CN111679009A - 一种同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的gc-ms-ms方法 - Google Patents

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Abstract

一种同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC‑MS‑MS方法，其特征是：根据烟用香精香料种类的不同，烟用精油用有机溶剂直接提取；烟用酊剂、浸膏等经饱和磷酸二氢钠酸性缓冲液分散后再用有机溶剂涡旋提取。提取液经离心后取上清液，过有机相滤膜。目测滤液，若滤液澄清，可加入硅烷化试剂直接衍生；若滤液有较重颜色，则将滤液用DMSO稀释，经混合吸附剂净化后，加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC‑MS‑MS进行分析。本发明的突出优点是：可同时定量分析烟用香精香料中挥发半挥发的酸类、醇类、酚类香味成分共118种，是一种高通量分析方法。操作简单，重复性好，准确度高，前处理简单，可对各种烟用香精香料样品进行快速分析。

Description

一种同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC- MS-MS方法
技术领域
本发明属于烟用香精香料成分检测技术领域，具体涉及一种有机溶剂提取、离心净化、硅烷化衍生-气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时测定烟用香精香料中118种挥发半挥发酸、醇、酚的分析方法。
背景技术
烟用香精香料是卷烟生产中必不可少的原料，其配方也是烟草工业企业的核心技术之一,是构成香烟品牌风格的重要因素，通过加香加料，可以提高烟气浓度和香味，改善烟草自身品质，稳定卷烟质量，满足个性化需求，香精香料的应用同卷烟品牌的树立及发展密切相关(参见：浅谈烟用香精香料[J].科技信息，2013，25：483)。
烟用香精香料品种很多，成分复杂，其中酸类、醇类、酚类是其中重要的化合物。低相对分子质量的羧酸赋予烟气吸味和芳香特征，高相对分子质量的脂肪酸则更多使烟气柔和、适口；有些醇类具有另人愉快的香气，可直接用于香精的调配，有些醇类则是天然香料的重要成分，如苯甲醇、苯乙醇、薄荷醇等；一些酚类物质对烟气香味也具有重要贡献，有些具有特定的香气，有些则使烟气增加奇异的味道，且不易被其他致香剂所减轻，丁香油、茴香油等天然香料是卷烟重要的香味添加剂(参见：烟草香料技术原理与应用[M].北京:化学工业出版社,2009:145-152.)。因此全面、准确的烟用香精香料中关键酸类、醇类、酚类香味成分分析数据，是进行卷烟设计的重要依据，对仿香、创香，对维护香烟品牌风格至关重要。
烟用香精香料的分析方法主要是非靶标GC-MS全扫描指纹图谱法，在化合物含量的表征上采用内标半定量；也有针对香精香料中个别成分的靶标定量分析方法，但目标化合物种类过少，不能有效全面表征香精香料的成分含量(参见：基于GC—MS和计算机智能***的烟草香精剖析及复配方法初探[J].分析测试学报，2013，32(3)：314-319)。在香精香料酸、醇、酚等重要化合物分析方面，文献有报道烟用酊剂中挥发酸的分析、乌梅浸膏中挥发性、半挥发性和非挥发性有机酸的分析，但由于受样品基质干扰、GC/MS灵敏度不足等分析方法问题制约，目标物仅局限于酸性成分，而且数量仅有三十余个[7-8]。目前在剖析香精香料中缺少有效分析手段，在仿香创香方面还有较大困难，难以揭示烟叶及卷烟风格特征的物质基础，因此，迫切需要建立高通量、易操作、准确度高、灵敏度好的同时分析烟用香精香料中酸类、醇类、酚类的高效分析方法。
由于酸类、醇类、酚类物质极性的不同，往往需要应用不同的色谱柱，不能同时进行分析，而硅烷化反应可解决这一问题。硅烷化气相色谱法的原理旧J是通过硅烷化衍生反应使三甲基硅烷基取代衍生对象的羟基、羧基、巯基、氨基及亚氨基的活泼氢，提高衍生对象挥发性，将非挥发性物质转化为挥发性衍生物，从而扩大气相色谱的测定范围，克服气相色谱对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质不能直接进样分析的缺点，此外，转化为衍生物的方法还具有改善结构近似化合物的分离选择性，克服载体、柱壁对高极性、低挥发性样品的吸附，改善样品峰形等优点。硅烷化技术已应用于烟气、酊剂、浸膏中挥发半挥发酸性成分的分析(参见：反相高效液相色谱法测定烟用香精香料中3种多酚类化合物[J].烟草科技，2009，9：32-38)，也有分析烟草中有机酸的专利(参见CN109406704A，CN109212066A)。目前尚未见有硅烷化反应同时测定烟用香精香料中酸类、醇类、酚类物质的报道。
发明内容
本文发明的目的旨在建立操作简单、通用性强、成本低、环境友好、能满足烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类同时提取的通用、高效型的前处理方法，并结合气相色谱-串联质谱技术，寻找最佳色谱条件及串接质谱MRM多反应监测模式参数，实现对烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分的同时分析。在本发明中，将样品进行硅烷化，结合灵敏度更高、选择性更好的GC-MS-MS仪器，建立了烟用香精香料中同时分析酸类、醇类、酚类物质的高通量分析方法，满足了对烟用香精香料中酸类、醇类、酚类香味成分同时进行快速、高通量分析研究的需要。该方法简单、准确、易操作、通量高，可同时对118种酸类、醇类、酚类香味成分进行测定，为烟用香精香料化学成分研究提供了技术支持。
本发明的目的是通过以下技术方案来实现的：
一种同时检测烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分的方法，对于烟用精油，用有机溶剂直接提取；对于烟用酊剂、浸膏等，先用酸性缓冲液浸泡待测烟样，然后加入有机溶剂提取。提取液离心后若澄清，无较重颜色，可直接用BSTFA衍生；若还有较重颜色，则将提取液经DMSO稀释后加入混合吸附剂对样品进行净化，离心后取上清液，过有机相滤膜，取滤液，再加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC-MS-MS进行分析。具体步骤如下：
对于烟用精油：
(1)称取烟用精油2g；
(2)用有机溶剂(二氯甲烷)10mL稀释,并加入内标溶液50μL；内标溶液为：反二己烯酸的二氯甲烷溶液，浓度为100μg/mL。
(3)若样品澄清则直接过滤膜，取滤液500μL，于1ml衍生瓶中，加入衍生化BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min。若样品浑浊，离心后过滤膜，取滤液，经BSTFA衍生后进行GC-MS-MS分析。
对于烟用酊剂或浸膏
(1)称取烟用酊剂或浸膏2g，
(2)加入磷酸二氢钠酸性缓冲液5mL稀释分散，加入内标溶液50μL，再加入有机溶剂(二氯甲烷)10mL，以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；涡旋萃取。其中磷酸二氢钠酸性缓冲液配制为：将60g含两个结晶水的磷酸二氢钠加入90mL去离子水中，然后滴加9.5g磷酸，摇匀待用。内标溶液为：反二己烯酸的二氯甲烷溶液，浓度为100μg/mL。
(3)取500μL有机相溶液于2mL离心管中，加入500μLDMSO，摇匀，然后加入5～10mg吸附剂(C18和GCB，粒度40～60μm，质量比1:1)，立即以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；上清液经0.22μm有机相滤膜。取脱色后溶液进行硅烷化衍生，然后进行GC-MS-MS分析。
(4)样品衍生：取500μL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min。
(5)样品分析：将待测液用气相色谱-串联质谱分析，采用标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量；
GC-MS/MS分析条件如下：
色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；
进样口温度：280℃；
进样量：0.8～1.0μL；
进样方式：分流进样，分流比：10:1；
载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；
程序升温；初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min。
电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；
灯丝电流：35μA；
离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；
Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的优化。首先将各化合物进行全扫描(Full Scan)(扫描范围m/z40～500)，确定保留时间，并筛选2～3个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下(5、10、15、20、25、30eV)进行产物离子扫描(ProductIon Scan)，并筛选2个质荷比及丰度较大的离子作为子离子，每个化合物筛选出2～3对离子对及相应的最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择无基质干扰、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。目标物的MRM参数如表1所示。
表1 118种目标物的检测质谱条件
Figure BDA0002548918730000041
Figure BDA0002548918730000051
Figure BDA0002548918730000061
Figure BDA0002548918730000071
本发明的突出优点在于：
1、本发明用二氯甲烷提取、C18和GCB净化，硅烷化衍生后进GC-MS-MS分析。目前，烟用香精香料的分析方法主要是非靶标GC-MS全扫描指纹图谱法，即通过一级质谱全扫，检索标准质谱图库定性，受样品基质干扰、GC/MS灵敏度不足等分析方法问题制约，能准确定性的化合物数量极为有限。本发明用气相色谱-串联质谱(GC-MS/MS)同时测定烟用香精香料中118种挥发半挥发酸类、醇类、酚类香味成分，和以往方法相比，每个化合物都选择优化了相应的定量离子对和定性离子对，无需标准谱库检索，化合物的定性更准确；且方法灵敏度更高、精密度和重复性更好。能满足烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类的同时提取、净化；用时短、成本低、溶剂用量少、通量高。
2、118种化合物均通过内标法建立标准工作曲线，根据各目标物面积相应及各目标物的标准曲线计算相应成分的含量；而目前的香味成分的定量方法大多是根据化合物选择离子的峰面积与内标选择离子峰面积比例及内标化合物的量进行估算，是半定量方法。因此本发明的准确度更高。
3、本发明中对样本进行硅烷化，使性质不同挥发半挥发的酸类、醇类、酚类中羧基、羟基上的活泼氢均被三甲基硅烷基取代，提高衍生对象挥发性，将非挥发性物质转为挥发性衍生物，克服气相色谱对极性强、挥发性低、热稳定性差的物质不能直接进样分析的缺点，克服载体、柱壁对高极性、低挥发性样品的吸附，改善了样品峰形。实现了一套色谱***对烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类等118种化合物的同时测定。
4、本发明中，将烟用酊剂或浸膏用所配制的磷酸盐缓冲溶液按所述比例进行泡发，一方面使样本体系pH调至3左右，降低酸类、醇类、酚类物质的损失，提高了萃取效率。样本经缓冲盐溶液泡发后，密度增大，后续经有机溶剂萃取后，样本可与二氯甲烷良好分层，沉积于底部，便于取样。
5、本发明中采用的净化吸附剂为C18和GCB质量比为1:1的混合物，C18对非极性化合物的吸附很好，GCB主要的吸附样本中的色素。二者配合使用，达到非常理想的净化效果，提供了较为干净的上机溶液，减少了仪器在使用过程中的维护。
6、本发明中二氯甲烷萃取液经DMSO稀释后，体系极性增强，增加了大分子化合物及非极性化合物在净化材料(C18和GCB质量比为1:1的混合物)上的吸附量，降低了酸类、醇类、酚类等极性目标物的吸附，既增加了净化效果又提高了方法准确度。
附图说明
图1为本发明中标准溶液在GC-MS/MS上的总离子流图。
具体实施方式
本发明以下结合实施例(附图)做进一步描述，但并不限制本发明。
含量测定实例：
(1)样品前处理
称取2g烟用浸膏，加入5mL配制好的酸性缓冲溶液，以2500r/min涡旋2min，使样品充分分散，加入10mL二氯甲烷及50μL内标工作液，以2500r/min涡旋5min，8000r/min离心3min；取500μL有机相溶液于2mL离心管中，加入500μLDMSO，摇匀，然后加入10mg吸附剂(C18和GCB，粒度40～60μm，质量比1:1)，以2500r/min涡旋3min，8000r/min离心3min；上清液经0.22μm有机相滤膜。取500μL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化试BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min。
(2)气相色谱仪条件及质谱条件
色谱条件：色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱(1m×0.25mm×0.25μm)；进样口温度：280℃；进样量：1.0μL；进样方式：分流进样，分流比：10:1；载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；程序升温；初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min。
质谱条件：电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；灯丝电流：35μA；离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；Q2碰撞气：氮气(纯度99.999％)，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气(纯度为99.999％)，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。MRM参数见表1。
(3)工作曲线与检测限的测定
通过以下公式考察了118种香味成分的基质效应：ME＝B/A，其中，A为溶剂标准工作溶液标准曲线的斜率，B为基质匹配标准工作溶液标准曲线的斜率。其中的内标物反-2-己烯酸的浓度为500ng/mL。根据样品中目标物的含量，含量较低的化合物共111种，6级标线浓度分别为10、20、50、100、200、500ng/mL；含量较高的化合物共7种，分别是甲酸、乙酸、棕榈酸、亚油酸、油酸、亚麻酸、硬脂酸，6级标线浓度分别为2、4、10、20、40、100μg/mL。以各目标物的峰面积与内标的峰面积之比与各目标物浓度与内标浓度之比进行线性回归分析，得到标准工作曲线，实验结果表明：118种目标物的基质效应不明显(0.9<ME<1.1)，因此本实验可采用溶剂直接制作标准曲线。在线性浓度范围内，各标准曲线的线性关系良好，适合定量分析。以3倍信噪比和10倍信噪比计算方法检出限(LOD)和定量限(LOQ)，所有目标物的检出限在1～34ng/g之间，定量限在4～100ng/g之间，完全满足烟用香精香料中挥发半挥发酸类、醇类、酚类成分的定量分析需求。
表2化合物的标准工作曲线
Figure BDA0002548918730000091
Figure BDA0002548918730000101
Figure BDA0002548918730000111
Figure BDA0002548918730000121
(4)回收率与精密度
称取2g烟用浸膏，加入5mL配制好的酸性缓冲溶液，加入标准品溶液，使低含量目标物添加水平为0.5μg/g，高含量目标物添加量为5μg/g。其余操作如(2)所述，进行日内6次，日间6次平行实验，考察了方法的精密度，并在高、中、低三个含量水平上进行了样品加标回收率的测定(添加量以样品中含量为参考，添加含量的0.5倍、1倍、2倍)。结果表明，118种化合物测定结果的日内RSD％在0.98％～8.55％，日间RSD％1.40％～10.85％；三水平方法回收率的结果在79.07％～117.56％之间。结果表明，该方法具有良好的回收率，精密度、灵敏度、稳定性较好，可满足分析检测需要。
表3 118种化合物的回收率及精密度
Figure BDA0002548918730000131
Figure BDA0002548918730000141
Figure BDA0002548918730000151
(5)样品测定
采用所建方法，检测了5个不同的烟用香精香料样品，共检出89种目标物。其中，1号样品共检出54种目标物，含量最高的是苯甲醇，其次依次是亚麻酸、棕榈酸、亚油酸和叶醇；2号样品共检出62种目标物，含量最高的是棕榈酸，其次依次是苯甲醇、乳酸薄荷酯、叶醇和丁香酚；3号样品共检出50种目标物，含量最高的是亚麻酸，其次依次是棕榈酸、亚油酸、硬脂酸和乳酸薄荷酯；4号样品共检出61种目标物，含量最高的是肉桂酸，其次依次是苯甲醇、苯甲酸、金合欢醇和肉桂醇；5号样品共检出72种目标物，含量最高的是肉桂酸，其次依次是金合欢醇、薰衣草醇、异丁香酚和愈创木酚。

Claims (10)

1.一种同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：根据烟用香精香料种类使用不同方式进行提取：
A、当烟用香精香料为烟用精油时用有机溶剂直接提取；
B、当烟用香精香料为烟用酊剂、浸膏时经饱和磷酸二氢钠酸性缓冲液分散后再用有机溶剂涡旋提取；提取液经离心后取上清液，过有机相滤膜；
目测滤液，若滤液澄清，可加入硅烷化试剂直接衍生；若滤液有较重颜色，则将滤液用DMSO稀释，经混合吸附剂净化后，加入硅烷化试剂进行衍生，最后采用GC-MS-MS进行分析。
2.根据权利要求1所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：当烟用香精香料为烟用精油的具体检测步骤如下：
(1)称取烟用精油2g；
(2)用有机溶剂10mL稀释,并加入内标溶液50μL；
(3)若样品澄清则直接过滤膜，取滤液500μL，于1ml衍生瓶中，加入衍生化BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min；若样品浑浊，离心后过滤膜，取滤液，经BSTFA衍生后进行GC-MS-MS分析。
3.根据权利要求1所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：当烟用香精香料为烟用酊剂或浸膏的具体检测步骤如下：
(1)称取烟用酊剂或浸膏2g；
(2)加入磷酸二氢钠酸性缓冲液5mL稀释分散，加入内标溶液50μL，再加入有机溶剂10mL，以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；涡旋萃取；其中磷酸二氢钠酸性缓冲液配制为：将60g含两个结晶水的磷酸二氢钠加入90mL去离子水中，然后滴加9.5g磷酸，摇匀待用；
(3)取500μL有机相溶液于2mL离心管中，加入500μLDMSO，摇匀，然后加入5～10mg吸附剂，立即以2500r/min涡旋1～5min，5000～8000r/min离心3～5min；上清液经0.22μm有机相滤膜。取脱色后溶液进行硅烷化衍生，然后进行GC-MS-MS分析；
(4)样品衍生：取500μL过滤液，于1ml衍生瓶中，加入衍生化BSTFA20μL，水浴60℃，衍生40min；
(5)样品分析：将待测液用GC-MS-MS分析，采用标准工作溶液制作标准曲线，用标准曲线定量。
4.根据权利要求1或2或3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：
所述GC-MS/MS分析条件如下：
色谱柱：弹性石英毛细管色谱柱，固定相为5％苯基-甲基聚硅氧烷，规格60m×0.25mm×0.25μm，进样口端串联预柱，规格1m×0.25mm×0.25μm；
进样口温度：280℃；
进样量：0.8～1.0μL；
进样方式：分流进样，分流比：10:1；
载气：氦气，恒流模式，流速1.0mL/min；
程序升温；
电离模式：电子轰击电离，电离能70eV；
灯丝电流：35μA；
离子源温度：280℃；四级杆温度：150℃；传输线温度：280℃；
Q2碰撞气：氮气，流量1.5mL/min；淬灭气：氦气，流量2.25mL/min；扫描方式：多反应监测(MRM)模式。
5.根据权利要求1或2或3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：所述有机溶剂为二氯甲烷。
6.根据权利要求1或2或3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：内标溶液为：反二己烯酸的二氯甲烷溶液，浓度为100μg/mL。
7.根据权利要求3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：所述吸附剂包括C18和GCB，粒度40～60μm，质量比1:1。
8.根据权利要求3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：所述程序升温为：初温40℃，然后以4℃/min的升温速度升到280℃，再以10℃/min的升温速率升至290℃，保持20min。
9.根据权利要求3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：MRM参数包括保留时间的确定，母离子、子离子和碰撞能量的优化：首先将各化合物进行全扫描(FullScan)，确定保留时间，并筛选2～3个质荷比及丰度较大的离子作为备选母离子；再将上述各母离子在不同的碰撞能量下包括5、10、15、20、25、30eV进行产物离子扫描，并筛选2个质荷比及丰度较大的离子作为子离子，每个化合物筛选出2～3对离子对及相应的最优碰撞能量；最后，用MRM模式对标准溶液、基质提取液、添加标准品的基质提取液进行分析，选择无基质干扰、灵敏度高的两对离子对分别作为定量及定性离子对。
10.根据权利要求1或2或3所述的同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的GC-MS-MS方法，其特征在于：所述同时检测烟用香精香料中挥发及半挥发酸、醇、酚的数量共118种。
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