CN111647510A - 一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂 - Google Patents

Abstract

本发明涉及食品加工的相关技术领域，更具体地，本发明提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂。第一方面提供一种双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括10～30％脱脂奶粉、0.1～5.0％氨基酸及其盐、3～25％二糖或/和多糖、1～5％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为6.5～8.5；本发明通过采用特定的复合保护剂与助剂共同作用，能显著提高婴儿双歧杆菌冻干存活率及菌粉活菌数，解决了婴儿双歧杆菌菌粉在冻干过程中存活率低、活菌数少、保藏期短等问题。

Description

一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂

技术领域

本发明涉及食品加工的相关技术领域，更具体地，本发明提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉、制备方法及其所用复合保护剂。

背景技术

近年来，益生菌在功能性乳制品、保健食品、微生态制剂及医疗等领域得到广泛应用，具体是指一类对宿主有功能性健康益处的活性微生物，具有调节人体免疫功能、改善肠道菌群微生态平衡、降低血脂胆固醇、促进营养物质消化与吸收等优点。常见的益生菌有乳酸菌、双歧杆菌、酪酸梭菌及酵母菌等。双歧杆菌作为机体肠道中最重要的生理性细菌，与人体的生长、新陈代谢密切相关，在人体健康和疾病方面起着重要的作用。具体的说，双歧杆菌具有抑制肠道病原菌生长、预防腹泻或便秘、提供维生素、提高机体免疫力等生理功能。目前，已经发现的双歧杆菌有30余种，包括婴儿双歧杆菌(Bifidobacteriuminfantis)、青春双歧杆菌(Bifidobacterium adolescentis)、长双歧杆菌(Bifidobacterium longum)、短双歧杆菌(Bifidobacterium breve)、两歧双歧杆菌(Bifidobacterium bifidum)等。

双歧杆菌属于革兰氏阳性菌、专性厌氧、形态多变，多呈V字形、Y字形、弯曲状等形态、不形成芽孢、抗酸能力差，在生产、保藏和运输过程中很难保持活性。研究表明，液态双歧杆菌制剂在贮存过程中活菌数量下降很快，4℃条件下冷藏也只能保藏5～7d，因此制备高活性双歧杆菌菌粉至关重要，有利于后期产品的加工、储藏及运输。

真空冷冻干燥技术是制备和保存双歧杆菌最有效的方法之一，可以很好的保持菌体的生物活性。在制备菌粉过程中，水分在真空和低温条件下不经过液态直接升华，菌株要经受冷冻和干燥两种激烈因素的作用，若是在不添加保护剂的情况下直接冷冻干燥，会造成微生物细胞膜通透性和流动性发生变化、胞内的动态平衡被破坏、酶蛋白分子钝化等，这势必会导致菌体的死亡，有研究表明，若是直接冷冻干燥，菌体存活率仅10％-30％左右。冷冻干燥过程中，影响微生物冻干存活率及菌粉活菌数的因素复杂，主要有菌株生理特性、培养基成分、培养条件、收获期、预冻条件、初始菌悬液浓度、冻干保护剂及其pH值、冷冻速率、残留水分、复水条件及亚致死处理等。其中，冻干保护剂是最复杂、最难选择的一个关键因素，目前，关于提高婴儿双歧杆菌冻干存活率的方法也多集中在这一方面，但是，保护剂的添加量越多，单位质量菌粉活菌数就越低，一些对双歧杆菌冻干菌粉的研究结果表明，双歧杆菌发酵制备的高密度菌体经历冻干后，菌体密度基本呈指数级下降，因此制备得到能很好维持菌粉活菌数量的冻干粉是很有必要的。

发明内容

目前大量研究表面保护剂的效果存在菌种特异性，不同菌种所需要的保护剂种类以及含量会不同，本发明提供了一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，以及其含有复合保护剂的冻干粉，通过采用特定的复合保护剂与助剂共同作用，能显著提高婴儿双歧杆菌冻干存活率及菌粉活菌数，解决了婴儿双歧杆菌菌粉在冻干过程中存活率低、活菌数少、保藏期短等问题。

为实现上述技术效果，本发明的第一方面提供一种双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括10～30％脱脂奶粉、0.1～5.0％氨基酸及其盐、3～25％二糖或/和多糖、1～5％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为6.5～8.5；优选地，复合保护剂包括16～22％脱脂奶粉、0.2～3.0％氨基酸及其盐、5～20％二糖或/和多糖、2.5～3.6％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为7.0～7.5；进一步优选地，复合保护剂包括18～21％脱脂奶粉、1.2～2.0％氨基酸及其盐、12～17％二糖或/和多糖、2.8～3.2％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为7.0。

本发明所述“脱脂奶粉”是将鲜牛奶脱去脂肪再干燥而成，除脂肪可降低至1％左右外，其在生物制品冻干过程中可以起骨架租用，防止低分子物质的碳化与氧化，保护活性物质不受高温的影响，使得冻干成品呈多孔性、疏松的海绵状，不过也需要控制脱脂奶粉中复合保护剂中的重量占比，当其含量超过30wt％时，容易在使用过程中引起过敏现象，而当其含量小于10wt％时，所得婴儿双歧杆菌冻干粉中的菌粉活菌数会降低。本发明对所述脱脂奶粉的购买厂家不做特别限定，一种实施方式中，所述脱脂奶粉购自nzmp NewZenland。

本发明所述保护剂含有脱脂奶粉的高分子物质之外，还包括糖类，例如二糖和/或多糖，和氨基酸类的低分子物质，有利于促进微生物保持稳定的活存状态以及对水分子起缓解作用，本发明所述氨基酸及其盐中的氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸中的任一种或多种组合。

不过在实际实验中可以发现不同微生物所适用的保护剂不同，不同的保护剂对不同细胞的作用机制也不同，对菌体细胞的保护程度也会不同，同样地，并不是所有的氨基酸及其盐类物质均适用于婴儿双歧杆菌的冷冻干燥，这可能是由于其生物学特性；优选地，本发明所述氨基酸及其盐为谷氨酸钠，申请人意外发现当谷氨酸钠作为复合保护剂中的组分使用时，可以有效提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率，同时提高菌粉活菌数，减少冷冻干燥过程中的粘壁问题，这可能是加入谷氨酸钠属于盐类物质，可在冻干过程中与菌体中的水分作用，保留了部分水分形成水膜，满足了冻干结束后益生菌对水分的需要，同时能减轻其他物质对菌体的氧化作用，这样也避免了蛋白质等有机物与壁之间的贴合与吸附，缓解冷冻干燥过程中的粘壁问题，也提高了婴儿双歧杆菌的存活率，并提高菌粉活菌数。

一些实施方式中，二糖选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中的任一种或多种组合；优选地，多糖选自淀粉、纤维素、菊糖、果胶、花粉多糖、玉米须多糖、枣多糖、无花果多糖、茶多糖、芦荟多糖、桑叶多糖、龙眼多糖、茶多糖、芦荟多糖、桑叶多糖、龙眼多糖中的任一种或多种的组合；不过在实验过程中发现并不是所有的糖类小分子物质均可以提高婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数，这也是保护剂的效果存在菌种特异性的表现。

优选地，糖类物质包括海藻糖和菊糖，进一步优选地，海藻糖和菊糖的重量比为1：(0.35～0.95)；进一步优选地，海藻糖和菊糖的重量比为1：(0.6～0.83)；申请人发现当海藻糖与菊糖共同与谷氨酸钠协同作用，尤其当二糖和多糖总重量占比为5～22％时，且海藻糖和菊糖的重量比为1：(0.6～0.95)，可以提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数，这可能是由两个葡萄糖组成的非还原性糖与菊糖以及体系中的其他组分共同作用，在细胞膜表面形成独特的保护膜，有效地保护生物分子结构不被破坏，从而维持生命体的生命过程和生物特征，同时与蛋白质形成氢键，满足蛋白质表面带电基团形成氢键的需求，从而稳定菌体细胞的活性，提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数而当海藻糖含量较多时，体系中渗透压改变，体系的氧化还原电位提高，降低对体系中氧气的消耗，从而保护效果降低。

此外，申请人也发现复合保护剂体系还需要含有小分子多元醇，所述小分子多元醇例如丙二醇、甘油、丁二醇、甘露醇、木糖醇等，同样地，并不是所有的小分子多元醇都是合适的，优选为甘油；申请人意外发现当作用甘油与谷氨酸钠、海藻糖、菊糖协同作用时，可以有效避免所得冻干粉的占比现象，同时结构蓬松、不结块，还能进一步提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数，这可能是由于甘油与谷氨酸钠、海藻糖、菊糖协同作用，可以在冷冻干燥过程中发挥保护作用取代水分子与菌体细胞膜磷脂中的磷酸基团或与菌体蛋白极性基团形成氢键，保护细胞膜和蛋白质结构与功能的完整性，同时能有效在冷冻干燥阶段避免结晶水的析出，减轻冻干粉在壁表面的粘附，同时避免因为水分的析出造成的冻干粉团聚，结块的问题。

优选地，一些实施方式中，复合保护剂的制备方法包括：

(1)将脱脂奶粉与小分子多元醇溶于磷酸缓冲液中，高温灭菌，得A液；

(2)将二糖或/和多糖溶于磷酸缓冲液中，高温灭菌，得B液；

(3)将氨基酸及其盐溶于磷酸缓冲液中，用滤膜过滤除菌，得C液；

(4)将A液、B液、C液在无菌条件下混合，即得。

进一步优选地，一些实施方式中，复合保护剂的制备方法包括：

(1)将磷酸缓冲液按体积1:1:1的比例分成三份，将脱脂奶粉与小分子多元醇溶于其中一份磷酸缓冲液中，105～108℃灭菌10～20min，得A液；

(2)将二糖或/和多糖溶于另一份磷酸缓冲液中，110～112℃灭菌10～20min，得B液；

(3)将氨基酸及其盐溶于剩余磷酸缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；

(4)将A液、B液、C液在无菌条件下混合，即得。

所述复合保护剂在制备过程中不同成分采用不同的方式或温度进行灭菌制备，所得复合保护剂能溶解充分且均匀的体系，可能当脱脂奶粉在较高温度下灭菌时容易蛋白变性，形成沉淀；此外，脱脂奶粉、糖类物质分别先溶解于磷酸缓冲液中，再进行混合，有利于溶解充分形成均匀体系，避免脱脂奶粉与糖类物质直接混合，形成较大的内聚力，发生团聚，影响其溶解程度。

本发明的第二方面提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，所用复合保护剂为所述双歧杆菌的冻干粉复合保护剂。

本发明的第三方面提供一种所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，将湿菌泥与复合保护剂混合，冷冻干燥即得。

优选地，一些实施方式中，湿菌泥与复合保护剂的重量比为(0.2～3.5)：1；进一步优选地，湿菌泥与复合保护剂的重量比为(0.5～3)：1；或进一步优选地，湿菌泥与复合保护剂的重量比为(1～2)：1；或进一步优选地，湿菌泥与复合保护剂的重量比为1：1。

一些实施方式中，湿菌泥的制备过程包括菌种活化、一级菌种培养、二级菌种培养、发酵培养、收集菌体的步骤。

具体地，湿菌泥的制备过程包括以下步骤：

(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的婴儿双歧杆菌菌种溶解在20-30mL无菌生理盐水中，震荡混匀后按照体积比为2％-6％的接种量接种于TPY液体培养基中，35-38℃条件下厌氧培养8-15h，再按照相同接种量、培养条件在TPY液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；

(2)一级菌种培养：将第3代液体活化培养物接种于一级菌种液体培养基中，接种量为2％-6％，35-38℃条件下厌氧培养8-15h后，终止培养；

(3)二级菌种培养：将一级菌种液体培养物接种于二级菌种液体培养基中，接种量为2％-6％，35-38℃条件下厌氧培养8-15h后，终止培养；

(4)发酵培养：将二级菌种液体培养物接种于液体发酵培养基中，接种量为2％-6％，35-38℃厌氧培养，补加氢氧化钠溶液使其发酵液pH稳定在6-6.5之间，培养12-20h后，终止培养；

(5)收集菌体：在离心机温度4℃、转速5000rpm条件下离心发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得湿菌泥。

所述婴儿双歧杆菌菌种购自上海复祥生物。

本发明对所述TPY液体培养基不做特别限定，可以市购，对购买厂家也不做特别限定，一种实施方式中，TPY液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司。

本发明对所述一级、二级菌种培养的菌种培养基不做特别限制，可以为本领域技术人员熟知的菌种培养基成分；本发明对所述的发酵培养基也不做特别限制，可以为本领域技术人员熟知的发酵培养基成分。

一些实施方式中，所述一级菌种培养与二级菌种培养所用的菌种培养基相同，其组成与重量配比为：酪蛋白胨12～18g，大豆蛋白胨3～8g，酵母浸粉3～8g，牛肉浸膏7～13g，葡萄糖7～13g，乳糖3～8g，乙酸钠0.5～1.5g，柠檬酸二胺1～5g，磷酸氢二钾0.5～4.5g，硫酸镁1～3g，L-半胱氨酸0.1～0.8g，蒸馏水1000mL。

一些实施方式中，所述发酵培养基组成与重量配比包括：酪蛋白胨12～18g，大豆蛋白胨12～18g，酵母浸粉3～8g，消化血清粉12～18g，牛肉浸膏12～18g，葡萄糖12～18g，乳糖3～8g,乙酸钠0.5～2.5g，柠檬酸二胺1～5g，磷酸氢二钾1～3g，硫酸镁0.5～2.5g，山梨醇0.5～1.5g，谷氨酸0.1～0.6g，L-半胱氨酸0.1～0.45g，蒸馏水1000mL。

优选地，所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，将湿菌泥与复合保护剂混合，30～45℃平衡20min～60min，于-20～-60℃下预冻3～10h，再进行冷冻干燥，即得；进一步优选地，所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，将湿菌泥与复合保护剂混合，30～45℃平衡20min～60min，于-30～-50℃下预冻3～10h，然后于3-8Pa下冷冻干燥16～22h，即得。

优选地，一些实施方式中，所述发酵培养基中还含有助剂，助剂包括第二组分氨基酸、第二组分多元醇以及蒸馏水，且第二组分多元醇的相对分子量为100～400g/mol；进一步优选地，按照助剂的重量百分比计，助剂包括0.01～0.5％第二组分多元醇、0.01～0.3％第二组分氨基酸以及余量蒸馏水；进一步优选地，助剂包括0.02～0.3％第二组分多元醇、0.02～0.15％第二组分氨基酸以及余量蒸馏水；进一步优选地，助剂包括0.06～0.2％第二组分多元醇、0.06～0.11％第二组分氨基酸以及余量蒸馏水。

在一些实施方式中，所述第二组分氨基酸可以选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸中的任一种或多种组合；优选为谷氨酸。

在一些实施方式中，所述第二组分多元醇可以选自山梨醇、木糖醇、麦芽醇、甘油、甘露醇中的任一种或多种组合；优选为山梨醇。

申请人在实验过程中意外发现，当采用山梨醇以及谷氨酸配置成一定浓度的无菌溶液添加至菌体发酵培养基时，有利于提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数，这可能是由于在发酵培养基中添加助剂，在不影响菌体发酵的条件下，更好的吸附于菌体细胞表面，在冷冻干燥过程中与复合保护剂协同作用，阻碍蛋白质空间结构的变化，减少菌体与水分子间的作用力，同时也能有效避免因水分过多而快速代谢死亡，避免细胞受到损伤或产生亚致死现象。

所述助剂使用时将助剂用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，加入到菌体发酵培养基中，即可。

与现有技术相比，本发明具有如下有益效果：

(1)本申请采用特定的糖类物质、氨基酸及其盐类物质形成适用于婴儿双歧杆菌的复合保护剂，能够有效提高所得冻干粉中婴儿双歧杆菌的存活率以及菌粉活菌数，同时能够避免冷冻干燥过程中出现的粘壁、颜色深、结块等问题；

(2)本申请在冻干粉制备过程中采用特定的助剂与复合保护剂协同作用，能够提高婴儿双歧杆菌冻干粉的存活率以及菌粉活菌数，存活率可以高达85％以上，菌粉活菌数可以高达1.5×10¹¹cfu/g以上。

具体实施方式

下面通过实施例对本发明进行具体描述。有必要在此指出的是，以下实施例只用于对本发明作进一步说明，不能理解为对本发明保护范围的限制，该领域的专业技术人员根据上述本发明的内容做出的一些非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。另外，如果没有其它说明，所用原料都是市售的，为本领域技术人员所熟知的种类或类型。

以下实施例中脱脂奶粉购自nzmp NewZenland；TPY液体培养基购自青岛海博生物技术有限公司；婴儿双歧杆菌菌种购自上海复祥生物。

实施例1

本发明的实施例1提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括20％脱脂奶粉、1.6％谷氨酸钠、16％二糖和多糖、2％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液；小分子多元醇为甘油；

二糖为海藻糖，多糖为菊糖，海藻糖与菊糖的重量比为1：0.82；

所述复合保护剂的制备方法包括：

(1)将磷酸缓冲液按体积1:1:1的比例分成三份，将脱脂奶粉与小分子多元醇溶于其中一份磷酸缓冲液中，107℃灭菌15min，得A液；

(2)将二糖和多糖溶于另一份磷酸缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；

(3)将氨基酸及其盐溶于剩余磷酸缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；

(4)将A液、B液、C液在无菌条件下混合，即得。

实施例2

本发明的实施例2提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括25％脱脂奶粉、0.5％谷氨酸钠、8％二糖和多糖、1.5％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液；小分子多元醇为甘油；

二糖为海藻糖，多糖为菊糖，海藻糖与菊糖的重量比为1：0.6；

所述复合保护剂的制备方法同实施例1。

实施例3

本发明的实施例3提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括13％脱脂奶粉、2％谷氨酸钠、10.5％二糖和多糖、4％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液；小分子多元醇为甘油；

二糖为海藻糖，多糖为菊糖，海藻糖与菊糖的重量比为1：0.35；

所述复合保护剂的制备方法同实施例1。

实施例4

本发明的实施例4提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将甘油替换为甘露醇。

实施例5

本发明的实施例5提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将甘油替换为山梨醇。

实施例6

本发明的实施例6提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将菊糖替换为乳糖。

实施例7

本发明的实施例7提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将菊糖替换为果胶。

实施例8

本发明的实施例8提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将谷氨酸钠换为Vc-Na。

实施例9

本发明的实施例9提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将谷氨酸钠换为赖氨酸。

实施例10

本发明的实施例10提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例3，不同之处在于，将二糖和多糖的总占比替换为35wt％。

实施例11

本发明的实施例11提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法为：将湿菌泥与复合保护剂混合，37℃平衡35min，于-40℃下预冻6h，然后于3-8Pa下冷冻干燥21h，即得；

湿菌泥与复合保护剂的重量比为1：1；所述复合保护剂为实施例1所得复合保护剂；

湿菌泥的制备过程包括以下步骤：

(1)菌种活化：在无菌室中，将低温保存的婴儿双歧杆菌菌种溶解在20-30mL无菌生理盐水中，震荡混匀后按照体积比为4％的接种量接种于TPY液体培养基中，37℃条件下厌氧培养9.5h，再按照相同接种量、培养条件在TPY液体培养基中连续活化2代，获得第3代液体活化培养物；

(2)一级菌种培养：将第3代液体活化培养物接种于一级菌种液体培养基中，接种量为4％，37℃条件下厌氧培养12h后，终止培养；

(3)二级菌种培养：将一级菌种液体培养物接种于二级菌种液体培养基中，接种量为4％，37℃条件下厌氧培养12h后，终止培养；

(4)发酵培养：将二级菌种液体培养物接种于液体发酵培养基中，接种量为4％，38℃厌氧培养，补加氢氧化钠溶液使其发酵液pH稳定在6-6.5之间，培养15h后，终止培养；

(5)收集菌体：在离心机温度4℃、转速5000rpm条件下离心发酵液，离心时间为20min，弃上清，获得湿菌泥；

所述一级菌种培养与二级菌种培养所用的菌种培养基相同，其组成与重量配比为：酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨5g，酵母浸粉5g，牛肉浸膏10g，葡萄糖10g，乳糖5g，乙酸钠1g，柠檬酸二胺3g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1.5g，L-半胱氨酸0.3g，蒸馏水1000mL；

所述的发酵培养基组成及重量配比包括：酪蛋白胨15g，大豆蛋白胨10g，酵母浸粉5g，消化血清粉10g，牛肉浸膏10g，葡萄糖10g，乳糖5g，乙酸钠1g，柠檬酸二胺3g，磷酸氢二钾2g，硫酸镁1.5g，山梨醇1g，谷氨酸0.2g，L-半胱氨酸0.3g，蒸馏水1000mL；

所述发酵培养基还包括助剂，按照助剂的重量百分比计，助剂为0.12％第二组分多元醇、0.08％第二组分氨基酸以及余量蒸馏水；第二组分多元醇为山梨醇；第二组分氨基酸为谷氨酸；

将所述的山梨醇与谷氨酸溶解于50mL蒸馏水中，然后用0.22μm滤膜过滤除菌后，在无菌室中，加入到菌体发酵培养基中。

实施例12

本发明的实施例12提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例2所得复合保护剂；湿菌泥与复合保护剂的重量比为3：1。

实施例13

本发明的实施例13提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例3所得复合保护剂；湿菌泥与复合保护剂的重量比为1：2.5。

实施例14

本发明的实施例14提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例4所得复合保护剂。

实施例15

本发明的实施例15提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例5所得复合保护剂。

实施例16

本发明的实施例16提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例6所得复合保护剂。

实施例17

本发明的实施例17提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例7所得复合保护剂。

实施例18

本发明的实施例18提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例8所得复合保护剂。

实施例19

本发明的实施例19提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例9所得复合保护剂。

实施例20

本发明的实施例20提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，所述复合保护剂为实施例10所得复合保护剂。

实施例21

本发明的实施例21提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，将第二组分多元醇替换为甘露醇。

实施例22

本发明的实施例22提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，将第二组分氨基酸替换为半胱氨酸。

实施例23

本发明的实施例23提供一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其具体实施方式同实施例11，不同之处在于，将复合保护剂含量替换为0，将助剂含量也替换为0。

实施例24

本发明的实施例24提供一种用于婴儿双歧杆菌冻干粉的复合保护剂，其具体实施方式同实施例1，不同之处在于，

所述复合保护剂的制备方法包括：

(1)将磷酸缓冲液按体积1:1的比例分成两份，将脱脂奶粉、小分子多元醇、二糖和多糖溶于一份磷酸缓冲液中，110℃灭菌15min，得B液；

(2)将氨基酸及其盐溶于剩余磷酸缓冲液中，用0.22μm滤膜过滤除菌，得C液；

(3)将A液、B液、C液在无菌条件下混合，即得。

性能评估

1.婴儿双歧杆菌的冻干存活率测定；称量3g离心后湿菌泥加入27mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取100ul稀释液涂布于GAM固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数，再乘以菌泥重量，得冻干前总活菌数，记为a；冻干后以相同方法对菌粉计数，记为b；冻干存活率记为c；则冻干存活率计算公式为：c＝a/b*100％；

2.婴儿双歧杆菌冻干粉中菌粉活菌数测定：称量3g冻干菌粉加入27mL含有玻璃珠的生理盐水中，振荡30min，取1mL菌液至9mL生理盐水中进行梯度稀释，取100ul稀释液涂布于GAM固体培养基中，涂布3个梯度，每个梯度3个平行，将涂布后的培养皿放于37℃恒温培养箱中培养48h后取出计数。

3.冷冻干燥性检测：观察所得冻干粉是否出现粘壁现象，观察是否有结块问题，每个检测的实施例对应100个样品，粘壁评价等级以及标准为：A—出现0～3个粘壁；B—出现4～10个粘壁；C—出现11～25个粘壁；D—出现大于25个粘壁；结块评价等级以及标准为：A—出现0～3个结块；B—出现4～10个结块；C—出现11～25个结块；D—出现大于25个结块；

4.观察实施例1～3所得复合保护剂为均匀体系，没有团聚、沉淀、分层的现象，而实施例24所得复合保护剂有沉降、分层的问题出现。

表1

以上所述，仅是本发明的较佳实施例而已，并非是对发明作其他形式的限制，任何熟悉本专业的技术人员可能利用上述揭示的技术内容加以变更或更改为等同变化的等效实施例，但是凡是未脱离本发明技术方案内容，依据本发明的技术实质对以上实施例所作的任何简单修改，等同变化与改型，仍属于本发明技术方案的保护范围。

Claims (10)

1.一种双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，其特征在于，按照复合保护剂的重量百分比计，复合保护剂包括10～30％脱脂奶粉、0.1～5.0％氨基酸及其盐、3～25％二糖或/和多糖、1～5％小分子多元醇、余量的磷酸盐缓冲液，且复合保护剂的pH为6.5～8.5。

2.根据权利要求1所述双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，其特征在于，氨基酸选自甘氨酸、丙氨酸、亮氨酸、异亮氨酸、苯丙氨酸、色氨酸、酪氨酸、天冬氨酸、天冬酰胺、谷氨酸、赖氨酸、谷氨酰胺、甲硫氨酸、丝氨酸、苏氨酸、半胱氨酸、脯氨酸、组氨酸、精氨酸中的任一种或多种组合。

3.根据权利要求1或2所述双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，其特征在于，二糖选自海藻糖、蔗糖、麦芽糖、乳糖中的任一种或多种组合；优选地，多糖选自淀粉、纤维素、菊糖、果胶、花粉多糖、玉米须多糖、枣多糖、无花果多糖、茶多糖、芦荟多糖、桑叶多糖、龙眼多糖、茶多糖、芦荟多糖、桑叶多糖、龙眼多糖中的任一种或多种的组合。

4.根据权利要求1～3任一项所述双歧杆菌的冻干粉复合保护剂，其特征在于，复合保护剂的制备方法包括：

(1)将脱脂奶粉与小分子多元醇溶于磷酸缓冲液中，高温灭菌，得A液；

(2)将二糖或/和多糖溶于磷酸缓冲液中，高温灭菌，得B液；

(3)将氨基酸及其盐溶于磷酸缓冲液中，用滤膜过滤除菌，得C液；

(4)将A液、B液、C液在无菌条件下混合，即得。

5.一种婴儿双歧杆菌冻干粉，其特征在于，所用复合保护剂为权利要求1～4任一项所述双歧杆菌的冻干粉复合保护剂。

6.一种根据权利要求5所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，将湿菌泥与复合保护剂混合，30～45℃平衡20min～60min，于-20～-60℃下预冻3～10h，再进行冷冻干燥，即得。

7.根据权利要求6所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，湿菌泥与复合保护剂的重量比为(0.2～3.5)：1。

8.根据权利要求6或7所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，湿菌泥的制备过程包括菌种活化、一级菌种培养、二级菌种培养、发酵培养、收集菌体的步骤。

9.根据权利要求8所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，发酵培养所用发酵培养基中含有助剂，助剂包括第二组分氨基酸、第二组分多元醇以及蒸馏水，且第二组分多元醇的相对分子量为100～400g/mol。

10.根据权利要求8所述婴儿双歧杆菌冻干粉的制备方法，其特征在于，按照助剂的重量百分比计，助剂包括0.01～0.5％第二组分多元醇、0.01～0.3％第二组分氨基酸以及余量蒸馏水。