 19 <210> 52 <211> 16 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Mutated region D102 of deltaCOP gene on chromosome 10 <220> <221> misc_feature <222> (1)..(16) <223> Mutated region D102 of delta10 gene <400> 52 ttcatgtctc tgccat 16 <210> 53 <211> 21 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(21) <223> Mutated region N1 of NSI gene <400> 53 gagtgaattt gttctagttg a 21 <210> 54 <211> 11 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(11) <223> Mutated region N2 of NSI gene <400> 54 gagctagttg a 11 <210> 55 <211> 1735 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1735) <223> cDNA sequence of mutated delta01 gene <220> <221> misc_feature <222> (471)..(488) <223> Mutated region D011 <400> 55 ccaaattggt tggtatagga aagcagcata catatattga gactgaaaat gtgcgatatg 60 tttatcagcc gatagaatct ctgtacttgc tccttgtgac caacaaacag agcaacattc 120 ttgaagattt ggagacactg aggctgctgt ctaaactagt gcctgaatat tcttattcac 180 tagatgagga aggaattggc aggacggctt ttgagcttat ttttgcattt gatgaagtga 240 tctctcttgg gcacaaggaa aatgttacag ttacacaagt caagcagtac tgtgaaatgg 300 agagtcacga ggagagatta cacaagttag tcttacagaa caagataaat gaaactaagg 360 atgtcatgaa gcgtaaagcc agtgaaattg acaaaagcaa gattgagagg aatagaggtg 420 acaaaggagg tttcatgtca ctgcaatcca tgagttctgg aagaattgat actggctttg 480 gcagcctcag gcatatccaa cataggaggc aatggttctg gtggatttgc tctaccccct 540 gatgtggaca cattttccac caaatccaag ggtcgtccag ctgcatctgc tactgctcca 600 ccgaaaggtc ttggtatgca actgggtaaa acacagaaga ccaaccaatt tctggaatcc 660 ctaaaagctg agggtgaggt aattgtcgag gatgtgaggc caagcgttgg tcaggccaaa 720 ccagctgctg ctccactaac tgatcccgtc acgttgactg ttgaagagaa gataaatgta 780 acactaaagc gtgatggtgg tctcagcaat tttgtcgtcc agggtacttt gtctctccaa 840 attctgaacc aagaagatgc ttttatccaa gtgcagattg aaaccagtgg taatccagca 900 atcctcttca aagcacaccc aaacatgaac aaggagttgt ttgcaaatga aaatattctt 960 ggccttaaag atcccaatag gtcatttccc acagggcaag gtggtgatgg tgttagtctt 1020 ttgaggtgga gaatgcaaag cacagatgag tcaattttgc ctttgacaat taactgctgg 1080 ccttcagttt ctggaagtga aacctatgtg aatatcgagt atgaaacccc cgcgcagatt 1140 gatttacaaa atgttgtaat ttctgtaccc cttccagctc tcagggaggc tccaaatgta 1200 caacagattg atggagagtg gaggtacgat tccagaaatt ctgttttgga gtggtctgtt 1260 cttctcattg acaattcgaa ccgcagtgga tcactagagt ttgttgttcc agctgctgat 1320 ccatcagcat tctttccaat ttctgcacag tttacttctt cgagaacctt cagtgatgtg 1380 aaggttgtca acgtgctgcc tctaaaaggt ggggccactc ccaagcattc tcaaagaaca 1440 ctgctggcca cggagagtta ccaggttgtg tgaccacaag gacattataa aattgtgccg 1500 ttacagcaaa cattataggg cttgttttat ttcatttttg ttcagacttt tgtttgccct 1560 tttccttgtt atcctttccc aaagttcttt catgtacgga gatggaataa ctttgttagg 1620 ttgaacttag aaagtcttgt gcatttatag cgtacgccga tcaacttact tttgcgcaat 1680 tgaattgaac caaaatttga agcttcactg ttttctttat ttgttctatt atttc 1735 <210> 56 <211> 1734 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1734) <223> cDNA sequence of mutated delta01 gene <220> <221> misc_feature <222> (470)..(487) <223> Mutated region D012 <400> 56 ccaaattggt tggtatagga aagcagcata catatattga gactgaaaat gtgcgatatg 60 tttatcagcc gatagaatct ctgtacttgc tccttgtgac caacaaacag agcaacattc 120 ttgaagattt ggagacactg aggctgctgt ctaaactagt gcctgaatat tcttattcac 180 tagatgagga aggaattggc aggacggctt ttgagcttat ttttgcattt gatgaagtga 240 tctctcttgg gcacaaggaa aatgttacag ttacacaagt caagcagtac tgtgaaatgg 300 agagtcacga ggagagatta cacaagttag tcttacagaa caagataaat gaaactaagg 360 atgtcatgaa gcgtaaagcc agtgaaattg acaaaagcaa gattgagagg aatagaggtg 420 acaaaggagg tttcatgtca ctgcaatcca tgagttctgg aagaattgat actggctttg 480 gcagctcagg catatccaac ataggaggca atggttctgg tggatttgct ctaccccctg 540 atgtggacac attttccacc aaatccaagg gtcgtccagc tgcatctgct actgctccac 600 cgaaaggtct tggtatgcaa ctgggtaaaa cacagaagac caaccaattt ctggaatccc 660 taaaagctga gggtgaggta attgtcgagg atgtgaggcc aagcgttggt caggccaaac 720 cagctgctgc tccactaact gatcccgtca cgttgactgt tgaagagaag ataaatgtaa 780 cactaaagcg tgatggtggt ctcagcaatt ttgtcgtcca gggtactttg tctctccaaa 840 ttctgaacca agaagatgct tttatccaag tgcagattga aaccagtggt aatccagcaa 900 tcctcttcaa agcacaccca aacatgaaca aggagttgtt tgcaaatgaa aatattcttg 960 gccttaaaga tcccaatagg tcatttccca cagggcaagg tggtgatggt gttagtcttt 1020 tgaggtggag aatgcaaagc acagatgagt caattttgcc tttgacaatt aactgctggc 1080 cttcagtttc tggaagtgaa acctatgtga atatcgagta tgaaaccccc gcgcagattg 1140 atttacaaaa tgttgtaatt tctgtacccc ttccagctct cagggaggct ccaaatgtac 1200 aacagattga tggagagtgg aggtacgatt ccagaaattc tgttttggag tggtctgttc 1260 ttctcattga caattcgaac cgcagtggat cactagagtt tgttgttcca gctgctgatc 1320 catcagcatt ctttccaatt tctgcacagt ttacttcttc gagaaccttc agtgatgtga 1380 aggttgtcaa cgtgctgcct ctaaaaggtg gggccactcc caagcattct caaagaacac 1440 tgctggccac ggagagttac caggttgtgt gaccacaagg acattataaa attgtgccgt 1500 tacagcaaac attatagggc ttgttttatt tcatttttgt tcagactttt gtttgccctt 1560 ttccttgtta tcctttccca aagttctttc atgtacggag atggaataac tttgttaggt 1620 tgaacttaga aagtcttgtg catttatagc gtacgccgat caacttactt ttgcgcaatt 1680 gaattgaacc aaaatttgaa gcttcactgt tttctttatt tgttctatta tttc 1734 <210> 57 <211> 1731 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1731) <223> cDNA sequence of mutated delta01 gene <220> <221> misc_feature <222> (470)..(484) <223> Mutated region D013 <400> 57 ccaaattggt tggtatagga aagcagcata catatattga gactgaaaat gtgcgatatg 60 tttatcagcc gatagaatct ctgtacttgc tccttgtgac caacaaacag agcaacattc 120 ttgaagattt ggagacactg aggctgctgt ctaaactagt gcctgaatat tcttattcac 180 tagatgagga aggaattggc aggacggctt ttgagcttat ttttgcattt gatgaagtga 240 tctctcttgg gcacaaggaa aatgttacag ttacacaagt caagcagtac tgtgaaatgg 300 agagtcacga ggagagatta cacaagttag tcttacagaa caagataaat gaaactaagg 360 atgtcatgaa gcgtaaagcc agtgaaattg acaaaagcaa gattgagagg aatagaggtg 420 acaaaggagg tttcatgtca ctgcaatcca tgagttctgg aagaattgat actggctttg 480 actcaggcat atccaacata ggaggcaatg gttctggtgg atttgctcta ccccctgatg 540 tggacacatt ttccaccaaa tccaagggtc gtccagctgc atctgctact gctccaccga 600 aaggtcttgg tatgcaactg ggtaaaacac agaagaccaa ccaatttctg gaatccctaa 660 aagctgaggg tgaggtaatt gtcgaggatg tgaggccaag cgttggtcag gccaaaccag 720 ctgctgctcc actaactgat cccgtcacgt tgactgttga agagaagata aatgtaacac 780 taaagcgtga tggtggtctc agcaattttg tcgtccaggg tactttgtct ctccaaattc 840 tgaaccaaga agatgctttt atccaagtgc agattgaaac cagtggtaat ccagcaatcc 900 tcttcaaagc acacccaaac atgaacaagg agttgtttgc aaatgaaaat attcttggcc 960 ttaaagatcc caataggtca tttcccacag ggcaaggtgg tgatggtgtt agtcttttga 1020 ggtggagaat gcaaagcaca gatgagtcaa ttttgccttt gacaattaac tgctggcctt 1080 cagtttctgg aagtgaaacc tatgtgaata tcgagtatga aacccccgcg cagattgatt 1140 tacaaaatgt tgtaatttct gtaccccttc cagctctcag ggaggctcca aatgtacaac 1200 agattgatgg agagtggagg tacgattcca gaaattctgt tttggagtgg tctgttcttc 1260 tcattgacaa ttcgaaccgc agtggatcac tagagtttgt tgttccagct gctgatccat 1320 cagcattctt tccaatttct gcacagttta cttcttcgag aaccttcagt gatgtgaagg 1380 ttgtcaacgt gctgcctcta aaaggtgggg ccactcccaa gcattctcaa agaacactgc 1440 tggccacgga gagttaccag gttgtgtgac cacaaggaca ttataaaatt gtgccgttac 1500 agcaaacatt atagggcttg ttttatttca tttttgttca gacttttgtt tgcccttttc 1560 cttgttatcc tttcccaaag ttctttcatg tacggagatg gaataacttt gttaggttga 1620 acttagaaag tcttgtgcat ttatagcgta cgccgatcaa cttacttttg cgcaattgaa 1680 ttgaaccaaa atttgaagct tcactgtttt ctttatttgt tctattattt c 1731 <210> 58 <211> 1175 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1175) <223> cDNA sequence of mutated delta10 gene <220> <221> misc_feature <222> (135)..(154) <223> Mutated region D101 <400> 58 atggagagcc atgaagagaa actgcataag ttagtcttac aaagcaagat taatgaaact 60 aaggatgtca tgaagcgcaa agccagtgag attgataaaa gcaagattga gaggaataga 120 ggtgaaaaag gaggtttcat gtctctgcaa tcatgggttc tggaagaatg gataccggct 180 ttggcagtga tacaaactta tctagtttag gaggcagtgg ttctggattt ggaccaagca 240 ctgatgtgga ttcattttcc accaagtcca agggtcgtcc agttgcatct gctacaggcc 300 ccccaaaagg tcttggtatg cagctaggta aaacacaaag gaccaaccag tttttgcaat 360 ccctgaaagc tgagggtgaa gtcattgtcg aagatgtcag accaagcatt ggtccgtcca 420 agccacctgc tccaccacca actgaccctg tcacccttac tattgaagag aaaattaatg 480 taacattaaa gcgtgatgga ggtatcagca acttcaatgt ccagggtacc ttatctctcc 540 aaattctgaa ccaagaagat gggcttatcc aagttcagat tgaaaccagt ggtaatccag 600 ccatccactt caacacacac ccaaatatca ataaggagtt gttttctaat gaaaatattc 660 taggcctcaa agaacctagt aggccttttc ctgctaatca atctggtgat ggagttagtc 720 tcttgagatg gagaatgcaa agtgcagatg agtcgatttt acctttaact attaactgct 780 ggccttcagt ttctgggaat gaaacctatg tgaatattga gtatgaaaca ccagcacaaa 840 ctgatctaca gaatgttgtg atttttgtac ctctcccagc tctcagggat gccccacgta 900 tacagcaaat tgatggagag tggaggtatg attccagaaa ttctgttctg gagtggtctg 960 tagttctcat cgacaattct aatcgcagtg gatcactgga atttgtggtt ccggcagcag 1020 atcctgatgt gttcttcccg atttctgccc gttttaccgc ctcaagaacg ttcagtgacc 1080 tgaaggttgc caatattctg ccattgaaag gtgggtctcc acccaagttc tctcaaagaa 1140 cgctgctggc ttccgagaac taccaagtcg tgtaa 1175 <210> 59 <211> 1172 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(1172) <223> cDNA sequence of mutated delta10 gene <220> <221> misc_feature <222> (135)..(151) <223> Mutated region D102 <400> 59 atggagagcc atgaagagaa actgcataag ttagtcttac aaagcaagat taatgaaact 60 aaggatgtca tgaagcgcaa agccagtgag attgataaaa gcaagattga gaggaataga 120 ggtgaaaaag gaggtttcat gtctctgcca tgggttctgg aagaatggat accggctttg 180 gcagtgatac aaacttatct agtttaggag gcagtggttc tggatttgga ccaagcactg 240 atgtggattc attttccacc aagtccaagg gtcgtccagt tgcatctgct acaggccccc 300 caaaaggtct tggtatgcag ctaggtaaaa cacaaaggac caaccagttt ttgcaatccc 360 tgaaagctga gggtgaagtc attgtcgaag atgtcagacc aagcattggt ccgtccaagc 420 cacctgctcc accaccaact gaccctgtca cccttactat tgaagagaaa attaatgtaa 480 cattaaagcg tgatggaggt atcagcaact tcaatgtcca gggtacctta tctctccaaa 540 ttctgaacca agaagatggg cttatccaag ttcagattga aaccagtggt aatccagcca 600 tccacttcaa cacacaccca aatatcaata aggagttgtt ttctaatgaa aatattctag 660 gcctcaaaga acctagtagg ccttttcctg ctaatcaatc tggtgatgga gttagtctct 720 tgagatggag aatgcaaagt gcagatgagt cgattttacc tttaactatt aactgctggc 780 cttcagtttc tgggaatgaa acctatgtga atattgagta tgaaacacca gcacaaactg 840 atctacagaa tgttgtgatt tttgtacctc tcccagctct cagggatgcc ccacgtatac 900 agcaaattga tggagagtgg aggtatgatt ccagaaattc tgttctggag tggtctgtag 960 ttctcatcga caattctaat cgcagtggat cactggaatt tgtggttccg gcagcagatc 1020 ctgatgtgtt cttcccgatt tctgcccgtt ttaccgcctc aagaacgttc agtgacctga 1080 aggttgccaa tattctgcca ttgaaaggtg ggtctccacc caagttctct caaagaacgc 1140 tgctggcttc cgagaactac caagtcgtgt aa 1172 <210> 60 <211> 769 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <222> (1)..(769) <223> cDNA sequence of mutated NSI gene <220> <221> misc_feature <222> (283)..(303) <223> Mutated region N1 <400> 60 atgcaaactc tccacttagt atccacttct actgttgctt cttcttcttc ttcttcttcc 60 ctacccacta ttgtttctct taattgctgc cgttgtcaac cttcaaatca gttgccattt 120 cccaattcta atttgggttt tctgaaagtt aagaggcaac caaaagtttc taacttgaag 180 gctagctttt gggattccat cagatccggg tttggcaaga ataacataat acaggttata 240 gatacaccat ccagtgaaga agaagaggaa gaacctttgc ctgagtgaat ttgttctagt 300 tgaaaagact caacctgatg gaacagttga acagattata ttctcttctg gaggagatgt 360 tgatgtgtat gatctccaag atttatgtga taaggttggt tggcctcgaa gaccactgtc 420 taagctagct gcagctctga aaaatagcta tatagttgca actttgcatt ctaggaaatt 480 ctcatcagga gaagagggga gtggagaaaa gaagctgata ggcatggccc gtgcaacatc 540 agatcatgca ttcaatgcaa caatttggga tgttcttgtt gatccttcct atcagggaca 600 aggacttgga aaagttctta tcgagaaact gatacgaacc cttctccaaa gggacatcgg 660 aaatatttca ctgtttgcag atagtaaagt tgtggaattt tacaggaatc ttggttttga 720 acctgatcca gagggaatta agggaatgtt ctggtacccc atgtattag 769 <210> 61 <211> 759 <212> DNA <213> Solanum lycopersicum <220> <221> misc_feature <223> cDNA sequence of mutated NSI gene <220> <221> misc_feature <222> (283)..(293) <223> Mutated region N2 <400> 61 atgcaaactc tccacttagt atccacttct actgttgctt cttcttcttc ttcttcttcc 60 ctacccacta ttgtttctct taattgctgc cgttgtcaac cttcaaatca gttgccattt 120 cccaattcta atttgggttt tctgaaagtt aagaggcaac caaaagtttc taacttgaag 180 gctagctttt gggattccat cagatccggg tttggcaaga ataacataat acaggttata 240 gatacaccat ccagtgaaga agaagaggaa gaacctttgc ctgagctagt tgaaaagact 300 caacctgatg gaacagttga acagattata ttctcttctg gaggagatgt tgatgtgtat 360 gatctccaag atttatgtga taaggttggt tggcctcgaa gaccactgtc taagctagct 420 gcagctctga aaaatagcta tatagttgca actttgcatt ctaggaaatt ctcatcagga 480 gaagagggga gtggagaaaa gaagctgata ggcatggccc gtgcaacatc agatcatgca 540 ttcaatgcaa caatttggga tgttcttgtt gatccttcct atcagggaca aggacttgga 600 aaagttctta tcgagaaact gatacgaacc cttctccaaa gggacatcgg aaatatttca 660 ctgtttgcag atagtaaagt tgtggaattt tacaggaatc ttggttttga acctgatcca 720 gagggaatta agggaatgtt ctggtacccc atgtattag 759

Claims

번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖고,
상기 변이에 의하여, 상기 변이를 갖는 상기 유전자의 발현이 억제되고 있거나, 또는 상기 변이를 갖는 상기 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이며,
상기 바이러스에 대하여 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물.
제1항에 있어서,
상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, 가지과 식물.
제1항 또는 제2항에 있어서,
상기 변이가, 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입된 것인, 가지과 식물.
제1항 내지 제3항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변이가, 하기 (a)~(d) 중 적어도 1종인, 가지과 식물.
(a) 프레임 시프트 변이,
(b) 넌센스 변이,
(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및
(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제1항 내지 제4항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제5항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 가지과 식물.
제9항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제10항에 있어서,
상기 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 13~18로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, 가지과 식물.
제6항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 번역 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 가지과 식물.
제12항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제13항에 있어서,
상기 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 19~22로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, 가지과 식물.
제7항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 가지과 식물.
제15항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 35 또는 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제16항에 있어서,
상기 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 48~50으로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있거나, 및/또는
상기 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 51 또는 52에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, 가지과 식물.
제17항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 가지과 식물.
제18항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 갖는, 가지과 식물.
제19항에 있어서,
상기 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 53 또는 54에 나타나는 염기 배열로 변이되어 있는, 가지과 식물.
제1항 내지 제20항 중 어느 한 항에 있어서,
토마토인, 가지과 식물.
제1항 내지 제21항 중 어느 한 항에 기재된, 가지과 식물의 부분.
제22항에 있어서,
과실인, 가지과 식물의 부분.
제22항에 있어서,
종자인, 가지과 식물의 부분.
제1항 내지 제24항 중 어느 한 항에 기재된 가지과 식물 또는 그 부분의 가공품.
제25항에 있어서,
식용인, 가공품.
번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자가 변이를 갖고,
상기 변이에 의하여, 상기 변이를 갖는 상기 유전자의 발현이 억제되고 있거나, 또는 상기 변이를 갖는 상기 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이며,
상기 바이러스에 대하여 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물 세포.
제27항에 있어서,
상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, 가지과 식물.
제27항 또는 제28항에 있어서,
가지과 식물이 토마토인, 가지과 식물 세포.
제27항 내지 제29항 중 어느 한 항에 기재된 가지과 식물 세포를 갖고, 토마토 황화 잎말림 바이러스 저항성을 갖는, 가지과 식물 및 그 부분.
번역 개시 인자 eIF4E 유전자 및 그 상동 유전자, 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 및 그 상동 유전자, 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 및 그 상동 유전자, 및 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 및 그 상동 유전자로 이루어지는 군으로부터 선택되는 적어도 1종의 유전자를 선택하는 공정과,
가지과 식물의 게놈 내의 선택한 유전자에 대하여, 상기 선택한 유전자의 발현이 억제되는 변이, 또는 상기 선택한 유전자가 코드하는 단백질이 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 비기능적이 되는 변이를 도입하는 공정과,
상기 바이러스에 대하여 저항성을 갖는 가지과 식물을 선별하는 공정을 포함하는, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항에 있어서,
상기 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스가, 토마토 황화 잎말림 바이러스인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 또는 제32항에 있어서,
상기 변이를, 게놈 편집 기술에 의하여 게놈 내의 유전자에 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제33항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 변이가, 하기 (a)~(d) 중 적어도 1종인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
(a) 프레임 시프트 변이,
(b) 넌센스 변이,
(c) 연속 또는 비연속의 3n 염기(n=1~7)의 결손, 및
(d) 1 또는 복수의 염기의 치환, 결실, 부가, 및/또는 삽입.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제34항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제35항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 1에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제39항에 있어서,
상기 번역 개시 인자 eIF4E 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제40항에 있어서,
상기 배열 번호 3에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 13~18로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제36항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 4에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제36항에 있어서,
상기 수용체 유사 키나아제 RLK 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제40항에 있어서,
상기 배열 번호 6에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 19~22로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제37항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 33 또는 36에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제45항에 있어서,
상기 폴리머 코트 복합체 deltaCOP 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 35 또는 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제46항에 있어서,
상기 배열 번호 35에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 48~50으로부터 선택되는 1종에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하거나, 및/또는
상기 배열 번호 38에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 51 또는 52에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제38항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열을 포함하는 것이며,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자의 상동 유전자는, 그 cDNA 배열이 배열 번호 39에 나타나는 염기 배열에 대하여 85% 이상의 배열 상동성을 갖는 염기 배열을 포함하는 것인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제48항에 있어서,
상기 핵셔틀 단백질 상호 작용 인자 NSI 유전자 또는 그 상동 유전자 내의, 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역에 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제49항에 있어서,
상기 배열 번호 41에 나타나는 염기 배열에 대응하는 영역이, 배열 번호 53 또는 54에 나타나는 염기 배열이 되도록 변이를 도입하는, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제50항 중 어느 한 항에 있어서,
상기 가지과 식물이 토마토인, 바이러스 저항성 가지과 식물의 생산 방법.
제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진, 바이러스 저항성 가지과 식물.
제31항 내지 제51항 중 어느 한 항에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진 바이러스 저항성 가지과 식물 또는 그 후대를, 자가수분 또는 타가수분시키는 공정을 포함하는, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인 바이러스 저항성 가지과 식물의 육종 후대의 생산 방법.
제53항에 기재된 생산 방법에 따라 얻어진, 토마토에 황화 잎말림 유사 증상을 나타내는 베고모 바이러스속 바이러스에 대하여 저항성인 바이러스 저항성 가지과 식물.